Name: Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj anizotropię fluorescencyjną do badania oddziaływań białko-białko między białkami SBDS a EFL1. Technika ta dostarcza ilościowych i jakościowych danych kluczowych dla biochemii białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony projektów CONACyT numer 167359 i 177138, oraz z projektu DGAPA-UNAM numer IN201615.

1. Ekspresja i oczyszczanie białka z tagiem SBDS-FlAsH
UWAGA: Do eksperymentów z anizotropią, do końca C-końca sekwencji kodującej ludzkie białko SBDS za pomocą PCR dodano znacznik FlAsH odpowiadający sekwencji Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys. Konstrukt ten został podklonowany do wektora ekspresyjnego pRSET-A i przetransformowany do komórek Escherichia coli C41 w celu ekspresji białka zawierającego N-końcowy znacznik heksahistydynowy (His-tag), sekwencję kodującą ludzkie białko SBDS oraz znacznik FlAsH na C-końcu 10.
<ol>
	<li>Ekspresja białka SBDS-FlAsH
	<ol>
		<li>Przekształć kompetentne komórki E. coli C41 plazmidem pRSET-HisSBDS-FlAsH, stosując standardowy protokół szoku termicznego 19. Wysiej komórki na stałą pożywkę Luria-Bertani (LB) uzupełnioną o 100 µg/ml ampicyliny. Skład stałej pożywki LB to 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g tryptonu i 20 g agaru na 1 L objętości.</li>
		<li>Hoduj przekształcone bakterie w temperaturze 37 °C do momentu, gdy absorbancja przy 600 nm (A600) osiągnie wartość 0,5-0,7, w 1 L płynnej pożywki LB uzupełnionej o 100 µg/ml ampicyliny.</li>
		<li>Indukuj ekspresję białka poprzez dodanie do hodowli 0,5 mM izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu i kontynuuj inkubację przez kolejne 5 hr.</li>
		<li>Zbierz zawiesinę bakteryjną poprzez wirowanie przy 3 800 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Usuń nadsącz. Na tym etapie przechowuj osad komórkowy w temperaturze -20 °C lub użyj go niezwłocznie do oczyszczania białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie białka SBDS-FlAsH 
	UWAGA: Wszystkie etapy chromatograficzne są wykonywane przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) lub pompy perystaltycznej. W chromatografii powinowactwa do Ni2+ zastosowano kolumnę fast flow o pojemności 5 ml. W chromatografii wymiany anionowej zastosowano kolumnę z silnym wymieniaczem kationowym sulfopropyl o pojemności 5 ml. Dla wszystkich etapów chromatograficznych zastosowano szybkość przepływu 3 ml/min.
	<ol>
		<li>Resuspenduj komórki w 35 ml buforu do lizy SBDS (bufor fosforanowy 50 mM pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol) uzupełnionego o 1 mM fluorarczek fenylometylosulfonylowy (PMSF) i poddaj lizie przez sonikację przez łączny czas 4 min, stosując cykle 10 s włączony / 30 s wyłączony, w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wirowuj próbkę przy 9 000 x g przez 50 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zatrzymaj nadsącz i odrzuć osad, aby usunąć resztki komórkowe.</li>
		<li>Równoważ kolumnę powinowactwa do Ni2+ za pomocą 3 objętości kolumny (CV) buforu do lizy SBDS, a następnie wprowadź cały oczyszczony nadsącz na kolumnę.</li>
		<li>Usuń nieprzypisane białka, płucząc kolumnę 3 CV buforu do lizy SBDS, a następnie eluuj 3 CV buforu do elucji SBDS (bufor fosforanowy 50 mM pH 7,5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol).</li>
		<li>Rozcieńcz eluowane białko 6-krotnie buforem fosforanowym 50 mM pH 6,5 i usuń ewentualne agregaty poprzez filtrację przez membranę celulozową 0,22 µm.</li>
		<li>Równoważ kolumnę z wymieniaczem kationowym sulfopropyl za pomocą 3 CV buforu kolumnowego Low salt S (bufor fosforanowy 50 mM pH 6,5, 50 mM NaCl) i wprowadź próbkę białka z poprzedniego etapu.</li>
		<li>Wypłucz nieprzypisany materiał 3 CV buforu kolumnowego Low salt S i eluuj białko w jednym kroku, używając buforu fosforanowego 50 mM pH 6,5, 1 M NaCl.</li>
		<li>Rozcieńcz eluowane białko 3,3-krotnie buforem fosforanowym 50 mM pH 6,5. Zagęść białko za pomocą urządzeń do ultrafiltracji poprzez wirowanie przy 3 800 x g przez 15 min. Zamroź białko gwałtownie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
		<li>Zweryfikuj czystość białka za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie 20.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekspresja i oczyszczanie białka EFL1
UWAGA: EFL1 był wyrażany pod kontrolą dywergentnego promotora Gal 1/10 21 oraz 3'UTR Saccharomyces cerevisiae MATA w wektorze pRS426. Białko rekombinowane koduje ludzką izoformę 1 EFL1 połączoną z miejscem rozpoznawania proteazy wirusa trawienia tytoniu (TEV) oraz znacznikiem heksahistydynowym na C-końcu.
