Zaawansowany zwierzęcy model przerzutów jelita grubego w wątrobie: techniki obrazowania i właściwości klonów z przerzutami

Ogólnym celem tego podejścia jest zamodelowanie kolonizacji wątroby przez klony nowotworowe z przerzutami pochodzące z raka jelita grubego oraz wykorzystanie tego modelu do usprawnienia diagnostyki i terapii przerzutów do wątroby. Obserwacje kliniczne wskazują na heterogeniczność choroby przerzutowej. Nasz model umożliwia uchwycenie tej heterogeniczności w celu wykrycia genów powiązanych z chorobą oligometastatyczną i polimetastatyczną.

Oraz aby wykorzystać tę wiedzę do usprawnienia wczesnego wykrywania i leczenia przerzutów. Główną zaletą naszej techniki jest zastosowanie podwójnie znakowanych linii komórkowych monoklonalnych pochodzących od pacjentów z rakiem jelita grubego, co pozwala na obserwację rozwoju przerzutów do wątroby zarówno in vivo, jak i ex vivo. Zastosowania tej techniki obejmują terapię chorób przerzutowych.

Umożliwia to testowanie potencjalnych leków z ilościową oceną liczby zmian przerzutowych oraz kinetyki wzrostu każdej z nich. Po wygenerowaniu komórek HCT116 znakowanych lucyferazą i tdTomato oraz przygotowaniu pożywek, odczynników i aparatury zgodnie z protokołem tekstowym, wysiej przetransfekowane komórki w płytkach 96-dołkowych z następującą gęstością w każdym dołku, w trzech powtórzeniach. Po pięciogodzinnej inkubacji komórek określ intensywność fluorescencji tdTomato za pomocą systemu IVIS, uruchamiając oprogramowanie do obrazowania na komputerze stacjonarnym.

Kliknij przycisk Initialize, aby zainicjować czas obrazowania, binning medium, wartość 2 dla przysłony (F/Stop), 535 dla filtra wzbudzenia oraz 580 dla filtra emisji. Umieść płytkę 96-dołkową na stacji obrazowania, a następnie kliknij Acquire, aby rozpocząć obrazowanie. Po uzyskaniu obrazu w palecie narzędzi (Tool Palette) kliknij ROI tools i wybierz opcję 12x8 z ikony szczeliny.

Utwórz szczeliny o wymiarach 12x8, aby pokryć obszar sygnału na obrazie płytki 96-dołkowej, a następnie kliknij kartę Measurements. Pojawi się okno z tabelą pomiarów ROI w jednostkach fotonów na sekundę, na steradian, na centymetr kwadratowy. Gdy komórki osiągną 70 do 80 procent konfluencji, około jednej godziny przed wstrzyknięciem do śledziony, dodaj do komórek 0,05 procent trypsyny i 0,53 milimolar EDTA w celu ich dysocjacji.

Po inkubacji komórek przez trzy do pięciu minut, należy użyć równej objętości C-DMEM, aby zneutralizować trypsynę. Kultury należy dokładnie wymieszać pipetą, aby uniknąć powstawania skupisk, a następnie policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Zawiesinę komórkową w 1x DBPS należy zamrozić przy stężeniu od 1,2 do 2 x 10⁶ komórek na 100 µl, dokładnie pipetując w celu uniknięcia agregacji.

Następnie przechowywać komórki w lodzie do momentu iniekcji, okresowo resuspendując je w probówce. Po podaniu leków przeciwbólowych i znieczuleniu samicy bezwłosej myszy athymicznej w wieku od sześciu do ośmiu tygodni zgodnie z protokołem tekstowym, zlokalizować śledzionę jako fioletowy obszar widoczny zewnętrznie przez skórę na lewym boku, a następnie wykonać cięcie skóry o długości ośmiu milimetrów na lewym boku tuż nad organem. Następnie unieść ścianę brzuszną i wykonać niewielkie nacięcie.

Wprowadzić powietrze do jamy brzusznej, aby narządy wewnętrzne oddaliły się od miejsca nacięcia. Następnie poszerzyć nacięcie ściany brzusznej do około pięciu milimetrów. Kroki zaprezentowane dla iniekcji są kluczowe dla przeprowadzenia procedury.

