Name: Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę sortowania komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy z toczniem. Technika zapewnia wysoką czystość próbek do badań funkcjonalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Laboratorium Cytometrii Przepływowej w Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine za korzystanie z podstawowego urządzenia do cytometrii przepływowej. Prace te były wspierane przez fundusze startowe XML. XL jest stypendystą Stamps Fellow w programie dla absolwentów nauk biomedycznych i weterynaryjnych.

UWAGA: Myszy podatne na toczeń MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) były hodowane i utrzymywane w określonym obiekcie wolnym od patogenów zgodnie z wymaganiami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Virginia Tech (numer gwarancji dobrostanu zwierząt: A3208-01). Badanie to zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem IACUC #12-062.
1. Pożywka do hodowli komórkowych i bufor sortujący
<ol>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę do hodowli komórkowych (C10) przy użyciu RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1 mM pirogronianem sodu, 1% 100 aminokwasów endogennych MEM, 10 mM HEPES, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Przygotować bufor sortujący (pełny HBSS) przy użyciu 1x Zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) uzupełnionego 10 mM HEPES, 2,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0,05 mM MgCl2 i 0,2 U/ml DNazy I.</li>
</ol>
2. Sekcja myszy
<ol>
	<li>Przygotuj dwie naczynia o średnicy 6 cm zawierające 4 ml C10. Ułóż naczynia na lodzie.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 .</li>
	<li>Zbierz śledzionę i trzymaj ją w naczyniu z C10 na lodzie.
	<ol>
		<li>Przygwoźdź mysz brzuchem do góry na płycie preparcyjnej. Wysterylizuj ciało, rozpylając 70% etanolu.</li>
		<li>Przetnij skórę i oddziel skórę od ściany mięśniowej pod spodem wzdłuż brzusznej linii środkowej od spojenia łonowego do szyi.</li>
		<li>Przetnij skórę wzdłuż tylnej kończyny od pierwszego nacięcia do kostki.</li>
		<li>Przypnij skórę z powrotem po bokach i przetnij ścianę mięśniową wzdłuż boków od pierwszego miejsca nacięcia do przepony.</li>
		<li>Przypnij ścianę mięśniową z powrotem po prawej stronie głowy.</li>
		<li>Zlokalizuj śledzionę po prawej stronie myszy pod jelitem cienkim i obok żołądka. Podnieś jeden koniec śledziony i oddziel go od żołądka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytnij obie tylne kończyny, w tym kość udową i piszczelową, i usuń wszystkie mięśnie tak bardzo, jak to możliwe.
	<ol>
		<li>Przetnij mięśnie wzdłuż tylnej kończyny od stawu miednicznego/biodrowego do kostki ostrymi nożycami, starając się unikać naczyń krwionośnych.</li>
		<li>Oddziel tylną kończynę, przecinając staw miednicy/biodrowy i staw skokowy/stopowy bez odsłaniania zawartości szpiku kostnego.</li>
		<li>Oczyść pozostałe mięśnie na kościach, wielokrotnie drapiąc żyletką i przecinając mięśnie w punktach stawowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kości należy przechowywać na lodzie w naczyniu o średnicy 6 cm zawierającym 4 ml C10. Przejdź do analizowania następnej myszy.</li>
</ol>
3. Izolacja splenocytów
<ol>
	<li>Delikatnie homogenizować śledzionę za pomocą tłoka strzykawki na sitku do komórek o średnicy 70 μm umieszczonym na górze naczynia zawierającego 4 ml C10, aż nie będą widoczne żadne czerwone kawałki.</li>
	<li>Dodać dodatkowe 6 ml C10 do naczynia przez sitko, a następnie przenieść całe 10 ml zawiesiny komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować stożkową probówkę o masie 800 x g przez 5 minut, 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml 1 x bufor do lizy krwinek czerwonych (RBC). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Po inkubacji odwirować stożkową probówkę o sile 800 x g przez 5 minut, 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml C10. Wyrzuć wszelkie duże grudki (martwe komórki) i trzymaj probówkę na lodzie na później. 
	UWAGA: Jeśli jest wiele małych grudek, użyj sitka do komórek o średnicy 70 μm, aby raz przefiltrować zawiesinę komórek.</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą trypana niebieskiego za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
</ol>
4. Izolacja komórek szpiku kostnego
<ol>
	<li>Przenieść kości z 4 ml C10 do moździerza i dodać 6 ml C10, aby uzyskać objętość 10 ml C10.</li>
	<li>Delikatnie rozbij kości w moździerzu za pomocą tłuczka.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj tłuczkiem, aby uwolnić szpik kostny do C10.</li>
	<li>Przenieść 10 ml C10 zawierający szpik kostny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml na lodzie przez sitko o średnicy 70 μm. Dodać 10 ml świeżego C10 do moździerza zawierającego jeszcze kości. 
	UWAGA: Kilkakrotnie odpipetować roztwór zawierający szpik kostny w górę i w dół przed przejściem przez sitko, jeśli widoczne są czerwone grudki.</li>
	<li>Powtórz kroki od 4.2 do 4.4 dwukrotnie. Po ostatnim praniu kości powinny wydawać się białe.</li>
	<li>Odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml przy 800 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. W międzyczasie należy przygotować 5 ml gotowej do użycia pożywki o gradientce gęstości w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml C10.</li>
