Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania
21 grudnia 2016
Proponujemy protokół przeprogramowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poprzez posiew transdukowanych komórek krwi na płytkach pokrytych matrycą za pomocą wirowania, iPSC są z powodzeniem indukowane z komórek pływających. Technika ta sugeruje prosty i skuteczny protokół przeprogramowania komórek, takich jak PBMC i CBMC.
Ogólnym celem tego badania jest przeprogramowanie jednojądrzastych komórek krwi obwodowej w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu seryjnego posiewu przez wirowanie. Pierwotnie, iPSC, były generowane przez przeprogramowanie fibroblastów. Obecnie do przeprogramowania używa się różnych programów.
Jednak ze względu na dostępność krwi, PBMC mogą być nieakceptowanym źródłem komórek do dalszego zastosowania iPSC, w badaniach przesiewowych leków, modelowaniu prac dyplomowych i rozwoju medycyny regeneracyjnej. W ramach badania udostępnimy protokół dotyczący przeprogramowania iPSC za pomocą PBMC poprzez dodanie siły odśrodkowej. Ten protokół zapewni kolejną opcję podczas przeprogramowywania komórek pływających.
Demonstrując procedurę, będziemy używać Nama, doktoranta z mojego laboratorium. Aby wyizolować komórki monocytowe, najpierw uzyskaj co najmniej dziesięć mililitrów świeżej krwi z pobrania krwi w probówce do przygotowania komórek. Następnie przenieś krew do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki i rozcieńcz ją sterylnym PBS w stosunku od jednego do czterech.
Następnie dodaj dziesięć mililitrów pożywki o gradionym gęstości do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki i ostrożnie ułóż rozcieńczoną krew na pożywce o gradiencie gęstości. Następnie odwirować próbkę o masie 750 razy g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, bez przerwy na wirowanie. Po 30 minutach ostrożnie przenieś warstwę buffy do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki.
Dodaj 30 mililitrów PBS i umyj komórki. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 515 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć PBS i ponownie zawieś komórki w 0,5 mililitra pożywki z krwinkami.
Następnie policz komórki i umieść je na 24-dołkowej płytce. Dodaj PBS do otaczających studzienek, aby zapobiec parowaniu. Następnie stabilizuj komórki przez pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed transdukcją.
Dodaj dodatkowo 0,5 mililitra świeżej pożywki z krwinkami w trzecim do czwartego dnia, nie naruszając komórek. W tej procedurze przenieś komórki krwi do 15-mililitrowej stożkowej rurki i policz je za pomocą hemacytometru. Następnie przygotuj trzy razy dziesięć do piątej komórki do transdukcji i odwiruj komórki w temperaturze 515 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie wyrzuć supernatant przez odsysanie i ponownie zawieś komórki w 0,5 mililitra pożywki z krwinkami. Następnie przenieś komórki do dołka na niepowlekanej płytce 24-dołkowej. Rozmrozić mieszaninę wirusa Sendai w lodzie i dodać ją do zawieszonych komórek.
Uszczelnij płytkę folią uszczelniającą i odwiruj ją w temperaturze 1,150 g przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez noc. Aby pokryć 24-dołkową płytkę witronektyną, następnego dnia rozcieńczyć roztwór witronektyny w PBS, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu mikrogramów na mililitr.
Następnie dodaj jeden mililitr witronektyny do studzienki i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę. Następnie usuń roztwór powlekający i przenieś wszystkie podłoża zawierające komórki i wirusa do powleczonej studzienki. Następnie zbierz pozostałe komórki z dodatkowymi 0,5 mililitra świeżej pożywki z krwinkami i dodaj ją do studzienki zawierającej komórkę.
Następnie odwiruj płytkę w temperaturze 1 150 razy g przez dziesięć minut w temperaturze 35 stopni Celsjusza, a następnie utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez noc. W przypadku drugiego transferu komórek pokryj studzienkę pięcioma mikrogramami na mililitr witronektyny, jak opisano wcześniej. Do każdej transdukcji należy użyć jednego dołka płytki i przenieść zawiesinę komórek z pierwszej płytki na nowo pokrytą płytkę z witronektyną.
W międzyczasie dodaj jeden mililitr pożywki iPSC do studzienki pierwszej płytki w celu konserwacji i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla, z codzienną wymianą pożywki ze świeżą pożywką iPSC. Kolonie pojawią się od 14 do 21 dnia, po transdukcji. Odwirować nowo pokrytą płytkę, zawierającą zawieszone komórki, w temperaturze 1 150 razy g w 35 stopniach Celsjusza przez dziesięć minut.
Po odwirowaniu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego dnia należy usunąć supernatant i zastąpić go świeżo indukowaną pożywką z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Utrzymuj przyłączone komórki przy codziennej wymianie pożywki, aż do osiągnięcia 80% zbieżności.
