Name: Mikroglej jako zastępczy bioczujnik do określania neurotoksyczności nanocząstek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę oceny neurotoksyczności nanocząstek z wykorzystaniem mikrogleju jako zastępczego bioczujnika. Technika ta pozwala na aktywację mikrogleju in vitro i wykrywanie czynników neurotoksycznych bez kosztownych badań na zwierzętach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Departament ds. Weteranów USA BLR&D IK2 BX001686 (do TAB), oraz granty od University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (do CMD, JPN i TAB) oraz Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (do TAB). Dziękujemy doktorom Philippe'owi Marambaudowi (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) i Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) za dostarczenie linii komórkowej BV2.

1. Utrzymanie hodowli komórek mikrogleju
<ol>
	<li>Pożywka do hodowli komórkowych w ciepłych komórkach (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną/neomycyną (PSN) do 37 °C.</li>
	<li>Otrzymać zamrożony materiał komórek mikrogleju BV2 w pasażu 18-25 z przechowywania w temperaturze -80 °C. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie przenieść komórki do kolby z wentylacją o średnicy 75cm2 zawierającej 10 ml pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Inkubować kolbę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką. Hoduj komórki do około 70-80% zbieżności.</li>
</ol>
2. Liczenie i powlekanie komórek
<ol>
	<li>W łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ciepły DMEM i 1x-trypsyna-EDTA.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek i dodać 500 μl trypsyny. Inkubować w temperaturze 37°C przez 2 - 5 minut.</li>
	<li>Za pomocą skrobaka usunąć komórki z kolby i zawiesić w 5 ml DMEM. Przepuścić komórki przez sitko o średnicy 70 μm do probówki o pojemności 50 ml trzy razy.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiej 8 000 komórek / studzienkę na przezroczystej płytce dolnej o czarnych ściankach w końcowej objętości 200 μl DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% PSN. Inkubować płytkę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Usuń stary DMEM i zastąp go 200 μl podgrzanego DMEM uzupełnionego 1% PSN, aby surowicy zagłodzić mikroglej. Inkubować płytkę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
</ol>
3. Aktywacja mikrogleju
<ol>
	<li>W oddzielnych probówkach rozcieńczyć AgNPs (0,01, 0,05 lub 0,1 μg/ml) i kontrolę nośnika/obojętnego (cytrynian sodu, 0,04 mM) w DMEM bez surowicy uzupełnionym 1% PSN do końcowych stężeń roboczych.</li>
	<li>Usunąć 100 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 100 μl odpowiedniego środka do uzdatniania.</li>
	<li>Inkubować płytkę w 5 % CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
</ol>
4. Filtrowanie mediów kondycjonowanych
<ol>
	<li>Zebrać 200 μl supernatantu pożywki z każdej studzienki i przenieść do filtra (odcięcie masy cząsteczkowej 10 kDa) z probówką zbiorczą (pojemność 1,5 do 2 ml).</li>
	<li>Wirować przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej przez 15 min.</li>
	<li>Wyrzuć przepływowy (supernatant z cząstkami) i umieść filtr do góry nogami w nowej probówce zbiorczej.</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej przez 2 min. 
	UWAGA: Powstałe przefiltrowane pożywki (zawierające wydzielane cytokiny) są zagęszczane sześciokrotnie.</li>
	<li>Zwiększyć objętość koncentratu do 400 μl za pomocą świeżego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% PSN i przechowywać na lodzie. 
	UWAGA: Aby zapewnić usunięcie resztkowych AgNP z przefiltrowanych mediów, należy wygenerować stężenie AgNP w oparciu o charakterystyczny pik przy około 390 - 420 nm 10. Pokrótce przygotować podwielokrotności niefiltrowanych AgNP (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 i 0,2 μg/ml, jak opisano w kroku 3.1) i przefiltrowaną kontrolę nośnika (cytrynian sodu, 0,04 mM) w DMEM bez surowicy. Podwielokrotność 50 μl przefiltrowanych próbek i wzorców na przezroczystą płytkę dolną o czarnych ściankach. Za pomocą spektrofotometru zmierzyć absorbancję przy 390 - 410 nm i porównać odczyty z krzywą stężenia AgNP. Jeżeli przefiltrowane próbki mają taką samą wartość absorbancji jak próbka kontrolna nośnika, można założyć, że resztkowe AgNP zostały usunięte.</li>
	<li>Użyj połowy przefiltrowanej pożywki, aby określić wydzielanie TNF-α, postępując zgodnie z instrukcjami z dostępnego na rynku zestawu.</li>
</ol>
5. Utrzymanie hodowli komórek podwzgórza
<ol>
	<li>Ciepła pożywka do hodowli komórkowych DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% PSN do 37 °C.</li>
	<li>Otrzymać zamrożony zapas komórek podwzgórza (mHypo-A1/2) w czasie pasażu 18-25, przechowywany w temperaturze 80 °C. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie przenieść komórki do kolby z wentylacją o średnicy 75cm2 zawierającej 10 ml pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Inkubować kolbę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką. Hoduj komórki do około 70-80% zbieżności.</li>
</ol>
6. Określanie toksyczności komórek podwzgórza
<ol>
	<li>Ciepły roztwór DMEM i 1x-trypsyna-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek podwzgórza i dodać 500 μl trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 - 5 minut. Usunąć komórki z kolby za pomocą skrobaka, jak opisano powyżej w kroku 2.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytkuj komórki podwzgórza w 5 000 komórek/studzienkę na przezroczystej płytce dolnej o czarnych ściankach w końcowej objętości 200 μl DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% PSN i inkubuj przez noc w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć 100 μl starych pożywek za pomocą pipetera wielokanałowego i dodać 100 μl przefiltrowanych, skoncentrowanych kondycjonowanych pożywek, do końcowego stężenia 1x.</li>
	<li>Inkubować płytkę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Dodać 22 μl odczynnika rezazuryny i inkubować płytkę przez 20 minut w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Za pomocą spektrofotometru wielomodowego zarejestruj fluorescencję (560 nm EX/590 nm EM) w celu zmierzenia żywotności komórek. Raportuj wyniki jako względne jednostki fluorescencji (RFU).</li>
</ol>