	<li>Powoli ułóż 10 ml zawiesiny komórek na wierzchu 5 ml gradientu gęstości, zachowując wyraźny interfejs między dwiema fazami. Następnie odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml o masie 1,363 g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (20 °C) z przyspieszeniem ustawionym na 9 i opóźnieniem ustawionym na 0 (lub hamulec wyłączony).</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie usunąć górne 8 ml roztworu i zebrać 2 ml kożucha na granicy faz (warstwa komórek jednojądrzastych) do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 12 ml lodowatego C10 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej jednojądrzaste komórki szpiku kostnego, kilkakrotnie zakryć i odwrócić do góry dnem do dobrego wymieszania, a następnie odwirować probówkę o sile 800 x g przez 10 minut, 4 °C.</li>
</ol>
5. Barwienie powierzchni komórek dla FACS
<ol>
	<li>Barwienie próbki
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór przeciwciała przeciwko myszom CD16/32 (rozcieńczenie 1 do 100 w pełnym HBSS, końcowe stężenie 5 μg/ml).</li>
		<li>Po odwirowaniu w kroku 4.10 odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl roztworu przeciwciała anty-mysiego CD16/32 w celu zablokowania receptora Fc na komórkach jednojądrzastych. Inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę przeciwciał sprzężonych z fluorescencją (rozcieńczenie anty-mysie CD11c-PE 1:40, rozcieńczenie anty-mysie CD11b-APC-CY7 rozcieńczenie 1:80, rozcieńczenie anty-mysie PDCA-1-FITC 1:40 i rozcieńczenie anty-mysie B220-V500 1:40 w HBSS-full zgodnie z zaleceniami producenta w 100 μl końcowej objętości na próbkę). 
		UWAGA: Ważne jest, aby miareczkować przeciwciała przed użyciem.</li>
		<li>Po 10 minutach inkubacji w kroku 5.1.2 dodać 4 ml lodowatego pełnego HBSS i odwirować przy 800 x g przez 5 minut, 4 °C w celu usunięcia niezwiązanego CD16/32 przeciwko myszy.</li>
		<li>Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl mieszaniny przeciwciał sprzężonych z fluorescencją. Inkubować na lodzie przez 15 minut w ciemności.</li>
		<li>Po 15 minutach inkubacji dodać 4 ml lodowatego HBSS i wirować przy 800 x g przez 5 minut, 4 °C w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał sprzężonych z fluorescencją.</li>
		<li>Przygotować roztwór ładujący FACS (500 ng/ml DAPI w pełnym HBSS).</li>
		<li>Po odwirowaniu w kroku 5.1.6 odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze ładującym FACS o stężeniu 500 μl. Przenieś zawiesinę komórek do okrągłej probówki dennej o wymiarach 12 x 75 mm (probówka FACS) i trzymaj probówkę na lodzie w ciemności do momentu sortowania w ciągu 1 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie w celu kompensacji
	<ol>
		<li>Oznacz 6 probówek FACS jako PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI lub niebarwione. Porcję splenocytów w ilości 1 x 106 komórek/probówkę do probówek FACS i przemyć 4 ml HBSS-full przy 800 x g przez 5 min, 4 °C. 
		UWAGA: Użyj barwnika fluorescencyjnego wiążącego DNA, DAPI, aby odróżnić żywe komórki od martwych. DAPI może przenikać przez błonę plazmatyczną martwych komórek (ale nie żywych komórek) i wiązać chromosomowe DNA.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl HBSS-full.</li>
		<li>W każdej odpowiedniej probówce FACS dodać jedno z następujących przeciwciał: rozcieńczenie anty-mysie CD19-PE 1:40, rozcieńczenie anty-mysie CD11b-APC-CY7 1:80, rozcieńczenie anty-mysie PDCA-1-FITC 1:40 lub rozcieńczenie anty-mysie B220-V500 1:40 zgodnie z zaleceniami producenta. Pozostaw5-tą (DAPI) i6-tą (niebarwioną) probówkę FACS bez zmian. Dobrze wymieszaj, wstrząsając i inkubuj wszystkie probówki FACS na lodzie w ciemności przez 15 minut.</li>
		<li>Po inkubacji dodać 4 ml lodowatego HBSS do każdej probówki i odwirować probówki FACS przy 800 x g przez 5 minut, 4 °C.</li>
		<li>Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl lodowato zimnym HBSS, z wyjątkiem osadu w probówce oznaczonej DAPI, który jest ponownie zawieszany w 500 μl roztworu ładującego FACS. Trzymanie wszystkich 6 probówek na lodzie w ciemności do momentu sortowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Sortowanie w sortowniku komórek
UWAGA: Działanie procedury sortowania na cytometrze i oprogramowaniu jest ustandaryzowane ze szczegółową instrukcją dostarczoną przez firmę. Krótko mówiąc, używamy dyszy 100 mikronów przy 20 psi, ustawiamy docelowe stężenie komórek w zakresie 5 - 10 milionów na ml i dostosowujemy wydajność do 70% lub więcej (tj. konflikty utrzymywane poniżej 30%).
<ol>
	<li>Przygotować probówki do zbierania FACS z 500 μl FBS/probówkę zawierającą 100 j./ml penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Dostosuj parametry kompensacji sortera komórek za pomocą pojedynczych probówek kompensacyjnych z punktu 5.2.
	<ol>
		<li>Nagraj 10 000 komórek w niebarwionej probówce, aby ustawić ujemną bramkę dla każdej intensywności fluorescencji.</li>
		<li>Nagraj 10 000 komórek w innych probówkach do kompensacji pojedynczego zabarwienia, aby ustawić dodatnią bramkę dla każdej intensywności fluorescencji. 
		UWAGA: Oprogramowanie automatycznie oblicza parametry kompensacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj jednej próbki z kroku 5.1, aby ustawić bramki posortowanych populacji komórek, rejestrując 3 000 komórek. Używając intensywności fluorescencji jako parametrów wykresu osi X i Y, ręcznie bramkuj populację komórek docelowych jako grupę kropek pozornie oddzielonych od innych kropek. 