Wyciek komórek nowotworowych podczas wstrzykiwania może prowadzić do przerzutów pozawątrobowych. Wstrzykiwanie należy przeprowadzać powoli, w czasie od 30 do 60 sekund, podając nie więcej niż 1,5 miliona komórek, aby zapobiec zakrzepicy żyły wrotnej. Odsłoń śledzionę, używając patyczka higienicznego do delikatnego wywierania nacisku wokół nacięcia.

W razie potrzeby tkankę tłuszczową trzustki można delikatnie odsunąć, aby ułatwić dostęp i uniknąć uszkodzenia śledziony. Używając strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27G, w czasie od 30 do 60 sekund, wstrzyknij 100 µL komórek w koniuszek odsłoniętej śledziony. Po zakończeniu iniekcji, przed wyjęciem igły, załóż na śledzionę mikroklips, aby zapobiec wyciekowi wstrzykniętej zawiesiny komórkowej, i pozostaw go w tym miejscu przez pięć minut.

Pięć minut po wstrzyknięciu należy użyć ręcznego urządzenia do kauteryzacji, aby przeprowadzić splenektomię w celu uzyskania hemostazy. Należy rozpocząć od wnęki śledziony po stronie przedniej, wstępnie koagulując bliższą stronę naczyń wraz z przylegającą tkanką tłuszczową. W miejscu wstrzyknięcia może wystąpić krwawienie ze śledziony.

Mikro-klips zostaje założony na śledzionę, aby zapobiec wyciekowi komórek nowotworowych i kontrolować krwawienie ze śledziony. Metody hemostazy mogą obejmować kauteryzację, ucisk utrzymywany przez trzy do pięciu minut oraz, w razie potrzeby, ligację szwem. Zamknij ścianę brzusną, używając wchłanialnej plecionej nici chirurgicznej 5.0 i pojedynczego szwu poziomego.

Następnie należy zamknąć skórę za pomocą niewchłanialnej nici monofilamentowej 4.0, również stosując pojedynczy szew poziomy. Stan zwierzęcia po operacji należy monitorować zgodnie z protokołem opisanym w tekście. Aby przeprowadzić obrazowanie bioluminescencyjne, po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem opisanym w tekście, należy wstrzyknąć zwierzętom doprzewnowo 150 µL wcześniej przygotowanej lucyferyny świetlikowej.

Umieść myszy w systemie IVIS w pozycji grzbietowej, stosując dystanse pomiędzy zwierzętami, aby zminimalizować wpływ sygnału na sąsiednie myszy. Trzy minuty po wstrzyknięciu lucyferyny, po uruchomieniu systemu IVIS, wybierz tryb luminescencyjny, czas ekspozycji jeden sekundę oraz średni binning. Kliknij przycisk Acquire, aby rozpocząć obrazowanie, upewniając się, że procedura ta jest konsekwentnie przeprowadzana trzy minuty po wstrzyknięciu lucyferyny.

Po wykonaniu obrazu, gdy pojawi się okno obrazu oraz paleta narzędzi, kliknij narzędzia ROI i wybierz liczbę od jeden do pięciu z ikony koła, odpowiadającą liczbie obrazowanych myszy. Aby zdefiniować ROI, obrysuj kołem obszar sygnału luminescencyjnego w jamie brzusznej myszy, a następnie kliknij pomiary ROI jako dowolną jednostkę radiancji. Wyznacz dodatkowe koło ROI dla tła.

Cztery tygodnie po wstrzyknięciu, aby przeprowadzić rozproszoną tomografię obrazowania luminescencyjnego (DLIT), po uruchomieniu systemu IVIS, należy wybrać Imaging Wizard, Bioluminescence i kliknąć Next. Wybrać DLIT i kliknąć Next. Następnie wybrać Firefly Probes i kliknąć Next.

Wybierz Mouse (mysz) jako Image Subject (obiekt obrazowania), Auto dla Exposure Parameter (parametru ekspozycji), C-13 Centimeter dla Field of View (pola widzenia) oraz 0.5 Centimeter jako Subject Type (typ obiektu), a następnie kliknij Next (dalej). Następnie kliknij przycisk Acquire (pozyskaj), aby rozpocząć obrazowanie. Po uzyskaniu obrazu przejdź do karty Analyze (analiza), wybierz zakładkę DLIT 3D Reconstruction i kliknij Reconstruct (rekonstruuj), aby wygenerować obraz rekonstrukcji 3D.

