Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ocena i ilościowe określenie oddziaływania między dwoma badanymi białkami przy użyciu anizotropii fluorescencji. Pomiary te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii i biofizyki białek, na przykład dotyczące białek, których oddziaływania są istotne dla funkcji komórkowych.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania ilościowych i jakościowych informacji na temat oddziaływań białko-białko. Aby przygotować oczyszczone białko SBDS-FlAsH, należy najpierw przygotować jeden litr płynnej pożywki LB uzupełnionej o 100 µg/mL ampicyliny. Następnie w pożywce tej należy hodować transformowane bakterie w temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 0,5 do 0,7.

Indukować ekspresję białka SBDS-FlAsH poprzez dodanie 0,5 mM IPTG do hodowli i kontynuować inkubację przez kolejne pięć godzin. Następnie zebrać zawiesinę bakteryjną poprzez wirowanie przy 3800 ×g przez dziesięć minut w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz.

Ponownie zawiesić komórki w 35 ml buforu lizującego SBDS uzupełnionego o 1 mM PMSF. Przeprowadzić lizę metodą sonikacji przez łącznie cztery minuty, stosując cykle 10 sekund pracy i 30 sekund przerwy w temperaturze 4 °C. Następnie odwirować próbkę z prędkością 9 000 ×g przez 50 minut w temperaturze 4 °C.

Należy zachować nadsącz i odrzucić osad w celu usunięcia debris komórkowych. Po równoważeniu kolumny powinowactwa niklowego trzema objętościami kolumny buforu lizującego SBDS, należy nałożyć cały klarowny nadsącz na kolumnę. Białko niezdziązane należy usunąć poprzez przemycie kolumny trzema objętościami buforu lizującego SBDS.

Po przemyciu kolumny eluj związane białko za pomocą trzech objętości kolumny buforu elucyjnego SBDS. Aby dodatkowo oczyścić białko, zrównoważ kolumnę z kationowym wymieniaczem sulfopropylowym za pomocą trzech objętości kolumny buforu kolumnowego S o niskim zasoleniu. Rozcieńcz białko sześciokrotnie w 50 millimolar buforze fosforanowym pH 6.5 i wprowadź je na kolumnę.

Nieprzypisanym materiałem wypłukać przy użyciu trzech objętości kolumny buforu S o niskim zasoleniu (Low salt S column buffer). Następnie eluirować białko w jednym kroku, dodając na kolumnę 50 mM bufor fosforanowy pH 6,5 z 1 M chlorkiem sodu. Eluat rozcieńczyć trzykrotnie buforem fosforanowym 50 mM pH 6,5.

Następnie zagęszcz białko za pomocą urządzeń do ultrafiltracji poprzez wirowanie przy 3800 ×g przez piętnaście minut. Jakość białek stosowanych w tego typu eksperymentach ma kluczowe znaczenie. Interpretacja danych staje się skomplikowana, jeśli użyte próbki białek nie charakteryzują się wysoką czystością.

Zweryfikuj czystość białka SBDS-FlAsH za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie. Zamroź białko gwałtownie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu dalszego użycia. Aby przygotować oczyszczone białko EFL1, najpierw hoduj transformowane drożdże w temperaturze 30 °C w jednym litrze syntetycznego medium drop-out bez uracylu, uzupełnionego o 0,5% glukozy, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 1,8.

Indukuj ekspresję białka, dodając 2,8% galaktozy do hodowli, a następnie kontynuuj inkubację przez 18 godzin w temperaturze 30 °C. Zbierz zawiesinę drożdży poprzez wirowanie przy 3800 ×g przez dziesięć minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu usuń nadosad.

Resuspender komórki w 50 mililitrach buforu do lizy EFL1 uzupełnionego o 1 mM PMSF i 1 mM benzamidyny. Rozbić komórki metodą tarcia w homogenizatorze kuleczkowym (bead-beater) przy użyciu szklanych kuleczek przez łącznie sześć minut, stosując cykle: dwie minuty pracy i piętnaście minut przerwy w temperaturze 4 °C. Następnie odwirować próbkę z prędkością 9 000 ×g przez 50 minut w temperaturze 4 °C.

