Pomiar sztywności mysich aort ex vivo za pomocą mikroskopii sił atomowych
19 października 2016
Przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji aort od myszy i pomiaru ich modułu sprężystości za pomocą mikroskopii sił atomowych.
Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie procedur wykorzystania mikroskopii sił atomowych do pomiaru modułu sprężystości ex vivo aort myszy. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomechaniki naczyń krwionośnych i chorób, takich jak choroby sercowo-naczyniowe i starzenie się. Główną zaletą tej techniki jest to, że AFM charakteryzuje właściwości biomechaniczne miękkich próbek biologicznych, takich jak tętnice i komórki, z dużym stopniem dokładności na poziomie Danoscale.
Przedstawię procedury AFM, a doktor Shu-lin Liu, badacz z naszego laboratorium, pokaże, jak izolować aorty myszy. Na początek poddaj mysz eutanazji i przeprowadź jej sekcję aż do aorty, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Za pomocą małych kleszczy chwyć tłuszcz otaczający aortę i użyj małych nożyczek, aby ostrożnie odciąć tłuszcz wokół aorty.
Następnie delikatnie chwyć aortę kleszczami i wykonaj jedno nacięcie przez naczynie na początku aorty wstępującej, a drugie nacięcie na końcu aorty zstępującej, tuż nad aortą brzuszną. Przenieś wypreparowaną aortę do 60-milimetrowego naczynia zawierającego PBS bez wapnia i magnezu. W naczyniu kontynuuj wycinanie pozostałej tkanki tłuszczowej z aorty, a następnie otwórz aortę wzdłużnie.
Następnie wytnij kawałek o wymiarach 2 milimetry na 4 milimetry z aorty zstępującej i kawałek tego samego rozmiaru z łuku aorty do analizy za pomocą mikroskopu sił atomowych. Umieść te kawałki tkanki w świeżym plastikowym naczyniu o grubości 60 milimetrów i utrzymuj je wilgotne w kropli PBS. Ostrożnie usuń PBS z okolic tkanki za pomocą chusteczki laboratoryjnej, nie dotykając aorty.
Upewnij się, że luminalna strona tkanki jest skierowana do góry i użyj od pięciu do 10 mikrolitrów kleju cyjanoakrylowego, aby delikatnie przykleić każdy koniec otwartej aorty do płytki. Bardzo ważne jest, aby aorta nie była rozciągana podczas tego procesu. Po zakończeniu sprawdź, czy sklejona aorta nie jest zagięta lub pływająca.
Po wysuszeniu kleju na powietrzu na aorcie przez 30 do 60 sekund, delikatnie dodaj PBS i zanurz próbkę. Za pomocą pęsety wsuń silikonową sondę AFM z azotanu z kulistą końcówką na uchwyt sondy. Następnie mocno przymocuj uchwyt sondy do mocowania ZScanner głowicy AFM.
Następnie otwórz oprogramowanie AFM. Wybierz typ eksperymentu, przechodząc do kategorii eksperymentu i wybierając opcję Tryb kontaktu. Następnie przejdź do grupy eksperymentów i wybierz pozycję Tryb kontaktu w płynie, a na koniec przejdź do pozycji Eksperyment i wybierz pozycję Tryb kontaktu w płynie.
Po wybraniu tych opcji kliknij Załaduj eksperyment. Spowoduje to włączenie lasera. Następnie przygotuj próbkę używaną do wyrównania lasera zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.
Umieścić próbkę na AFM. Umieść plamkę lasera na końcówce sondy AFM, regulując pokrętła pozycjonowania lasera. Następnie użyj pokręteł pozycjonowania detektora, aby wyregulować położenie fotodiody, aż wartości odchylenia pionowego będą wynosić od zera do ujemnego jednego wolta, a odchylenie poziome będzie bliskie zeru woltów.
Następnie sprawdź, czy sygnał sumy laserowej jest zmaksymalizowany. W razie potrzeby wyreguluj położenie wiązki laserowej na końcówce AFM oraz położenie fotodiody, aby uzyskać maksymalny sygnał sumy. Aby rozpocząć kalibrację, wybierz opcję Sprawdź parametry i ustaw parametr Rozmiar skanowania na zero.
Ustaw szybkość skanowania na jeden herc. Ustaw próbkę/linię na 256, a nastawę ugięcia na 20 nanometrów. Następnie wybierz opcję Zaangażuj się.
Gdy sonda zetknie się z powierzchnią płyty, kliknij Rampa. Następnie wybierz tryb rozszerzony z menu paska narzędzi skanowania i ustaw parametry, jak pokazano poniżej. Na pasku narzędzi rampy wybierz ciąg rampy i uzyskaj krzywą siły na płycie.
Na tej krzywej siły ustaw Kanał 1 na Błąd ugięcia, aby umożliwić oprogramowaniu przedstawienie wyników na wykresie jako ugięcia pionowego w funkcji pozycji Z. Kliknij po lewej lub prawej stronie na krzywej siły i przeciągnij kursor, aby objąć obszar liniowy krzywej siły, który będzie pasował do linii prostej. Następnie wybierz Rampa na pasku narzędzi i kliknij Aktualizuj czułość.
