Name: Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj anizotropię fluorescencyjną do badania oddziaływań białko-białko między białkami SBDS a EFL1. Technika ta dostarcza ilościowych i jakościowych danych kluczowych dla biochemii białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony projektów CONACyT numer 167359 i 177138, oraz z projektu DGAPA-UNAM numer IN201615.

1. Ekspresja i oczyszczanie białka z tagiem SBDS-FlAsH
UWAGA: Do eksperymentów z anizotropią, do końca C-końca sekwencji kodującej ludzkie białko SBDS za pomocą PCR dodano znacznik FlAsH odpowiadający sekwencji Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys. Konstrukt ten został podklonowany do wektora ekspresyjnego pRSET-A i przetransformowany do komórek Escherichia coli C41 w celu ekspresji białka zawierającego N-końcowy znacznik heksahistydynowy (His-tag), sekwencję kodującą ludzkie białko SBDS oraz znacznik FlAsH na C-końcu 10.
<ol>
	<li>Ekspresja białka SBDS-FlAsH
	<ol>
		<li>Przekształć kompetentne komórki E. coli C41 plazmidem pRSET-HisSBDS-FlAsH, stosując standardowy protokół szoku termicznego 19. Wysiej komórki na stałą pożywkę Luria-Bertani (LB) uzupełnioną o 100 µg/ml ampicyliny. Skład stałej pożywki LB to 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g tryptonu i 20 g agaru na 1 L objętości.</li>
		<li>Hoduj przekształcone bakterie w temperaturze 37 °C do momentu, gdy absorbancja przy 600 nm (A600) osiągnie wartość 0,5-0,7, w 1 L płynnej pożywki LB uzupełnionej o 100 µg/ml ampicyliny.</li>
		<li>Indukuj ekspresję białka poprzez dodanie do hodowli 0,5 mM izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu i kontynuuj inkubację przez kolejne 5 hr.</li>
		<li>Zbierz zawiesinę bakteryjną poprzez wirowanie przy 3 800 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Usuń nadsącz. Na tym etapie przechowuj osad komórkowy w temperaturze -20 °C lub użyj go niezwłocznie do oczyszczania białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie białka SBDS-FlAsH 
	UWAGA: Wszystkie etapy chromatograficzne są wykonywane przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) lub pompy perystaltycznej. W chromatografii powinowactwa do Ni2+ zastosowano kolumnę fast flow o pojemności 5 ml. W chromatografii wymiany anionowej zastosowano kolumnę z silnym wymieniaczem kationowym sulfopropyl o pojemności 5 ml. Dla wszystkich etapów chromatograficznych zastosowano szybkość przepływu 3 ml/min.
	<ol>
		<li>Resuspenduj komórki w 35 ml buforu do lizy SBDS (bufor fosforanowy 50 mM pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol) uzupełnionego o 1 mM fluorarczek fenylometylosulfonylowy (PMSF) i poddaj lizie przez sonikację przez łączny czas 4 min, stosując cykle 10 s włączony / 30 s wyłączony, w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wirowuj próbkę przy 9 000 x g przez 50 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zatrzymaj nadsącz i odrzuć osad, aby usunąć resztki komórkowe.</li>
		<li>Równoważ kolumnę powinowactwa do Ni2+ za pomocą 3 objętości kolumny (CV) buforu do lizy SBDS, a następnie wprowadź cały oczyszczony nadsącz na kolumnę.</li>
		<li>Usuń nieprzypisane białka, płucząc kolumnę 3 CV buforu do lizy SBDS, a następnie eluuj 3 CV buforu do elucji SBDS (bufor fosforanowy 50 mM pH 7,5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol).</li>
		<li>Rozcieńcz eluowane białko 6-krotnie buforem fosforanowym 50 mM pH 6,5 i usuń ewentualne agregaty poprzez filtrację przez membranę celulozową 0,22 µm.</li>
		<li>Równoważ kolumnę z wymieniaczem kationowym sulfopropyl za pomocą 3 CV buforu kolumnowego Low salt S (bufor fosforanowy 50 mM pH 6,5, 50 mM NaCl) i wprowadź próbkę białka z poprzedniego etapu.</li>
		<li>Wypłucz nieprzypisany materiał 3 CV buforu kolumnowego Low salt S i eluuj białko w jednym kroku, używając buforu fosforanowego 50 mM pH 6,5, 1 M NaCl.</li>
		<li>Rozcieńcz eluowane białko 3,3-krotnie buforem fosforanowym 50 mM pH 6,5. Zagęść białko za pomocą urządzeń do ultrafiltracji poprzez wirowanie przy 3 800 x g przez 15 min. Zamroź białko gwałtownie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
		<li>Zweryfikuj czystość białka za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie 20.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekspresja i oczyszczanie białka EFL1
UWAGA: EFL1 był wyrażany pod kontrolą dywergentnego promotora Gal 1/10 21 oraz 3'UTR Saccharomyces cerevisiae MATA w wektorze pRS426. Białko rekombinowane koduje ludzką izoformę 1 EFL1 połączoną z miejscem rozpoznawania proteazy wirusa trawienia tytoniu (TEV) oraz znacznikiem heksahistydynowym na C-końcu.