<ol>
	<li>Ekspresja białka EFL1
	<ol>
		<li>Przetransformuj komórki S. cerevisiae BCY123 plazmidem pRS426-EFL1TevHis, stosując standardowy protokół z octanem litu 22. Wszystkie przetransformowane komórki wysiej na syntetyczne podłoże selekcyjne bez uracylu (SD-URA) uzupełnione o 2% (w/v) glukozy. Skład podłoża SD-URA na 1 L objętości to: 8 g bazy azotowej dla drożdży bez aminokwasów, 11 g kwasów kasamino, 55 mg siarczanu adeniny, 55 mg tyrozyny, 60 mg leucyny i 60 mg tryptofanu.</li>
		<li>Hoduj przetransformowane drożdże w temperaturze 30 °C do momentu, aż A600 osiągnie wartość 1,8 w 1 L podłoża SD-URA uzupełnionego o 0,5% (w/v) glukozy.</li>
		<li>Indukuj ekspresję białka poprzez dodanie 2,8% (w/v) galaktozy do hodowli i kontynuuj inkubację przez kolejne 18 hr w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Zbierz zawiesinę drożdży przez wirowanie przy 3,800 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Usuń nadsącz. Na tym etapie przechowuj osad komórkowy w temperaturze -20 °C lub wykorzystaj go natychmiast do oczyszczania białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie białka EFL1 
	UWAGA: Wszystkie etapy chromatograficzne są wykonywane przy użyciu systemu FPLC lub pompy perystaltycznej. Chromatografia powinowactwa do Ni2+ wykorzystuje kolumnę fast flow o pojemności 5 ml przy szybkości przepływu 3 ml/min. Chromatografia wykluczania treści wykorzystuje kolumnę o pojemności 125 ml wypełnioną żywicą Superdex 200 przy szybkości przepływu 1 ml/min.
	<ol>
		<li>Resuspenduj komórki w 50 ml buforu do lizy EFL1 (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu, 5 mM MgCl2, 10% glicerolu) uzupełnionego o 1 mM PMSF i 1 mM benzamidyny, a następnie zniszcz komórki mechanicznie za pomocą homogenizatora kulowego z kulkami szklanymi (Ø = 0,5 mm) przez łączny czas 6 min, stosując cykle: 2 min pracy i 15 min przerwy, w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wirowuj próbkę przy 9,000 x g przez 50 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zabierz nadsącz i odrzuć osad, aby usunąć szczątki komórkowe.</li>
		<li>Urównoważ kolumnę powinowactwa Ni2+ za pomocą 3 CV buforu do lizy EFL1 i wprowadź cały klarowny nadsącz na kolumnę.</li>
		<li>Usuń nieprzypisane białka, przemywając kolumnę 3 CV buforu do lizy EFL1, a następnie eluuj 3 CV buforu do elucji EFL1 (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolu, 5 mM MgCl2, 10% glicerolu).</li>
		<li>Urównoważ kolumnę do wykluczania treści za pomocą 1,5 CV buforu do anizotropii (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% glicerolu, 5 mM β-merkaptoetanolu).</li>
		<li>Skoncentruj białko EFL1 eluowane z kolumny powinowactwa Ni2+ do objętości 1 ml za pomocą urządzeń do ultrafiltracji poprzez wirowanie przy 3,800 x g do pożądanej objętości. Wprowadź próbkę na kolumnę do wykluczania treści.</li>
		<li>Zbierz eluowane białko i skoncentruj je metodą ultrafiltracji do końcowego stężenia około 30 µM. Zamroź białko błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. Zweryfikuj czystość białka za pomocą analizy SDS-PAGE i barwienia Coomassie 20.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Znakowanie SBDS-FlAsH fluorescencyjnym barwnikiem FlAsH 4',5'-bis(1,3,2-dytioarsolan-2-ylo)fluoresceiną
<ol>
	<li>Wymieszać 3 nmol białka SBDS-FlAsH z 3 nmol barwnika 4',5'-bis(1,3,2 ditiolarsolan-2-yl) fluoresceiny w 5 µl buforu do anizotropii.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 8 hr w temperaturze 4 °C. Próbkę dializować przeciwko buforowi do anizotropii przez noc w celu usunięcia wolnego barwnika.</li>
	<li>Wykorzystać prawo Lamberta-Beera do określenia procentowego stopnia znakowania białka. Zmierzyć absorbancję przy 280 nm i 508 nm za pomocą spektrofotometru, używając kwarcowej kuwety o odpowiedniej objętości. UWAGA: Należy przyjąć następujące molowe współczynniki absorpcji (M-1 cm-1): 
	<img alt="Współczynniki absorpcji w wzorach, kontekst spektroskopowy, badania optyczne, analiza barwników." src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation1B"></li>