Zapisz bieżącą wartość. Następnie wybierz Kalibruj i kliknij Detektor. Wartość wejściowa i średnia z pięciu pomiarów w polu Czułość ugięcia.
Kliknij Wycofaj dwa do trzech razy, aby podnieść głowicę AFM i zapobiec interakcji między końcówką AFM a płytą podczas procesu dostrajania termicznego. Następnie kliknij Thermal Tune na pasku narzędzi. Ustaw zakres strojenia termicznego w zakresie od 1 do 100 kiloherców, a korekcję czułości ugięcia na 1,144 dla wsporników w kształcie litery V i 1,166 dla wsporników prostokątnych.
W menu Strojenie termiczne kliknij Uzyskaj dane, aby uzyskać krzywą strojenia termicznego. Następnie umieść czerwoną kreskę na liniach po obu stronach krzywej i wybierz model oscylatora Lorentza lub prosty oscylator harmoniczny, w zależności od tego, który lepiej pasuje do danych. Następnie kliknij Dopasuj dane i wybierz Oblicz sprężynę K, aby zapisać tę wartość.
Umieść 60-milimetrowe naczynie hodowlane zawierające tkankę aorty na stoliku mikroskopu i zabezpiecz płytkę magnetycznym uchwytem płytki. Gdy aorta zostanie sprzężona ze wspornikiem, upewnij się, że środek piezoelektryczny jest stabilny i kliknij Rampa. Ustaw rozmiar rampy na trzy mikrometry, tryb wyzwalania na względny, a próg wyzwalania na 100 nanometrów.
Następnie wybierz opcję rampa ciągła. Zwróć uwagę, że punkt styku między sondą a próbką występuje mniej więcej w środku do dolnych trzech czwartych cyklu rampy Z. Jeśli nie zostanie to zaobserwowane, odłącz się od próbki, dostosuj rozmiar rampy w razie potrzeby i ponownie włącz próbkę.
Następnie kliknij Mikroskop na pasku menu i wybierz Ustawienia zaangażowania. Zmień wartość wypłaty SPM na 30 mikrometrów, a następnie kliknij przycisk OK. Po zaobserwowaniu krzywej siły kliknij Przechwyć na pasku menu i wybierz Przechwytywanie Nazwa pliku. Wprowadź żądaną nazwę pliku kończącą się na OOO, wybierz wyznaczony folder i zapisz dane.
Aby rozpocząć analizę, otwórz oprogramowanie do analizy krzywej siły, załaduj plik, który ma być analizowany, a następnie zmodyfikuj i wygładź dane zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie wybierz opcję Baseline Correction (Korekcja linii bazowej) na pasku menu i ustaw dane wejściowe, jak pokazano tutaj. Następnie dostosuj pionową przerywaną niebieską linię na wykresie, aby objąć płaską część krzywej siły, a następnie kliknij przycisk Wykonaj.
Następnie kliknij Wcięcie w menu paska narzędzi i ustaw dane wejściowe, jak pokazano tutaj. Zapisz te wartości i przeanalizuj moduł Younga dla każdego z obszarów zainteresowania, mierząc pięć krzywych siły na obszar, które są pobierane w niewielkiej odległości od siebie. Aby określić ogólną sztywność próbki tkanki, należy wykonać do 25 pomiarów w pięciu różnych obszarach obszaru próbki w tkance.
Obszary te można wykorzystać do porównania tkanek w różnych lokalizacjach, takich jak łuk aorty i aorta zstępująca. Na tych wykresach pokazano reprezentatywne krzywe siły aorty zstępującej i łuku aorty z tej samej próbki aorty myszy. Na podstawie tych danych można obliczyć moduł sprężystości dla każdej grupy i wykorzystać go do porównania różnych regionów lub warunków.
Po obejrzeniu tego filmu będziesz dobrze wiedział, jak prawidłowo wyizolować aortę myszy i zmierzyć moduł sprężystości za pomocą mikroskopii sił atomowych. Po wykonaniu tej procedury należy pamiętać o wykonaniu pomiaru AFM natychmiast po izolacji tkanek. Po opanowaniu, izolacja aort może zostać zakończona w około 45 minut na mysz, a pomiar i analiza AFM mogą zostać zakończone w ciągu półtorej godziny, jeśli zostaną wykonane prawidłowo.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy immunofluorescencji lub proliferacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z przebudową naczyń krwionośnych lub proliferacją komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły izolacji aorty z myszy oraz pomiaru jej modułu sprężystości z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych (AFM). Opisane metody są kluczowe dla zrozumienia biomechaniki naczyniowej oraz związanych z nią schorzeń.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biomechanika naczyniowa
- Skaningowa mikroskopia sił atomowych
- Badania nad chorobami układu sercowo-naczyniowego
Wprowadzenie
- Zrozumienie właściwości mechanicznych naczyń krwionośnych jest niezbędne do badania zdrowia układu sercowo-naczyniowego.
