Name: Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Odkryj mechanizmy wpływu fungicydów na zdrowie pszczół poprzez badanie zmian w mikrobiomie pyłku i demografii kolonii trzmieli. Ta metoda łączy eksperymenty polowe z analizą sekwencjonowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Centrum Biotechnologii Uniwersytetu Wisconsin za udostępnienie urządzeń i usług do amplifikacji i sekwencjonowania, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto i Max Haase za pomoc techniczną w analizie molekularnej. Praca ta była wspierana przez fundusze przyznane przez USDA-Agricultural Research Service (Current Research Information System #3655-21220-001). Dalszego wsparcia udzieliła Narodowa Fundacja Nauki (w ramach grantu nr Grantu). DEB-1442148), Centrum Badań Bioenergetycznych Wielkich Jezior Departamentu Energii (DOE Biuro Nauki BER DE-FC02-07ER64494) oraz Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa USDA (projekt Hatch 1003258). C.T.H. jest stypendystą Pew Scholar w dziedzinie nauk biomedycznych i Alfred Toepfer Faculty Fellow, wspieranym odpowiednio przez Pew Charitable Trusts i Fundację Alexandra von Humboldta. Autorzy dziękują Hannah Gaines-Day i Olivii Bernauer za ich wkład w nasze wcześniejsze, opublikowane prace terenowe.