Tydzień przed zbiorem kolonii wysiewaj od jednej dziesiątki do czwartej komórki w 100-milimetrowym naczyniu pokrytym witronektyną. Następnie przygotuj 60-milimetrowe naczynie pokryte witronektyną, dodając dwa mililitry roztworu witronektyny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę. Obserwując przez mikroskop, zaznacz kolonie na dnie płytki wyraźnymi granicami za pomocą markera.
Usuń roztwór witronektyny z nowej płytki i dodaj sześć mililitrów indukowanej pluripotencjalnej pożywki z komórek macierzystych, uzupełnionej dziesięciomilimolową kinazą RHO. Następnie usuń pożywkę hodowlaną z komórek i umyj je trzema mililitrami PBS. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu odrywającego kolonie iPSC i inkubuj je przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.
Następnie usuń roztwór z płytki i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 30 sekund. Po 30 minutach pobrać z płytki 200 mikrolitrów pożywki i odłączyć docelowe kolonie przez pipetowanie. Następnie przenieś rozproszone kolonie do nowej 60-milimetrowej naczynia.
Inkubuj i utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla, aż osiągną przejście dziesiąte. Na wczesnym etapie przeprogramowywania komórki iPS zmieszano z przyłączonymi nieprzeprogramowanymi komórkami zróżnicowanymi. Przed ekspansją iPSC i inne komórki różniły się od siebie, aby je rozróżnić.
Wysiewając komórki w małej gęstości, uzyskano kolonie, które były wystarczająco duże do zbierania. Po wyizolowaniu kolonii grudki komórek zostały zdysocjowane na pojedyncze komórki i hodowlę. Później zaobserwowano czyste kolonie iPSC.
Po namnażaniu się czystych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych badano jakość komórek. Komórki barwiono fosfatazą alkaliczną, aby potwierdzić niezróżnicowany stan indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Wszystkie kolonie pochodzące z wyizolowanych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych wykazywały pozytywne zabarwienie.
Markery pluripotencjalne potwierdzono barwieniem immunofluorescencyjnym. Przeprogramowane komórki wykazywały wysoką ekspresję markerów pluripotencjalnych, takich jak SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 i, co najważniejsze, TRA-1-60, ekspresja markerów pluripotencjalnych została potwierdzona za pomocą RTPCR. Korzystając z galwanizacji seryjnej przez wirowanie, mocowanie tranzytu wykorzystuje PBMC na płytce pokrytej metrykami.
Przyłącza się tam są zgodnie z zaleceniami, a kolonie iPSC powtarza się w celu oczyszczenia. Korzystając z tego protokołu, iPSC można wygenerować z PBMC w ciągu miesiąca. Protokół ten skraca czas potrzebny na przyłączenie transdukowanych komórek i zapobiega utracie przeprogramowanych komórek, które nie były w stanie samodzielnie się przyłączyć.
Jednak oczyszczanie w pełni przeprogramowanych iPSC tworzących kolonie może mieć kluczowe znaczenie podczas próby tej procedury. Wcześniej udało nam się przeprogramować PBMC i komórki jednojądrzaste przy użyciu tego protokołu. Wygenerowane iPC pochodzące z komórek krwi mogą być szeroko stosowane w różnych dziedzinach badań.
Protokół ten może pomóc w procesie przeprogramowania innych typów pływających komórek zawiesinowych, do dalszych zastosowań i badań.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół przeprogramowania monocyto- i limfocytów krwi obwodowej (PBMC) w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z wykorzystaniem wirowania. Metoda ta zwiększa dostępność PBMC jako wiarygodnego źródła iPSC, które mogą być wykorzystywane w różnorodnych zastosowaniach, takich jak przesiewy leków oraz medycyna regeneracyjna.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Reprogramowanie komórek
- Medycyna regeneracyjna
Wprowadzenie
- Indukowane pluripotentne komórki macierzyste (iPSCs) zostały po raz pierwszy wygenerowane z fibroblastów.
- Mononuklearné komórki krwi obwodowej (PBMCs) stanowią bardziej dostępnym źródłem komórek.
- iPSCs znajdują zastosowanie w przesiewaniu leków oraz modelowaniu chorób.
- Obecne metody reprogramowania PBMCs są ograniczone.
Cel badania
- Opracowanie prostego i skutecznego protokołu przeprogramowania PBMC w iPSC.
- Wykorzystanie siły odśrodkowej w celu usprawnienia procesu przeprogramowania.
- Zapewnienie alternatywnej metody pracy z komórkami zawiesiny.
Zastosowane metody
- Reprogramowanie PBMC do iPSC.
- Wysiewanie transdukowanych komórek krwi na płytki pokryte macierzą.
- Zastosowanie wirowania w celu ułatwienia adhezji komórek.