	UWAGA: Ten zestaw bramkowania jest elastyczny i arbitralny w zależności od wymagań badaczy. Jeśli badacze spodziewają się wyższej czystości na podstawie jednego lub więcej markerów, przesuń bramkę wyżej w oparciu o odpowiednią intensywność fluorescencji.</li>
	<li>Załaduj probówkę zbiorczą i zacznij sortować docelową populację komórek.</li>
	<li>Po posortowaniu trzymaj probówkę zbiorczą na lodzie, aż wszystkie probówki z próbkami będą gotowe.</li>
	<li>Dodaj lodowaty C10 do probówki zbiorczej o pojemności do 4 ml, zakręć i odwróć do wymieszania.</li>
	<li>Odwirować probówkę zbiorczą o stężeniu 800 x g przez 5 minut, 4 °C, a następnie odessać supernatant, pozostawiając około 200 μl z nietkniętym osadem komórkowym.</li>
	<li>Dodać 1 ml lodowatego C10, aby ponownie zawiesić osad komórkowy i przenieść całą zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml o stężeniu 800 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C i odessać supernatant, pozostawiając 100 μl z nietkniętym osadem komórkowym.</li>
	<li>Posortowane populacje komórek należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting.</a> Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).</li>
<li>Herzenberg, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+the+fluorescence+activated+cell+sorter+and+flow+cytometry%3A+a+view+from+Stanford%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford.</a> Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).</li>
<li>Brown, M., Wittwer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+principles+and+clinical+applications+in+hematology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology.</a> Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).</li>
<li>Laerum, O. D., Farsund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+flow+cytometry%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Clinical application of flow cytometry: a review.</a> Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).</li>
<li>Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+flow+cytometry+to+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of flow cytometry to clinical microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).</li>
<li>Mattanovich, D., Borth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+cell+sorting+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Applications of cell sorting in biotechnology.</a> Microb Cell Fact. 5 (12), (2006).</li>
<li>Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD95+and+CCR7+expression+on+circulating+CD4%28%2B%29+lymphocytes+revealed+disparate+immunoregulatory+potentials+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus.</a> Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).</li>
<li>Cullender, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immunity+interact+to+quench+microbiome+flagellar+motility+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut.</a> Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).</li>
<li>Fernandez, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence-based+isolation+of+live+C.+elegans+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).</li>
<li>Cai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+expression+on+podocytes+and+its+role+in+inflammatory+immune+response+of+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis.</a> Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).</li>
<li>Blasius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-surface+molecule+selectively+expressed+on+murine+natural+interferon-producing+cells+that+blocks+secretion+of+interferon-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha.</a> Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).</li>
<li>Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic-activated+cell+sorting+%28MCS%29+can+be+used+as+a+large-scale+method+for+establishing+zebrafish+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures.</a> Sci Rep. 5, 7959(2015).</li>
<li>Valli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-+and+magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+enrich+human+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells.</a> Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).</li>
<li>Yamashiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+change+of+cytokine-activated+neutrophils%3A+inflammatory+neutrophils+are+heterogeneous+and+enhance+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses.</a> J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).</li>
<li>Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dysregulation+of+cytokine+networks+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus.</a> J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).</li>
<li>Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+plasmacytoid+dendritic+cell+frequency+and+function+revealed+by+a+novel+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody.</a> J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).</li>
<li>Liao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tacrolimus+Protects+Podocytes+from+Injury+in+Lupus+Nephritis+Partly+by+Stabilizing+the+Cytoskeleton+and+Inhibiting+Podocyte+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis.</a> PLoS One. 10 (7), e0132724(2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

