Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena i ilościowe określenie interakcji między dwoma białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu anizotropii fluorescencyjnej. Środki te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania. Biochemia białek i biofizyka białek, takich jak białka, których interakcje są ważne dla funkcji komórek.

Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy uzyskać ilościowe i jakościowe informacje na temat interakcji białko-białko. Aby przygotować oczyszczone białko SBDS-FlAsH, najpierw przygotuj jeden litr płynnego podłoża LB uzupełnionego 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny. A w nim kultura przekształciła bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,5 do 0,7.

Indukuj ekspresję białka SBDS-FlAsH, dodając 0,5 milimolowego IPTG do kultury i kontynuuj inkubację przez kolejne pięć godzin. Następnie zebrać zawiesinę bakteryjną przez odwirowanie w temperaturze 3800 razy G przez dziesięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant.

Ponownie zawieś komórki w 35 mililitrach masła do lizy SBDS uzupełnionego jednym milimolowym PMSF. Lizować przez sonikację przez łączny czas czterech minut, stosując cykle po dziesięć sekund włączenia i 30 sekund wyłączenia w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 9 000 razy G przez 50 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zachowaj supernatant i wyrzuć paletę, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Po zrównoważeniu kolumny powinowactwa do niklu z trzema objętościami kolumnowymi buforu do lizy SBDS, wprowadzić cały sklarowany supernatant do kolumny. Usunąć niezwiązane białko przez przemywanie trzema objętościami kolumny buforu do lizy SBDS.

Po przepłukaniu kolumny wymyć związane białko trzema objętościami buforu elucyjnego SBDS w trzech kolumnach. W celu dalszego oczyszczenia białka należy zrównoważyć kolumnę wymieniacza kationowego sulfopropylu z trzema objętościami kolumny buforu kolumny S o niskiej zawartości soli. Rozcieńczyć białko sześciokrotnie 50-milimolowym buforem fosforanowym o pH 6,5 i wprowadzić je do kolumny.

Przemyć niezwiązany materiał trzema objętościami kolumny buforu kolumnowego o niskiej zawartości soli. Następnie eluuj białko w jednym etapie, dodając 50 milimolowy bufor fosforanowy o pH 6,5, jeden molowy chlorek sodu do kolumny. Rozcieńczyć eluat trzykrotnie 50-milimolowym buforem fosforanowym o pH 6,5.

Następnie zagęścić białko za pomocą urządzeń ultrafiltracyjnych przez odwirowanie w temperaturze 3800 razy G przez piętnaście minut. Jakość białek używanych w tego typu eksperymentach jest bardzo silna. Interpretacja danych komplikuje się, jeśli użyte próbki białek nie są wysokiej czystości.

Sprawdź czystość białka SBDS-FlAsH za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie. Błyskawicznie zamroź białko w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Aby przygotować oczyszczone białko EFL1, pierwsza hodowla przekształciła drożdże w temperaturze 30 stopni Celsjusza w jednym litrze syntetycznej pożywki bez uracylu, uzupełnionej 0,5 procentami glukozy, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 1,8.

Indukuj ekspresję białka, dodając 2,8 procent galaktozy do kultury i kontynuuj inkubację przez 18 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Zebrać zawiesinę drożdży przez odwirowanie w temperaturze 3800 razy G przez dziesięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant po odwirowaniu.

Ponownie zawiesić komórki w 50 mililitrach buforu do lizy EFL1 uzupełnionego jednym milimolowym PMSF i jedną milimolową benzamidyną. Rozerwij komórki przez tarcie na ubijaku do koralików za pomocą szklanych kulek przez łączny czas sześciu minut, stosując cykle po dwie minuty włączenia i piętnaście minut wyłączenia w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 9 000 razy G przez 50 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zachowaj supernatant i wyrzuć podniebienie, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Następnie zrównoważyć kolumnę powinowactwa do niklu z trzema objętościami kolumny buforu do lizy EFL1. Wprowadzić cały oczyszczony supernatant do kolumny zrównoważonej.

Po usunięciu niezwiązanego białka przez przemycie kolumny trzema objętościami kolumny buforu do lizy EFL1, należy wymyć związane białko trzema objętościami kolumny buforu elucyjnego EFL1. Aby dalej oczyścić białko EFL1, należy zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość z 1,5 objętością kolumny buforu anizotropii. Zagęścić białko EFL1 wydostające się z kolumny powinowactwa do niklu do jednego mililitra za pomocą urządzeń ultrafiltracyjnych przez odwirowanie w temperaturze 3800 razy G. Następnie wprowadzić zagęszczoną próbkę do kolumny wykluczającej wielkość.

Zebrać usunięte białko i skoncentrować je przez ultrafiltrację do końcowego stężenia około 30 mikromolowych. Sprawdź czystość białka EFL1 za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie. Błyskawiczne zamrożenie białka w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.

Wymieszaj trzy nanomole białka SBDS-FlAsH z trzema nanomolami zielonego barwnika lumio w buforze anizotropii o objętości pięciu mikrometrów. Pozwól reakcji postępować przez osiem godzin w czterech stopniach Celsjusza. Po ośmiu godzinach należy dializować próbkę z buforem anizotropii przez noc, aby usunąć wolny barwnik.

Zmierz absorbenty przy 280 nanometrach i 508 nanometrach w spektrofotometrze za pomocą kuwety kwarcowej. Następnie użyj prawa Lamberta-Beera, aby określić procentowo zawartość procentową znakowanego białka, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przed pomiarem wartości anizotrofii każdy etap filtracji z legionu białek powinien być wykonany ostrożnie, upewniając się, że cała próbka jest dozowana do roztworu i staje się jednorodna.

W kuwecie fluorescencyjnej umieść 200 mikrolitrów 30 nanomolowych SBDS-FlAsH w buforze anizotrofii i miareczkuj dwa mikrolitry 30 mikromolowych EFL1. Dokładnie wymieszaj i pozostaw reakcję na trzy minuty przed pomiarem anizotrofii i wartości fluorescencji. Powtarzaj ten proces, aż zostanie dodana całkowita objętość 40 mikrolitrów EFL1.

W ostatnim kroku dopasuj dane do przypuszczalnego modelu powiązania zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić jakikolwiek eksperyment anizotrofii, ważne jest, aby wykluczyć duże zmiany w intensywności fluorescencji. Jak pokazano tutaj, fluorescencja SBDS-FlAsH nie zmienia się zauważalnie po związaniu z EFL1.

Miareczkowanie EFL1 do kuwety kwarcowej zawierającej SBDS-FlAsH powoduje wzrost początkowej obserwowanej anizotrofii. Kilka dodatków EFL1 opisuje odpowiednią krzywą wiązania, którą można dopasować za pomocą nieliniowej regresji metodą najmniejszych kwadratów do przypuszczalnego modelu wiązania. W takim przypadku model z jednym wiążącym miejscem nie opisuje odpowiednio danych eksperymentalnych.

Zamiast tego model dwóch nieidentycznych miejsc wiązania odpowiednio opisuje dane eksperymentalne. Po opanowaniu eksperyment wiązania anizotrofii fluorescencji można przeprowadzić w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby mieć oczyszczone białko w dużych ilościach.

Równolegle z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak ta, z testem komplementacji opartej na fragmentach lub anizotrofią fluorescencji z różnymi domenami badanego białka, w celu wsparcia odpowiedniego modelu wiązania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić eksperyment wiązania, a następnie anizotrofię fluorescencji.