	<li>Obliczyć stężenie znakowanego białka SBDS-FlAsH, korzystając z równania 2. 
	<img alt="Równanie absorbancji A₅₀₈=Cₛᵦdₛ₋fₗₐₛₕ·l·ε₅₀₈ dla stężenia barwnika, analiza spektroskopowa." src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation2"></li>
	<li>Obliczyć całkowite stężenie białka SBDS za pomocą równania 3, podstawiając obliczoną wartość CSBDS-FlAsH z poprzedniego kroku. 
	<img alt="Wzór równania spektroskopowego dla absorbancji kompleksu białko-barwnik, A=ε·c·l; materiały edukacyjne." src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation3"></li>
	<li>Obliczyć procentowy stopień znakowania białka, korzystając z równania 4. 
	<img alt="Wzór na procent znakowania, C_SBDS-FLASH przez C_SBDS, dla obliczeń analizy chemicznej, równanie 4." src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation4"></li>
</ol>
4. Eksperymenty z anizotropią fluorescencji
UWAGA: Eksperymenty dotyczące anizotropii przeprowadzono w spektrofluorometrze wyposażonym w zestaw do pomiarów polaryzacji, a gromadzenie danych odbyło się za pomocą programu do anizotropii dostarczonego w oprogramowaniu urządzenia. Długość fali wzbudzenia ustawiono na 494 nm przy szerokości pasma widmowego 8 nm, a emisję rejestrowano przy użyciu filtra pasmowo-przepustowego 530±25 nm. Pomiary wykonano w temperaturze 25 °C w kuwecie o objętości 200 µl i drodze optycznej 5 mm 10.
<ol>
	<li>Do kuwety fluorescencyjnej nalać 200 µl 30 nM SBDS-FlAsH w buforze do anizotropii i miareczkować 2 µl 30 µM EFL1. Dokładnie wymieszać i odstawić reakcję na 3 min przed pomiarem wartości anizotropii.</li>
	<li>Powtarzać krok 4.1 do momentu, aż zostanie dodana całkowita objętość 40 µl EFL1.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Dopasuj dane do odpowiedniego modelu wiązania, korzystając z algorytmu nieliniowej regresji najmniejszych kwadratów. Równania dla najczęściej stosowanych modeli wiązania przedstawiono w Tabeli 1.</li>
	<li>Oceń, który model najlepiej opisuje oddziaływanie między białkami, analizując residua dopasowania 23. Potwierdź wybrany model za pomocą dodatkowych eksperymentów.</li>
</ol>
Tabela 1. Typowe modele wiązania w oddziaływaniach białko-białko oraz równania matematyczne opisujące te procesy. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640table1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.</a> 
<img alt="Tabela równań równowagi wiązania; modele: 1 miejsce wiązania, 2 miejsca identyczne, 2 miejsca nieidentyczne." src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1">

<ol><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+of+protein-fragment+complementation+assays+for+studying+and+dissecting+large-scale+and+dynamic+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).</li>
<li>Snider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+protein+interaction+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of protein interaction network mapping.</a> Mol Syst Biol. 11 (12), 848(2015).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Structure+and+mechanism+in+protein+science%3A+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein+folding%22">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding</a>. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).</li>
<li>Menne, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shwachman-Bodian-Diamond+syndrome+protein+mediates+translational+activation+of+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast.</a> Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).</li>
<li>Boocock, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+SBDS+are+associated+with+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome.</a> Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).</li>
<li>Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Guanine+Nucleotide+Exchange+in+the+Elongation+Factor-like+1+%28EFL1%29+GTPase+by+Mutations+in+the+Shwachman-Diamond+Syndrome+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein.</a> J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).</li>