Protokół opisany w tym manuskrypcie służy do wzbogacania o wysoką czystość żywych pDC, które zachowują zdolność do wytwarzania IFNα. Zastosowania tego protokołu obejmują między innymi oczyszczanie pDC i/lub innych komórek jednojądrzastych ze szpiku kostnego MRL/lpr i wszelkich innych szczepów myszy do badań funkcji komórkowych i molekularnych. Kilka krytycznych kroków w tym protokole ma na celu zapewnienie wysokiej żywotności i czystości posortowanego pDC. Pierwszym kluczowym krokiem jest uwolnienie szpiku kostnego z koś...

Skuteczne oddzielenie wybranej populacji komórek od innych komórek umożliwia badania populacji, które w inny sposób mogłyby nie być możliwe. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) to metoda wzbogacania interesującej populacji komórek o wysokiej czystości. 1,2 Różne typy komórek zwykle wyrażają unikalne cząsteczki lub unikalną kombinację kilku cząsteczek na błonie plazmatycznej, które mogą odróżnić jedną populację komórek od drugiej. Po związaniu tych cząsteczek na powierzchni komórki przez specyficzne przeciwciała sprzężone z fluorescencją, maszyna wykrywająca zwana cytometrem przepływowym / sorterem jest w stanie wzbudzić i wykryć sygnały świetlne różnych barwników fluorescencyjnych, które reprezentują różne markery molekularne na komórkach na poziomie pojedynczej komórki. Połączona informacja składająca się z obecności sygnału świetlnego (reprezentującego dodatnią ekspresję odpowiedniej cząsteczki powierzchniowej) lub braku sygnału świetlnego (reprezentującego ujemną ekspresję cząsteczki) określa fenotyp komórki. Po przejściu przez detektor komórki o tym samym fenotypie zainteresowania są kierowane do wyznaczonej rurki zbiorczej opartej na ładunku elektrycznym.
FACS jest szeroko stosowany w różnych badaniach, o ile populacja, która ma być wzbogacona, jest znakowana fluorescencją. 3-7 Zastosowano go do oddzielenia bakterii pokrytych immunoglobuliną (Ig)A od bakterii niepokrytych IgA w mikrobiocie jelitowej 8 i sortowania genetycznie modyfikowanych populacji komórek wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych. 9 Co ważne, ma zdolność do jednoczesnego oddzielania więcej niż jednej populacji, co nie tylko oszczędza czas i odczynniki, ale także pozwala na bardziej wyrafinowane projekty badań. 10 FACS ma jednak również swoje ograniczenia. Jeśli populacja będąca przedmiotem zainteresowania jest bardzo rzadka (mniej niż 1%), wydajność sortowania może być zmniejszona, powodując znaczną utratę komórek. Ponadto pewne wiązanie przeciwciał może aktywować wewnątrzkomórkową transdukcję sygnału, która indukuje zmiany funkcjonalne posortowanej populacji komórek. 11 W związku z tym fenotyp używany do sortowania powinien być starannie wybrany. 
Oprócz FACS istnieją inne metody, które również opierają się na markerach powierzchni komórek do wzbogacania określonych populacji komórek, takie jak sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MCS). 12 Podobnie jak FACS, przeciwciała sprzężone z kulkami magnetycznymi mogą celować w określone cząsteczki na powierzchni komórki. W wyniku interakcji przeciwciało-antygen komórki pokryte kulkami magnetycznymi można oddzielić od komórek niepowlekanych po przejściu przez pole magnetyczne. Jednak tylko ograniczona liczba cząsteczek może być celem MCS, ponieważ kulki magnetyczne są, w przeciwieństwie do różnych kolorów fluorescencyjnych w FACS, nierozróżnialne. W związku z tym MCS ma trudności z określeniem fenotypu komórki za pomocą skomplikowanej kombinacji markerów powierzchniowych. 13,14 Ponadto MCS jest również w stanie powodować niezamierzoną aktywację komórek docelowych.
W naszych badaniach mysiego modelu tocznia rumieniowatego układowego (SLE), 15 zamierzaliśmy oczyścić plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) w celu zbadania ich zmian funkcjonalnych wraz z postępem choroby. Po raz pierwszy użyliśmy MCS do wzbogacenia pDC ze szpiku kostnego, celując w PDCA-1, cząsteczkę o wysokiej i unikalnej ekspresji na mysim pDC w stanie stacjonarnym. 16 Jednak czystość komórek była nieoczekiwanie niska, prawdopodobnie z powodu regulacji w górę PDCA-1 w innych populacjach komórek w środowisku zapalnym, takim jak TRU. 16 Ostatecznie użyliśmy FACS z kombinacją czterech markerów powierzchniowych (CD11c, CD11b, B220 i PDCA-1) do oddzielenia pDC o wysokiej czystości jako populacji CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+. Mysz pDC ma inny specyficzny znacznik powierzchniowy Siglec-H. Zdecydowaliśmy się nie używać Siglec-H, ponieważ wiązanie przeciwciał w tej cząsteczce hamuje funkcję pDC do produkcji IFNα. 11