1. Zbadaj wpływ ekspozycji na fungicydy na sukces kolonii trzmieli za pomocą eksperymentów w klatkach polowych
<ol>
	<li>Ustaw dziesięć siatkowych klatek na polu obsadzonym owsem. Wykop rów wokół każdej klatki i wkop wszystkie cztery krawędzie klatki siatkowej w ziemię, aby pszczoły nie mogły uciec. Zaopatrz klatki w doniczkowe, kwitnące rośliny, o których wiadomo, że są atrakcyjne dla pszczół (np. gryka, ogórecznik, alyssum, kosmos i słoneczniki) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Uzupełnij klatki pojedynczą tacą (36 cm x 42 cm) kwitnącej koniczyny. Skupisko zasobów kwiatowych w jednym rogu klatki, zajmując przestrzeń o wymiarach około 2,5 m x 1 m. Pozostałą powierzchnię klatki wegetuj owsem.</li>
	<li>Losowo przypisz koloniom trzmieli, z których każda zawiera robotnice i jedną królową, zabieg (fungicyd obecny/nieobecny, N = 5 kolonii na zabieg, łącznie 10 kolonii), a następnie umieść je w klatce polowej (N = 1/klatkę) na 29 dni (23 czerwca - 21 lipca 2014 r.).</li>
	<li>Ustaw skrzynki kolonijne tak, aby otwory kolonii były skierowane na południe, aby zapewnić pszczołom optymalne warunki nawigacyjne. Dofinansuj kolonie pęcherzami z wodą z cukrem, umieszczonymi w skrzynkach ula, aby uzupełnić dostępność nektaru.</li>
	<li>Fungicyd na bazie chlorotalonilu należy zastosować na poziomie odpowiednim dla pola (20 g/l) na rośliny kwitnące w pięciu klatkach do stosowania fungicydów, używając ręcznego opryskiwacza do pestycydów, dwa razy w trakcie badania (dzień 0 i 13). Pokryj kwiaty równomiernie, tak aby żaden płyn nie przylegał do powierzchni kwiatowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Na zakończenie badania w klatkach polowych należy ręcznie usunąć kolonie B. impatiens z klatek, schłodzić ule, umieszczając je w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 20 minut.</li>
	<li>Usuń pszczoły za pomocą sterylnych kleszczy i zapisz liczbę larw, poczwarek, dorosłych samic (i.e. zbieracze) i dorosłe samce. Za pomocą wagi analitycznej należy odnotować suchą masę matki, matki, larw, poczwarek, dorosłych samic (tj. zbieraczy) i dorosłych samców.</li>
</ol>
2. Zbadaj wpływ ekspozycji na fungicydy na społeczności mikrobiologiczne w zapasach pyłku w gniazdach trzmieli, korzystając z laboratoryjnych prób in vivo
<ol>
	<li>Sproszkować zakupiony w handlu pyłek na drobny proszek za pomocą standardowego laboratoryjnego młyna kulowego. Sterylizuj sproszkowany pyłek, mocząc go w 70% etanolu, pozwalając mu odparować przez noc w świetle UV. Sprawdź sterylność pyłku, posiewając ~0,5 mg na pożywkach agarowych ogólnego przeznaczenia.
	<ol>
		<li>Do suchego, wysterylizowanego pyłku za pomocą wysterylizowanych pipet dodać odpowiednią dla pola dawkę fungicydu: propikonazol w stężeniu 14,3%; azoksystrobina w dawce 22,9% do zabiegów (odpowiednio 0,74 μl i 0,65 μl / dzień / ul). Dobrze wymieszaj za pomocą wysterylizowanych drewnianych patyczków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść 6 uli doświadczalnych (n = 3 każdy do kontroli i leczenia) na czystym, higienicznym stole laboratoryjnym utrzymywanym w temperaturze pokojowej. Każdego dnia waż 4,27 g pyłku34,35 zmieszanego z fungicydami (do zabiegów) lub sterylną wodą (do kontroli) wewnątrz kaptura przy użyciu standardowej techniki aseptycznej.
	<ol>
		<li>Korzystając z klap znajdujących się po stronie kartonu otaczającego ule, wprowadź pyłek do wnętrza uli. Co tydzień uzupełniaj ule wysterylizowanym roztworem cukru. Kontynuuj karmienie przez cztery tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu badania laboratoryjnego schłodzić ule, umieszczając je w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 20 minut. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy i szpatułek zeskrobać zapasy pyłku znajdujące się w komorach lęgowych i umieścić je w sterylnych probówkach do przechowywania. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Policz i zapisz masę robotnic i matki na początku i na końcu doświadczenia (etap 1.7).</li>
	<li>Wyizolować DNA z próbki pobierającej pyłek za pomocą dostępnych na rynku zestawów do izolacji DNA (szczegółowe informacje znajdują się w tabeli materiałów).
	<ol>
		<li>Dodać 0,25 g preparatu pyłkowego do probówek ekstrakcyjnych, krótko zwirować do wymieszania.</li>
		<li>Przygotować roztwór lizozymu o stężeniu 200 mg/ml w dejonizowanej wodzie destylowanej, wystarczający na 50 μl / próbkę. Wstrząśnij energicznie, aż całkowicie utworzy roztwór.</li>
		<li>Dodać 50 μl roztworu lizozymu do probówek ekstrakcyjnych z próbką w środku i dobrze wymieszać, kilkakrotnie odwracając. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Jeśli utworzył się osad, przed użyciem podgrzać roztwór do temperatury 60 °C aż do rozpuszczenia.</li>
		<li>Dodać 70 μl wodnego roztworu do lizy do probówek ekstrakcyjnych, zabezpieczyć poziomo na płaskiej podkładce wirowej z taśmą i wirować przez 10 minut. Probówki wirowe o sile 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przenieść sklarowany osad do czystej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml. Dodaj 250 μl roztworu do wytrącania białek i wiruj przez 5 sekund. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut w łaźni lodowej. 
		UWAGA: Spodziewaj się od 400 μl do 500 μl supernatantu. Supernatant może nadal zawierać pewne cząstki.</li>
		<li>Odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przy 10 000 x g i przenieść do 600 μl supernatantu do czystej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml. Dodać 200 μl wodnego roztworu do usuwania inhibitorów, krótko zmieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przy 10 000 x g. Przenieść do 750 μl supernatantu do czystej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Dodać 1200 μl wodnego roztworu wiążącego do supernatantu i wirować przez 5 s. Załadować około 675 μl supernatantu na filtr wirowy i odwirować przy 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Odrzuć przepływ.</li>
		<li>Powtórz 2.4.7. dwa razy. 
		UWAGA: Wymagane są łącznie trzy ładunki dla każdej przetwarzanej próbki.</li>