<ol>
	<li>Ekspresja białka EFL1
	<ol>
		<li>Przetransformuj komórki S. cerevisiae BCY123 plazmidem pRS426-EFL1TevHis, stosując standardowy protokół z octanem litu 22. Wszystkie przetransformowane komórki wysiej na syntetyczne podłoże selekcyjne bez uracylu (SD-URA) uzupełnione o 2% (w/v) glukozy. Skład podłoża SD-URA na 1 L objętości to: 8 g bazy azotowej dla drożdży bez aminokwasów, 11 g kwasów kasamino, 55 mg siarczanu adeniny, 55 mg tyrozyny, 60 mg leucyny i 60 mg tryptofanu.</li>
		<li>Hoduj przetransformowane drożdże w temperaturze 30 °C do momentu, aż A600 osiągnie wartość 1,8 w 1 L podłoża SD-URA uzupełnionego o 0,5% (w/v) glukozy.</li>
		<li>Indukuj ekspresję białka poprzez dodanie 2,8% (w/v) galaktozy do hodowli i kontynuuj inkubację przez kolejne 18 hr w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Zbierz zawiesinę drożdży przez wirowanie przy 3,800 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Usuń nadsącz. Na tym etapie przechowuj osad komórkowy w temperaturze -20 °C lub wykorzystaj go natychmiast do oczyszczania białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie białka EFL1 
	UWAGA: Wszystkie etapy chromatograficzne są wykonywane przy użyciu systemu FPLC lub pompy perystaltycznej. Chromatografia powinowactwa do Ni2+ wykorzystuje kolumnę fast flow o pojemności 5 ml przy szybkości przepływu 3 ml/min. Chromatografia wykluczania treści wykorzystuje kolumnę o pojemności 125 ml wypełnioną żywicą Superdex 200 przy szybkości przepływu 1 ml/min.
	<ol>
		<li>Resuspenduj komórki w 50 ml buforu do lizy EFL1 (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu, 5 mM MgCl2, 10% glicerolu) uzupełnionego o 1 mM PMSF i 1 mM benzamidyny, a następnie zniszcz komórki mechanicznie za pomocą homogenizatora kulowego z kulkami szklanymi (Ø = 0,5 mm) przez łączny czas 6 min, stosując cykle: 2 min pracy i 15 min przerwy, w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wirowuj próbkę przy 9,000 x g przez 50 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zabierz nadsącz i odrzuć osad, aby usunąć szczątki komórkowe.</li>
		<li>Urównoważ kolumnę powinowactwa Ni2+ za pomocą 3 CV buforu do lizy EFL1 i wprowadź cały klarowny nadsącz na kolumnę.</li>
		<li>Usuń nieprzypisane białka, przemywając kolumnę 3 CV buforu do lizy EFL1, a następnie eluuj 3 CV buforu do elucji EFL1 (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolu, 5 mM MgCl2, 10% glicerolu).</li>
		<li>Urównoważ kolumnę do wykluczania treści za pomocą 1,5 CV buforu do anizotropii (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% glicerolu, 5 mM β-merkaptoetanolu).</li>
		<li>Skoncentruj białko EFL1 eluowane z kolumny powinowactwa Ni2+ do objętości 1 ml za pomocą urządzeń do ultrafiltracji poprzez wirowanie przy 3,800 x g do pożądanej objętości. Wprowadź próbkę na kolumnę do wykluczania treści.</li>
		<li>Zbierz eluowane białko i skoncentruj je metodą ultrafiltracji do końcowego stężenia około 30 µM. Zamroź białko błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. Zweryfikuj czystość białka za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie 20.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Znakowanie SBDS-FlAsH fluorescencyjnym barwnikiem FlAsH 4',5'-bis(1,3,2-dytioarsolan-2-ylo)fluoresceiną
<ol>
	<li>Wymieszać 3 nmol białka SBDS-FlAsH z 3 nmol barwnika 4',5'-bis(1,3,2 ditiolarsolan-2-yl) fluoresceiny w 5 µl buforu do anizotropii.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 8 hr w temperaturze 4 °C. Próbkę dializować przeciwko buforowi do anizotropii przez noc w celu usunięcia wolnego barwnika.</li>
	<li>Wykorzystać prawo Lamberta-Beera do określenia procentowego stopnia znakowania białka. Zmierzyć absorbancję przy 280 nm i 508 nm za pomocą spektrofotometru, używając kwarcowej kuwety o odpowiedniej objętości. UWAGA: Należy przyjąć następujące molowe współczynniki absorpcji (M-1 cm-1): 
	<img alt="Współczynniki absorpcji w wzorach, kontekst spektroskopowy, badania optyczne, analiza barwników." src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation1B"></li>
	<li>Obliczyć stężenie znakowanego białka SBDS-FlAsH, korzystając z równania 2. 
	<img alt="Równanie absorbancji A₅₀₈=Cₛᵦdₛ₋fₗₐₛₕ·l·ε₅₀₈ dla stężenia barwnika, analiza spektroskopowa." src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation2"></li>
	<li>Obliczyć całkowite stężenie białka SBDS za pomocą równania 3, podstawiając obliczoną wartość CSBDS-FlAsH z poprzedniego kroku. 