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>gibco firmy life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>gibco firmy life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne</td><td>gibco firmy life technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco firmy life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>gibco firmy life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>gibco by life technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>gibco by life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>1x Hank' s Zrównoważony roztwór soli&nbsp;</td><td>gibco by life technologies</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Roztwór podstawowy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>SIGMA</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Gradient gęstości średni</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Ficoll-Paque Plus&nbsp;</td></tr><tr><td>przeciw myszom CD19-PE</td><td>BD Pharmingen 553786</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie CD11c-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>przeciw myszom CD11b-APC-CY7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>przeciw myszom PDCA-1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-3172-81</td><td></td></tr><tr><td>przeciw myszom B220-V500&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561226</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek sendrytycznych plazmocytoidu II, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy BD FACSAria I&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>643178</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva wersja 6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) to technika oczyszczania określonych populacji komórek na podstawie fenotypów wykrytych przez cytometrię przepływową. Metoda ta umożliwia naukowcom lepsze zrozumienie charakterystyki pojedynczej populacji komórek bez wpływu innych komórek. W porównaniu z innymi metodami wzbogacania komórek, takimi jak sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MCS), FACS jest bardziej elastyczny i dokładny w separacji komórek ze względu na możliwość wykrywania fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto FACS jest zwykle zdolny do separacji wielu populacji komórek jednocześnie, co poprawia wydajność i różnorodność eksperymentów. Chociaż FACS ma pewne ograniczenia, jest szeroko stosowany do oczyszczania komórek do badań funkcjonalnych zarówno in vitro, jak i in vivo. Tutaj przedstawiamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu wyizolowania bardzo rzadkiej populacji komórek odpornościowych, plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC), o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych in vitro pDC.