		<li>Dodać 500 μl etanolu i wirować w temperaturze pokojowej przez 30 s przy 10 000 x g. Odrzucić przepływ i ponownie odwirować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przy 10 000 x g. Umieść filtr wirowy w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Dodać 100 μl buforu elucyjnego do środka membrany filtracyjnej. Wirować w temperaturze pokojowej przez 30 s przy 10 000 x g. Wyrzuć filtr wirowy. Przechowywać pobrane DNA w temperaturze od -20 °C do -80 °C</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj wyizolowanego DNA do sekwencjonowania.
	<ol>
		<li>Określ ilościowo i znormalizuj wyizolowane DNA do 2 ng / μl za pomocą analizy fluorometrycznej.
		<ol>
			<li>Przygotuj reakcje w trzech egzemplarzach dla każdej wyekstrahowanej próbki, aby porównać względne ilości składników 28S (roślina), przeanalizować ITS (grzyby) i 16S (bakterie) w każdej próbce dostarczania pyłku36. Upewnij się, że każda reakcja zawiera 10 ng całkowitego DNA, 2x asymetrycznej mieszanki głównej na bazie barwnika cyjaninowego i 2,5 μl każdej z par starterów do przodu i do tyłu 28KJ/28B37 dla rośliny i ITS1/ITS5.8R dla DNA grzyba38.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Amplifikować DNA przy użyciu następujących parametrów: 2 minuty wstępnej denaturacji w temperaturze 50 °C, 2 minuty początkowej denaturacji w temperaturze 95 °C, 40 cykli (15 s w temperaturze 98 °C, 15 s w temperaturze 58 °C, 60 s w temperaturze 72 °C), a następnie krzywa topnienia.</li>
		<li>Przygotuj 2-etapowy, zagnieżdżony protokół PCR przy użyciu bibliotek sekwencjonowania nowej generacji ukierunkowanych na region zmienny 16S rRNA V3/V4 i region dystansowy rRNA ITS/5,8s.
		<ol>
			<li>Dodaj 12,5 μl DNA do 5 pmol każdego startera i 2x mieszanki głównej. Przeprowadzaj oddzielne reakcje dla każdego regionu (16S lub ITS; patrz Tabela 1). Zmodyfikuj startery specyficzne dla regionu, jak opisano wcześniej39,40, aby dodać sekwencje nukleotydowe specyficzne dla sekwencera adaptera do sekwencji specyficznych dla genu.</li>
			<li>Przeprowadzić wstępne amplifikację przy użyciu następujących parametrów: 3 minuty początkowej denaturacji w temperaturze 95 °C, 25 cykli (30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 55 °C, 30 s w temperaturze 72 °C), 5 minut końcowego przedłużenia w temperaturze 72 °C.</li>
			<li>Po wstępnej amplifikacji sprawdź rozmiar i ilość biblioteki za pomocą ruchliwości elektroforetycznej i wyczyść za pomocą odwracalnych kulek unieruchamiających w fazie stałej o objętości 1x, aby usunąć resztki starterów i odczynników reakcyjnych. Pula 16S i amplikony ITS ilościowo, aby utworzyć pojedynczą pulę amplikonów dla każdej próbki.</li>
			<li>Dodaj adaptery specyficzne dla sekwencera i podwójne indeksy specyficzne dla próbki, używając następujących starterów (patrz Tabela 1). Dodaj 2,5 μl amplifikowanego DNA do 5 pmol każdego startera i 2x mieszanki głównej. Wykonaj amplifikację biblioteki przy użyciu następujących parametrów: 3 minuty początkowej denaturacji w temperaturze 95 °C, 8 cykli (30 s w 95 °C, 30 s w 55 °C, 30 s w temperaturze 72 °C), 5 minut końcowego przedłużenia w temperaturze 72 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po PCR wyczyść gotowe biblioteki za pomocą 1 x objętość odwracalnych kulek unieruchamiających w fazie stałej. Oceń jakość i ilość gotowych bibliotek za pomocą odpowiednio ruchliwości elektroforetycznej i fluorometrii. Standaryzacja bibliotek do 2 μM i pula przed sekwencjonowaniem.</li>
		<li>Wykonaj sekwencjonowanie nowej generacji na platformie analogicznej do adapterów dodawanych w wtórnym PCR, o odpowiedniej długości, aby pokryć cały amplicon41.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Adnotacja sekwencji i analiza składu mikrobiologicznego.
	<ol>
		<li>Łączenie danych sekwencjonowania par końców (R1 i R2) w pojedyncze kontigi dla wszystkich sekwencjonowanych bibliotek. Po scaleniu plików R1 i R2 tworzony jest pojedynczy plik fasta dla każdej z bibliotek. 
		UWAGA: Ten krok i procesy opisane poniżej (o ile nie wskazano inaczej) są wykonywane w Mothur w wersji 1.38.038.</li>
		<li>Prześwietl każdy plik fasta, aby usunąć niejednoznaczne zasady, nieoczekiwanie długie sekwencje i długie homopolimery. 
		UWAGA: Parametry badania przesiewowego i usuwania sekwencji to maxambig = 0, maxlength = 600 i maxhomop = 8 dla obu genów. Usuń identyczne sekwencje, ale zachowaj tabelę kontyngencji oddzielnie dla wszystkich bibliotek (tzw. tabela zliczania w Mothur).</li>
		<li>Dopasuj unikalne sekwencje biblioteki genów 16S do bazy danych SILVA w wersji 123, a biblioteki ITS genów do bazy danych UNITE ITS42. 
		UWAGA: Sekwencje muszą być opatrzone adnotacjami od poziomu królestwa do poziomu rodzaju.
		<ol>
			<li>Następnie grupuj sekwencje wyrównane z funkcją pre.cluster za pomocą diff=5 i usuń chimery.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Klasyfikuj sekwencje za pomocą metody Wang43 na podstawie plików taksonomii SILVA (dla genu 16S) i UNITE ITS (dla genu ITS) (wartość odcięcia 80%).</li>
		<li>Załaduj do R44 tabele kontyngencji (po jednej na gen) wygenerowane podczas procesu klasyfikacji w Mothur. Na każdym poziomie taksonomicznym uzyskaj względną obfitość na bibliotekę w celu dalszej analizy zmian w zbiorowisku drobnoustrojów. 
		UWAGA: Na każdym poziomie taksonomicznym należy połączyć grupy taksonomiczne, gdy względna liczebność jest mniejsza niż 2% dla wszystkich powtórzeń eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania nad wpływem fungicydów na zdrowie pszczół pozostają niedostatecznie zbadanym aspektem strategii ochrony przed szkodnikami. Nasze badanie ma na celu wypełnienie tej luki w wiedzy poprzez zastosowanie zestawu uzupełniających się technik, które wyraźnie izolują potencjalne czynniki powodujące spadek liczebności pszczół. Planowanie, uzasadnienie i renderowanie tych eksperymentów są szczegółowo opisane poniżej.
Ważne jest, aby zapewnić, że żadne pszczoły nie będą mogły uciec z siatki doświa...