<ol><li>Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution%3A+mechanisms+of+neuroinflammation+and+CNS+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease.</a> Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).</li>
<li>Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+daily+inhalation+rates+for+health+risk+assessment+in+overweight%2Fobese+children%2C+adults%2C+and+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Anal%22%5BJournal%5D)">Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly.</a> Risk Anal. 34, 567-582 (2014).</li>
<li>Jerrett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic-related+air+pollution+and+obesity+formation+in+children%3A+a+longitudinal%2C+multilevel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis.</a> Environ Health. 13, 49(2014).</li>
<li>Kraft, A. D., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+microglia+and+neuroinflammation+relevant+to+environmental+exposure+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity.</a> Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).</li>
<li>Duffy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+orexin+A+signaling+in+dietary+palmitic+acid-activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells.</a> Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).</li>
<li>Butterick, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+caspase+multiplexing+assay+to+determine+apoptosis+in+a+hypothalamic+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+cell+viability+and+proliferation+in+hydrogel-encapsulated+system+by+resazurin+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay.</a> Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf%2Fv-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).</li>
<li>Belsham, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+recruitment+of+glucagon-like+peptide-1+mediates+neurogenesis%2C+allowing+immortalization+of+adult+murine+hypothalamic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons.</a> FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).</li>
<li>Paramelle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+estimate+the+concentration+of+citrate+capped+silver+nanoparticles+from+UV-visible+light+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra.</a> Analyst. 139, 4855-4861 (2014).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+air+pollution+particles+increases+the+risk+of+obesity+and+metabolic+syndrome%3A+findings+from+a+natural+experiment+in+Beijing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing.</a> FASEB J. , (2016).</li>
<li>Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+%26+the+brain%3A+Subchronic+diesel+exhaust+exposure+causes+neuroinflammation+and+elevates+early+markers+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease.</a> J Neuroinflammation. 8, 105(2011).</li>
<li>Block, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outdoor+air+pollution+and+brain+health+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">The outdoor air pollution and brain health workshop.</a> Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).</li>
<li>Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+CNS+microglia%3A+the+quest+to+identify+predictive+models%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models.</a> Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).</li>
<li>Valdearcos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+dictate+the+impact+of+saturated+fat+consumption+on+hypothalamic+inflammation+and+neuronal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function.</a> Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).</li>
<li>Perry, V. H., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+priming+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microglial priming in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).</li>
<li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li>
<li>Vincenti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Microglia+Response+during+the+Time+Course+of+Chronic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration.</a> J Virol. 90, 3003-3017 (2015).</li>
<li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).</li>
<li>Lull, M. E., Block, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+and+chronic+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation and chronic neurodegeneration.</a> Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).</li>
<li>Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+in+NF-kappaB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways.</a> Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).</li>
<li>Gifford, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-modified+gold+nanoparticles+for+the+inhibition+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis.</a> Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).</li>
<li>Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+is+associated+with+halorhodopsin+as+a+free+fatty+acid.+Radiolabeling+of+halorhodopsin+with+3H-palmitic+acid+and+chemical+analysis+of+the+reaction+products+of+purified+halorhodopsin+with+thiols+and+NaBH4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4.</a> Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).</li>
<li>Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+high+molecular+weight+glycosylated+forms+of+murine+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor.</a> Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).</li>
<li>PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. 
 <a target="_blank" href="https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755">https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755</a> (2004).</li>
<li>Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+induced+by+fibrillar+beta-amyloid+and+IgGs+are+differentially+regulated+by+proinflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines.</a> J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).</li>
<li>McCarthy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+adult+murine+immortalized+microglial+cell+line+and+its+activation+by+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta.</a> J Neuroinflammation. 13, (2016).</li>
<li>Schauer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+airborne+particulate+matter+using+organic+compounds+as+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Environ%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers.</a> Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).</li>
<li>Kleeman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+fine+%28PM1.8%29+and+ultrafine+%28PM0.1%29+airborne+particulate+matter+during+a+severe+winter+pollution+episode%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode.</a> Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).</li>
<li>Borm, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+risks+of+nanomaterials%3A+a+review+carried+out+for+ECETOC%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC.</a> Part Fibre Toxicol. 3, (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Ostatnie badania potwierdzają, że narażenie środowiskowe przyczynia się do otyłości i innych chorób neurodegeneracyjnych 11,12. Jednak techniki stosowane w poprzednich badaniach są czasochłonne i kosztowne. Względy ekonomiczne, fizjologicznie istotne systemy dostarczania, kwestie etyczne związane z szerokim wykorzystaniem modeli zwierzęcych in vivo oraz trudności z przełożeniem wyników na znaczące zalecenia zdrowotne to tylko niektóre z głównych wyzwań, które zahamowały postęp w badaniach nad neurotok...