Naszym celem było wysokiej czystości wzbogacenie populacji pDC z szpiku kostnego, bez wpływu innych typów komórek, u młodych i starych myszy podatnych na toczeń z linii MRL/lpr, aby zbadać zmiany funkcjonalne pDC w zakresie ich zdolności do produkcji IFNα. Pierwszą zastosowaną strategią oczyszczania było MCS, co, jak pokazuje Rysunek 1, doprowadziło do uzyskania czystości na poziomie zaledwie 7,75% po wzbogaceniu. W porównaniu z MCS, FACS pozwoliło na wzbogacenie pDC z cz...

Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wyizolowanie z wysoką czystością plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych, lub PDC, z szpiku kostnego myszy predysponowanych do tocznia w celu zbadania ich funkcji. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące charakterystyki konkretnej populacji komórek odpornościowych, takich jak PDC produkujące interferon alfa w późnym stadium rozwoju tocznia. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wzbogacenia od jednej do kilku populacji docelowych do wyższego stopnia czystości niż w przypadku sortowania za pomocą kulek magnetycznych.Po pobraniu, przenieść kości kończyn tylnych oraz cztery mililitry pełnej pożywki do moździerza. Dodać sześć mililitrów świeżej pełnej pożywki, aby uzyskać całkowitą objętość 10 mililitrów. Następnie delikatnie rozbić kości za pomocą tłuczka.Delikatnie mieszaj tłuczkiem, aby uwolnić szpik kostny. Następnie przenieś całe medium przez sitko o oczkach 70 micronów do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów umieszczonej na lodzie. Do moździerza dodaj 10 mililitrów świeżego kompletnego medium.Następnie przefiltruj supernatant dwa kolejne razy, aż kości staną się białe. Potem odwiruj komórki szpiku kostnego i resuspenduj osad w 10 milliliters świeżej pożywki kompletnej. Następnie nałóż komórki na pięć milliliters świeżo przygotowanej pożywki do gradientu gęstości w probówce stożkowej o pojemności 15 milliliters, dbając o to, aby nie zaburzyć warstw.Następnie oddziel komórki poprzez wirowanie. Po tym ostrożnie usuń górne 8 ml roztworu i pobierz 2 ml warstwy leukocytarnej (buffy coat) z interfazy. Do wyizolowanych komórek mononuklearnych dodaj 12 ml schłodzonej do temperatury lodu pożywki kompletnej, a następnie zakręć probówkę i wymieszaj zawartość przez odwracanie.Następnie odwirować komórki w celu ich sfragmentowania w pellet. Aby zabarwić komórki do analizy FACS, resuspender je w 100 µL przeciwciała blokującego CD1632FC w temperaturze 4°C. Po 10 minutach przemyć komórki w 4 mL lodowatego buforu do sortowania i znakować je za pomocą 100 µL odpowiedniego koktajlu przeciwciał do barwienia powierzchniowego komórek.Przez 15 minut w temperaturze 4°C w ciemności. Przemyć komórki 4 mL lodowatego buforu do sortowania, aby usunąć niezwiązane przeciwciała sprzężone z fluorescencją. Następnie zawiesić osad ponownie w 500 µL roztworu do ładowania FACS i przenieść próbkę do probówki do FACS na lodzie.Aby zabarwić kontrole kompensacji, odmierzyć do każdej probówki 1×10⁶ splenocytów. Przemyć komórki 4 ml buforu do sortowania i ponownie zawiesić osady w 100 µl buforu do sortowania. Następnie do odpowiednich probówek kompensacyjnych dodać właściwe przeciwciała koniugowane z fluorochromem z głównego koktajlu przeciwciał powierzchniowych i wstrząsnąć probówki w celu wymieszania.Po 15 minutach w ciemności, w temperaturze czterech stopni Celsjusza, należy przemyć wszystkie próbki buforem do sortowania i ponownie zawiesić osady w 500 µL