<li>Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanine+nucleotide+exchange+in+the+ribosomal+GTPase+EFL1+is+modulated+by+the+protein+mutated+in+the+Shwachman-Diamond+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Third, Springer US. (2010).</li>
<li>Nishigaki, T., Treviño, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNishigaki%2C+T+%22Tools+to+understand+protein-protein+interactions%22">Tools to understand protein-protein interactions</a>. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).</li>
<li>Johnson, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+I+%22The+Molecular+Probes+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).</li>
<li>Sabnis, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabnis%2C+RW+%22Handbook+of+Fluorescent+Dyes+and+Probes%22">Handbook of Fluorescent Dyes and Probes</a>. , Wiley. (2015).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications.</a> J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li>
<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281 (5374), 269-272 (1998).</li>
<li>Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+labeling+of+proteins%3A+techniques+and+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches.</a> Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL1-GAL10+divergent+promoter+region+of+Saccharomyces+cerevisiae+contains+negative+control+elements+in+addition+to+functionally+separate+and+possibly+overlapping+upstream+activating+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences.</a> Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li>
<li>Eftink, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+methods+for+studying+equilibrium+macromolecule-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions.</a> Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Substrates+to+the+Central+Pore+of+the+Vps4+ATPase+Is+Autoinhibited+by+the+Microtubule+Interacting+and+Trafficking+%28MIT%29+Domain+and+Activated+by+MIT+Interacting+Motifs+%28MIMs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs).</a> J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).</li>
<li>Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+natively+unfolded+HIF-1alpha+ODD+domain+to+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53.</a> Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).</li>
<li>Trusch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Region+of+the+Ubiquitin+Regulatory+X+%28UBX%29+Domain-containing+Protein+1+%28UBXD1%29+Modulates+Interdomain+Communication+within+the+Valosin-containing+Protein+p97%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97.</a> J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).</li>
<li>Kamp, F., Beyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+alpha-synuclein+affects+the+lipid+packing+in+bilayers+of+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemsitry%22%5BJournal%5D)">Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles.</a> The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).</li>
<li>Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Intensity%2C+Anisotropy%2C+and+Transient+Dynamic+Quenching+Stopped-Flow+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Spectroscopic+Methods+of+Analysis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics.</a> Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).</li>
<li>Asano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+EFL1+and+SBDS+is+mediated+by+an+intrinsically+disordered+insertion+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Większość eksperymentów biochemicznych z białkami wymaga nie tylko czystego białka, ale także jego dużych ilości, niezależnie od zastosowanej techniki. Z tego powodu białka wykorzystywane w tego typu badaniach pozyskuje się poprzez ekspresję heterologiczną, tak jak w przedstawionym tutaj przypadku. Spektroskopia fluorescencyjna wymaga obecności fluoroforu w badanej cząsteczce. Pozostałości aromatyczne stanowią wewnętrzne fluorofory białka, jednak wykorzystanie ich sygnału do badania oddziaływań białko-białko komplikuje a...