Gatunki dzikich pszczół zarządzanych i dzikich doświadczają powszechnego spadku, co ma poważne konsekwencje zarówno dla systemów naturalnych, jak i rolniczych1. Pomimo wspólnych wysiłków zmierzających do zrozumienia przyczyn tego problemu, czynniki powodujące spadek liczebności pszczół miodnych nadal nie są dobrze poznane2,3,4. W przypadku niektórych gatunków dzikich, rodzimych pszczół sytuacja stała się tragiczna5,6. Jeśli populacje pszczół nie mogą być utrzymane, gdy krzyżują się z rolnictwem przemysłowym, ich populacje będą nadal spadać, a uprawy wymagające zapylaczy (35% światowej produkcji7) będą miały zmniejszone zbiory.
Chociaż wiele potencjalnych czynników, takich jak narażenie na pestycydy, choroby i utrata siedlisk1,4,8,9,10 było związanych z wyginięciem pszczół miodnych, stosunkowo niewiele wiadomo na temat interaktywnego wpływu tych czynników stresogennych na zdrowie rodzimych pszczół, w systemach rolniczych lub w ich pobliżu. Wiele obecnych wysiłków badawczych nadal koncentruje się na insektycydach (np. neonikotynoidy11,12), chociaż wcześniejsze badania wskazują, że fungicydy mogą również odgrywać rolę w spadku liczebności pszczół poprzez upośledzenie tworzenia pamięci, odbioru węchowego13, nest recognition14, aktywność enzymów i funkcje metaboliczne15,16,17. Na całym świecie fungicydy są nadal stosowane do roślin kwitnących podczas kwitnienia. Ostatnie badania udokumentowały, że pszczoły często przynoszą pozostałości fungicydów z powrotem do ula18, rzeczywiście, badania wykazały, że duża część testowanych uli zawierała pozostałości fungicydów19,20. Dalsze prace wykazały, że pozostałości fungicydów są związane z wysokimi wskaźnikami śmiertelności larw pszczół miodnych21,22,23 oraz obecność "pogrzebanego pyłku" w koloniach, który choć nietoksyczny, jest pozbawiony aktywności mikrobiologicznej i jest upośledzony pod względem odżywczym24. Pomimo faktu, że fungicydy od dawna są uważane za "bezpieczne dla pszczół", obecnie istnieją dowody na to, że narażenie na sam fungicyd może spowodować poważne straty w koloniach u rodzimego gatunku trzmieli, Bombus impatiens25.
Aby ustalić związek przyczynowo-skutkowy między ekspozycją na fungicydy a śmiertelnością kolonii, należy określić sposób działania tych chemikaliów. Jak wykazano w soils26, sediments27 i środowiskach wodnych28, atakując grzyby, fungicydy najprawdopodobniej zmieniają obfitość i różnorodność grzybów w obrębie zasobów pyłkowych, wywołując w ten sposób poważną zmianę społeczności, która może zdecydowanie faworyzować bakterie. Bez konkurentów lub antagonistów grzybów, niektóre bakterie chorobotwórcze mogą namnażać się stosunkowo niekontrolnie, ułatwiając psucie się zapasów pyłku. Wcześniejsze badania wykazały, że mikroorganizmy, w szczególności drożdże i grzyby strzępkowe, służą jako symbionty odżywcze dla pszczół29,30,31, chronią przed pasożytami i patogenami32,33 i zapewniają długoterminową ochronę magazynów pyłku. Fungicydy mogą zatem pośrednio szkodzić niedojrzałym pszczołom, zaburzając zbiorowość drobnoustrojów, która jest potrzebna do świadczenia tych usług i/lub zwiększając podatność na oportunistyczne patogeny i pasożyty12. Wraz z rosnącym zapotrzebowaniem na produkcję żywności, uprawy na całym świecie są co roku opryskiwane fungicydami w okresie kwitnienia, co podkreśla potrzebę zrozumienia skali takich skutków wywołanych fungicydami.
Do tej pory, podstawowe luki w wiedzy dotyczące rodzimej ekologii mikrobiologicznej pszczół można przedstawić za pomocą następujących pytań: W jakim stopniu fungicyd zmienia społeczność mikrobiologiczną w zakresie zaopatrzenia w pyłek pszczeli? Jakie są dalsze skutki spożywania pyłku w przypadku głęboko zmienionej społeczności mikrobiologicznej? Zgodnie z tymi ekologicznie niemieckimi pytaniami, opracowano eksperymenty, których głównym celem było ujawnienie: 1) że same pozostałości fungicydów mogą powodować poważny spadek liczby kolonii u rodzimych gatunków pszczół; 2) stopień, w jakim zbiorowiska mikrobiologiczne w zaopatrzeniu w pyłek są zmieniane przez fungicydy, oraz 3) jak na zdrowie pszczół wpływa poważnie zmieniona społeczność mikrobiologiczna. Cele eksperymentu zostały zdefiniowane w celu odpowiedzi na powyższe pytania przy użyciu kombinacji eksperymentów laboratoryjnych i terenowych. Wykorzystując najnowocześniejsze techniki metagenomiczne i molekularne wraz z tradycyjnymi metodami obserwacji terenowej, badania te mają na celu zebranie w całość potencjalnego wpływu fungicydów na zdrowie pszczół.
Pierwszym celem tego badania jest wykazanie, że samo narażenie na fungicydy może spowodować znaczne straty w koloniach wśród rodzimych gatunków pszczół. Badanie z udziałem dużych klatek polowych wykorzystano do zbadania wpływu ekspozycji na fungicydy na wzrost kolonii Bombus impatiens, wszechobecnej, licznie występującej rodzimej pszczoły w USA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Postawiono hipotezę, że ule traktowane fungicydami będą charakteryzować się niższą przydatnością i nietypową demografią w porównaniu z ulami nienarażonymi. Dane uzyskane w tym eksperymencie potwierdziły tę hipotezę, wykazując, że pozostałości fungicydów w pyłku mogą być jedyną przyczyną głębokich strat kolonii u rodzimych gatunków trzmieli25. Drugim celem tego badania jest zbadanie odpowiedzi mikrobiomu pyłkowego na ekspozycję na fungicydy. Przypuszcza się, że skład zbiorowisk drobnoustrojów w obrębie pyłków narażonych na działanie fungicydów będzie inny niż w pyłku nieleczonym. Chociaż oczekuje się, że liczebność i różnorodność grzybów znacznie spadnie, bakterie i/lub pojedynczy dominujący gatunek grzybów prawdopodobnie będą rosły w sposób niekontrolowany pod nieobecność innych konkurencyjnych grzybów. Dzięki serii badań in vivo te zmiany w składzie społeczności drobnoustrojów zostaną przeanalizowane za pomocą metagenomiki.