Zachowaj nadsącz, a osad odrzuć, aby usunąć szczątki komórkowe. Następnie zrównoważ kolumnę powinowactwa niklowego, przepuszczając przez nią trzy objętości kolumny buforu do lizy EFL1. Nanieś cały klarowny nadsącz na zrównoważoną kolumnę.

Po usunięciu nieprzypisanego białka poprzez przemycie kolumny trzykrotnością jej objętości buforem do lizy EFL1, eluj związane białko trzykrotnością objętości kolumny buforem do elucji EFL1. Aby dalej oczyścić białko EFL1, zrównoważ kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczkowego 1,5-krotnością objętości kolumny buforem do anizotropii. Skoncentruj białko EFL1 eluowane z kolumny powinowactwa niklowego do objętości jednego mililitra za pomocą urządzeń do ultrafiltracji poprzez wirowanie przy 3800 ×g. Następnie wprowadź skoncentrowaną próbkę na kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczkowego.

Zebrać eluowane białko i zagęścić metodą ultrafiltracji do stężenia końcowego wynoszącego około 30 micromolar. Zweryfikować czystość białka EFL1 za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie. Białko zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsius do czasu dalszego użycia.

Wymieszać 3 nanomoli białka SBDS-FlAsH z 3 nanomolami barwnika lumio green w 5 µL buforu do anizotropii. Inkubować mieszaninę przez 8 godzin w temperaturze 4 °C. Po 8 godzinach dializować próbkę przeciwko buforowi do anizotropii przez noc w celu usunięcia wolnego barwnika.

Zmierz absorbancję przy 280 nanometrach i 508 nanometrach w spektrofotometrze, używając kuwety kwarcowej. Następnie, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wykorzystaj prawo Lamberta-Beera do określenia procentowej zawartości znakowanego białka. Przed pomiarem wartości anizotropii każdy etap filtrowania frakcji białkowej należy przeprowadzić starannie, upewniając się, że cała próbka została przeniesiona do roztworu i stała się jednorodna.

Do kuwety fluorescencyjnej należy wprowadzić 200 µL 30 nM SBDS-FlAsH w buforze do anizotropii, a następnie miareczkować 2 µL 30 µM EFL1. Po dokładnym wymieszaniu odstawić reakcję na trzy minuty przed pomiarem wartości anizotropii i fluorescencji. Powtarzać ten proces do momentu dodania łącznej objętości 40 µL EFL1.

W ostatnim kroku dopasuj dane do przyjętego modelu wiązania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić dowolny eksperyment z anizotropią, ważne jest wykluczenie znaczących zmian w intensywności fluorescencji. Jak pokazano tutaj, fluorescencja SBDS-FlAsH nie zmienia się zauważalnie po związaniu z EFL1.

Miareczkowanie białka EFL1 w kuwecie kwarcowej zawierającej SBDS-FlAsH prowadzi do zwiększenia początkowej obserwowanej anizotropii. Kilkukrotne dodanie EFL1 pozwala wyznaczyć odpowiadającą temu krzywą wiązania, którą można dopasować do przyjętego modelu wiązania za pomocą nieliniowej regresji najmniejszych kwadratów. W tym przypadku model z jednym miejscem wiązania nie opisuje w sposób odpowiedni danych eksperymentalnych.

Zamiast tego, model dwóch nieidentycznych miejsc wiązania odpowiednio opisuje dane eksperymentalne. Po opanowaniu metody eksperyment wiązania z wykorzystaniem anizotropii fluorescencji można przeprowadzić w trzy godziny, pod warunkiem właściwego wykonania. Podczas próby zastosowania tej procedury ważne jest posiadanie oczyszczonego białka w dużych ilościach.

Równolegle z tą procedurą, w celu wsparcia odpowiedniego modelu wiązania, można przeprowadzić inne metody, takie jak wspomniany test komplementacji opartej na fragmentach lub anizotropia fluorescencji z wykorzystaniem różnych domen badanego białka. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić eksperyment wiązania, a następnie anizotropię fluorescencji.