Komórki zawierają mnóstwo biomakrocząsteczek, które nieustannie ze sobą oddziałują. Powiązania te prowadzą do tworzenia kompleksów uczestniczących w szlakach komórkowych odpowiedzialnych m.in. za transdukcję sygnału, regulację ekspresji genów oraz migrację komórek. Wszystkie oddziaływania białko-białko zachodzące w komórce tworzą sieć zwaną interaktomem. Wykazano, że w Saccharomyces cerevisiae ponad 70% białek posiada partnerów interakcji 1. Zrozumienie interaktomu komórki i pełnionych przez niego funkcji dostarcza istotnych informacji o złożoności i różnorodności organizmów żywych. Opisano kilka metodologii służących do identyfikacji i charakterystyki oddziaływań białko-białko. Do identyfikacji interakcji 5,6 stosuje się różne metody wysokoprzepustowe, takie jak system dwuhybrydowy drożdży 2, testy komplementacji fragmentów białek 3, oczyszczanie powinowactwa 4 sprzężone ze spektrometrią mas oraz mikromacierze białkowe. Po zidentyfikowaniu interakcji konieczna jest jej walidacja, która może różnić się w zależności od przypadku. Zazwyczaj eksperymenty te polegają na zakłóceniu samej interakcji na poziomie poszczególnych członków pary oddziałującej, np. poprzez delecję genu lub nadekspresję jednego z białek, a następnie poszukiwaniu zmian we właściwościach lub funkcji drugiego członka na poziomie komórkowym. Następnie do charakterystyki oddziaływania białko-białko na poziomie molekularnym wykorzystuje się techniki biofizyczne 7. W tym celu strukturę kompleksów białkowych określa się za pomocą krystalografii rentgenowskiej, magnetycznego rezonansu jądrowego i kriomikroskopii elektronowej, podczas gdy kalorymetrii i spektroskopii fluorescencyjnej używa się do ich ilościowego i mechanistycznego opisu.
W niniejszej pracy zastosowano anizotropię fluorescencji jako technikę do charakterystyki oddziaływania między GTPazą EFL1 a białkiem SBDS. Białka te uczestniczą w syntezie rybosomów, promując uwalnianie eukariotycznego czynnika inicjacji 6 z powierzchni podjednostki rybosomalnej 60S 8. Białko SBDS ulega mutacji w jednostce chorobowej znanej jako zespół Shwachmana-Diamonda 9 i pełni funkcję czynnika wymiany nukleotydów guaninowych dla EFL1, zmniejszając jego powinowactwo do guanozynodifosforanu 10,11. Mutacje chorobowe w SBDS znoszą oddziaływanie z EFL1, a tym samym zapobiegają jego aktywacji.
Anizotropia fluorescencji jest powszechnie stosowana w aplikacjach biologicznych do badania oddziaływań białko-peptyd lub białko-kwas nukleinowy. Opiera się ona na zasadzie, zgodnie z którą fluorofor wzbudzony światłem spolaryzowanym emituje światło częściowo spolaryzowane. Anizotropia fluorescencji jest zdefiniowana zgodnie z Równaniem 1:
<img alt="równanie anizotropii, wzór do analizy orientacji molekularnej, równowaga statyczna" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation1">
gdzie IVV i IVH to intensywności fluorescencji emisji spolaryzowanej pionowo (VV) i poziomo (VH), gdy próbka jest wzbudzana światłem spolaryzowanym pionowo 12. Anizotropia fluorescencji jest wrażliwa na czynniki wpływające na szybkość dyfuzji rotacyjnej fluoroforu, a zatem zależy od temperatury, lepkości roztworu oraz pozornej wielkości cząsteczkowej fluoroforu. Pozorna wielkość białka zawierającego fluorofor zwiększa się, gdy oddziałuje ono z innym białkiem, a taką zmianę można następnie ocenić jako zmianę anizotropii. Bardziej szczegółowo, fluorofor, który rotuje w roztworze powoli w stosunku do czasu życia jego fluorescencji, będzie miał dużą wartość IVV i małą wartość IVH, a zatem wykaże stosunkowo dużą anizotropię. W przypadku fluoroforów, które rotują szybko w stosunku do czasu życia ich fluorescencji, wartości IVV i IVH będą zbliżone, a wartość ich anizotropii będzie mała 12 (Rysunek 1). Ponadto, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu pomiaru anizotropii, konieczne jest zastosowanie fluoroforu o czasie życia fluorescencji zbliżonym do czasu korelacji rotacyjnej badanej cząsteczki. W przeciwnym razie nie jest możliwe dokładne zarejestrowanie różnicy w anizotropii między wolnym białkiem a białkiem w kompleksie. Na przykład anizotropia sondy fluorescencyjnej o czasie życia bliskim 4 nsec, takiej jak fluoresceina lub rodamina przyłączona do związku o niskiej masie cząsteczkowej 100 Da, wynosi 0,05. Wiązanie z cząsteczką o masie 160 kDa zwiększy wartość jej anizotropii do 0,29; jest to różnica, którą można dokładnie zmierzyć. W przeciwieństwie do tego, ta sama sonda fluorescencyjna biorąca udział w reakcji wiązania, w której wzrost wielkości cząsteczkowej waha się od 65 do 1 000 kDa, spowoduje zmianę anizotropii jedynie z 0,28 do 0,3, co jest wartością zbyt małą, aby można ją było dokładnie zmierzyć. W takim scenariuszu bardziej odpowiednia byłaby sonda o czasie życia 400 nsec 12.
