Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy
4 listopada 2016
Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wyizolowanie plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych lub PDC o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń w celu zbadania ich funkcji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z charakterystyką określonej populacji komórek odpornościowych, takimi jak PDC wytwarzający interferon alfa w późnym stadium rozwoju tocznia. Główną zaletą tej techniki jest to, że od jednej do kilku populacji docelowych można wzbogacić do wyższej czystości niż w przypadku magnetycznego sortowania kulkowego.
Po zbiorach przenieś kości kończyn tylnych i cztery mililitry kompletnego podłoża do moździerza. Dodaj sześć mililitrów świeżej, kompletnej pożywki, aby zwiększyć całkowitą objętość do 10 mililitrów. I delikatnie połam kości tłuczkiem.
Delikatnie wymieszaj tłuczek, aby uwolnić szpik kostny. Następnie przenieś całe podłoże przez sitko o średnicy 70 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów na lodzie. Do zaprawy dodać 10 mililitrów świeżej kompletnej pożywki.
I przefiltruj supernatant jeszcze dwa razy, aż kości staną się białe. Następnie odwirować komórki szpiku kostnego i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach świeżego kompletnego podłoża. Następnie ułóż komórki na pięciu mililitrach świeżo przygotowanego podłoża o gradiencie gęstości w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, uważając, aby nie naruszyć warstw.
I oddziel komórki przez odwirowanie. Następnie ostrożnie usuń górne osiem mililitrów roztworu i zbierz dwumililitrową warstwę kożucha na skrzyżowaniu. Dodaj 12 mililitrów lodowatej pożywki do izolowanych komórek jednojądrzastych i zamknij probówkę do wymieszania przez inwersję.
Następnie granuluj komórki przez odwirowanie. Aby wybarwić komórki pod kątem FACS, ponownie zawiesić je w 100 mikrolitrach przeciwciała blokującego CD1632FC w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 10 minutach umyj komórki w czterech mililitrach lodowatego buforu sortującego i oznacz komórki 100 mikrolitrami odpowiedniego koktajlu przeciwciał barwiących powierzchnię komórek.
Przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Umyj komórki w czterech mililitrach lodowatego buforu sortującego, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała sprzężone z fluorescencją. Następnie ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach roztworu ładującego FACS i przenieść próbkę do probówki FACS na lodzie.
Aby zabarwić kontrole kompensacyjne, podwielokrotność 10 do sześciu splennocytów na probówkę. Umyj komórki czterema mililitrami buforu sortującego i ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach buforu sortującego. Następnie dodaj odpowiednie przeciwciało sprzężone z fluorescencją z koktajlu przeciwciał powierzchniowych komórek macierzystych do każdej odpowiedniej probówki kompensacyjnej i potrząśnij probówkami, aby wymieszać.
Po 15 minutach w ciemności, w temperaturze czterech stopni Celsjusza, umyj wszystkie próbki buforem sortującym i ponownie zawieś granulki w 500 mikrolitrach lodowatego buforu sortującego. Z wyjątkiem rurki DAPI, która jest ponownie zawieszona w 500 mikrolitrach roztworu ładującego FACS. Aby oczyścić docelową populację komórek przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, należy załadować probówki zbiorcze zawierające 500 mikrolitrów FBS uzupełnionych antybiotykami poniżej zaworów sortujących.
Następnie załaduj niezabarwioną rurkę i zbierz 10 000 zdarzeń, aby ustawić bramkę ujemną dla każdej intensywności fluorescencji. I 10 000 zdarzeń w pojedynczych rurkach kompensacji barwienia, aby ustawić bramkę dodatnią dla każdej intensywności fluorescencji. Zbierz 3 000 zdarzeń z próbki eksperymentalnej, aby ustawić bramki posortowanej populacji komórek.
Wykorzystanie intensywności fluorescencji jako parametrów wykresu dostępu X i Y do ręcznego bramkowania docelowej populacji komórek. Następnie posortuj docelową populację komórek do probówki zbiorczej. Pod koniec sortowania dodaj do komórek do czterech mililitrów kompletnej pożywki ice cole.
