Name: Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę reprogramowania komórek krwi PBMC do iPSC przy użyciu wirowania. Protokół wykorzystuje wirusa Sendai i siłę odśrodkową do przylegania komórek, oferując nowe podejście w biologii komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z Programu Badań Podstawowych przez National Research Foundation of Korea (NRF), finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).

Oświadczenie etyczne: Niniejszy protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Katolickiego Uniwersytetu Korei (KC12TISI0861).
1. Izolacja komórek monocytowych z krwi
<ol>
	<li>Izolacja komórek monocytowych (dzień -5)
	<ol>
		<li>Uzyskać co najmniej 10 ml świeżej krwi z pobrania krwi do probówki do preparatyki komórkowej (CPT).</li>
		<li>Przenieść krew do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńczyć ją sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w stosunku 1:4. 
		UWAGA: W celu uzyskania wyższej czystości można zastosować wyższy stosunek rozcieńczenia.</li>
		<li>Dodaj 10 ml pożywki o gradionym gęstości do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i ostrożnie ułóż rozcieńczoną krew na pożywce o gradiencie gęstości. Wirować przy 750 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przerwy wirowania.</li>
		<li>Ostrożnie przenieś warstwę buffy do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, dodaj 30 ml PBS do probówki i umyj komórki.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 515 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wyrzucić PBS i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml pożywki z krwinkami.</li>
		<li>Policz komórki i płytkę 1 x 106 komórek na dołek 24-dołkowej płytki. Dodaj PBS do otaczających studzienek, aby zapobiec parowaniu.</li>
		<li>Ustabilizować komórki przez 5 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przed transdukcją. Dodać dodatkowe 0,5 ml świeżej pożywki z krwinkami w dniach 3-4 bez naruszania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transdukcja przez wirusa Sendai
<ol>
	<li>Transdukcja (dzień 0)
	<ol>
		<li>Zebrać i przenieść komórki krwi do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i policzyć je za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Przygotować 3 x 105 komórek na transdukcję i odwirować komórki przy 515 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml pożywki z krwinkami.</li>
		<li>Przenieść komórki do dołka na niepowlekanej płytce 24-dołkowej.</li>
		<li>Rozmrozić mieszaninę wirusa Sendai w lodzie i dodać ją do zawieszonych komórek. Dodaj wirusa Sendai do komórek zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Uszczelnić płytkę folią uszczelniającą i odwirować ją w temperaturze 1,150 x g przez 30 minut w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Po odwirowaniu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez noc (O/N).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfer komórek do macierzy zasilającej (dzień 1)
	<ol>
		<li>Następnego dnia pokryj 24-dołkową płytkę witronektyną. Rozcieńczyć roztwór witronektyny w PBS do uzyskania końcowego stężenia 5 μg/ml. Dodać 1 ml witronektyny do studzienki na 24-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Przed użyciem usunąć roztwór powlekający. Powlekane talerze można przechowywać w RT przez 3 dni.</li>
		<li>Przenieść wszystkie podłoża zawierające komórki i wirusa do powleczonego dołka.</li>
		<li>Zebrać pozostałe komórki z dodatkowymi 0,5 ml świeżej pożywki z krwinkami i dodać ją do studzienki zawierającej komórki.</li>
		<li>Odwirować płytkę o sile 1,150 x g przez 10 minut w temperaturze 35 °C.</li>
		<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant, dodać 1 ml pożywki iPSC i utrzymać komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drugi transfer komórek (dzień 2)
	<ol>
		<li>Pokryć studzienki nowej 24-dołkowej płytki 5 μg/ml witronektyny, jak opisano w kroku 2.2.1. Do każdej transdukcji należy użyć jednego dołka płytki.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórkową z pierwszej płytki na nowo pokrytą płytkę z witronektyną. 
		UWAGA: Jeśli nie są potrzebne, komórki zawiesiny można wyrzucić. Procedurę opisaną w kroku 2.3 można powtórzyć 2-3 razy z komórkami zawiesiny. Jeśli kroki zostaną powtórzone, zbierz komórki.</li>
		<li>W międzyczasie dodać 1 ml pożywki iPSC do dołka pierwszej płytki w celu konserwacji i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 O/N.</li>
		<li>Utrzymuj przyłączone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i wykonuj codzienną wymianę pożywki na świeżej pożywce iPSC. Kolonie pojawią się w dniach 14-21 po transdukcji.</li>
		<li>Odwirować nowo pokrytą płytkę zawierającą komórki zawiesiny w temperaturze 1,150 x g i temperaturze 35 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Po odwirowaniu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 O/N.</li>