<img alt="Schemat polarymetry pokazujący światło wzbudzenia, monochromatory i detektor do analizy wielkości białek." src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczna reprezentacja aparatury wykorzystywanej do pomiaru anizotropii fluorescencji oraz opis procedury. Schematyczna reprezentacja aparatury wykorzystywanej do przeprowadzenia eksperymentu badającego oddziaływania białko-białko poprzez pomiar anizotropii fluorescencji. Fluorofory, które rotują szybko, wykazują niską anizotropię, która wzrasta po związaniu z partnerem interakcji. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Zastosowania fluorescencji wymagają obecności fluoroforu w którejkolwiek z badanych cząsteczek. Do badania oddziaływań białko-białko stosuje się trzy rodzaje fluoroforów: 1) reszty tryptofanu obecne w białkach, 2) fluorofory przyłączone chemicznie oraz 3) fluorescencyjne partnery fuzyjne, takie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) i jego pochodne. Większość białek posiada w swojej strukturze reszty tryptofanu, zatem najprostszym sposobem pomiaru oddziaływania jest monitorowanie zmian w odpowiadających im widmach fluorescencji lub monitorowanie zmian natężenia fluorescencji reszt tryptofanu. Jednakże reszty tryptofanu mogą występować w obu białkach, co komplikuje analizę. Z drugiej strony, aby fluorofor zmienił swoje właściwości fluorescencyjne w wyniku oddziaływania, musi znajdować się na miejscu wiązania lub w jego pobliżu, co może zakłócać samo oddziaływanie. Wymaga to szczególnej uwagi przy stosowaniu rozbudowanych fluoroforów, takich jak GFP. Jeśli żadnego z tych fluoroforów nie można wykorzystać do badań wiązania, konieczne jest wprowadzenie fluoroforów zewnętrznych do jednego z białek uczestniczących w procesie. Istnieje wiele syntetycznych chemicznie fluoroforów, które można kowalencyjnie przyłączyć do białek za pomocą ich grup reaktywnych, takich jak grupy aminowe (łańcuch boczny lizyn lub koniec N) i grupy tiolowe w cysteinie. Pochodne fluoroforów z izotiocyjanianami i estrami sukcesymidylowymi reagują z grupami amidowymi, podczas gdy jodoacetamid i maleimid są grupami reaktywnymi wobec tioli 13. Najczęściej stosowanymi barwnikami w zastosowaniach fluorescencyjnych są pochodne barwników fluoresceiny i rodaminy zielonej, kumaryny, fluorofory BODIPY oraz barwniki Alexa Fluor. Szczegółową listę dostępnych komercyjnie fluoroforów i ich zastosowań można znaleźć w literaturze 14,15. Aby znakowanie przebiegło pomyślnie, grupa reaktywna musi być wyeksponowana na powierzchni białka, jednak ze względu na dużą liczbę grup funkcjonalnych reaktywnych, zazwyczaj obecnych w polipeptydach, bardzo trudno jest uzyskać modyfikację specyficzną dla konkretnego miejsca. Białko będące przedmiotem niniejszego badania, SBDS, zawiera 5 wolnych cystein i 33 lizyny, co może prowadzić do znakowania w wielu miejscach. Niejednorodne znakowanie może wpływać na wiązanie i skomplikować analizę danych, ponieważ różne cząsteczki fluoroforu mogą generować różne sygnały natężenia fluorescencji po związaniu. Aby rozwiązać ten problem, użyliśmy fluoroforu FlAsH, 4',5'-bis(1,3,2 ditiarsolan-2-yl) fluoresceiny, do celowanego znakowania białka SBDS. Jest to barwnik arsenkowy o wysokim powinowactwie do czterech rozstawionych cystein w motywie znanym jako FlAsH-tag, składającym się z sekwencji CCXXCC, gdzie X to dowolny aminokwas inny niż cysteina 16,17. Motyw tetracysteinowy ten jest dodawany do końca N- lub C- białka za pomocą inżynierii genetycznej wraz z odpowiednim łącznikiem, aby zapobiec zaburzeniu ogólnej struktury białka. Para składająca się z barwnika FlAsH i FlAsH-tag została pierwotnie zaprojektowana do specyficznego znakowania białek w żywych komórkach 17, ale może być również stosowana do znakowania oczyszczonych białek in vitro, co zostało tutaj zobrazowane. Dodatkowo opracowano strategie enzymatyczne umożliwiające specyficzną funkcjonalizację białek 18.