lodowatego buforu do sortowania. Wyjątek stanowi probówka z DAPI, którą ponownie zawiesza się w 500 µL roztworu do ładowania FACS. Aby oczyścić docelową populację komórek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), należy umieścić probówki zbiorcze zawierające 500 µL FBS z dodatkiem antybiotyków pod zaworami sortującymi.Następnie należy załadować probówkę niebarwioną i zebrać 10 000 zdarzeń, aby ustawić bramkę negatywną dla każdej intensywności fluorescencji. Następnie należy zebrać 10 000 zdarzeń z probówek do kompensacji z pojedynczym barwieniem, aby ustawić bramkę pozytywną dla każdej intensywności fluorescencji. Z próbki eksperymentalnej należy zebrać 3 000 zdarzeń, aby ustawić bramki dla sortowanej populacji komórek.Używając intensywności fluorescencji jako parametrów osi X i Y wykresu, należy ręcznie wyznaczyć bramkę dla docelowej populacji komórek. Następnie należy posortować docelową populację komórek do probówki zbiorczej. Po zakończeniu sortowania, do komórek należy dodać do czterech mililitrów schłodzonego do temperatury 0°C medium kompletnego.Następnie zakręć probówkę i wymieszaj komórki przez odwracanie. Odwiruj oczyszczone komórki w wirówce, odsysając cały nadpław z wyjątkiem ostatnich 200 µL. Następnie zawieś pellet w jednym mililitrze lodowatego medium kompletnego i przenieś komórki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml w celu drugiego wirowania.Na koniec odessaj cały nadlewek z wyjątkiem ostatnich 100 µL i przechowuj posortowaną populację komórek na lodzie do momentu użycia. Magnetyczna aktywacja sortowania komórek plazmocytopodobnych komórek dendrytycznych szpiku kostnego u myszy predysponowanych do tocznia daje czystość na poziomie zaledwie 7,75% po wzbogaceniu. Natomiast komórki dendrytyczne plazmocytopodobne wzbogacone metodą FACS wykazują czystość sięgającą 96,4% po sortowaniu.Aby zapewnić wysoką czystość, mononuklearne komórki szpiku kostnego są najpierw bramowane i oddzielane od zanieczyszczeń za pomocą parametrów rozproszenia światła w przód (forward scatter) i z boku (side scatter). Wykorzystując szerokość względem wysokości rozproszenia w przód oraz szerokość względem wysokości rozproszenia z boku, pojedyncze komórki są dalej bramowane, aby uniknąć fałszywie dodatnich sygnałów generowanych przez agregaty. Żywe pojedyncze komórki negatywne pod kątem DAPI są następnie bramowane na podstawie ekspresji powierzchniowej CD11c-dodatniej i CD11B-ujemnej, co umożliwia dalsze bramowanie docelowej populacji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych szpiku kostnego, będących dodatnimi pod kątem B220 i PDCA-1.Posortowana populacja pDC charakteryzuje się nie tylko wysoką czystością, ale jest również funkcjonalnie prawidłowa, wykazując zdolność do produkcji IFNalpha po stymulacji CpG in vitro. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o rozłupaniu kości i delikatnym mieszaniu uwolnionego szpiku kostnego, aby zachować żywotność komórek. Po zakończeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA lub hodowla i stymulacja in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji genów lub funkcji wzbogaconych populacji komórek.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom PDC do zgłębienia roli tych potężnych komórek w rozwoju tocznia oraz w modelach mysich podatnych na toczeń. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób izolacji wysoce oczyszczonej populacji PDC ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń.