- Indukcja iPSC z komórek pływających.
Główne wyniki
- Skuteczna indukcja iPSC z PBMC zgodnie z proponowanym protokołem.
- Wykazanie efektywności wirowania w procesie reprogramowania.
- Potencjał do szerszego zastosowania iPSC pochodzących z PBMC.
- Zapewnienie nowej opcji dla badaczy w dziedzinie biologii komórek macierzystych.
Wnioski
- Protokół oferuje prosty sposób przeprogramowania PBMC w iPSC.
- Metoda ta może zwiększyć wykorzystanie PBMC w różnych zastosowaniach biomedycznych.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć użyteczność tej techniki w medycynie regeneracyjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia efektywne generowanie iPSC z mononuklearnych komórek krwi obwodowej, zapewniając nieinwazyjne i skalowalne źródło do modelowania chorób oraz badań przesiewowych leków. Dzięki zastosowaniu wirowania w celu zwiększenia adhezji komórek, metoda ta poprawia wydajność reprogramowania i ogranicza utratę komórek w początkowych etapach. Metoda ta wspiera walidację celu oraz rozwój modeli przedklinicznych z wykorzystaniem komórek pochodzących od pacjentów, przyspieszając badania translacyjne w medycynie regeneracyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych z wykorzystaniem genetycznie dopasowanych ludzkich iPSC pochodzących z dostępnych próbek krwi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odnawialne źródło komórek do wyjaśniania szlaków sygnałowych i walidacji funkcjonalnej celów terapeutycznych bez konieczności przeprowadzania inwazyjnych biopsji.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie zestandaryzowanych populacji iPSC w celu zapewnienia spójności podczas przesiewania związków i opracowywania analiz fenotypowych.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność dzięki seryjnemu wysiewaniu metodą wirowania, co ogranicza zmienność w przywieraniu komórek oraz wydajności reprogramowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie istotne dla chorób poprzez wytwarzanie komórek pluripotencjalnych zdolnych do różnicowania się w linie komórkowe istotne dla testowania toksyczności i skuteczności leków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia skalowalną ekspansję i bankowanie kolonii iPSC na potrzeby podłużnych badań przedklinicznych oraz ograniczania ryzyka w analizie mechanizmu działania.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając niezawodne źródło iPSC do późniejszych zastosowań w walidacji celów terapeutycznych, opracowywaniu testów oraz badaniach przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez poprzez generowanie specyficznych dla pacjenta iPSC, które zachowują tło genetyczne dawcy na potrzeby badań mechanistycznych.
- Przesiewanie: Pozwala na otrzymanie adherentnych, proliferujących kolonii iPSC odpowiednich do wysokoprzepustowych analiz obrazowych (high-content screening) oraz testów zależności dawka-odpowiedź po transdukcji i selekcji.
- Analityka: Umożliwia ilościową ocenę wydajności reprogramowania poprzez parametry tworzenia kolonii oraz ekspresję markerów pluripotencji (np. SSEA4, Oct4, TRA-1-60) w celu podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu procesu.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej, dostarczając komórek zdolnych do różnicowania w tkankowo specyficznych testach i badaniach farmakologii bezpieczeństwa.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę generowania iPSC w wielu projektach, co zmniejsza zależność od reprogramowania fibroblastów i umożliwia prowadzenie równoległych procesów roboczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez wykorzystanie pochodzących od ludzi, genetycznie stabilnych iPSC, które odzwierciedlają zmienność pacjentów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność produkcji iPSC dzięki określonym etapom wirowania i wysiewaniu na powłokę z macierzy, co minimalizuje zmienność wynikającą z błędów manualnych.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza ryzyko biologiczne w identyfikacji wiodących związków poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania fenotypów związanych z celem w ludzkim kontekście komórkowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka, dostarczając odczytów mechanistycznych z modeli pochodnych od iPSC, które informują decyzje o dalszym rozwoju.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, transdukcji wirusowej oraz technikach manipulacji komórkami z wykorzystaniem wirowania.
- Zależne od dostępu do wirówek chłodzących, powłok macierzy (np. witronektyny) oraz specjalistycznych pożywek do utrzymania komórek krwi i ekspansji iPSC.
- Konieczna jest standaryzacja działań między zespołami w zakresie siły odśrodkowej (g), czasu i temperatury podczas etapów seryjnego wysiewania w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wymagane jest uwzględnienie adaptacji przy zastosowaniu różnych źródeł komórek pochodzenia krwi (np. krew pępowinowa vs. krew obwodowa) ze względu na zmienność żywotności komórek i wydajności transdukcji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność stosowania technik aseptycznych podczas wielokrotnych przeniesień oraz potencjalną zmienność wydajności reprogramowania w zależności od jakości komórek dawcy i historii pasażowania.