<table><tbody><tr><td>Ul Natupol</td><td>Koppert</td><td>USRESM1</td><td>16 uli</td></tr><tr><td>Propikonazol 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propikonazol 14.3%</td></tr><tr><td>Obfitość</td><td>Syngenta</td><td>4033540</td><td>Azoksystrobina 22.9%</td></tr><tr><td>Chlorotalonil</td><td>Syngenta</td><td>3452</td><td>Fungicyd stosowany do prób</td></tr><tr><td>Granulki pyłku</td><td>Pszczoła uratowana</td><td>B004D5650C</td><td>3X 16oz Butelki z pyłkiem do prób</td></tr><tr><td>Szczepy bakteryjne do inokulacji</td><td>Currie Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczepy drożdży do inokulacji</td><td>Hittinger lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pary starterów</td><td>Centrum</td><td></td><td></td>Biotechnologiczne UW</tr><tr><td>Zestaw do izolacji DNA</td><td>Mo Bio</td><td>12830-50</td><td>Komercyjny zestaw do izolacji DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td>DNA Narzędzie do oznaczania ilościowego</td></tr><tr><td>Select Master Mix dla CFX</td><td>Thermo Fisher</td><td>4472952</td><td>Służy do wykonywania PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu barwnika SYBR GreenER.</td></tr><tr><td>System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym Bio</td><td>Rad</td><td>1855196</td><td>Przyrząd używany do amplifikacji</td></tr><tr><td>PCR Zestaw do czyszczenia PCR,</td> <td>Axygen</td><td>10159-696</td><td>Służy do skutecznego usuwania nieinkorporowanych dNTP, soli i enzymów</td></tr><tr><td>Zestaw DNA 1000</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Używany do wymiarowania i analizy fragmentów DNA</td></tr><tr><td>MiSeq Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td>Używany dla nowej generacji sekwencjonowanie</td></tr><tr><td>Asortyment wyrobów szklanych (zlewki, kolby, pipety, probówki, wypychacze)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Hodowcy często używają oprysków fungicydami podczas kwitnienia, aby chronić uprawy przed chorobami, które narażają pszczoły na pozostałości fungicydów. Chociaż uważa się, że jest to "bezpieczne dla pszczół", istnieje coraz więcej dowodów na to, że pozostałości fungicydów w pyłku są związane ze spadkiem liczebności pszczół (zarówno w przypadku gatunków pszczół miodnych, jak i trzmieli). Chociaż mechanizmy pozostają stosunkowo nieznane, naukowcy spekulują, że w grę wchodzą symbiozy pszczół i mikroorganizmów. Drobnoustroje odgrywają kluczową rolę w konserwacji i/lub przetwarzaniu pyłku, który służy jako pożywienie dla larw pszczół. Zmieniając społeczność mikrobiologiczną, prawdopodobne jest, że fungicydy zakłócają te usługi, w których pośredniczą drobnoustroje, a tym samym zagrażają zdrowiu pszczół. Niniejszy manuskrypt opisuje protokoły stosowane do badania pośrednich mechanizmów, za pomocą których fungicydy mogą powodować spadek liczebności kolonii. Eksperymenty z klatkami, w których pszczoły miały kontakt z kwiatami poddanymi działaniu fungicydów, dostarczyły już pierwszych dowodów na to, że fungicydy powodują głębokie straty w koloniach trzmieli (Bombus impatiens). Wykorzystując dawki fungicydów odpowiednie dla pola polowego, opracowano serię eksperymentów, aby zapewnić dokładniejszy opis dynamiki społeczności mikrobiologicznej pyłku narażonego na działanie fungicydów. Zmiany w składzie strukturalnym zbiorowisk grzybów i bakterii w obrębie mikrobiomu pyłku są badane za pomocą sekwencjonowania nowej generacji i analizy metagenomicznej. Eksperymenty opracowane w tym artykule zostały zaprojektowane w celu zapewnienia mechanistycznego zrozumienia, w jaki sposób fungicydy wpływają na mikrobiom zaopatrzenia w pyłek. Ostatecznie odkrycia te powinny rzucić światło na pośrednią ścieżkę, przez którą fungicydy mogą powodować spadek liczebności kolonii.