Następnie zakryj probówkę i wymieszaj komórki przez odwrócenie. Oczyszczone komórki rozpylić przez odwirowanie, odsysając wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów supernatantu. Następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatego kompletnego podłoża i przenieść komórki do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej w celu drugiego odwirowania.
Na koniec odessać wszystkie oprócz ostatnich 100 mikrolitrów supernatantu i przechowywać posortowaną populację komórek na lodzie do czasu użycia. Magnetyczne sortowanie komórek plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych szpiku kostnego od myszy podatnych na toczeń daje tylko 7,75% czystości po wzbogaceniu. Plazmocytoidalne komórki dendrytyczne wzbogacone w FACS wykazują jednak czystość sięgającą 96,4% po sortowaniu.
Aby zapewnić wysoką czystość, jednojądrzaste komórki szpiku kostnego są najpierw bramkowane i oddzielane od zanieczyszczeń za pomocą parametrów rozpraszania do przodu i boku. Korzystając z szerokości rozproszenia do przodu w stosunku do wysokości rozproszenia do przodu i szerokości rozproszenia bocznego w stosunku do wysokości rozproszenia bocznego, pojedyncze komórki są dodatkowo bramkowane, aby uniknąć fałszywie dodatnich sygnałów wytwarzanych przez agregacje. Żywe pojedyncze komórki ujemne DAPI są następnie bramkowane przez ich CD11c dodatnią, CD11B ujemną ekspresję powierzchni komórki, co pozwala na dalsze bramkowanie populacji komórek dendrytycznych plazmocytoidu szpiku kostnego B220 dodatniego, PDCA-1 dodatniego.
Posortowana populacja PDC jest nie tylko o wysokiej czystości, ale także funkcjonalnie normalna, ze zdolnością do wytwarzania IFNalpha po stymulacji CPG in vitro. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o złamaniu kości i delikatnym wymieszaniu uwolnionego szpiku kostnego, aby zachować żywotność komórek. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA lub hodowla i stymulacja in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji genów lub funkcji wzbogaconych populacji komórek.
Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom z PDC do zbadania roli tej potężnej komórki w rozwoju modeli myszy z toczniem i podatnym na toczeń. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować wysoce oczyszczoną populację PDC ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół izolacji plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) z szpiku kostnego myszy z predyspozycją do tocznia za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Metoda ta ma na celu uzyskanie wysokiej czystości w celu przeprowadzenia późniejszych badań funkcjonalnych pDC.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Autoimmunologia
Wprowadzenie
- Plazmacytoidalne komórki dendrytyczne są kluczowe dla odpowiedzi odpornościowej.
- Produkują one interferon alfa, szczególnie podczas progresji tocznia.
- Izolacja o wysokiej czystości jest niezbędna do dokładnej analizy funkcjonalnej.
- Sortowanie komórek metodą fluorescencji (FACS) oferuje przewagi nad metodami tradycyjnymi.
Cel badania
- Izolacja pDC z myszy predysponowanych do tocznia.
- Badanie cech funkcjonalnych pDC.
- Pogłębienie zrozumienia zachowania komórek odpornościowych w toczniu.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie szpiku kostnego od myszy predysponowanych do tocznia.
- Wykorzystanie sortowania komórek aktywowane fluorescencją do izolacji.
- Przygotowanie pożywki kompletnej do przetwarzania komórek.
- Kruszenie kości w celu uwolnienia komórek do sortowania.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja pDC o wysokiej czystości.
- Pogłębione zrozumienie funkcji pDC w toczniu.
- Wykazanie zalet sortowania komórek metodą fluorescencyjną (FACS).
- Opracowanie niezawodnego protokołu do przyszłych badań.