	<img alt="Wzór równania spektroskopowego dla absorbancji kompleksu białko-barwnik, A=ε·c·l; materiały edukacyjne." src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation3"></li>
	<li>Obliczyć procentowy stopień znakowania białka, korzystając z równania 4. 
	<img alt="Wzór na procent znakowania, C_SBDS-FLASH przez C_SBDS, dla obliczeń analizy chemicznej, równanie 4." src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation4"></li>
</ol>
4. Eksperymenty z anizotropią fluorescencji
UWAGA: Eksperymenty dotyczące anizotropii przeprowadzono w spektrofluorometrze wyposażonym w zestaw do pomiarów polaryzacji, a gromadzenie danych odbyło się za pomocą programu do anizotropii dostarczonego w oprogramowaniu urządzenia. Długość fali wzbudzenia ustawiono na 494 nm przy szerokości pasma widmowego 8 nm, a emisję rejestrowano przy użyciu filtra pasmowo-przepustowego 530±25 nm. Pomiary wykonano w temperaturze 25 °C w kuwecie o objętości 200 µl i drodze optycznej 5 mm 10.
<ol>
	<li>Do kuwety fluorescencyjnej nalać 200 µl 30 nM SBDS-FlAsH w buforze do anizotropii i miareczkować 2 µl 30 µM EFL1. Dokładnie wymieszać i odstawić reakcję na 3 min przed pomiarem wartości anizotropii.</li>
	<li>Powtarzać krok 4.1 do momentu, aż zostanie dodana całkowita objętość 40 µl EFL1.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Dopasuj dane do odpowiedniego modelu wiązania, korzystając z algorytmu nieliniowej regresji najmniejszych kwadratów. Równania dla najczęściej stosowanych modeli wiązania przedstawiono w Tabeli 1.</li>
	<li>Oceń, który model najlepiej opisuje oddziaływanie między białkami, analizując residua dopasowania 23. Potwierdź wybrany model za pomocą dodatkowych eksperymentów.</li>
</ol>
Tabela 1. Typowe modele wiązania w oddziaływaniach białko-białko oraz równania matematyczne opisujące te procesy. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640table1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.</a> 
<img alt="Tabela równań równowagi wiązania; modele: 1 miejsce wiązania, 2 miejsca identyczne, 2 miejsca nieidentyczne." src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1">

<ol><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+of+protein-fragment+complementation+assays+for+studying+and+dissecting+large-scale+and+dynamic+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).</li>
<li>Snider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+protein+interaction+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of protein interaction network mapping.</a> Mol Syst Biol. 11 (12), 848(2015).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Structure+and+mechanism+in+protein+science%3A+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein+folding%22">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding</a>. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).</li>
<li>Menne, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shwachman-Bodian-Diamond+syndrome+protein+mediates+translational+activation+of+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast.</a> Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).</li>
<li>Boocock, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+SBDS+are+associated+with+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome.</a> Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).</li>
<li>Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Guanine+Nucleotide+Exchange+in+the+Elongation+Factor-like+1+%28EFL1%29+GTPase+by+Mutations+in+the+Shwachman-Diamond+Syndrome+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein.</a> J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).</li>
<li>Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanine+nucleotide+exchange+in+the+ribosomal+GTPase+EFL1+is+modulated+by+the+protein+mutated+in+the+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Third, Springer US. (2010).</li>
<li>Nishigaki, T., Treviño, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNishigaki%2C+T+%22Tools+to+understand+protein-protein+interactions%22">Tools to understand protein-protein interactions</a>. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).</li>
<li>Johnson, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+I+%22The+Molecular+Probes+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).</li>
<li>Sabnis, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabnis%2C+RW+%22Handbook+of+Fluorescent+Dyes+and+Probes%22">Handbook of Fluorescent Dyes and Probes</a>. , Wiley. (2015).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications.</a> J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li>
<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281 (5374), 269-272 (1998).</li>
<li>Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+labeling+of+proteins%3A+techniques+and+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches.</a> Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL1-GAL10+divergent+promoter+region+of+Saccharomyces+cerevisiae+contains+negative+control+elements+in+addition+to+functionally+separate+and+possibly+overlapping+upstream+activating+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences.</a> Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li>
<li>Eftink, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+methods+for+studying+equilibrium+macromolecule-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions.</a> Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Substrates+to+the+Central+Pore+of+the+Vps4+ATPase+Is+Autoinhibited+by+the+Microtubule+Interacting+and+Trafficking+%28MIT%29+Domain+and+Activated+by+MIT+Interacting+Motifs+%28MIMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs).</a> J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).</li>
<li>Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+natively+unfolded+HIF-1alpha+ODD+domain+to+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53.</a> Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).</li>
<li>Trusch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Region+of+the+Ubiquitin+Regulatory+X+%28UBX%29+Domain-containing+Protein+1+%28UBXD1%29+Modulates+Interdomain+Communication+within+the+Valosin-containing+Protein+p97%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97.</a> J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).</li>
<li>Kamp, F., Beyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+alpha-synuclein+affects+the+lipid+packing+in+bilayers+of+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemsitry%22%5BJournal%5D)">Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles.</a> The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).</li>
<li>Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Intensity%2C+Anisotropy%2C+and+Transient+Dynamic+Quenching+Stopped-Flow+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Spectroscopic+Methods+of+Analysis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics.</a> Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).</li>
<li>Asano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+EFL1+and+SBDS+is+mediated+by+an+intrinsically+disordered+insertion+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Większość eksperymentów biochemicznych z białkami wymaga nie tylko czystego białka, ale także jego dużych ilości, niezależnie od zastosowanej techniki. Z tego powodu białka wykorzystywane w tego typu badaniach pozyskuje się poprzez ekspresję heterologiczną, tak jak w przedstawionym tutaj przypadku. Spektroskopia fluorescencyjna wymaga obecności fluoroforu w badanej cząsteczce. Pozostałości aromatyczne stanowią wewnętrzne fluorofory białka, jednak wykorzystanie ich sygnału do badania oddziaływań białko-białko komplikuje a...