Badanie w klatkach polowych:
Dane uzyskane z eksperymentów w klatkach wykazały, że kolonie trutni wykazały istotną reakcję na ekspozycję na fungicyd. Ule traktowane fungicydem wyprodukowały znacznie mniej robotnic (12,2 ± 3,8, średnia ± SE) niż ule kontrolne (43,2 ± 11,2, F1,9= 6,8, p = 0,03) (Rysunek 4). Ponadto biomasa pszczół w ulach traktowanych fungicydem (0,9...

Konsorcja mikrobiologiczne w ulach trzmieli wzbogacają i zachowują pyłek dla larw pszczół. Wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji, wraz z eksperymentami laboratoryjnymi i terenowymi, manuskrypt ten opisuje protokoły stosowane do testowania hipotezy, że pozostałości fungicydów zmieniają mikrobiom pyłku i demografię kolonii, ostatecznie prowadząc do utraty kolonii.

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Ogólnym celem tego multidyscyplinarnego projektu jest wyizolowanie konkretnych mechanizmów, za pomocą których pozostałości fungicydów na pyłku mogą powodować spadek liczebności kolonii trzmieli. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące wysokiej śmiertelności larw trzmieli, na które wpływ ma zakłócenie symbiozy drobnoustrojów pszczelich za pośrednictwem fungicydów. Główną zaletą tej techniki jest to, że bada ona pośredni wpływ fungicydów na pszczoły poprzez śledzenie danych demograficznych pszczół wraz ze zmianami w zbiorowiskach drobnoustrojów w pyłku pszczelim.Chociaż metody te zapewniają wgląd w rodzime zdrowie pszczół, można je również zastosować do innych zapylaczy, takich jak pszczoły miodne, które odgrywają kluczową rolę w zapylaniu upraw na całym świecie, podkreślając w ten sposób mądre stosowanie fungicydów w uprawach kwitnących. Procedury w tym wspólnym badaniu zademonstrują Prarthana Dharampal, Luis Diaz-Garcia i Caitlin Carlson. Na początek ustaw klatki siatkowe na polu obsadzonym owsem.Przygotuj po jednym na replikę. Zaplanuj wykonanie co najmniej 10 w jednym eksperymencie terapeutycznym. Najpierw wykop rów wokół każdej klatki i wkop wszystkie cztery krawędzie klatki siatkowej w ziemię, aby upewnić się, że pszczoły nie mogą uciec.Następnie zaopatrz klatki w doniczkowe rośliny kwitnące, o których wiadomo, że są atrakcyjne dla pszczół, takie jak gryka, ogórecznik, alyssum, kosmos i słoneczniki. Uzupełnij również każdą klatkę pojedynczą tacą kwitnącej koniczyny. Zgrupuj wszystkie zasoby kwiatowe w jednym rogu klatki, zajmującej około 2,5 metra kwadratowego.Pozostałą powierzchnię klatki wegetować owsem. Przed załadowaniem rodzin do klatek polowych upewnij się, że w każdej z nich znajdują się robotnice i jedna królowa. Następnie załaduj jedną kolonię na klatkę przez okres 29 dni.W klatce ustaw skrzynki kolonijne tak, aby otwory kolonii były skierowane na południe, aby zapewnić pszczołom optymalne warunki nawigacyjne. Następnie zastosuj eksperymentalne leczenie do połowy klatek. W takim przypadku należy użyć ręcznego opryskiwacza do pestycydów, aby zastosować fungicyd na bazie chlorotalonilu na poziomie odpowiednim dla pola na rośliny kwitnące.Zabieg ten stosuje się w dniu zero i ponownie w dniu 13. Pokryj kwiaty równomiernie, tak aby żaden dodatkowy płyn nie przylegał do powierzchni kwiatowych. Pod koniec okresu badania wyjmij kolonie z klatek i znieczul pszczoły, umieszczając je w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 20 minut.Po znieczuleniu usuń pszczoły za pomocą sterylnych kleszczy i zapisz liczbę larw, poczwarek, dorosłych samic i dorosłych samców oraz matki królowej. Następnie użyj wagi analitycznej i zapisz suchą masę matki królowej i innych klas pszczół. Na początek sproszkowaj zakupiony w handlu pyłek na drobny proszek za pomocą standardowego laboratoryjnego młyna kulowego.Następnie, aby wysterylizować sproszkowany pyłek, namocz go w 70 procentach etanolu. Pozostaw etanol do odparowania przez noc w świetle UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnego dnia sprawdź sterylność pyłku, posiewając niewielką ilość na podłożu agarowym ogólnego przeznaczenia za pomocą sterylnej