Zanieczyszczenia środowiska, szczególnie te o zakresie nanocząstek (NP) (średnica 1 - 20 nm), zostały powiązane z otyłością i innymi chorobami neurodegeneracyjnymi ze względu na zdolność do przekraczania bariery krew-mózg 1-3. Zwiększone narażenie na zanieczyszczenia może wywołać stan zapalny w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym w podwzgórzu 1. Jednym z potencjalnych mechanizmów, w których to zachodzi, może być indukowana przez nanocząstki aktywacja mikrogleju (komórek odpornościowych mózgu) 4. We wcześniejszych badaniach wykorzystano modele in vivo do zbadania wpływu nanocząsteczek na zdrowie mózgu, które są czasochłonne, kosztowne i nie dają bezpośredniej odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób nanocząsteczki wpływają na mikroglej. Mikroglej odgrywa wieloaspektową rolę w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym w utrzymaniu mikrośrodowiska mózgu i komunikowaniu się z otaczającymi neuronami poprzez uwalnianie wydzielanych czynników i cytokin. W zależności od bodźców, mikroglej może być aktywowany do stanu prozapalnego M1 lub przeciwzapalnego M2. Na przykład mikroglej aktywowany M1 uwalnia cytokiny prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α), podczas gdy mikroglej aktywowany M2 uwalnia cytokiny przeciwzapalne, w tym interleukinę-4 (IL-4). Aby zwalidować nasz zastępczy bioczujnik in vitro do określania neurotoksyczności zanieczyszczeń powietrza, zmierzyliśmy odpowiedź mikrogleju na nanocząstki srebra (AgNPs) o długości fali 20 nm. Celem tego artykułu jest opisanie w jaki sposób linia komórkowa mikrogleju in vitro może być wykorzystana jako zastępczy marker biosensora do badania mysiej odpowiedzi mikrogleju na NP oraz jak aktywacja mikrogleju wpływa na komórki podwzgórza. Długoterminowym zamierzonym zastosowaniem tego zwalidowanego modelu jest testowanie wpływu rzeczywistych zanieczyszczeń na zdrowie mózgu i choroby neurodegeneracyjne. Przedstawiamy szczegółowy opis 96-dołkowego testu in vitro do pomiaru aktywacji mikrogleju i przeżycia komórek podwzgórza po ekspozycji na pożywki kondycjonowane mikroglejem.
Aktywacja mikrogleju została określona po ekspozycji na AgNP przy użyciu testu immunoenzymatycznego połączonego z TNF-α (ELISA). Aby określić wpływ aktywowanego mikrogleju na komórki podwzgórza, AgNP usunięto z supernatantu mikrogleju (kondycjonowane pożywki) za pomocą urządzenia filtrującego. Urządzenie filtrujące zatrzymuje cytokiny, wykluczając AgNP ze względu na wielkość. Krótko mówiąc, supernatant z mikrogleju potraktowany lub bez AgNP został zebrany, dodany do filtrów i odwirowany przy 14 000 x g przez 15 minut. Udało nam się wówczas określić wpływ cytokin wydzielanych przez mikroglej na żywotność komórek podwzgórza. Toksyczność komórek po ekspozycji na kondycjonowane pożywki (zawierające cytokiny) określono za pomocą testu na bazie resazuryny, jak opisano wcześniej 5,6. Metabolicznie aktywne komórki redukują rezazurynę i wytwarzają sygnał fluorescencyjny proporcjonalny do liczby żywotnych komórek 7.
Istnieje kilka zalet korzystania z tej techniki w porównaniu z innymi (takimi jak kokultura, ustawienia trans-well lub eksperymenty in vivo). Nasz model zapewnia możliwość bezpośredniej aktywacji mikrogleju i określenia, czy wydzielane czynniki są toksyczne dla neuronów 8. Obecny protokół wykorzystuje unieśmiertelniony mikroglej BV2 stymulowany nanocząstkami o średnicy 20 nm oraz unieśmiertelnione mysie komórki podwzgórza (oznaczone mHypo-A1/2) 9 w celu określenia późniejszej odpowiedzi. Chociaż protokół ten został zoptymalizowany pod kątem tych specyficznych warunków, metody można zmienić, aby można je było zastosować w innych modelach śmierci komórek indukowanej mikroglejem lub w przypadku innych typów komórek, w tym pierwotnego mikrogleju i neuronów.

