Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy
November 4th, 2016
Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wyizolowanie plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych lub PDC o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń w celu zbadania ich funkcji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z charakterystyką określonej populacji komórek odpornościowych, takimi jak PDC wytwarzający interferon alfa w późnym stadium rozwoju tocznia. Główną zaletą tej techniki jest to, że od jednej do kilku populacji docelowych można wzbogacić do wyższej czystości niż w przypadku magnetycznego sortowania kulkowego.
Po zbiorach przenieś kości kończyn tylnych i cztery mililitry kompletnego podłoża do moździerza. Dodaj sześć mililitrów świeżej, kompletnej pożywki, aby zwiększyć całkowitą objętość do 10 mililitrów. I delikatnie połam kości tłuczkiem.
Delikatnie wymieszaj tłuczek, aby uwolnić szpik kostny. Następnie przenieś całe podłoże przez sitko o średnicy 70 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów na lodzie. Do zaprawy dodać 10 mililitrów świeżej kompletnej pożywki.
I przefiltruj supernatant jeszcze dwa razy, aż kości staną się białe. Następnie odwirować komórki szpiku kostnego i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach świeżego kompletnego podłoża. Następnie ułóż komórki na pięciu mililitrach świeżo przygotowanego podłoża o gradiencie gęstości w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, uważając, aby nie naruszyć warstw.
I oddziel komórki przez odwirowanie. Następnie ostrożnie usuń górne osiem mililitrów roztworu i zbierz dwumililitrową warstwę kożucha na skrzyżowaniu. Dodaj 12 mililitrów lodowatej pożywki do izolowanych komórek jednojądrzastych i zamknij probówkę do wymieszania przez inwersję.
Następnie granuluj komórki przez odwirowanie. Aby wybarwić komórki pod kątem FACS, ponownie zawiesić je w 100 mikrolitrach przeciwciała blokującego CD1632FC w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 10 minutach umyj komórki w czterech mililitrach lodowatego buforu sortującego i oznacz komórki 100 mikrolitrami odpowiedniego koktajlu przeciwciał barwiących powierzchnię komórek.
Przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Umyj komórki w czterech mililitrach lodowatego buforu sortującego, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała sprzężone z fluorescencją. Następnie ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach roztworu ładującego FACS i przenieść próbkę do probówki FACS na lodzie.
Aby zabarwić kontrole kompensacyjne, podwielokrotność 10 do sześciu splennocytów na probówkę. Umyj komórki czterema mililitrami buforu sortującego i ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach buforu sortującego. Następnie dodaj odpowiednie przeciwciało sprzężone z fluorescencją z koktajlu przeciwciał powierzchniowych komórek macierzystych do każdej odpowiedniej probówki kompensacyjnej i potrząśnij probówkami, aby wymieszać.
Po 15 minutach w ciemności, w temperaturze czterech stopni Celsjusza, umyj wszystkie próbki buforem sortującym i ponownie zawieś granulki w 500 mikrolitrach lodowatego buforu sortującego. Z wyjątkiem rurki DAPI, która jest ponownie zawieszona w 500 mikrolitrach roztworu ładującego FACS. Aby oczyścić docelową populację komórek przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, należy załadować probówki zbiorcze zawierające 500 mikrolitrów FBS uzupełnionych antybiotykami poniżej zaworów sortujących.
Następnie załaduj niezabarwioną rurkę i zbierz 10 000 zdarzeń, aby ustawić bramkę ujemną dla każdej intensywności fluorescencji. I 10 000 zdarzeń w pojedynczych rurkach kompensacji barwienia, aby ustawić bramkę dodatnią dla każdej intensywności fluorescencji. Zbierz 3 000 zdarzeń z próbki eksperymentalnej, aby ustawić bramki posortowanej populacji komórek.
Wykorzystanie intensywności fluorescencji jako parametrów wykresu dostępu X i Y do ręcznego bramkowania docelowej populacji komórek. Następnie posortuj docelową populację komórek do probówki zbiorczej. Pod koniec sortowania dodaj do komórek do czterech mililitrów kompletnej pożywki ice cole.
Następnie zakryj probówkę i wymieszaj komórki przez odwrócenie. Oczyszczone komórki rozpylić przez odwirowanie, odsysając wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów supernatantu. Następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatego kompletnego podłoża i przenieść komórki do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej w celu drugiego odwirowania.
Na koniec odessać wszystkie oprócz ostatnich 100 mikrolitrów supernatantu i przechowywać posortowaną populację komórek na lodzie do czasu użycia. Magnetyczne sortowanie komórek plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych szpiku kostnego od myszy podatnych na toczeń daje tylko 7,75% czystości po wzbogaceniu. Plazmocytoidalne komórki dendrytyczne wzbogacone w FACS wykazują jednak czystość sięgającą 96,4% po sortowaniu.