wykałaczki.Inkubuj płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 48 godzin i używaj jej tylko wtedy, gdy nie ma wzrostu. Następnie, za pomocą sterylnych pipet, dodaj odpowiednią do pola dawkę fungicydu do wysterylizowanego pyłku i dokładnie wymieszaj je ze sobą za pomocą sterylnych drewnianych patyczków. Do kontroli używaj sterylnej wody.Teraz przygotuj ule do eksperymentu w próbkach o wielkości co najmniej trzech. Codziennie należy przygotowywać porcje pyłku dla każdego ula. Następnie przez klapę w skrzynce otaczającej każdy ul wprowadź pyłek.Oprócz pyłku, co tydzień dostarczaj każdemu ulowi wysterylizowany roztwór cukru. Wykonuj ten reżim karmienia przez cztery tygodnie. Tak jak poprzednio, znieczulenie pokrzywki należy przeprowadzić pod koniec okresu testowego.Następnie bardzo delikatnie podważ i ekshumuj zawartość legowiska, nie pozwalając pyłkowi lub larwom pszczół na głębsze opadnięcie w głąb gniazda. Wykonaj te same pomiary liczenia i ważenia dla ula, co poprzednio, ale także zeskrob zapasy pyłku zawarte w komorach czerwiowych za pomocą wysterylizowanych kleszczy. Zbierz pyłek w sterylnych probówkach, a następnie przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszej analizy.Dane uzyskane z eksperymentów klatkowych wykazały, że kolonie trzmieli miały znaczącą reakcję na ekspozycję na fungicydy. Ule traktowane fungicydami wytwarzały znacznie mniej robotnic niż ule kontrolne. Ogólna biomasa została również zmniejszona w ulach traktowanych fungicydami, w tym w masie Matki Królowej.Wówczas liczba i masa larw, poczwarek i dorosłych samców nie uległa zmianie. Eksperymenty laboratoryjne odzwierciedlały wyniki uzyskane w terenie. Podsumowując, wyniki te są zgodne z wcześniej opublikowanymi wynikami i wskazują, że ekspozycja na fungicydy wpływa na kondycję kolonii.Z naszych danych wynika, że różnorodność i równomierność mikroorganizmów była zmniejszona w ulach traktowanych fungicydami. Analiza metagenomiczna zapasów pyłku została wykorzystana do analizy zmian w zbiorowiskach mikrobiologicznych uli traktowanych fungicydami. Nastąpił ogromny spadek liczebności powszechnie izolowanych Streptomycetales i Enterobacteriales w ulach traktowanych fungicydami, podczas gdy bakteryjni członkowie rzędu Rickettsiales, który obejmuje powszechne patogeny stawonogów, występowali w znacznie większej obfitości w ulach traktowanych fungicydami.Ule traktowane fungicydami miały również mniejszą liczebność grzybów należących do rzędów Eurotiales, Sordariales i Saccharomycetales, podczas gdy faktycznie zwiększały obfitość grzybów w rzędach Capnodiales i Ascosphaerales. Wyniki te wskazują, że fungicydy mogą zmieniać mikrobiom zapasów pyłku, skutecznie zakłócając symbiozę drobnoustrojów pszczelich i zagrażając zdrowiu pszczół. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować trzmiele w terenie, preparować gniazda pszczół i identyfikować zbiorowiska mikrobiologiczne w zaopatrzeniu w pyłek pszczeli, oceniając w ten sposób rolę fungicydów dla zdrowia rodzin pszczelich.Po opanowaniu techniki te można wykorzystać do wykazania zakłócenia mikrobiomu pyłku za pośrednictwem fungicydów i jego pośredniego wpływu na ogólny stan zdrowia kolonii trzmieli. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zachowaniu warunków aseptyki podczas przygotowywania posiłków pyłkowych, aby uniknąć infekcji i inwazji. Zgodnie z tą procedurą, opis struktury zbiorowisk drobnoustrojów może być jeszcze bardziej ulepszony poprzez złagodzenie ułamka całkowitych różnic między sekwencjami i zmniejszenie liczby taksonów poprzez połączenie tych o niskiej względnej liczebności.

empirical-metagenomic-computational-techniques-illuminate-mechanisms

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten manuskrypt opisuje kilka protokołów podawania środków farmakologicznych pszczołom miodnym, w tym proste nieinwazyjne metody dla pszczół swobodnie latających, a także bardziej inwazyjne warianty, które pozwalają na precyzyjne, miejscowe leczenie krępowanych pszczół.