Komórki zawierają mnóstwo biomakrocząsteczek, które nieustannie ze sobą oddziałują. Powiązania te prowadzą do tworzenia kompleksów uczestniczących w szlakach komórkowych odpowiedzialnych m.in. za transdukcję sygnału, regulację ekspresji genów oraz migrację komórek. Wszystkie oddziaływania białko-białko zachodzące w komórce tworzą sieć zwaną interaktomem. Wykazano, że w Saccharomyces cerevisiae ponad 70% białek posiada partnerów interakcji 1. Zrozumienie interaktomu komórki i pełnionych przez niego funkcji dostarcza istotnych informacji o złożoności i różnorodności organizmów żywych. Opisano kilka metodologii służących do identyfikacji i charakterystyki oddziaływań białko-białko. Do identyfikacji interakcji 5,6 stosuje się różne metody wysokoprzepustowe, takie jak system dwuhybrydowy drożdży 2, testy komplementacji fragmentów białek 3, oczyszczanie powinowactwa 4 sprzężone ze spektrometrią mas oraz mikromacierze białkowe. Po zidentyfikowaniu interakcji konieczna jest jej walidacja, która może różnić się w zależności od przypadku. Zazwyczaj eksperymenty te polegają na zakłóceniu samej interakcji na poziomie poszczególnych członków pary oddziałującej, np. poprzez delecję genu lub nadekspresję jednego z białek, a następnie poszukiwaniu zmian we właściwościach lub funkcji drugiego członka na poziomie komórkowym. Następnie do charakterystyki oddziaływania białko-białko na poziomie molekularnym wykorzystuje się techniki biofizyczne 7. W tym celu strukturę kompleksów białkowych określa się za pomocą krystalografii rentgenowskiej, magnetycznego rezonansu jądrowego i kriomikroskopii elektronowej, podczas gdy kalorymetrii i spektroskopii fluorescencyjnej używa się do ich ilościowego i mechanistycznego opisu.
W niniejszej pracy zastosowano anizotropię fluorescencji jako technikę do charakterystyki oddziaływania między GTPazą EFL1 a białkiem SBDS. Białka te uczestniczą w syntezie rybosomów, promując uwalnianie eukariotycznego czynnika inicjacji 6 z powierzchni podjednostki rybosomalnej 60S 8. Białko SBDS ulega mutacji w jednostce chorobowej znanej jako zespół Shwachmana-Diamonda 9 i pełni funkcję czynnika wymiany nukleotydów guaninowych dla EFL1, zmniejszając jego powinowactwo do guanozynodifosforanu 10,11. Mutacje chorobowe w SBDS znoszą oddziaływanie z EFL1, a tym samym zapobiegają jego aktywacji.
Anizotropia fluorescencji jest powszechnie stosowana w aplikacjach biologicznych do badania oddziaływań białko-peptyd lub białko-kwas nukleinowy. Opiera się ona na zasadzie, zgodnie z którą fluorofor wzbudzony światłem spolaryzowanym emituje światło częściowo spolaryzowane. Anizotropia fluorescencji jest zdefiniowana zgodnie z Równaniem 1:
<img alt="równanie anizotropii, wzór do analizy orientacji molekularnej, równowaga statyczna" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation1">
gdzie IVV i IVH to intensywności fluorescencji emisji spolaryzowanej pionowo (VV) i poziomo (VH), gdy próbka jest wzbudzana światłem spolaryzowanym pionowo 12. Anizotropia fluorescencji jest wrażliwa na czynniki wpływające na szybkość dyfuzji rotacyjnej fluoroforu, a zatem zależy od temperatury, lepkości roztworu oraz pozornej wielkości cząsteczkowej fluoroforu. Pozorna wielkość białka zawierającego fluorofor zwiększa się, gdy oddziałuje ono z innym białkiem, a taką zmianę można następnie ocenić jako zmianę anizotropii. Bardziej szczegółowo, fluorofor, który rotuje w roztworze powoli w stosunku do czasu życia jego fluorescencji, będzie miał dużą wartość IVV i małą wartość IVH, a zatem wykaże stosunkowo dużą anizotropię. W przypadku fluoroforów, które rotują szybko w stosunku do czasu życia ich fluorescencji, wartości IVV i IVH będą zbliżone, a wartość ich anizotropii będzie mała 12 (Rysunek 1). Ponadto, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu pomiaru anizotropii, konieczne jest zastosowanie fluoroforu o czasie życia fluorescencji zbliżonym do czasu korelacji rotacyjnej badanej cząsteczki. W przeciwnym razie nie jest możliwe dokładne zarejestrowanie różnicy w anizotropii między wolnym białkiem a białkiem w kompleksie. Na przykład anizotropia sondy fluorescencyjnej o czasie życia bliskim 4 nsec, takiej jak fluoresceina lub rodamina przyłączona do związku o niskiej masie cząsteczkowej 100 Da, wynosi 0,05. Wiązanie z cząsteczką o masie 160 kDa zwiększy wartość jej anizotropii do 0,29; jest to różnica, którą można dokładnie zmierzyć. W przeciwieństwie do tego, ta sama sonda fluorescencyjna biorąca udział w reakcji wiązania, w której wzrost wielkości cząsteczkowej waha się od 65 do 1 000 kDa, spowoduje zmianę anizotropii jedynie z 0,28 do 0,3, co jest wartością zbyt małą, aby można ją było dokładnie zmierzyć. W takim scenariuszu bardziej odpowiednia byłaby sonda o czasie życia 400 nsec 12.