		<li>Następnego dnia usuń supernatant i zastąp go nowym nośnikiem iPSC. 
		UWAGA: Procedurę wymienioną w kroku 2.3 można powtórzyć 2-3 razy z komórkami zawiesiny. Jeśli kroki zostaną powtórzone, należy pobrać komórki z supernatantu i powtórzyć krok 2.3.</li>
		<li>Utrzymuj przyłączone komórki przy codziennych zmianach pożywki, aż do osiągnięcia 80% konfluencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przeprogramowana konserwacja komórek
<ol>
	<li>Wczesna konserwacja po hodowli na płytkach 24-dołkowych
	<ol>
		<li>7-10 dni po transdukcji, gdy komórki się zlewają, przygotuj naczynie o średnicy 60 mm pokryte witronektyną. Rozcieńczyć roztwór witronektyny w PBS do uzyskania końcowego stężenia 5 μg/ml. Dodać 1 ml witronektyny do naczynia i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Umyj komórki PBS i dodaj 1 ml PBS/1 mM EDTA w celu odłączenia komórek.</li>
		<li>Inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 minuty.</li>
		<li>Zebrać komórki i odwirować je w stężeniu 250 x g i RT przez 2 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml świeżej pożywki iPSC.</li>
		<li>Umieść wszystkie zawieszone komórki na nowo pokrytej czaszy o średnicy 60 mm.</li>
		<li>Dodać 10 mM inhibitora kinazy RHO do komórek i utrzymywać je w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , aż komórki zlewają się w 80%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podział w celu pojawienia się kolonii (przygotowanie do subklonowania)
	<ol>
		<li>Przygotować naczynie o średnicy 100 mm pokryte witronektyną, zgodnie z opisem w kroku 3.1.2.</li>
		<li>Umyj komórki PBS i dodaj 1 ml PBS/1 mM EDTA w celu odłączenia komórek.</li>
		<li>Inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 minuty.</li>
		<li>Zebrać komórki i odwirować je przy 250 x g i RT przez 2 minuty.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj 1 x 104 komórki na naczynie.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 250 x g i RT przez 2 minuty.</li>
		<li>Zawiesić 1 x 104 komórki w 6 ml pożywki iPSC, ułożyć je na powlekanej 100-milimetrowej szalce i dodać do pożywki 10 mM inhibitora kinazy RHO.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez tydzień, aż pojawią się duże kolonie. 
		UWAGA: Utrzymuj i rozbudowuj kolonie do subklonowania. Podklonowanie odbywa się zwykle w mniej niż 5 przejściach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie kolonii za pomocą roztworu do odrywania kolonii iPSC
	<ol>
		<li>Na tydzień przed zbiorem kolonii wysiewaj 1 x10 4 komórki w pokrytym witronektyną, 100-milimetrowym naczyniu, jak wspomniano w kroku 3.2.7.</li>
		<li>Przygotować naczynie pokryte witronektyną o średnicy 60 mm, dodając 2 ml roztworu witronektyny i inkubując w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Obserwując przez mikroskop (powiększenie 40X lub 100X), oznacz kolonie wyraźnymi granicami za pomocą markera. Usunąć roztwór witronektyny z nowej płytki wykonanej w kroku 3.3.2 i dodać 6 ml pożywki iPSC uzupełnionej 10 mM kinazą RHO.</li>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek i przemyć je 3 ml PBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu odłączającego kolonię iPSC i inkubować je przez 30 s w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wyjąć roztwór z płytki i inkubować go w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 30 sekund.</li>
		<li>Za pomocą pipety P200 pobrać 200 μl pożywki z płytki i odłączyć docelowe kolonie przez pipetowanie. Przenieś rozproszone kolonie do nowej 100-milimetrowej szalki.</li>
		<li>Inkubować i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . 
		UWAGA: Po uzyskaniu czystej kolonii iPSC, komórki utrzymywano aż do osiągnięcia pasażu 10. Charakterystykę wykonano po co najmniej 10 fragmentach. Rozcieńczenia przeciwciał i informacje o starterze przedstawiono w tabelach 1 i 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine%3A+current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li>
<li>Seki, T., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application.</a> World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).</li>
<li>Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPSCs+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+non-integrative+Sendai+virus+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li>
<li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ embrionalne komórki macierzyste (ESC) wykazywały szereg niedociągnięć, konieczne było zastosowanie alternatywnego narzędzia. W związku z tym opracowanie przez firmę Yamanaka indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) znalazło się w centrum uwagi na arenie międzynarodowej. Minęło prawie dziesięć lat, odkąd Yamanaka odkrył, że pluripotencja może być wywołana przez dodanie tylko czterech genów do dorosłych komórek somatycznych. Ponieważ iPSC są "indukowane" z dojrzałych komórek somatycznych, mogą ...