<table><tbody><tr><td>Cells/Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa mikrogleju myszy (BV2)</td><td>Interlab Cell Line Collection (Genua, Włochy)</td><td>ATL03001</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa podwzgórza dorosłej myszy mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodowa&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna/Neomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Nanocząstki srebra (20 nm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>730793</td><td></td></tr><tr><td> Odczynnik żywotności komórek PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Mysz TNF- &alfa; ELISA Max Delux</td><td>Biolegend</td><td>430904</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</ mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 W Optyczna płyta dolna, polistyren, poddana obróbce kultur komórkowych, z pokrywką, sterylna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5 z membraną Ultracel-10</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Rurki</td><td>Corning, Inc</td><td> 14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do komórek Falcon 70 &mu; m</td><td>Corning, Inc</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa 5430</td><td>Eppendorf</td><td>22620560</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroglej jako zastępczy bioczujnik do określania neurotoksyczności nanocząstek

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanocząsteczki znajdujące się w zanieczyszczeniach powietrza mogą zmieniać profile neuroprzekaźników, zwiększać stan zapalny układu nerwowego i zmieniać funkcjonowanie mózgu. Dlatego opisany tutaj test pomoże w wyjaśnieniu roli mikrogleju w zapaleniu nerwów i chorobach neurodegeneracyjnych. Wykorzystanie mikrogleju, rezydujących komórek odpornościowych mózgu, jako zastępczego bioczujnika, dostarcza nowych informacji na temat tego, w jaki sposób reakcje zapalne pośredniczą w uszkodzeniach neuronów. Tutaj wykorzystujemy unieśmiertelnioną mysią linię komórkową mikrogleju, oznaczoną jako BV2, i opisujemy metodę ekspozycji na nanocząstki przy użyciu nanocząstek srebra (AgNP) jako standardu. Opisujemy, jak wystawić mikroglej na działanie nanocząstek, jak usunąć nanocząstki z supernatantu i jak użyć supernatantu z aktywowanego mikrogleju do określenia toksyczności, używając jako miary przeżycia komórek podwzgórza. Po ekspozycji na AgNP aktywację mikrogleju BV2 zwalidowano za pomocą testu immunoenzymatycznego połączonego z czynnikiem martwicy nowotworu alfa (TNF-α) (ELISA). Supernatant przefiltrowano w celu usunięcia AgNP i umożliwienia cytokiny i innych wydzielanych czynników pozostania w kondycjonowanych pożywkach. Komórki podwzgórza poddano następnie działaniu supernatantu z mikrogleju aktywowanego AgNP, a przeżycie neuronów określono za pomocą testu fluorescencyjnego na bazie resazuryny. Technika ta jest przydatna do wykorzystania mikrogleju jako zastępczego biomarkera zapalenia nerwów i określenia wpływu zapalenia nerwów na inne typy komórek.

Wykazujemy, że przy użyciu powyższego protokołu mikroglej pełni funkcję zastępczego biosensora odpowiedzi mózgu na nanocząstki. Nasze wyniki obejmują pomiar toksycznych efektów aktywacji mikrogleju w odniesieniu do następczej śmierci komórek neuronalnych. Rysunek 1 przedstawia schemat procedury aktywacji mikrogleju oraz określania, czy wydzielane cytokiny obniżają żywotność neuronów podwzgórza. Wydzielanie TNF-α uległo znacznemu zwiększeniu po ekspozycji na AgNP (...

Mikroglej (komórki odpornościowe mózgu), są używane jako zastępczy bioczujnik do określenia, jak nanocząsteczki wpływają na neurotoksyczność. Opisujemy serię eksperymentów mających na celu zbadanie odpowiedzi mikrogleju na nanocząstki i narażenie neuronów podwzgórza na supernatant z aktywowanego mikrogleju w celu określenia neurotoksyczności.