<img alt="Schemat polarymetry pokazujący światło wzbudzenia, monochromatory i detektor do analizy wielkości białek." src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczna reprezentacja aparatury wykorzystywanej do pomiaru anizotropii fluorescencji oraz opis procedury. Schematyczna reprezentacja aparatury wykorzystywanej do przeprowadzenia eksperymentu badającego oddziaływania białko-białko poprzez pomiar anizotropii fluorescencji. Fluorofory, które rotują szybko, wykazują niską anizotropię, która wzrasta po związaniu z partnerem interakcji. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Zastosowania fluorescencji wymagają obecności fluoroforu w którejkolwiek z badanych cząsteczek. Do badania oddziaływań białko-białko stosuje się trzy rodzaje fluoroforów: 1) reszty tryptofanu obecne w białkach, 2) fluorofory przyłączone chemicznie oraz 3) fluorescencyjne partnery fuzyjne, takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) i jego pochodne. Większość białek posiada w swojej strukturze reszty tryptofanu, zatem najprostszym sposobem pomiaru oddziaływania jest monitorowanie zmian w odpowiadających im widmach fluorescencji lub monitorowanie zmian natężenia fluorescencji reszt tryptofanu. Jednakże reszty tryptofanu mogą występować w obu białkach, co komplikuje analizę. Z drugiej strony, aby fluorofor zmienił swoje właściwości fluorescencyjne w wyniku oddziaływania, musi znajdować się na miejscu wiązania lub w jego pobliżu, co może zakłócać samo oddziaływanie. Wymaga to szczególnej uwagi przy stosowaniu rozbudowanych fluoroforów, takich jak GFP. Jeśli żadnego z tych fluoroforów nie można wykorzystać do badań wiązania, konieczne jest wprowadzenie fluoroforów zewnętrznych do jednego z białek uczestniczących w procesie. Istnieje wiele syntetycznych chemicznie fluoroforów, które można kowalencyjnie przyłączyć do białek za pomocą ich grup reaktywnych, takich jak grupy aminowe (łańcuch boczny lizyn lub koniec N) i grupy tiolowe w cysteinie. Pochodne fluoroforów z izotiocyjanianami i estrami sukcesymidylowymi reagują z grupami amidowymi, podczas gdy jodoacetamid i maleimid są grupami reaktywnymi wobec tioli 13. Najczęściej stosowanymi barwnikami w zastosowaniach fluorescencyjnych są pochodne barwników fluoresceiny i rodaminy zielonej, kumaryny, fluorofory BODIPY oraz barwniki Alexa Fluor. Szczegółową listę dostępnych komercyjnie fluoroforów i ich zastosowań można znaleźć w literaturze 14,15. Aby znakowanie przebiegło pomyślnie, grupa reaktywna musi być wyeksponowana na powierzchni białka, jednak ze względu na dużą liczbę grup funkcjonalnych reaktywnych, zazwyczaj obecnych w polipeptydach, bardzo trudno jest uzyskać modyfikację specyficzną dla konkretnego miejsca. Białko będące przedmiotem niniejszego badania, SBDS, zawiera 5 wolnych cystein i 33 lizyny, co może prowadzić do znakowania w wielu miejscach. Niejednorodne znakowanie może wpływać na wiązanie i skomplikować analizę danych, ponieważ różne cząsteczki fluoroforu mogą generować różne sygnały natężenia fluorescencji po związaniu. Aby rozwiązać ten problem, użyliśmy fluoroforu FlAsH, 4',5'-bis(1,3,2 ditiarsolan-2-yl) fluoresceiny, do celowanego znakowania białka SBDS. Jest to barwnik arsenkowy o wysokim powinowactwie do czterech rozstawionych cystein w motywie znanym jako FlAsH-tag, składającym się z sekwencji CCXXCC, gdzie X to dowolny aminokwas inny niż cysteina 16,17. Motyw tetracysteinowy ten jest dodawany do końca N- lub C- białka za pomocą inżynierii genetycznej wraz z odpowiednim łącznikiem, aby zapobiec zaburzeniu ogólnej struktury białka. Para składająca się z barwnika FlAsH i FlAsH-tag została pierwotnie zaprojektowana do specyficznego znakowania białek w żywych komórkach 17, ale może być również stosowana do znakowania oczyszczonych białek in vitro, co zostało tutaj zobrazowane. Dodatkowo opracowano strategie enzymatyczne umożliwiające specyficzną funkcjonalizację białek 18.