Komórki macierzyste są jednym z najbardziej atrakcyjnych materiałów w terapii klinicznej odkilkudziesięciu lat. 1. Atrakcyjnymi właściwościami komórek macierzystych są pluripotencja i zdolność do samoodnawiania się. W 1981 roku wyizolowano pierwsze embrionalne komórki macierzyste (ESC) z zarodka myszy2. Jednak, gdy technika ta została zastosowana do ludzkich embrionów, napotkała kilka problemów etycznych.
W 2006 roku, kiedy dr Yamanaka i jego zespół przeprogramowali pierwszą pluripotencjalną komórkę z mysich komórek somatycznych, pole komórek macierzystych odzyskało swoją możliwość, a zainteresowanie nim wzrosłona nowo 3. Dostarczając kilka zdefiniowanych czynników, pluripotencjalne komórki macierzyste zostały z powodzeniem "indukowane" z dorosłych komórek somatycznych i dlatego zostały nazwane "indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (iPSC)". W 2007 r. technika ta została zastosowana do komórekludzkich4, uzyskując komórki o dokładnych cechach ESC, ale bez debaty etycznej. Teoretycznie iPSC mogą być generowane z dowolnego typu komórek uzyskanych od dowolnej osoby lub pacjenta. Specyficzne dla pacjenta iPSC stają się coraz bardziej potencjalnym narzędziem, które może symulować fenotypy choroby i warunki epigenetyczne każdego pacjenta z osobna. Korzystając z edycji genów lub innych metod, które mogą odwrócić stan patogenny, specyficzne dla pacjenta iPSC mogą być również stosowane w medycynie spersonalizowanej5. Co więcej, iPSC są mniej związane z odrzuceniem immunologicznym, ponieważ mają taką samą tożsamość immunologiczną jak dawca, co sprawia, że autotransplantacja jest bardziej możliwa6. W związku z tym iPSC stały się najbardziej obiecującą platformą w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i terapiach regeneracyjnych. Biorąc pod uwagę te korzyści, stale opracowywane są ulepszone protokoły, które mogą zapewnić czystsze i wyższe plony w jak najkrótszym czasie z najmniejszego źródła komórek. Jednym z głównych czynników branych pod uwagę przy poszukiwaniu najbardziej wydajnego protokołu do przyszłego zastosowania jest typ komórki podstawowej. Większość wczesnych protokołów generowania iPSC jest zoptymalizowana pod kątem komórek adherentnych, ponieważ pierwotne linie iPSC zostały wyindukowane z fibroblastów skóry4. Jednak izolacja i przygotowanie tych komórek są pracochłonne. Ponadto izolacja fibroblastów skóry obejmuje inwazyjne zabiegi chirurgiczne, które mogą stać się poważnym mankamentem w przypadku szerszego zastosowania.
Dlatego, do dalszego korzystania z iPSC, wymagane jest źródło komórek z wygodną akwizycją. Krew jest uważana za idealne źródło komórek, ponieważ uzyskuje się ją za pomocą raczej minimalnie inwazyjnej procedury7-9. W tym badaniu opracowaliśmy prostą modyfikację protokołu generującego hiPSC z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Bez trudnego procesu ekspansji określonego typu komórek, takich jak komórki CD34+, całe komórki krwi lub PBMC były seryjnie siane na płytkach pokrytych matrycą przez wirowanie po transdukcji z wirusem Sendai zawierającym czynniki Yamanaka. Metoda ta skróciła czas potrzebny na przyłączenie transdukowanych komórek pływających i zmniejszyła straty przeprogramowanych komórek, które nie były w stanie samodzielnie się przyłączyć.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Naczynie</td><td>TPP&nbsp;</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka rogowa</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka rogowa</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta jednorazowa</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Jednorazowa płytka</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa TPP</td><td></td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PBMC Materiały izolacyjne</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9805</td><td>Pożywka dla komórek krwi</td></tr><tr><td>CC110</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>8697</td><td>Krew Suplement pożywki komórkowej (100x)</td></tr><tr><td colspan="4">iPSC Materiały do generowania i hodowli</td></tr><tr><td>CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8 Media</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5940</td><td>iPSC</td></tr><tr>Media<td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express (TrypLE)</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>12604-039</td><td>Roztwór</td></tr><tr> do odłączania kolonii<td colspan="4">Materiały do kontroli jakości</td></tr><tr><td>18 mm Szkło osłonowe</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innowacja</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej&nbsp;</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TRA-1-60</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TRA-1-81</td><td>Przeciwciało Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)</td><td>Sonda molekularna</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)</td><td>Sonda molekularna</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Sonda molekularna</td><td>DAPI</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Szkło szkiełkowe, powlekane&nbsp;</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Milipore</td> alkoholu<td>izoprypylowego</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA RevertAid</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE Buffer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>gwiazda ładowania</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1kb (+) Marker drabinkowy DNA</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna</td><td>Milipor</td><td>SCR004</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Bufor</td><td></td><td></td> do płukania Fisher Scientific BP152-1</tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520.1000</td><td>Bufor do płukania</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td>Bufor do płukania</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td>Bufor do płukania</td></tr></tbody></table>

indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa sendai i wirowania

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Niedawny rozwój ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) dowiódł, że dojrzałe komórki somatyczne mogą powrócić do niezróżnicowanego, pluripotencjalnego stanu. Teraz przeprogramowywanie odbywa się na różnych typach dorosłych komórek somatycznych: keratynocytach, komórkach moczu, fibroblastach itp. Wczesne eksperymenty były zwykle przeprowadzane na fibroblastach skóry. Wymagało to jednak inwazyjnego zabiegu chirurgicznego w celu uzyskania fibroblastów od pacjentów. Dlatego komórki zawiesinowe, takie jak komórki krwi i moczu, zostały uznane za idealne do przeprogramowania ze względu na wygodę uzyskania komórek pierwotnych. W tym miejscu przedstawiamy skuteczny protokół generowania iPSC z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Poprzez posiewanie transdukowanych PBMC szeregowo na nową, pokrytą matrycą płytkę za pomocą wirowania, protokół ten może z łatwością dostarczyć kolonie iPSC. Metodę tę stosuje się również do komórek jednojądrzastych krwi pępowinowej (CBMC). W niniejszym badaniu przedstawiono prosty i skuteczny protokół przeprogramowania PBMC i CBMC.

Niniejszy protokół przedstawia prostą metodę reprogramowania komórek PBMC izolowanych z krwi. Dzięki zastosowaniu kombinacji seryjnego pasażowania i wirowania udało się wygenerować iPSC. Przy użyciu tej metody możliwe jest otrzymanie iPSC z niewielkiej ilości całych komórek krwi, bez konieczności izolowania lub namnażania konkretnego typu komórek. Z sukcesem wygenerowano iPSC z zaledwie 1x104 komórek w małej płytce do hodowli komórkowej.
<p class="jove_content" fo:keep-toge...

Proponujemy protokół przeprogramowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poprzez posiew transdukowanych komórek krwi na płytkach pokrytych matrycą za pomocą wirowania, iPSC są z powodzeniem indukowane z komórek pływających. Technika ta sugeruje prosty i skuteczny protokół przeprogramowania komórek, takich jak PBMC i CBMC.

Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Ogólnym celem niniejszego badania jest przeprogramowanie mononuklearnych komórek krwi obwodowej w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z wykorzystaniem seryjnego wysiewania metodą wirowania. Pierwotnie iPSC generowano poprzez przeprogramowanie fibroblastów. Obecnie do przeprogramowania wykorzystuje się różnorodne komórki.Jednakże ze względu na łatwą dostępność krwi, PBMC mogą stanowić akceptowalne źródło komórek do dalszych zastosowań iPSC, takich jak przesiewanie leków, modelowanie chorób oraz rozwój medycyny regeneracyjnej. W ramach niniejszego opracowania przedstawimy protokół reprogramowania iPSC z wykorzystaniem PBMC z zastosowaniem siły odśrodkowej. Protokół ten stanowi alternatywną opcję podczas reprogramowania komórek zawiesinowych.W celu zademonstrowania procedury poprosiliśmy o pomoc Nama, doktoranta z mojego laboratorium. Aby wyizolować komórki monocytarne, należy najpierw pobrać co najmniej 10 ml świeżej krwi do probówki do przygotowania komórek. Następnie krew należy przenieść do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml i rozcieńczyć sterylnym PBS w stosunku 1:4.Następnie do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml należy dodać dziesięć mililitrów medium do gradientu gęstości i ostrożnie nałożyć rozcieńczoną krew na wierzch medium do gradientu gęstości. Następnie próbkę wiruje się przy 750 ×g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, bez przerwy w wirowaniu. Po 30 minutach warstwę przejściową (buffy coat) należy ostrożnie przenieść do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.Dodaj 30 ml PBS i przemyj komórki. Następnie odwiruj komórki z prędkością 515 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie odlej PBS i resuspenduj komórki w 0,5 ml pożywki do komórek krwi.Następnie należy policzyć komórki i wysiać je na płytkę 24-dołkową. Do sąsiednich dołków należy dodać PBS, aby zapobiec parowaniu. Po tym etapie komórki należy stabilizować przez pięć dni w temperaturze 37 °C przed transdukcją.W trzecim lub czwartym dniu dodać dodatkowo 0,5 ml świeżej pożywki do komórek krwi, nie zakłócając stanu komórek. W tej procedurze przenieść komórki krwi do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i policzyć je za pomocą hemocytometru. Następnie przygotować 3 × 10⁵ komórek do transdukcji i odwirować je z prędkością 515 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie odessać nadosad i resuspendować komórki w 0,5 milliliters medium do komórek krwi. Potem przenieść komórki do dołka niepowlekanej płytki 24-dołkowej. Rozmrozić mieszaninę wirusa Sendai w lodzie i dodać ją do zawiesiny komórek.Uszczelnij płytkę folią uszczelniającą i wiruj ją z prędkością 1 150 ×g przez 30 minut w temperaturze 30 °C. Po wirowaniu inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez noc. Aby pokryć płytkę 24-dołkową witronektyną, następnego dnia rozcieńcz roztwór witronektyny w PBS, aby uzyskać stężenie końcowe 5 µg/mL.Następnie do dołka należy dodać jeden mililitr witronektyny i inkubować go w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę. Po tym czasie należy usunąć roztwór powlekający i przenieść całe medium zawierające komórki oraz wirusa do powleczonego dołka. Następnie pozostałe komórki należy zebrać za pomocą dodatkowych 0,5 mililitra świeżego medium do komórek krwi i dodać je do dołka z komórkami.Następnie wirowarką odwirować płytkę z prędkością 1 150 ×g przez dziesięć minut w temperaturze 35 °C, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez noc. W celu drugiego transferu komórek, pokryć dołki witronektyną w stężeniu 5 µg/mL zgodnie z wcześniejszym opisem. Do każdej transdukcji użyć jednego dołka płytki, a następnie przenieść zawiesinę komórkową z pierwszej płytki na nowo pokrytą witronektyną płytkę.W międzyczasie, w celu utrzymania hodowli, dodaj jeden mililitr pożywki iPSC do studni pierwszej płytki i inkubuj ją w temperaturze 37 °C w 5% CO2, dokonując codziennej wymiany na świeżą pożywkę iPSC. Kolonie pojawią się od 14. do 21. dnia po transdukcji. Nowo pokrytą płytkę zawierającą zawiesinę komórek odwiruj przy 1 150 ×g w temperaturze 35 °C przez dziesięć minut.Po wirowaniu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez noc. Następnego dnia usunąć nadsącz i zastąpić go świeżą pożywką dla indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Utrzymywać przylegające komórki, codziennie wymieniając pożywkę, aż do osiągnięcia 80% konfluencji.Na tydzień przed wybieraniem kolonii, wysiej 1×10⁴ komórek do płytki 100-milimetrowej pokrytej witronektyną. Następnie przygotuj płytkę 60-milimetrową pokrytą witronektyną, dodając 2 mL roztworu witronektyny, i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę. Obserwując pod mikroskopem, zaznacz markerem na dnie płytki kolonie o wyraźnych granicach.Usunąć roztwór witronektyny z nowej płytki i dodać sześć mililitrów pożywki dla indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, uzupełnionej o dziesięć milimoli inhibitora kinazy RHO. Następnie usunąć pożywkę hodowlaną z komórek i przemyć je trzema mililitrami PBS. Potem dodać jeden mililitr roztworu do odrywania kolonii iPSC i inkubować przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.Następnie należy usunąć roztwór z płytki i inkubować ją w temperaturze pokojowej przez kolejne 30 sekund. Po 30 minutach należy pobrać 200 µL pożywki z płytki i odseparować docelowe kolonie poprzez pipetowanie. Następnie rozproszone kolonie należy przenieść do nowej szalki o średnicy 60 mm.Inkubować i hodować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 aż do osiągnięcia dziesiątego pasażu. Na wczesnym etapie reprogramowania iPSC były wymieszane z przytwierdzionymi, niediferencjowanymi komórkami zróżnicowanymi. Przed ekspansją iPSC oraz pozostałe komórki były możliwe do rozróżnienia.Poprzez wysiewanie komórek w niskiej gęstości uzyskano kolonie o wielkości wystarczającej do pobrania. Po wyizolowaniu kolonii skupiska komórek rozdzielono do pojedynczych komórek i poddano hodowli. Następnie zaobserwowano czyste kolonie iPSC.Po namnożeniu czystych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych sprawdzono ich jakość. Komórki barwiono na obecność fosfatazy zasadowej, aby potwierdzić niezdiferencjowany stan indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Wszystkie kolonie pochodzące z izolowanych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych wykazały pozytywne barwienie.Markery pluripotencji potwierdzono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Przeprogramowane komórki wykazywały wysoką ekspresję markerów pluripotencji, takich jak SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 i przede wszystkim TRA-1-60; ekspresję markerów pluripotencji potwierdzono metodą RTPCR. Zastosowano seryjne wysiewanie z wirowaniem w celu przyczepienia PBMC do płytki pokrytej matrycą.Próbki są dołączone, a kolonie iPSC są powielane w celu puryfikacji. Stosując ten protokół, iPSC można wygenerować z PBMC w ciągu miesiąca. Protokół ten skraca czas wymagany do przylegania przetransdukowanych komórek i zapobiega utracie przeprogramowanych komórek, które nie były w stanie przylgnąć samodzielnie.Niemniej jednak, podczas próby przeprowadzenia tej procedury, kluczowe może okazać się oczyszczanie w pełni przeprogramowanych iPSC zdolnych do tworzenia kolonii. Wcześniej z sukcesem przeprogramowaliśmy PBMC oraz komórki jednojądrowe, korzystając z tego protokołu. Wygenerowane iPC pochodzące z komórek krwi mogą znaleźć szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach badawczych.Niniejszy protokół może pomóc w procesie przeprogramowania innych typów komórek w zawiesinie, w celu dalszych zastosowań i badań.

induced-pluripotent-stem-cell-generation-from-blood-cells-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Ten film demonstruje przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) na indukowane nerwowe komórki macierzyste (iNSC) za pomocą wirusa Sendai. Wirus Sendai jest nieintegrującym się wirusem, który oferuje skuteczny i bezpieczny pojazd do przeprogramowania komórek.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych (iNSC) z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC): procedura oparta na wirusie Sendai w celu przeprogramowania PBMNC na iNSC

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Poznaj metodę reprogramowania komórek krwi PBMC do iPSC przy użyciu wirowania. Protokół wykorzystuje wirusa Sendai i siłę odśrodkową do przylegania komórek, oferując nowe podejście w biologii komórek macierzystych.

Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania

Przeglądaj więcej filmów