Kropelki wodne stosowane jako mikroreaktory enzymatyczne i ich elektromagnetyczne uruchamianie
28 sierpnia 2017
Systemy reakcji typu lab-in-a-drop pozwalają na wszechstronne przeprowadzanie złożonych reakcji w skali mikroprzepływowej. Opracowano zautomatyzowaną platformę uruchamiającą składającą się z matrycy cewek elektromagnetycznych o wymiarach 3 x 3, która z powodzeniem została wykorzystana do połączenia dwóch mikroreaktorów o pojemności 10 μl, a tym samym zainicjowania reakcji enzymatycznej w powstałych płynnych kulkach.
Ogólnym celem tego urządzenia jest dostarczenie nowej technologii platformy mikroprzepływowej, która realizuje zautomatyzowane reakcje kaskadowe w małych kropelkach wodnych. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii syntetycznej poprzez odtworzenie sekwencji reakcji mikroorganizmów wykonujących złożone sekwencje reakcji z enzymami i badania przesiewowe nowych katalizatorów. Główną zaletą naszego podejścia lab-in-a-drop jest to, że jest ono bardzo elastyczne.
W przeciwieństwie do mikroprzepływowych chipów opartych na kanałach, jedynym warunkiem wstępnym jest środowisko reakcji hydrofilowej. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w reakcje enzymatyczne, może być również stosowana do innych systemów, takich jak katalizatory nieorganiczne lub ciągnięcie ligandów. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy próbowałem zaprojektować urządzenie mikroprzepływowe ze zintegrowaną separacją produktów, ale bez skomplikowanego systemu zaworów i separatorów.
Przesuwając roztwór reakcyjny w postaci kropelki, kontrola reakcji staje się bardzo prosta. Najpierw zaprojektuj w druku 3D korpusy cewek. Następnie za pomocą maszyny do nawijania owiń ciała drutem miedzianym o średnicy 08 milimetrów 45 sto razy każdy.
Umieść element Peltiera na tablicy elektrycznej. Przykręć pierwszą warstwę zwojów do elementu Peltiera, aby utworzyć kwadrat. Następnie zabezpiecz drugą warstwę cewek na górze za pomocą wydrukowanej w 3D plastikowej ramy lub innego nieprzewodzącego materiału.
Podłącz tablicę elektryczną do sterownika magnesu za pomocą taśmowego. Włóż magnesy neodymowe do cewek. Umieść szklaną lub plastikową płytkę ze szkła kwarcowego lub tworzywa sztucznego o grubości jednego milimetra na wierzchu matrycy cewki.
Przymocuj pokrywę na miejscu za pomocą, aby zakończyć montaż platformy uruchamiającej. Aby rozpocząć syntezę nanocząstek w atmosferze obojętnej, najpierw zawiesić 85 gramów sześciowodnego chlorku żelaza(III) i 3 gramy czterowodnego chlorku żelaza(II) w 200 mililitrach roztworu woda-etanol w proporcji cztery do jednego. Następnie dodaj 0,2 mililitra PFOTES i wymieszaj mieszaninę z prędkością 500 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego.
Dodać 1,5 molowego wodorotlenku amonu do mieszaniny, aby uzyskać pH 8,0. A następnie kontynuuj mieszanie roztworu przez 24 godziny, aby uzyskać hydrofobowe nanocząstki magnetyczne. Przymocować magnes sztabkowy o sile przyczepności 25 kilogramów do dna kolby reakcyjnej.
Odlej roztwór i umyj cząstki trzykrotnie roztworem wody do etanolu w proporcji cztery do jednego. Wyjmij magnes i susz cząsteczki w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Scharakteryzuj cząstki za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.
Przygotować roztwór 0,1 mikrograma na mililitr peroksydazy chrzanowej w 0,1 molowym buforze fosforanu potasu o pH 6,5 z 10 milimolowym nadtlenkiem wodoru. Następnie należy przygotować 20-mikromolowy roztwór sondy fluorescencyjnej 10-acetylo-3,7-dihydroksyfenoksazyny w buforze fosforanu potasu. Następnie delikatnie zmiel suche nanocząstki za pomocą szklanego moździerza i tłuczka.
