Zaawansowany zwierzęcy model przerzutów jelita grubego w wątrobie: techniki obrazowania i właściwości klonów z przerzutami

Ogólnym celem tego podejścia jest modelowanie kolonizacji wątroby przez klony guzów z przerzutami generowane przez raka jelita grubego oraz wykorzystanie tego modelu do poprawy diagnostyki i terapii przerzutów do wątroby. Obserwacje kliniczne wskazują na niejednorodność choroby przerzutowej. Nasz model zapewnia możliwość uchwycenia tej heterogeniczności w celu wykrycia genów, które są związane z chorobą oligometastatyczną i wieloprzerzutową.

I wykorzystać tę wiedzę do poprawy wczesnego wykrywania i leczenia przerzutów. Główną zaletą naszej techniki jest to, że wykorzystujemy podwójnie znakowane linie komórek monoklonalnych pochodzących od pacjentów z rakiem jelita grubego i możemy obserwować rozwój przerzutów do wątroby zarówno in vivo, jak i ex vivo. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii choroby przerzutowej.

Daje nam to możliwość przetestowania dowolnego potencjalnego leku z ilościowym oszacowaniem liczby zmian przerzutowych i kinetyki wzrostu każdej zmiany. Po wygenerowaniu komórek HCT116 znakowanych lucyferazyą tdPomidor i przygotowaniu pożywki, odczynników i instrumentów, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść transkrybowane komórki pod kontrolą o następujących gęstościach na basenie, w trzech egzemplarzach, na płytkach 96-dołkowych. Po inkubacji komórek przez pięć godzin, określ ilościowo intensywność fluorescencji tdTomato za pomocą systemu IVIS, uruchamiając oprogramowanie do obrazowania na pulpicie.

Kliknij przycisk Inicjalizuj, aby zainicjować czas obrazowania, średnie grupowanie, dwa dla F/Stop, 535 dla filtra wzbudzenia i 580 dla filtra emisji. Umieść 96-dołkową płytkę na stacji obrazowania i kliknij Pobierz, aby rozpocząć obrazowanie. Po pobraniu obrazu w palecie narzędzi kliknij Narzędzia ROI i wybierz 12x8 z ikony szczeliny.

Utwórz szczeliny 12x8, aby pokryć obszar sygnału na obrazie płytki 96-dołkowej i kliknij zakładkę Pomiary. Obserwuj okno z tabelą pomiarów ROI z jednostkami fotonów na sekundę, na steradian, na centymetr kwadratowy. Gdy komórki osiągną 70 do 80 procent zbiegu, około godziny przed wstrzyknięciem śledziony, dodaj 0,05 procent tripyny i 0,53 milimolowego EDTA do komórek, aby je zdysocjować.

Po inkubacji komórek przez trzy do pięciu minut, użyj równej objętości C-DMEM, aby zneutralizować trypinę. Dokładnie odpipetuj kultury, aby uniknąć zbrylania się, a następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki. Zamrozić zawieszone komórki w 1x DBPS w stężeniu od 1,2 do 2 x 10 do 6 komórek na 100 mikrolitrów, dokładnie pipetując, aby uniknąć zbrylania.

Następnie należy trzymać komórki na lodzie do momentu wstrzyknięcia, od czasu do czasu zawieszając je ponownie w probówce. Po podaniu środków przeciwbólowych i znieczuleniu sześcio- do ośmiotygodniowej nagiej samicy atymimicznej myszy zgodnie z protokołem tekstowym, zidentyfikuj śledzionę jako fioletowy obszar widoczny zewnętrznie przez skórę na lewym boku i wykonaj ośmiomilimetrowe nacięcie na lewym boku skóry tuż nad narządem. Następnie unieś się na ścianie brzucha i wykonaj małe nacięcie.

Wpuść powietrze do jamy brzusznej, aby narządy wewnętrzne odsunęły się od miejsca nacięcia. Następnie powiększ nacięcie ściany brzucha do około pięciu milimetrów. Kroki pokazane w przypadku wstrzyknięcia mają kluczowe znaczenie dla zabiegu.

