Testy do badania roli witronektyny w adhezji bakterii i oporności surowicy

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji gospodarz-patogen, takie jak to, w jaki sposób patogeny bakteryjne powodują choroby u ludzi poprzez wykorzystanie ludzkich białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona odpowiedzieć na pytanie, czy jakikolwiek patogen może wykorzystać witronektynę do ustalenia infekcji gospodarza. Skupimy się na witronektynie, białku gospodarza, które bierze udział w macierzy zewnątrzkomórkowej, ale pełni również funkcję inhibitora dopełniacza w determinującym szlaku aktywacji dopełniacza.

Fakty te są bardzo ważne i bardzo atrakcyjne dla patogenów wywołujących choroby u ludzi. Aby przygotować się do cytometrii przepływowej, należy ponownie zawiesić osady bakteryjne za pomocą 50 mikrolitrów buforu blokującego zawierającego 250 nanomolowych witronektyny. Następnie inkubować próbki przez godzinę w temperaturze pokojowej bez wstrząsania.

Po inkubacji osadzać bakterie przez odwirowanie w stężeniu 3 500 g przez pięć minut. Następnie umyj granulki trzy razy za pomocą PBS i podobnych etapów wirowania. Po umyciu dodać 50 mikrolitrów pierwotnych przeciwciał poliklonalnych przeciwko ludzkiej witronektynie owcom do osadu bakteryjnego w rozcieńczeniu od jednego do 100 w PBS BSA.

Inkubować zawiesinę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj bakterie trzykrotnie PBS, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Następnie dodaj 50 mikrolitrów PBS BSA zawierających sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny przeciwciała poliklonalne przeciwko owcom osła.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę w ciemności. Na koniec, po trzech etapach mycia, ponownie zawieś osad bakteryjny z 300 mikrolitrami PBS i przeanalizuj za pomocą cytometrii przepływowej. Aby przygotować się do testu ELISA, należy dozować 100 mikrolitrów roztworu białkowego do każdego dołka płytki do mikromiareczkowania PolySorp.

Zamknij płytkę pokrywką i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby ułatwić unieruchomienie białka na dołkach płytki do mikromiareczkowania. Wylej roztwór z płytki do mikromiareczkowania, przechylając ją do góry nogami nad zlewem. Następnie umyj studzienki trzykrotnie 300 mikrolitrami PBS na studzienkę.

Zablokuj powlekane studzienki na jedną godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą PBS zawierającego 2,5 procenta objętości masy BSA. Po usunięciu roztworu blokującego umyć studzienki trzykrotnie 300 mikrolitrami PBST na studzienkę. Teraz dodaj 100 mikrolitrów 50 nanomolowych rekombinowanych PH oznaczonych przez niego do każdej próbki.

W studzienkach kontrolnych dodaj tylko 100 mikrolitrów PBS BSA. Inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wyrzucić roztwór białkowy i usunąć niezwiązane białka, przemłukując studzienki trzykrotnie 300 mikrolitrami PBST na studzienkę.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów PBS BSA zawierających sprzężone z peroksydazą chrzanową przeciwciała poliklonalne anty-HE. Po inkubacji przez godzinę w temperaturze pokojowej umyj studzienki trzykrotnie 300 mikrolitrami PBST na studzienkę. Wykryj kompleksy antygen-przeciwciało, dodając 100 mikrolitrów odczynnika wykrywającego ELISA do każdej studzienki.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów jednego molowego kwasu siarkowego na studzienkę, aby zatrzymać reakcję. Zmierz gęstość optyczną studzienek przy 450 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek. Unieruchomić ludzką witronektynę na czujnikach reagujących aminami metodą sprzężenia aminowego zgodnie z wytycznymi producenta.

Za pomocą PBS seryjnie rozcieńczyć rekombinowany ligand pH od zera do czterech mikromoli i przenieść powstałe roztwory na 96-dołkową czarną płaską płytkę do mikromiareczkowania. Przeprowadź eksperyment w temperaturze 30 stopni Celsjusza za pomocą instrumentu do interferometrii biowarstwowej. Odpipetować 10 mikrolitrów roztworu witronektyny w PBS o dwóch mikrogramach na mililitr na szklane szkiełko mikroskopowe w postaci pojedynczej kropli.

Pozostaw kroplę do wyschnięcia na szkiełku przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyć szkiełka podstawowe pokryte białkiem trzykrotnie, zanurzając je w zlewce zawierającej PBS na dwie sekundy w celu usunięcia nadmiaru niepowlekanego białka. Teraz dodaj 10 mililitrów świeżej kultury Hif do sterylnej plastikowej szalki Petriego i zanurz powlekane szkiełka w pożywce hodowlanej.