W niniejszym manukrypcie opisujemy użyteczność anizotropii fluorescencji jako narzędzia do badania oddziaływań białko-białko. Wiązanie można ocenić poprzez prostą analizę kształtu krzywej wiązania, natomiast informacje ilościowe można uzyskać z dopasowania danych eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td>Koraliki szklane 0,5 mm</td><td>Produkty Biospec 11079105</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td>Ultra czysty</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>barwnik 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-yl) fluoresceina</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>LC6090</td><td>Ten zestaw zawiera barwnik do oznaczania znacznika FlAsH</td></tr><tr><td>Ampiciline</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza bezwodna</td><td>Formedium</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Galaktoza</td><td>Formedium</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>Formedium</td><td>DOC0157</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptofan&nbsp;</td><td>Formedium</td><td>DOC0189</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek bezamidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Gold Biotechnology, Inc</td><td>P-470-25</td><td>Fluorek fenylometylosulfonylu</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Formedium</td><td>NAC02</td><td>Chlorek sodu&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Tecsiquim, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>Chlorek magnezu</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td></tr><tr><td>Drożdże na bazie azotu bez aminokwasów</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td>Mikrogranulowany</td></tr><tr><td>L-Tyroisne</td><td>Formedium</td><td>DOC0193</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan</td> <td>adeninyFormedium</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Formedium</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>Jednostki filtracyjne</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10&nbsp; Filtr membranowy kDa</td></tr><tr><td>Merck</td><td>Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>Filtr membranowy, mieszane estry celulozy, Hydrofilowy, 0.22&nbsp; &mikro; m, 47&nbsp; mm, biały, gładki</td></tr><tr><td>Ni2+ kolumna powinowactwa</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>Wkład wstępnie napełniony 5&nbsp; ml Kolumna wymiennika kationowego Ni-NTA Superflow</td></tr><tr><td>Strong Sulfopropyl</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td></tr><tr><td>Kolumna wykluczająca rozmiar</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Komórka fluorescencyjna</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6860AA</td><td>Cary 60 UV-Vis</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 Zakres temperatur na stole Ambient-15&deg; do 60&deg; </td></tr><tr><td>C Wirówka</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004271</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>Wycofano</td><td>system FPLC przewodność Monitor UV-MM II Frakcja pompy P500</td></tr><tr><td>Spektrofluorometr</td><td>Olis</td><td>Nie dotyczy</td><td>Olis DM 45 z zestawem narzędzi do polaryzacji</td></tr></tbody></table>

anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Interakcje białko-białko odgrywają istotną rolę w funkcjonowaniu żywego organizmu. Po zidentyfikowaniu i walidacji interakcji konieczne jest jej scharakteryzowanie na poziomie strukturalnym i mechanistycznym. W tym celu istnieje kilka metod biochemicznych i biofizycznych. Wśród nich anizotropia fluorescencji jest potężną techniką, szczególnie stosowaną, gdy intensywność fluorescencji białka znakowanego fluoroforem pozostaje stała po interakcji białko-białko. W tej technice białko znakowane fluoroforem jest wzbudzane pionowo spolaryzowanym światłem o odpowiedniej długości fali, które selektywnie wzbudza podzbiór fluoroforów zgodnie z ich względną orientacją z przychodzącą wiązką. Powstała emisja ma również kierunkowość, której stosunek w płaszczyźnie pionowej i poziomej definiuje anizotropię (r) w następujący sposób: r=(IVV-I VH)/(IVV+2IVH), gdzie IVV i IVH są intensywnościami fluorescencji odpowiednio składowej pionowej i poziomej. Anizotropia fluorescencji jest wrażliwa na dyfuzję rotacyjną fluoroforu, a mianowicie pozorną wielkość cząsteczki fluoroforu przyłączonego do białka, która ulega zmianie w wyniku interakcji białko-białko. W niniejszym tekście przedstawiono zastosowanie anizotropii fluorescencji jako narzędzia do badania interakcji białko-białko w celu rozwiązania problemu wiązania między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a czynnikiem wydłużenia, takim jak GTPaza 1 (EFL1). Tradycyjnie znakowanie białka fluoroforem przeprowadza się na grupach tiolowych (cysteina) lub w grupach aminowych (N-końcowa amina lub lizyna) białka. Jednak SBDS posiada kilka cystein i lizyn, które nie pozwalały na jego etykietowanie skierowane na miejsce. Jako alternatywną technikę, barwnik 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-yl) fluoresceina został użyty do specyficznego znakowania motywu tetracysteiny, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetycznie zmodyfikowanego w C-końcu rekombinowanego białka SBDS. Dopasowanie danych doświadczalnych dostarczyło ilościowych i mechanistycznych informacji na temat sposobu wiązania między tymi białkami.