W niniejszym manukrypcie opisujemy użyteczność anizotropii fluorescencji jako narzędzia do badania oddziaływań białko-białko. Wiązanie można ocenić poprzez prostą analizę kształtu krzywej wiązania, natomiast informacje ilościowe można uzyskać z dopasowania danych eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td>Koraliki szklane 0,5 mm</td><td>Produkty Biospec 11079105</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td>Ultra czysty</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>barwnik 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-yl) fluoresceina</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>LC6090</td><td>Ten zestaw zawiera barwnik do oznaczania znacznika FlAsH</td></tr><tr><td>Ampiciline</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza bezwodna</td><td>Formedium</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Galaktoza</td><td>Formedium</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>Formedium</td><td>DOC0157</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptofan&nbsp;</td><td>Formedium</td><td>DOC0189</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek bezamidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Gold Biotechnology, Inc</td><td>P-470-25</td><td>Fluorek fenylometylosulfonylu</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Formedium</td><td>NAC02</td><td>Chlorek sodu&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Tecsiquim, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>Chlorek magnezu</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td></tr><tr><td>Drożdże na bazie azotu bez aminokwasów</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td>Mikrogranulowany</td></tr><tr><td>L-Tyroisne</td><td>Formedium</td><td>DOC0193</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan</td> <td>adeninyFormedium</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>Formedium</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>Jednostki filtracyjne</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10&nbsp; Filtr membranowy kDa</td></tr><tr><td>Merck</td><td>Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>Filtr membranowy, mieszane estry celulozy, Hydrofilowy, 0.22&nbsp; &mikro; m, 47&nbsp; mm, biały, gładki</td></tr><tr><td>Ni2+ kolumna powinowactwa</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>Wkład wstępnie napełniony 5&nbsp; ml Kolumna wymiennika kationowego Ni-NTA Superflow</td></tr><tr><td>Strong Sulfopropyl</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td></tr><tr><td>Kolumna wykluczająca rozmiar</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Komórka fluorescencyjna</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6860AA</td><td>Cary 60 UV-Vis</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 Zakres temperatur na stole Ambient-15&deg; do 60&deg; </td></tr><tr><td>C Wirówka</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004271</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>Wycofano</td><td>system FPLC przewodność Monitor UV-MM II Frakcja pompy P500</td></tr><tr><td>Spektrofluorometr</td><td>Olis</td><td>Nie dotyczy</td><td>Olis DM 45 z zestawem narzędzi do polaryzacji</td></tr></tbody></table>

anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Interakcje białko-białko odgrywają istotną rolę w funkcjonowaniu żywego organizmu. Po zidentyfikowaniu i walidacji interakcji konieczne jest jej scharakteryzowanie na poziomie strukturalnym i mechanistycznym. W tym celu istnieje kilka metod biochemicznych i biofizycznych. Wśród nich anizotropia fluorescencji jest potężną techniką, szczególnie stosowaną, gdy intensywność fluorescencji białka znakowanego fluoroforem pozostaje stała po interakcji białko-białko. W tej technice białko znakowane fluoroforem jest wzbudzane pionowo spolaryzowanym światłem o odpowiedniej długości fali, które selektywnie wzbudza podzbiór fluoroforów zgodnie z ich względną orientacją z przychodzącą wiązką. Powstała emisja ma również kierunkowość, której stosunek w płaszczyźnie pionowej i poziomej definiuje anizotropię (r) w następujący sposób: r=(IVV-I VH)/(IVV+2IVH), gdzie IVV i IVH są intensywnościami fluorescencji odpowiednio składowej pionowej i poziomej. Anizotropia fluorescencji jest wrażliwa na dyfuzję rotacyjną fluoroforu, a mianowicie pozorną wielkość cząsteczki fluoroforu przyłączonego do białka, która ulega zmianie w wyniku interakcji białko-białko. W niniejszym tekście przedstawiono zastosowanie anizotropii fluorescencji jako narzędzia do badania interakcji białko-białko w celu rozwiązania problemu wiązania między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a czynnikiem wydłużenia, takim jak GTPaza 1 (EFL1). Tradycyjnie znakowanie białka fluoroforem przeprowadza się na grupach tiolowych (cysteina) lub w grupach aminowych (N-końcowa amina lub lizyna) białka. Jednak SBDS posiada kilka cystein i lizyn, które nie pozwalały na jego etykietowanie skierowane na miejsce. Jako alternatywną technikę, barwnik 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-yl) fluoresceina został użyty do specyficznego znakowania motywu tetracysteiny, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetycznie zmodyfikowanego w C-końcu rekombinowanego białka SBDS. Dopasowanie danych doświadczalnych dostarczyło ilościowych i mechanistycznych informacji na temat sposobu wiązania między tymi białkami.