fluorescence-activated-cell-sorting-for-purification-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W przypadku wielu badań naukowych wymagających analizy biologicznej i chemicznej populacji komórek, komórki te muszą charakteryzować się wysokim stopniem czystości. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest doskonałą metodą pozyskiwania czystych populacji komórek.

Oczyszczanie specyficznej populacji komórek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Jest to szybka i kompleksowa metoda immunofenotypowania mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) oraz wzbogacania populacji leukocytów Gr-1+ z śledziony mysiej. Metoda ta wykorzystuje cytometrię przepływową oraz sortowanie komórek AutoMACS w celu wyizolowania żywych leukocytów Gr-1+ przed sortowaniem MDSC metodą FACS do późniejszych analiz in vivo oraz in vitro.

Przygotowanie mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) od myszy naiwnych oraz myszy z nowotworem trzustki z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i zautomatyzowanego magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (AutoMACS)

Ten film demonstruje test in vitro do generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) z popularnych limfoidalnych komórek progenitorowych (CLP). Po jednoczesnej hodowli oczyszczonych CLP z napromieniowanymi γ komórkami zasilającymi w obecności liganda kinazy tyrozynowej-3 (FL) podobnego do Fms, CLP różnicują się w nieprzylegające pDC, których obecność potwierdza się za pomocą cytometrii przepływowej.

Wytwarzanie in vitro plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych

Ten protokół opisuje eksperymentalne procedury oceny różnicowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w plastrze Peyera od typowych komórek progenitorowych komórek dendrytycznych, przy użyciu technik obejmujących izolację komórek za pośrednictwem FACS, hydrodynamiczny transfer genów i analizę przepływu podzbiorów immunologicznych w plastrze Peyera.

Ocena rozwoju mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera z wykorzystaniem adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych

W tym badaniu prezentujemy system hodowli in vitro, który może efektywnie generować pDC poprzez kokulturę pospolitych komórek progenitorowych limfoidalnych z komórkami zasilającymi AC-6 w obecności ligandu Flt3.

In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Tutaj udostępniamy metodę identyfikacji i izolowania dużej liczby komórek szpikowych sterowanych przez GM-CSF za pomocą szybkiego sortowania komórek. Na podstawie ekspresji Ly6C i CD115 można zidentyfikować pięć odrębnych populacji (pospolite przodki szpiku, progenitorzy granulocytów/makrofagów, monocyty, makrofagi pochodzące z monocytów i DC pochodzące z monocytów).

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Poznaj metodę sortowania komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy z toczniem. Technika zapewnia wysoką czystość próbek do badań funkcjonalnych.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy (Wideo) | JoVE Journal

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Przeglądaj więcej filmów