Inkubuj naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z potrząsaniem przy 20 obr./min. Po inkubacji należy usunąć wszelkie niezwiązane bakterie, zanurzając szkiełka trzykrotnie w zlewce wypełnionej PBS przed wizualizacją związanych bakterii za pomocą barwienia metodą Grama, jak opisano w protokole tekstowym. Hodowla komórek nabłonkowych A549 zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Po jednym przemyciu i trypsynizacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rozcieńczyć zawiesinę komórek do 5 000 komórek na mililitr za pomocą kompletnej pożywki zawierającej pięć mikrogramów na mililitr gentamycyny. Przed infekcją bakteryjną zastąp pożywkę w studzienkach pożywką F12 i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyj monowarstwę komórek trzykrotnie jednym mililitrem PBS w temperaturze pokojowej.

Następnie umieść płytkę na lodzie i 200 mikrolitrach wstępnie schłodzonego podłoża F12 zawierającego 10 mikrogramów na mililitr witronektyny. Po inkubacji płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę, wyrzucić roztwór przez pipetowanie i dwukrotnie przemyć warstwę komórek jednym mililitrem PBS w temperaturze pokojowej. Dodaj 100 mikrolitrów świeżo wyhodowanego dzikiego typu Hif w pożywce F12 do każdej studzienki.

Inkubować płytkę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odessać pożywkę pipetą i trzykrotnie przemyć komórki nabłonka A549 PBS. Dodać 50 mikrolitrów roztworu do oddzielania komórek na studzienkę, a następnie przeprowadzić pięciominutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów kompletnej pożywki F12 na studzienkę, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Przenieś komórki nabłonkowe z każdej studzienki do sześciomililitrowej szklanej rurki zawierającej cztery szklane kulki. Lizuj komórki w temperaturze pokojowej, wirując przez dwie minuty.

Po 100-krotnym rozcieńczeniu lizatu komórkowego rozcieńczyć 10 mikrolitrów rozcieńczonej próbki na czekoladowej płytce agarowej. Policz kolonie po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić analizę zależnej od witronektyny oporności na działanie bakteriobójcze surowicy ludzkiej, należy najpierw wyhodować i osadzać bakterie zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad bakteryjny z jedną objętością buforu dekstroza-żelatyna-weronal. Teraz dodaj 1 500 CFU bakterii do 100 mikrolitrów DGVB plus plus zawierających 5% surowicy. Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, wytrząsając przy 300 obr./min.

Usunąć 10 mikrolitrów podwielokrotności z mieszaniny reakcyjnej po upływie zero minut i 15 minut. Umieść porcję na agarze czekoladowym i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji płytek z agarem czekoladowym należy policzyć kolonie pojawiające się na płytkach i obliczyć procent zabitych bakterii zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Wszystkie izolaty kliniczne Hif testowane w tym badaniu rekrutowały witronektynę do powierzchni komórki, jak określono za pomocą cytometrii przepływowej. Wiązanie witronektyny przez dziki szczep Hif spowodowało przesunięcie populacji, podczas gdy mutant nie wiązał witronektyny. Interakcje białko-białko między głównym białkiem wiążącym witronektynę PH a witronektyną oszacowano za pomocą testu ELISA.

Wyniki wskazują na istotną interakcję między pH a witronektyną i kontrolą pozytywną w stosunku do kontroli ujemnej. Interakcja między pH a witronektyną oszacowano w czasie rzeczywistym za pomocą interferometrii biowarstwowej, uzyskując powinowactwo do 2,2 mikromola. Co więcej, bakterie pozbawione ekspresji pH na powierzchni komórki wykazywały zmniejszone przyleganie do powierzchni szklanych pokrytych witronektyną w porównaniu z komórkami typu dzikiego.

Ponadto obecność witronektyny na powierzchni komórek nabłonka znacznie zwiększyła przyleganie Hif. Aby oszacować aktywność witronektyny hamującą dopełniacz, zbadano zabijanie za pośrednictwem surowicy. Komórki Hif typu dzikiego wykazywały wyższą oporność na surowicę niż komórki zmutowane.

Żadne bakterie nie zostały zabite w obecności surowicy inaktywowanej termicznie. Co ciekawe, dziki typ Hif wykazywał zmniejszoną przeżywalność w surowicy zubożonej w witronektynę, a uzupełnienie witronektyny zwiększało przeżywalność bakterii. Jednak zmutowany szczep nie zareagował na wyczerpanie witronektyny, ponieważ nie mógł rekrutować witronektyny na powierzchnię komórki.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech dni dla dowolnego patogenu i pamiętaj, aby użyć świeżej kultury patogenów bakteryjnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować wiązanie witronektyny z patogenem. Oprócz tej techniki, białka powierzchniowe wiążące witronektynę bakterii można zidentyfikować za pomocą proteomiki i western blottingu.

Technika ta jest ważna dla naukowców zajmujących się interakcją gospodarz-patogen, a także dla zbadania mechanizmu wirulencji u bakterii.