Aby przeprowadzić jakikolwiek eksperyment z anizotropią, ważne jest wykluczenie dużych zmian w intensywności fluorescencji fluoroforu, ponieważ anizotropia mieszaniny gatunków jest reprezentowana przez Równanie 5:
<img alt="Równanie równowagi statycznej: r=ΣiFi*ri. Zasady matematyczne dla analizy inżynieryjnej." src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation5">
<p class="jove_...

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ocena i ilościowe określenie oddziaływania między dwoma badanymi białkami przy użyciu anizotropii fluorescencji. Pomiary te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii i biofizyki białek, na przykład dotyczące białek, których oddziaływania są istotne dla funkcji komórkowych.Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania ilościowych i jakościowych informacji na temat oddziaływań białko-białko. Aby przygotować oczyszczone białko SBDS-FlAsH, należy najpierw przygotować jeden litr płynnej pożywki LB uzupełnionej o 100 µg/mL ampicyliny. Następnie w pożywce tej należy hodować transformowane bakterie w temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 0,5 do 0,7.Indukować ekspresję białka SBDS-FlAsH poprzez dodanie 0,5 mM IPTG do hodowli i kontynuować inkubację przez kolejne pięć godzin. Następnie zebrać zawiesinę bakteryjną poprzez wirowanie przy 3800 ×g przez dziesięć minut w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz.Ponownie zawiesić komórki w 35 ml buforu lizującego SBDS uzupełnionego o 1 mM PMSF. Przeprowadzić lizę metodą sonikacji przez łącznie cztery minuty, stosując cykle 10 sekund pra

fluorescence-anisotropy-as-tool-to-study-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

W tym filmie opisujemy technikę anizotropii fluorescencji do badania interakcji między białkiem zespołu Shwachmana-Diamonda (SBDS) oznaczonym fluoroforem a czynnikiem wydłużenia 1 GTPazą (EFL1). Podczas inkubacji białek SBDS ze stopniowo rosnącymi stężeniami EFL1 obserwuje się stały wzrost anizotropii, co wskazuje na udaną interakcję między tymi dwoma białkami.

Wykrywanie interakcji białko-białko oparte na anizotropii fluorescencyjnej

Ten film opisuje wysoce wydajną anizotropię fluorescencji, która pomaga monitorować interakcję między czynnikami transkrypcyjnymi a DNA. Test monitoruje interakcje cząsteczki DNA znakowanej fluoroforem z jej specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym, mierząc stopień polaryzacji spowodowanej rotacją molekularną lub anizotropią DNA znakowanego fluoroforem.

Anizotropia fluorescencyjna w celu określenia powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego i DNA

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Ten protokół opisuje bezkalibracyjne podejście do ilościowego określania homo-oligomeryzacji białek in vitro na podstawie spektroskopii fluktuacji fluorescencji przy użyciu komercyjnej mikroskopii skaningowej światła. Wyświetlane są prawidłowe ustawienia akwizycji i metody analizy.

Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Poznaj anizotropię fluorescencyjną do badania oddziaływań białko-białko między białkami SBDS a EFL1. Technika ta dostarcza ilościowych i jakościowych danych kluczowych dla biochemii białek.

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Przeglądaj więcej filmów