Mikroglej jako zastępczy bioczujnik do określania neurotoksyczności nanocząstek

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opis biosensora zastępczego in vitro służącego do badania odpowiedzi mikrogleju na nanocząsteczki. Następnie określimy neurotoksyczność po ekspozycji na pożywkę warunkowaną z mikrogleju stymulowanego nanocząsteczkami. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak sposób aktywnego przesiewania nanocząsteczek pod kątem neurotoksyczności.Główną zaletą tej techniki jest to, że nasz model umożliwia bezpośrednią aktywację mikrogleju i ustalenie, czy czynniki wydzielnicze są neurotoksynami, bez konieczności przeprowadzania kosztownych, długoterminowych badań na gryzoniach. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat indukowanej przez mikroglej śmierci komórek po ekspozycji na mikrocząsteczki, może być ona również zastosowana w innych modelach chorób neurodegeneracyjnych w kontekście testowania potencjalnie neurotoksycznych zanieczyszczeń środowiska.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności na etapie filtracji pożywki warunkującej, ponieważ wydajność filtracji może różnić się w zależności od rozmiaru, kształtu i stężenia nanocząstek. W ramach przygotowania należy podgrzać DMEM uzupełniony o 10%FBS i 1%PSN do 37 °C.Następnie należy pobrać zamrożone komórki mikroglejalne BV2 pochodzące z przejść 18–25 i szybko je rozmrozić w temperaturze 37 °C. Następnie rozmrożone komórki należy delikatnie przenieść do wentylowanej kolby o powierzchni 75 cm², zawierającej 10 ml pożywki, i inkubować kolbę. Po 24 godzinach należy wymienić pożywkę i kontynuować hodowlę komórek do czasu osiągnięcia konfluencji na poziomie 70-80%. W tym momencie należy odessać pożywkę i dodać 500 µl podgrzanego roztworu trypsyny z EDTA 1x.Po inkubowaniu kolby przez kilka kolejnych minut użyć skrobaka, aby zebrać komórki do 5 mililitrów ciepłego DMEM. Następnie przefiltrować komórki z kolby, używając sita o oczkach 70 mikronów. Powtórzyć tę filtrację trzykrotnie, korzystając z tego samego sita, i zebrać komórki do probówki o pojemności 50 mililitrów.Po przefiltrowaniu należy policzyć komórki, a następnie zasiać je na płytce z czarnymi ściankami i przezroczystym dnem w zagęszczeniu 8000 komórek na studnię w 200 µL suplementowanego DMEM. Po 24 godzinach inkubacji należy wymienić medium w studniach na DMEM bez surowicy, aby doprowadzić do głodzenia mikrogleju. Po kolejnych 24 godzinach inkubacji należy przystąpić do aktywacji mikrogleju.Aby to zrobić, należy najpierw rozcieńczyć nanocząsteczki srebra w medium DMEM bez surowicy do pożądanej stężenia roboczego. Następnie należy zastąpić 100 µL medium związkiem testowym. Należy pamiętać o uwzględnieniu kontroli negatywnej w postaci rozcieńczonego roztworu nośnika bez nanocząsteczek.Następnie kontynuuj inkubację przez 24 godziny i przystąp do analizy. Na początek pobierz 200 µL supernatantu z każdej studni płytki i nałóż go na filtr usuwający nanocząstki, umieszczony nad probówką do mikrocentryfugi. Należy