Przenieś cząstki na szalkę do ważenia polistyrenu i dodaj 10 mikrolitrów roztworu peroksydazy. Delikatnie obracaj patelnię przez około 10 sekund, aby uzyskać samoorganizację nanocząstek wokół roztworu peroksydazy. Przenieś ten mikroreaktor na platformę uruchamiającą.
Powtórz ten proces z 10 mikrolitrami roztworu sondy fluorescencyjnej i umieść drugi mikroreaktor na platformie. Przechowuj pozostałe cząstki w temperaturze pokojowej. Użyj elementu Peltiera, aby utrzymać roztwory reakcyjne w mikroreaktorach w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
Zamontuj mikroskop fluorescencyjny około 10 milimetrów nad mikroreaktorami i podłącz mikroskop do komputera. Za pomocą sterowania magnesem aktywuj magnesy i obróć, aby ustawić mikroreaktor z roztworem sondy fluorescencyjnej pod mikroskopem. Włącz lampkę wzbudzenia.
Podnieś magnes cewki, aby otworzyć mikroreaktor i rozpocząć rejestrowanie obrazu z mikroskopii fluorescencyjnej. Po dwóch do pięciu sekundach opuść magnes, aby zamknąć mikroreaktor. Następnie użyj sterowania magnesem, aby przesunąć mikroreaktor peroksydazy w sąsiedztwie mikroreaktora fluorescencyjnego.
Otwórz mikroreaktor z sondą fluorescencyjną. Mikroreaktor peroksydazy jest wciągany do mikroreaktora sondy i otwierany, inicjując reakcję. Monitoruj reakcję za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, otwierając i zamykając połączony mikroreaktor w razie potrzeby.
Mikroreaktory stworzono poprzez kodowanie kropelek roztworu hydrofobowymi nanocząstkami żelaza. Te mikroreaktory mogą być przenoszone, otwierane, zamykane i łączone poprzez manipulację magnesami neodymowymi pod platformą uruchamiającą. Platforma uruchamiająca może być również zbudowana z żelaznych rdzeni w korpusach cewek.
Zapewnia to wystarczającą siłę magnetyczną, aby przesunąć mikroreaktor o ponad 10 milimetrów, ale jest niewystarczające do otwarcia mikroreaktora. Dlatego magnes neodymowy musi być używany do przeprowadzania reakcji w małych objętościach roztworu. Przeprowadzono reprezentatywną reakcję enzymatyczną między peroksydazą a znacznikiem fluorescencyjnym i monitorowano ją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Wspomniana przez Michaelisa kinetyka zaobserwowana podczas reakcji zgadzała się dobrze z wartościami literaturowymi, wskazując, że ustawienie mikroreaktora nie ma wpływu na przebieg reakcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować mikrocząstki hydrofobowe i generować z nich wodne mikrokropelki. Technologia platformy może być wykorzystywana do zautomatyzowanej kontroli reakcji poprzez łączenie kropel.
Dodatkowo, pojedyncze mikroreaktory wypełnione substratem mogą poruszać się po małych strefach powierzchniowych ze zmobilizowanymi enzymami. Zastosowanie wielu stref immobilizacji z różnymi enzymami umożliwia sekwencyjną kaskadę reakcji z produktami przenośnymi i natychmiastowymi. Opracowanie prototypu to dopiero początek.
Obecnie wdrażamy zautomatyzowany system dozujący nad platformą reakcyjną, aby ponownie umieścić unieruchomione enzymy w dowolnej pozycji. Matryca cewki zostanie zwiększona do 10 razy 10 pozycji. Technika ta może utorować drogę do sterowanego komputerowo planowania i wykonywania sekwencji reakcji biochemicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia nowatorską technologię platformy mikrofluidycznej zaprojektowaną do zautomatyzowanych reakcji kaskadowych w małych wodnych kroplkach. Podejście lab-in-a-drop pozwala na wszechstronną implementację złożonych reakcji, umożliwiając wgląd w procesy enzymatyczne i inne systemy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Biologia syntetyczna
- Reakcje enzymatyczne
Tło
- Systemy mikrofluidyczne tradycyjnie wykorzystują projekty oparte na kanałach.