Kliknij Tools, a następnie 3D Animation. Następnie w oknie 3D Animation wybierz Spin CCW on Y-Axis. Kliknij Record and Save, aby zapisać plik w formacie mov.

Aby przeprowadzić obrazowanie fluorescencyjne ex vivo, po pobraniu i wypreparowaniu wątrób myszy zgodnie z protokołem tekstowym, należy zmierzyć intensywność fluorescencji dla każdej kolonii nowotworowej przy użyciu systemu IVIS. Należy wybrać Fluorescence (fluorescencję), Exposure Time (czas ekspozycji) wynoszący cztery sekundy, Medium Binning (średnie binowanie), F/Stop na poziomie 2, filtr wzbudzenia 535 oraz filtr emisji 580. Następnie należy kliknąć przycisk Acquire, aby rozpocząć obrazowanie.

Po uzyskaniu obrazu odnaleźć okno obrazu w Palecie narzędzi (Tool Palette). Kliknąć Narzędzia ROI (ROI Tools) i wybrać opcję 1 z ikony koła. Aby zdefiniować obszary ROI, należy zakreślić kołem obszar sygnału poszczególnych kolonii nowotworowych na obrazie.

Wyznacz dodatkowy okrąg ROI dla tła, a następnie kliknij Measurements of the ROI, aby uzyskać wartość w arbitralnych jednostkach radiancji. Wyznacz kolejny okrąg ROI dla tła. Na koniec przeprowadź obliczenia zgodnie z protokołem tekstowym.

Jak pokazano tutaj za pomocą bioluminescencji, trzy tygodnie po wstrzyknięciu do śledziony, klony P1 i P2 HCT116 L2T wykazywały większy ładunek nowotworowy w porównaniu z klonami O1 i O2. Dane te wskazały, że klony O1 i O2 mogą naśladować chorobę oligometastatyczną, podczas gdy P1 i P2 reprezentują agresywną, rozległą kolonizację przerzutową wątroby. Ilościowe oznaczenie fluorescencji wątroby ex vivo, wykonane cztery tygodnie po wstrzyknięciu do śledziony, potwierdziło, że P1 i P2 wykazywały wyższą intensywność fluorescencji w porównaniu z wątróbami klonów O1 i O2. Fluorescencyjne znakowanie klonów nowotworowych pozwoliło zidentyfikować liczbę i wielkość poszczególnych kolonii przerzutowych w wątrobie.

Ogólnie obrazy fluorescencyjne ex vivo były zgodne z wynikami makroskopowymi, jednak małe kolonie ukryte pod powierzchnią były lepiej wykrywane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Jak tutaj przedstawiono, liczba i wielkość kolonii przerzutowych zostały policzone i zmierzone w każdej wątrobie, a obrazowanie fluorescencyjne ex vivo wykonano dla każdej kolonii przerzutowej dla każdego monoklonu. Jak pokazano na tych wykresach, całkowita liczba przerzutów w P1 była wyższa w porównaniu z P2, O1 i O2, podczas gdy średnia wielkość poszczególnych kolonii była większa w P2 niż w P1, O1 i O2. Nasz model zapewnia podejście do identyfikacji nowych genów perswazyjnych związanych z heterogenicznością molekularną przerzutów.

Geny te mogą służyć jako cele dla nowych podejść w leczeniu przerzutów. Nasz model może być również wykorzystany do walidacji różnych genów kodujących białka oraz niekodujących, które pojawiają się w aktualnych dużych bazach danych klinicznych, ale nie zostały jeszcze zdefiniowane funkcjonalnie w kontekście choroby przerzutowej. Zazwyczaj osoby nieznające tej metody będą miały trudności ze względu na delikatność zabiegu chirurgicznego u zwierząt.

Jednak dzięki praktyce, w krótkim czasie można osiągnąć dobre wyniki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o przestrzeganiu wytycznych dotyczących operacji na zwierzętach, uważne kontrolowanie krwawienia oraz zapobieganie wyciekowi zawiesiny komórek nowotworowych.