Aby przeprowadzić jakikolwiek eksperyment z anizotropią, ważne jest wykluczenie dużych zmian w intensywności fluorescencji fluoroforu, ponieważ anizotropia mieszaniny gatunków jest reprezentowana przez Równanie 5:
<img alt="Równanie równowagi statycznej: r=ΣiFi*ri. Zasady matematyczne dla analizy inżynieryjnej." src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation5">
<p class="jove_...

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ocena i ilościowe określenie oddziaływania między dwoma badanymi białkami przy użyciu anizotropii fluorescencji. Pomiary te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii i biofizyki białek, na przykład dotyczące białek, których oddziaływania są istotne dla funkcji komórkowych.Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania ilościowych i jakościowych informacji na temat oddziaływań białko-białko. Aby przygotować oczyszczone białko SBDS-FlAsH, należy najpierw przygotować jeden litr płynnej pożywki LB uzupełnionej o 100 µg/mL ampicyliny. Następnie w pożywce tej należy hodować transformowane bakterie w temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 0,5 do 0,7.Indukować ekspresję białka SBDS-FlAsH poprzez dodanie 0,5 mM IPTG do hodowli i kontynuować inkubację przez kolejne pięć godzin. Następnie zebrać zawiesinę bakteryjną poprzez wirowanie przy 3800 ×g przez dziesięć minut w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz.Ponownie zawiesić komórki w 35 ml buforu lizującego SBDS uzupełnionego o 1 mM PMSF. Przeprowadzić lizę metodą sonikacji przez łącznie cztery minuty, stosując cykle 10 sekund pracy i 30 sekund przerwy w temperaturze 4 °C. Następnie odwirować próbkę z prędkością 9 000 ×g przez 50 minut w temperaturze 4 °C.Należy zachować nadsącz i odrzucić osad w celu usunięcia debris komórkowych. Po równoważeniu kolumny powinowactwa niklowego trzema objętościami kolumny buforu lizującego SBDS, należy nałożyć cały klarowny nadsącz na kolumnę. Białko niezdziązane należy usunąć poprzez przemycie kolumny trzema objętościami buforu lizującego SBDS.Po przemyciu kolumny eluj związane białko za pomocą trzech objętości kolumny buforu elucyjnego SBDS. Aby dodatkowo oczyścić białko, zrównoważ kolumnę z kationowym wymieniaczem sulfopropylowym za pomocą trzech objętości kolumny buforu kolumnowego S o niskim zasoleniu. Rozcieńcz białko sześciokrotnie w 50 millimolar buforze fosforanowym pH 6.5 i wprowadź je na kolumnę.Nieprzypisanym materiałem wypłukać przy użyciu trzech objętości kolumny buforu S o niskim zasoleniu (Low salt S column buffer). Następnie eluirować białko w jednym kroku, dodając na kolumnę 50 mM bufor fosforanowy pH 6,5 z 1 M chlorkiem sodu. Eluat rozcieńczyć trzykrotnie buforem fosforanowym 50 mM pH 6,5.Następnie zagęszcz białko za pomocą urządzeń do ultrafiltracji poprzez wirowanie przy 3800 ×g przez piętnaście minut. Jakość białek stosowanych w tego typu eksperymentach ma kluczowe znaczenie. Interpretacja danych staje się skomplikowana, jeśli użyte próbki białek nie charakteryzują się wysoką czystością.Zweryfikuj czystość białka SBDS-FlAsH za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie. Zamroź białko gwałtownie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu dalszego użycia. Aby przygotować oczyszczone białko EFL1, najpierw hoduj transformowane drożdże w temperaturze 30 °C w jednym litrze syntetycznego medium drop-out bez uracylu, uzupełnionego o 0,5% glukozy, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 1,8.Indukuj ekspresję białka, dodając 2,8% galaktozy do hodowli, a następnie kontynuuj inkubację przez 18 godzin w temperaturze 30 °C. Zbierz zawiesinę drożdży poprzez wirowanie przy 3800 ×g przez dziesięć minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu usuń nadosad.Resuspender komórki w 50 mililitrach buforu do lizy EFL1 uzupełnionego o 1 mM PMSF i 1 mM benzamidyny. Rozbić komórki metodą tarcia w homogenizatorze kuleczkowym (bead-beater) przy użyciu szklanych kuleczek przez łącznie sześć minut, stosując cykle: dwie minuty pracy i piętnaście minut przerwy w temperaturze 4 °C. Następnie odwirować próbkę z prędkością 9 000 ×g przez 50 minut w temperaturze 4 °C.Zachowaj nadsącz, a osad odrzuć, aby usunąć szczątki komórkowe. Następnie zrównoważ kolumnę powinowactwa niklowego, przepuszczając przez nią trzy objętości kolumny buforu do lizy EFL1. Nanieś cały klarowny nadsącz na zrównoważoną kolumnę.Po usunięciu nieprzypisanego białka poprzez przemycie kolumny trzykrotnością jej objętości buforem do lizy EFL1, eluj związane białko trzykrotnością objętości kolumny buforem do elucji EFL1. Aby dalej oczyścić białko EFL1, zrównoważ kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczkowego 1,5-krotnością objętości kolumny buforem do anizotropii. Skoncentruj