pamiętać, że podczas filtrowania nanocząstek ich rozmiar, kształt oraz stężenie wpływają na wydajność fuzji.Zaleca się zatem wcześniejsze przetestowanie filtracji. Teraz wiruj probówki z prędkością 14000g w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie odlej filtrat zawierający nanocząstki i umieść filtry odwrócone do góry dnem w nowych probówkach do zbierania.Wirować filtry odwrócone do góry dnem z prędkością 1000g przez dwie minuty, aby zebrać skoncentrowane medium warunkowe zawierające cytokiny. Następnie zwiększyć objętość zebranego materiału do 400 µL za pomocą świeżo przygotowanego suplementacyjnego DMEM i przechowywać probówki na lodzie. Aby upewnić się, że z przefiltrowanych mediów usunięto pozostałe nanocząsteczki siarki, przygotować niefiltrowane standardy nanocząsteczek o stężeniach od próbki ślepej do 0,2 µg/mL w DMEM bez surowicy.Następnie odnieś aliquoty po 50 mililitrów przefiltrowanych próbek oraz każdego standardu do płytki z czarnymi ściankami i przezroczystym dnem i zmierz absorbancję w zakresie od 390 do 410 nanometrów. Aby zmierzyć stężenie TNF-alpha w próbkach, wykorzystaj połowę pozostałej objętości w komercyjnie dostępnym zestawie. Do tego analizy przygotuj komórki podwzgórza z zamrożonych zapasów.Stosując te same metody, które opisano przy tworzeniu kultur mikrogleju. Ostatecznie wykorzystaj je do wysiewu na płytki z czarnymi ściankami i przezroczystym dnem w zagęszczeniu 5000 komórek na studzienkę w 200 µl uzupełnionego DMEM. Po 24 godzinach hodowli usuń 100 µl medium i zastąp je 100 µl przefiltrowanego i zagęszczonego medium pobranego z kultur aktywowanych komórek mikrogleju, a następnie inkubuj płytkę przez 24 godziny w standardowych warunkach.Następnego dnia do każdej studzienki należy dodać 22 µL odczynnika rezauryny i kontynuować inkubację przez 20 minut. Następnie za pomocą spektrofotometru wielomodułowego należy wykonać pomiar fluorescencji, aby ocenić żywotność komórek w postaci względnych jednostek fluorescencji. Zastosowanie opisanego protokołu pozwala wykorzystać funkcje mikrogleju jako zastępczego biosensora odpowiedzi mózgu na nanocząsteczki.Sekrecja TNF-alfa przez mikroglej była znacznie zwiększona po ekspozycji na nanocząsteczki srebra. Gdy neurony podwzgórza zostały poddane działaniu pożywki warunkowej pochodzącej z mikrogleju aktywowanego nanocząsteczkami srebra, żywotność neuronów uległa znacznemu obniżeniu. W zasadzie ekspozycja na nanocząsteczki srebra aktywowała mikroglej do prozapalnego stanu M1.Następnie uwolnione cytokiny prozapalne przyczyniają się do śmierci okolicznych komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać mikroglej jako zastępczy biosensor do badania odpowiedzi na nanocząsteczki oraz czy odpowiedź ta jest neurotoksyczna. Po opanowaniu tej techniki cały proces może zostać przeprowadzony w trzy lub cztery dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak profilowanie innych wydzielanych cytokin po aktywacji mikrogleju, w celu określenia fenotypu stanów aktywacji mikrogleju.