Wyciek komórek nowotworowych podczas wstrzykiwania może prowadzić do przerzutów pozawątrobowych. Wstrzyknięcie powinno być wykonywane powoli, przez 30 do 60 sekund, z nie więcej niż 1,5 miliona komórek, aby zapobiec zakrzepicy żyły wrotnej. Odsłoń śledzionę za pomocą bawełnianego wacika, aby delikatnie docisnąć okolice nacięcia.

W razie potrzeby tłuszczem trzustkowym można delikatnie manipulować, aby pomóc w ekspozycji, aby nie uszkodzić śledziony. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 27, przez okres od 30 do 60 sekund, wstrzyknij 100 mikrolitrów komórek w końcówkę odsłoniętej śledziony. Pod koniec wstrzyknięcia, przed wyjęciem igły, należy założyć mikroklips na śledzionę, aby zapobiec wyciekowi zawiesiny komórek, do której wstrzyknięto iskierkę, i pozostawić go na miejscu na pięć minut.

Pięć minut po wstrzyknięciu użyj ręcznego urządzenia do kauteryzacji, aby wykonać splenektomię w celu hemostazy. Zacznij od wnęki śledziony po stronie przedniej, wstępnie koagulując bliższą stronę naczyń z przylegającą tkanką tłuszczową. W miejscu wstrzyknięcia może wystąpić krwawienie ze śledziony.

Mikroklips nakłada się na śledzionę, aby zapobiec wyciekowi komórek nowotworowych i kontrolować krwawienie ze śledziony. Metody hemostazy mogą obejmować kauteryzację, utrzymywanie ciśnienia przez trzy do pięciu minut i podwiązanie szwów, jeśli to konieczne. Zamknij ścianę brzucha za pomocą wchłanialnego szwu plecionego 5,0 i pojedynczego ściegu poziomego.

Następnie użyj niewchłanialnego szwu monofilamentowego 4.0, aby zamknąć skórę, również za pomocą pojedynczego ściegu poziomego. Monitoruj zwierzę po operacji, zgodnie z protokołem tekstowym. Aby wykonać obrazowanie bioluminescencyjne, po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, wstrzyknąć zwierzętom dootrzewnowo 150 mikrolitrów wcześniej przygotowanej lucyferyny świetlika.

Umieść myszy w IVIS w pozycji leżącej na plecach z przekładkami między zwierzętami, aby zminimalizować sygnał do sąsiednich myszy. Trzy minuty po wstrzyknięciu lucyferyny, po zainicjowaniu IVIS, wybierz luminescencyjny, jednosekundowy czas ekspozycji i średnie binning. Kliknij przycisk Pobierz, aby rozpocząć obrazowanie, upewniając się, że obrazowanie jest konsekwentnie wykonywane trzy minuty po wstrzyknięciu lucyferyny.

Po pobraniu obrazu i wyświetleniu okna obrazu oraz palety narzędzi kliknij pozycję Narzędzia ROI i wybierz liczbę od jednego do pięciu z ikony koła, która odpowiada liczbie sfotografowanych myszy. Aby zdefiniować ROI, zakreśl obszar sygnału luminescencyjnego na jamie brzusznej myszy, a następnie kliknij pomiary ROI jako dowolną jednostkę promieniowania. Dołącz dodatkowy okrąg ROI jako tło.

Cztery tygodnie po wstrzyknięciu, aby przeprowadzić tomografię obrazowania rozproszonego luminescencyjnego lub DLIT, po zainicjowaniu IVIS wybierz Kreator obrazowania, Bioluminescencja i kliknij Dalej. Wybierz DLIT i kliknij Dalej. Wybierz opcję Firefly Proes (Sondy Firefly) i kliknij przycisk Next (Dalej).

Wybierz opcję Mysz dla tematu obrazu, Auto dla parametru ekspozycji C-13 centymetr dla pola widzenia i 0,5 centymetra jako typ tematu, a następnie kliknij przycisk Dalej. Następnie kliknij przycisk Pobierz, aby rozpocząć obrazowanie. Po pobraniu obrazu wybierz zakładkę DLIT 3D Reconstruction, na karcie Analyze (Analizuj) i kliknij Reconstruct (Rekonstrukcja), aby wygenerować obraz rekonstrukcji 3D.