białko EFL1 eluowane z kolumny powinowactwa niklowego do objętości jednego mililitra za pomocą urządzeń do ultrafiltracji poprzez wirowanie przy 3800 ×g. Następnie wprowadź skoncentrowaną próbkę na kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczkowego.Zebrać eluowane białko i zagęścić metodą ultrafiltracji do stężenia końcowego wynoszącego około 30 micromolar. Zweryfikować czystość białka EFL1 za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie. Białko zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsius do czasu dalszego użycia.Wymieszać 3 nanomoli białka SBDS-FlAsH z 3 nanomolami barwnika lumio green w 5 µL buforu do anizotropii. Inkubować mieszaninę przez 8 godzin w temperaturze 4 °C. Po 8 godzinach dializować próbkę przeciwko buforowi do anizotropii przez noc w celu usunięcia wolnego barwnika.Zmierz absorbancję przy 280 nanometrach i 508 nanometrach w spektrofotometrze, używając kuwety kwarcowej. Następnie, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wykorzystaj prawo Lamberta-Beera do określenia procentowej zawartości znakowanego białka. Przed pomiarem wartości anizotropii każdy etap filtrowania frakcji białkowej należy przeprowadzić starannie, upewniając się, że cała próbka została przeniesiona do roztworu i stała się jednorodna.Do kuwety fluorescencyjnej należy wprowadzić 200 µL 30 nM SBDS-FlAsH w buforze do anizotropii, a następnie miareczkować 2 µL 30 µM EFL1. Po dokładnym wymieszaniu odstawić reakcję na trzy minuty przed pomiarem wartości anizotropii i fluorescencji. Powtarzać ten proces do momentu dodania łącznej objętości 40 µL EFL1.W ostatnim kroku dopasuj dane do przyjętego modelu wiązania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić dowolny eksperyment z anizotropią, ważne jest wykluczenie znaczących zmian w intensywności fluorescencji. Jak pokazano tutaj, fluorescencja SBDS-FlAsH nie zmienia się zauważalnie po związaniu z EFL1.Miareczkowanie białka EFL1 w kuwecie kwarcowej zawierającej SBDS-FlAsH prowadzi do zwiększenia początkowej obserwowanej anizotropii. Kilkukrotne dodanie EFL1 pozwala wyznaczyć odpowiadającą temu krzywą wiązania, którą można dopasować do przyjętego modelu wiązania za pomocą nieliniowej regresji najmniejszych kwadratów. W tym przypadku model z jednym miejscem wiązania nie opisuje w sposób odpowiedni danych eksperymentalnych.Zamiast tego, model dwóch nieidentycznych miejsc wiązania odpowiednio opisuje dane eksperymentalne. Po opanowaniu metody eksperyment wiązania z wykorzystaniem anizotropii fluorescencji można przeprowadzić w trzy godziny, pod warunkiem właściwego wykonania. Podczas próby zastosowania tej procedury ważne jest posiadanie oczyszczonego białka w dużych ilościach.Równolegle z tą procedurą, w celu wsparcia odpowiedniego modelu wiązania, można przeprowadzić inne metody, takie jak wspomniany test komplementacji opartej na fragmentach lub anizotropia fluorescencji z wykorzystaniem różnych domen badanego białka. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić eksperyment wiązania, a następnie anizotropię fluorescencji.

fluorescence-anisotropy-as-tool-to-study-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

W tym filmie opisujemy technikę anizotropii fluorescencji do badania interakcji między białkiem zespołu Shwachmana-Diamonda (SBDS) oznaczonym fluoroforem a czynnikiem wydłużenia 1 GTPazą (EFL1). Podczas inkubacji białek SBDS ze stopniowo rosnącymi stężeniami EFL1 obserwuje się stały wzrost anizotropii, co wskazuje na udaną interakcję między tymi dwoma białkami.

Wykrywanie interakcji białko-białko oparte na anizotropii fluorescencyjnej

Ten film opisuje wysoce wydajną anizotropię fluorescencji, która pomaga monitorować interakcję między czynnikami transkrypcyjnymi a DNA. Test monitoruje interakcje cząsteczki DNA znakowanej fluoroforem z jej specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym, mierząc stopień polaryzacji spowodowanej rotacją molekularną lub anizotropią DNA znakowanego fluoroforem.

Anizotropia fluorescencyjna w celu określenia powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego i DNA

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Ten protokół opisuje bezkalibracyjne podejście do ilościowego określania homo-oligomeryzacji białek in vitro na podstawie spektroskopii fluktuacji fluorescencji przy użyciu komercyjnej mikroskopii skaningowej światła. Wyświetlane są prawidłowe ustawienia akwizycji i metody analizy.

Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Poznaj anizotropię fluorescencyjną do badania oddziaływań białko-białko między białkami SBDS a EFL1. Technika ta dostarcza ilościowych i jakościowych danych kluczowych dla biochemii białek.

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Przeglądaj więcej filmów