microglia-as-surrogate-biosensor-to-determine-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Ten film demonstruje metodę oceny neurotoksycznych efektów nanocząsteczek za pomocą mikrogleju. Przedstawiono w nim etapy aktywacji mikrogleju za pomocą nanocząstek, filtrowania kondycjonowanych pożywek w celu wyizolowania cytokin prozapalnych pochodzących z mikrogleju oraz testowania toksyczności neuronów podwzgórza za pomocą kondycjonowanych pożywek.

Określanie toksyczności neuronów wywołanej przez nanocząstki przy użyciu mikrogleju jako zastępczego bioczujnika

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Mikroglej to komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o dużej zdolności do fagocytozy lub pochłaniania materiału w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu opisano szeroko stosowany, wiarygodny i wysoce ilościowy test do wizualizacji i pomiaru pochłaniania składników synaptycznych za pośrednictwem mikrogleju.

Test pochłaniania: protokół oceny interakcji między fagocytami OUN a neuronami

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS) to przyjazny dla użytkownika system analityczny, który nie wymaga znajomości kodowania i półautomatycznie analizuje morfologię pojedynczych komórek mikrogleju na obrazach immunofluorescencyjnych. MMPS, zweryfikowane w modelu neurozapalenia wywołanego lipopolisacharydem u gryzoni, w sposób powtarzalny wykrywa zmiany morfologiczne związane z aktywacją i umożliwia standaryzowane, skalowalne fenotypowanie mikrogleju.

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju

Poznaj metodę oceny neurotoksyczności nanocząstek z wykorzystaniem mikrogleju jako zastępczego bioczujnika. Technika ta pozwala na aktywację mikrogleju in vitro i wykrywanie czynników neurotoksycznych bez kosztownych badań na zwierzętach.

Mikroglej jako zastępczy bioczujnik do określania neurotoksyczności nanocząstek

Przeglądaj więcej filmów