Aby zapewnić wysoką czystość, jednojądrzaste komórki szpiku kostnego są najpierw bramkowane i oddzielane od zanieczyszczeń za pomocą parametrów rozpraszania do przodu i boku. Korzystając z szerokości rozproszenia do przodu w stosunku do wysokości rozproszenia do przodu i szerokości rozproszenia bocznego w stosunku do wysokości rozproszenia bocznego, pojedyncze komórki są dodatkowo bramkowane, aby uniknąć fałszywie dodatnich sygnałów wytwarzanych przez agregacje. Żywe pojedyncze komórki ujemne DAPI są następnie bramkowane przez ich CD11c dodatnią, CD11B ujemną ekspresję powierzchni komórki, co pozwala na dalsze bramkowanie populacji komórek dendrytycznych plazmocytoidu szpiku kostnego B220 dodatniego, PDCA-1 dodatniego.
Posortowana populacja PDC jest nie tylko o wysokiej czystości, ale także funkcjonalnie normalna, ze zdolnością do wytwarzania IFNalpha po stymulacji CPG in vitro. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o złamaniu kości i delikatnym wymieszaniu uwolnionego szpiku kostnego, aby zachować żywotność komórek. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA lub hodowla i stymulacja in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji genów lub funkcji wzbogaconych populacji komórek.
Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom z PDC do zbadania roli tej potężnej komórki w rozwoju modeli myszy z toczniem i podatnym na toczeń. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować wysoce oczyszczoną populację PDC ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia protokół izolowania komórek dendrytycznych plasmacytoidalnych (pDC) z szpiku kostnego myszy predysponowanych do tocznia za pomocą sortowania komórek z aktywacją fluorescencyjną. Metoda ma na celu osiągnięcie wysokiej czystości dla kolejnych badań funkcjonalnych pDC.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Autoimmunologia
Tło
- Komórki dendrytyczne plasmacytoidalne są kluczowe dla odpowiedzi immunologicznych.
- Produkują interferon alfa, szczególnie podczas progresji tocznia.
- Izolacja o wysokiej czystości jest niezbędna do dokładnej analizy funkcjonalnej.
- Sortowanie komórek z aktywacją fluorescencyjną oferuje zalety w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Cel badania
- Izolować pDC z myszy predysponowanych do tocznia.
- Zbadać funkcjonalne cechy pDC.
- Zwiększyć zrozumienie zachowania komórek immunologicznych w toczniu.
Zastosowane metody
- Zbiór szpiku kostnego od myszy predysponowanych do tocznia.
- Zastosowanie sortowania komórek z aktywacją fluorescencyjną do izolacji.
- Przygotowanie pełnego medium do przetwarzania komórek.
- Kruszenie kości w celu uwolnienia komórek do sortowania.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja pDC o wysokiej czystości.
- Zwiększone zrozumienie funkcji pDC w toczniu.
- Wykazane zalety sortowania komórek z aktywacją fluorescencyjną.
- Dostarczenie niezawodnego protokołu dla przyszłych badań.
Wnioski
- Protokół skutecznie izolowuje pDC na potrzeby badań funkcjonalnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia patologii tocznia.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating rare immune cell populations with high purity is critical for mechanistic de-risking in target validation and preclinical model development. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables precise phenotypic separation of plasmacytoid dendritic cells from lupus-prone mouse bone marrow, supporting reliable functional assays and translational biomarker discovery. This approach reduces biological noise in early discovery, improving predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plasmacytoid dendritic cell function in lupus pathogenesis by isolating a pure population for interferon alpha production studies.
- Operational Value: Achieves up to 96.4% purity post-sorting, significantly exceeding magnetic-activated cell sorting alternatives.
- Strategic Value: Supports target confidence by reducing cellular heterogeneity in functional readouts, aiding go/no-go decisions in immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified plasmacytoid dendritic cells suitable for in vitro stimulation assays, such as CpG-induced interferon alpha measurement.
- Operational Value: Permits simultaneous separation of multiple cell populations, increasing experimental throughput and assay standardization.
- Strategic Value: Creates a reproducible input for screening workflows, enabling reliable compound evaluation against defined immune phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system using lupus-prone mouse models to study plasmacytoid dendritic cell contributions to autoimmunity.
- Operational Value: Isolated cells remain functionally normal, capable of interferon alpha production upon stimulation, validating assay readiness.
- Strategic Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by supplying well-characterized primary cells for mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early target validation through phenotypic screening and enabling lead identification via functional readouts in purified immune cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating plasmacytoid dendritic cells to clarify their role in interferon-driven lupus pathology.
- Screening: Delivers standardized, high-purity cell populations for reproducible functional assays and compound screening.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as cytokine production, flow cytometry readouts, and purity assessment via forward/side scatter gating.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of lupus-prone mice, aligning with mechanistic de-risking in autoimmune disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating rare immune cells across multiple immunology and autoimmunity projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduction of mechanistic ambiguity in immune cell function studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined gating strategies and compensation controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions and reduced late-stage biological risk in immunomodulator development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable preclinical data from purified cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell staining, and compensation controls for accurate fluorescence-activated cell sorting.
- Dependent on instrumentation including flow cytometers, sorting equipment, and centrifugation systems for bone marrow processing.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, gating strategies, and sorting protocols across immunology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other model systems or tissue sources beyond mouse bone marrow.
- Includes practical limitations such as the need for gentle bone marrow disruption to preserve cell viability and the time-intensive nature of multi-step purification.