Kliknij Narzędzia i animacja 3D. Następnie w oknie Animacja 3D wybierz opcję Obróć w lewo na osi Y. Kliknij przycisk Nagraj i zapisz, aby zapisać plik w formacie mov.

Aby przeprowadzić obrazowanie fluorescencyjne ex vivo, po pobraniu i wypreparowaniu wątroby myszy zgodnie z protokołem tekstowym, należy zmierzyć intensywność fluorescencji dla każdej kolonii nowotworowej za pomocą IVIS. Wybierając Fluorescencja, cztery sekundy Czas ekspozycji, Średnie Binning, 2 dla F/Stop, 535 dla filtra wzbudzenia i 580 dla filtra emisji. Kliknij przycisk Pobierz, aby rozpocząć obrazowanie.

Po pobraniu obrazu zlokalizuj okno Obraz w palecie narzędzi. Kliknij Narzędzia ROI i wybierz 1 z ikony kółka. Aby zdefiniować ROI, zakreśl obszar sygnału poszczególnych kolonii guza na obrazie.

Uzyskaj dodatkowy okrąg ROI tła, a następnie kliknij opcję Measurements of ROI (Pomiary ROI) jako dowolną jednostkę promieniowania. Uzyskaj dodatkowy krąg ROI tła. Na koniec przeprowadź obliczenia zgodnie z protokołem tekstowym.

Jak wykazano za pomocą bioluminescencji, trzy tygodnie po wstrzyknięciu śledziony, klony HCT116 L2T P1 i P2 miały większe obciążenie guzem w porównaniu z klonami O1 i O2. Dane te wskazują, że klony O1 i O2 mogą naśladować chorobę oligoprzerzutową, podczas gdy P1 i P2 reprezentują agresywną, szeroko rozprzestrzenioną kolonizację przerzutową wątroby. Kwantyfikacja fluorescencji ex vivo wątroby, w ciągu czterech tygodni po wstrzyknięciu śledziony, potwierdziła, że P1 i P2 miały wyższą intensywność fluorescencji w porównaniu z wątrobami O1 i O2. Znakowanie fluorescencyjne klonów nowotworowych pozwoliło zidentyfikować liczbę i rozmiary poszczególnych kolonii przerzutowych w wątrobie.

Ogólnie rzecz biorąc, obrazy fluorescencyjne ex vivo były zgodne z wynikami makroskopowymi, ale małe kolonie ukryte pod powierzchnią były lepiej wykrywane przez obrazowanie fluorescencyjne. Jak pokazano tutaj, liczby i rozmiary kolonii przerzutowych zostały policzone i zmierzone w każdej wątrobie, a obrazowanie fluorescencyjne ex vivo przeprowadzono na każdej kolonii przerzutowej dla każdego monoklonu. Jak pokazano na tych wykresach, całkowita liczba przerzutów w P1 była wyższa w porównaniu z P2, O1 i O2, podczas gdy średnia wielkość poszczególnych kolonii była większa w P2 niż w P1, O1 i O2. Nasz model zapewnia podejście do identyfikacji nowych genów perswazji związanych z molekularną heterogenicznością przerzutów.

Geny te mogą być wykorzystane jako cele dla nowych podejść do leczenia przerzutów. Nasz model może być również wykorzystany do walidacji różnych genów kodujących i niekodujących białka, które wyłaniają się z obecnych dużych klinicznych baz danych, ale nie są jeszcze funkcjonalnie zdefiniowane w kontekście choroby przerzutowej. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, będą miały trudności ze względu na delikatność chirurgii na zwierzętach.

Jednak przy odrobinie praktyki dobre wyniki można osiągnąć w krótkim czasie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przestrzeganiu wytycznych chirurgii zwierząt, dokładnym kontrolowaniu krwawienia i zapobieganiu wyciekowi zawiesiny komórek nowotworowych.