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

Niniejszym przedstawiamy metodę karmienia skażoną pestycydami żywnością zarówno pojedynczej pszczoły miodnej, jak i kolonii ula. Procedura ocenia wpływ pestycydów na poszczególne pszczoły miodne poprzez dokarmianie in vivo podstawową dietą larw, a także na naturalny stan rodziny pszczelej.

Ocena wpływu chemikaliów środowiskowych na rozwój pszczół miodnych od poziomu osobnika do poziomu kolonii

Utrata kolonii pszczół miodnych stanowi wyzwanie dla służb zajmujących się zapylaniem upraw. Obecne praktyki ochrony owadów zapylających uzasadniają alternatywne podejście do minimalizacji kontaktu pszczół miodnych ze szkodliwymi pestycydami przy użyciu odstraszających środków chemicznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody protokołu śledzenia wizualnego w celu odstraszania pszczół.

Protokół śledzenia wideo w celu przesiewania środków chemicznych odstraszających pszczoły miodne

Subletalne dawki pestycydów mogą wpływać na kolonie w sposób, który jest trudny do wykrycia przy użyciu tylko metod okresowych lub wizualnych. Podano metody pomiaru całkowitej masy dorosłych pszczół, czerwiu i zasobów pokarmowych poprzez ważenie uli i części ula, fotografowanie ramek i instalowanie czujników. Poruszana jest również kwestia analizy danych.

Monitorowanie wpływu narażenia na subletalne pestycydy na pszczoły miodne na poziomie kolonii

Spraye fungicydowe na kwitnące rośliny mogą narażać samotne pszczoły na wysokie stężenia pozostałości fungicydów przenoszonych przez pyłki. Wykorzystując eksperymenty laboratoryjne z udziałem larw pszczół hodowanych in vitro, badanie to bada interaktywne efekty spożywania pyłku poddanego działaniu fungicydów pochodzącego z roślin żywicielskich i niebędących żywicielami.

In vitro Hodowla pszczół samotnic: narzędzie do oceny czynników ryzyka larw

Ten protokół został opracowany w celu lepszego zrozumienia, jak agrochemikalia wpływają na reprodukcję pszczół miodnych (Apis mellifera), poprzez ustanowienie metod wystawiania królowych pszczół miodnych i ich opiekunów na działanie agrochemikaliów w kontrolowanych, laboratoryjnych warunkach i uważne monitorowanie ich odpowiednich reakcji.

Ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych

Obecny protokół wyjaśnia metodę karmienia larwami samotnicy, pszczoły samotnicy, Osmia excavata, skażonymi pestycydami. W ramach procedury bada się ekotoksyczność pestycydu dla larw pszczół samotnic.

Ocena wpływu pestycydów na larwy pszczół samotnic

Produkty na bazie glifosatu (GBP) są najpopularniejszymi herbicydami o szerokim spektrum działania na świecie. W tym artykule przedstawiamy ogólne wytyczne dotyczące ilościowego określania wpływu GBP na mikrobiomy, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne.

Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy

Pokazujemy sprawdzoną metodę bezpiecznego obchodzenia się z pszczołami zebranymi na polu. Metoda ta umożliwia szybką manipulację, identyfikację, pobieranie próbek genetycznych i potwierdzanie interakcji między roślinami a owadami za pomocą pyłku pobranego podczas pobierania próbek. Podejście to, łatwe do adaptacji, oferuje opłacalny, nieśmiercionośny sposób badania rzadkich grup owadów.

Szybka metoda ograniczania i bezpiecznego obchodzenia się z pszczołami w terenie

Tutaj opisujemy prostą i szybką procedurę wykrywania DNA z patogenów pszczół, takich jak Lotmaria passim i Nosema ceranae, przy użyciu lizy komórek gotowej do amplifikacji, amplifikacji polimerazy rekombinazy i testów CRISPR/Cas12a.

Wykrywanie DNA pasożytów trypanosomatydów i Nosema ceranae na miejscu poprzez alkaliczną lizę sprzężoną z systemem RPA/CRISPR/Cas12a

Odkryj mechanizmy wpływu fungicydów na zdrowie pszczół poprzez badanie zmian w mikrobiomie pyłku i demografii kolonii trzmieli. Ta metoda łączy eksperymenty polowe z analizą sekwencjonowania.

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół (Wideo) | JoVE Journal

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

Przeglądaj więcej filmów