Wnioski
- Protokół ten pozwala na skuteczną izolację pDC do badań funkcjonalnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia patologii tocznia.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolowanie rzadkich populacji komórek odpornościowych z wysoką czystością jest kluczowe dla mechanistycznego ograniczania ryzyka w procesie walidacji celów terapeutycznych oraz opracowywania modeli przedklinicznych. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) umożliwia precyzyjną separację fenotypową plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy predysponowanych do tocznia, co wspiera wiarygodne testy funkcjonalne i odkrywanie biomarkerów translacyjnych. Podejście to redukuje szum biologiczny we wczesnej fazie odkryć, zwiększając pewność prognostyczną w przypadku późniejszego testowania hipotez terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w patogenezie tocznia poprzez izolację czystej populacji do badań nad produkcją interferonu alfa.
- Wartość operacyjna: Pozwala na osiągnięcie czystości do 96,4% po sortowaniu, co znacząco przewyższa alternatywne metody magnetycznej separacji komórek.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność w określaniu celu poprzez redukcję heterogeniczności komórkowej w odczytach funkcjonalnych, co wspomaga decyzje go/no-go w badaniach przesiewowych immunomodulatorów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie oczyszczonych plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych odpowiednich do testów stymulacji in vitro, takich jak pomiar interferonu alfa indukowanego przez CpG.
- Wartość operacyjna: Umożliwia jednoczesną separację wielu populacji komórek, co zwiększa przepustowość eksperymentów i standaryzację testów.
- Wartość strategiczna: Tworzy powtarzalny materiał wejściowy dla procesów przesiewowych, umożliwiając wiarygodną ocenę związków w odniesieniu do zdefiniowanych fenotypów immunologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia system istotny w badaniach nad chorobą, wykorzystujący modele mysie z predyspozycją do tocznia, w celu zbadania roli plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych w autoimmunizacji.
- Wartość operacyjna: Izolowane komórki zachowują prawidłową funkcjonalność, wykazując zdolność do produkcji interferonu alfa po stymulacji, co potwierdza gotowość do przeprowadzania testów.
- Wartość strategiczna: Ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, dostarczając dobrze scharakteryzowane komórki pierwotne do badań nad mechanizmem działania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, wspierając wczesną walidację celów poprzez screening fenotypowy oraz umożliwiając identyfikację związków wiodących za pomocą odczytów funkcjonalnych w oczyszczonych komórkach układu odpornościowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w celu wyjaśnienia ich roli w patogenezie tocznia napędzanej przez interferon.
- Screening: Dostarcza ustandaryzowane, wysokiej czystości populacje komórek do powtarzalnych analiz funkcjonalnych i screeningu związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary zmiennych zależnych, takich jak produkcja cytokin, odczyty z cytometrii przepływowej oraz ocena czystości za pomocą bramkowania rozproszenia przedniego/bocznego.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez zastosowanie myszy predysponowanych do tocznia, co jest zgodne z mechanistyczną redukcją ryzyka w modelach chorób autoimmunologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość wielokrotnego wykorzystania metody izolacji rzadkich komórek odpornościowych w wielu projektach z zakresu immunologii i autoimmunologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie wiarygodności wyników dzięki redukcji niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach funkcji komórek odpornościowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zdefiniowanym strategiom bramkowania oraz kontrolom kompensacji.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) oraz zmniejszenie biologicznego ryzyka na późnych etapach rozwoju immunomodulatorów.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o wiarygodne dane przedkliniczne z oczyszczonych populacji komórek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie cytometrii przepływowej, barwienia komórek oraz kontroli kompensacji w celu zapewnienia dokładnej fluorescencyjnej segregacji komórek.
- Procedura jest zależna od aparatury, w tym cytometrów przepływowych, urządzeń do sortowania oraz systemów wirowania do obróbki szpiku kostnego.
- Konieczna jest standaryzacja paneli przeciwciał, strategii bramkowania i protokołów sortowania pomiędzy zespołami zajmującymi się immunologią i opracowywaniem analiz.
- W przypadku zastosowania protokołu w innych systemach modelowych lub źródłach tkankowych poza szpikiem kostnym myszy, należy rozważyć niezbędne adaptacje.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność delikatnego rozdrabniania szpiku kostnego w celu zachowania żywotności komórek oraz czasochłonny charakter wieloetapowego oczyszczania.