- Systemy lab-in-a-drop oferują bardziej przystosowane środowisko reakcji.
- Zautomatyzowane platformy mogą zwiększyć efektywność i złożoność reakcji.
- Wgląd z tego badania mógłby poszerzyć zastosowania biologii syntetycznej.
Cel badania
- Rozwój platformy mikrofluidycznej do zautomatyzowanych reakcji kaskadowych.
- Odtwarzanie złożonych sekwencji reakcji podobnych do tych w mikroorganizmach.
- Przeszukiwanie nowych katalizatorów i zwiększenie rozumienia reakcji enzymatycznych.
Zastosowane metody
- Rozwój zautomatyzowanej platformy sterującej z elektromagnetycznymi cewkami.
- Łączenie mikroreaktorów w celu inicjacji reakcji enzymatycznych.
- Wykorzystanie środowisk hydrofilowych do ułatwienia reakcji.
- Adaptacja metody do różnych systemów kataalitycznych.
Główne wyniki
- Udane łączenie mikroreaktorów w celu stworzenia kropli płynnych.
- Wykazana przystosowawczość podejścia lab-in-a-drop.
- Potencjalne zastosowania poza reakcjami enzymatycznymi, w tym katalizatory nieorganiczne.
- Zdobyte wglądy mogą wpłynąć na przyszłe badania w dziedzinie biologii syntetycznej.
Wnioski
- Metoda lab-in-a-drop zapewnia elastyczną platformę do złożonych reakcji.
- Ta technologia może znacząco wpłynąć na biologię syntetyczną i przeszukiwanie katalizatorów.
- Dalsze badania tej metody mogą prowadzić do innowacyjnych zastosowań w różnych dziedzinach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated microreactor platforms using aqueous droplets enable programmable, multiplexed enzymatic and catalytic reactions at microscale volumes. This technology addresses the need for flexible, channel-free microfluidic systems that support rapid hypothesis testing and high-throughput screening in early discovery. Its adaptability and automation potential position it as a reusable capability for synthetic biology, catalyst evaluation, and mechanistic de-risking across the R&D pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of enzymatic pathways and substrate specificity in a controlled, miniaturized environment.
- Supports biological de-risking by allowing rapid, parallel testing of reaction sequences and catalyst candidates.
- Facilitates predictive confidence in target selection through quantitative, real-time monitoring of reaction kinetics.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microreactor systems for downstream compound or catalyst screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible assay conditions by automating droplet manipulation and merging.
- Enables scalable, multiplexed screening with minimal reagent consumption and high data density.
- Supports reliable evaluation of enzyme activity and substrate conversion via fluorescence readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant enzymatic pathways for translational biomarker exploration when appropriate substrates are used.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting sequential reaction cascades and product tracking.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by enabling precise control over reaction initiation and monitoring.
Pipeline & Workflow Integration
This microreactor platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical mechanistic studies, supporting hypothesis-driven research and rapid iteration.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling programmable reaction sequences in droplets.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible microreactors for high-throughput evaluation of enzymes, substrates, or catalysts.
- Analytics: Delivers quantitative fluorescence measurements and kinetic data for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports alignment with disease-relevant enzymatic processes when integrated with appropriate biological substrates.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, scalable platform adaptable to diverse reaction types and screening needs across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by enabling controlled, multiplexed reaction analysis.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability through automated droplet actuation and merging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing reagent use and enabling rapid data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates through robust mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, magnetic actuation, and fluorescence analytics.
- Needs access to 3D printing, coil winding, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of droplet preparation and actuation protocols.
- Adaptable to various model systems, but optimization may be needed for different enzyme or substrate classes.
- Practical limitations include the need for hydrophobic surfaces and precise magnetic control for reliable droplet manipulation.