- AFM umożliwia precyzyjny pomiar właściwości biomechanicznych miękkich tkanek biologicznych.
- Niniejsze badanie koncentruje się na aortach mysich jako modelu schorzeń naczyniowych u ludzi.
- Celem protokołu jest dostarczenie niezawodnej metody dla badaczy w tej dziedzinie.
Cel badania
- Opis procedur pomiaru modułu sprężystości aorty myszy.
- Pogłębienie zrozumienia mechaniki naczyniowej w kontekście chorób i starzenia się organizmu.
- Przedstawienie szczegółowej metodologii dla badaczy zainteresowanych właściwościami biomechanicznymi.
Zastosowane metody
- Eutanazja myszy i izolacja aorty.
- Wykorzystanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru modułu sprężystości.
- Precyzyjne techniki dysekcji w celu przygotowania aorty do analizy.
- Charakterystyka właściwości biomechanicznych w skali nanometrycznej.
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja aorty myszy do badań biomechanicznych.
- Dokładny pomiar modułu sprężystości przy użyciu AFM.
- Wnioski dotyczące właściwości mechanicznych tkanek naczyniowych.
- Potencjalne znaczenie dla zrozumienia chorób układu sercowo-naczyniowego.
Wnioski
- Przedstawione protokoły stanowią niezawodną metodę badania mechaniki naczyniowej.
- AFM jest cennym narzędziem do charakteryzacji miękkich próbek biologicznych.
- Wyniki mogą przyczynić się do postępów w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowy pomiar sztywności aorty mysiej ex vivo z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych (AFM) zapewnia biomechaniczny odczyt o wysokiej rozdzielczości, bezpośrednio istotny dla modelowania chorób układu sercowo-naczyniowego oraz badań nad starzeniem. Możliwość ta umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka oraz walidację celów w zakresie przebudowy naczyniowej i biologii komórek mięśni gładkich we wczesnej fazie odkrywania leków. Integracja profilowania sztywności opartego na AFM zwiększa pewność prognostyczną w wyborze modeli przedklinicznych oraz opracowywaniu translacyjnych biomarkerów dla terapii naczyniowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechaniki tkanki naczyniowej w celu walidacji celów terapeutycznych w oparciu o postawione hipotezy.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację zmian biomechanicznych związanych z chorobą lub interwencją.
- Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie funkcjonalnych odczytów służących do priorytetyzacji kandydatów.
Przesiewanie i rozwój testów
- Ustanawia zwalidowane testy biomechaniczne dla późniejszych etapów procesów przesiewowych związków.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary modułu sprężystości w celu standaryzacji testów.
- Przygotowuje systemy biologiczne do skalowalnej, porównawczej oceny interwencji terapeutycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność modeli przedklinicznych z biomechanicznymi punktami końcowymi istotnymi dla przebiegu choroby w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez powiązanie mechaniki tkanek z wynikami funkcjonalnymi.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów poprzez korelację sztywności z przebudową naczyniową lub proliferacją komórek.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Ta metoda pomiaru sztywności oparta na AFM wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między walidacją celu, opracowywaniem testów a badaniami translacyjnymi w odniesieniu do wskazań naczyniowych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia ilościową weryfikację hipotez dotyczących sztywności naczyniowej jako punktu końcowego mechanizmu.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, powtarzalnych odczytów biomechanicznych do analizy porównawczej.
- Analityka: Generuje dane krzywej siły oraz wartości modułu sprężystości w celu wsparcia porównań statystycznych między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy mechanikę tkanek ex vivo z modelami chorób i strategiami biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do oceny biomechanicznej w ramach programów badań naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiary biomechaniczne w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Stanowi podstawę do podejmowania decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez ograniczanie ryzyka programów we wczesnej fazie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na terapeutyki naczyniowe.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze AFM oraz analizie danych biomechanicznych.
- Wymaga dostępu do skalibrowanej aparatury AFM oraz oprogramowania do analizy krzywych siły.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania tkanek i pomiarów pomiędzy zespołami.
- Możlizna jest konieczność adaptacji metody dla różnych tkanek naczyniowych lub modeli chorobowych.
- Kluczowe dla zachowania integralności biomechanicznej jest wykonanie pomiaru bezpośrednio po izolacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
Preparing the Mouse and Isolation of the Aorta
2:06
Preparing Tissue Samples for the AFM Measurements
2:46
Loading the AFM Probe and Aligning the Laser
4:16
Calibrating the Deflection Sensitivity and Spring Constant of the AFM Probe
6:28
Measuring the Elastic Modulus on Mouse Arteries Ex Vivo
7:50
Data Analysis
8:47
Results: Determining Aortic Stiffness
9:29
Conclusion
