Mikroglej jako zastępczy bioczujnik do określania neurotoksyczności nanocząstek

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie zastępczego biosensora in vitro do badania odpowiedzi mikrogleju na nanocząstki. Następnie określimy neurotoksyczność po ekspozycji na kondycjonowane pożywki z mikrogleju stymulowane nanocząstkami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, w jaki sposób aktywnie badane nanocząstki pod kątem neurotoksyczności.

Główną zaletą tej techniki jest to, że nasz model zapewnia możliwość bezpośredniej aktywacji mikrogleju i określenia, czy czynniki wydzielające są neurotoksynami, bez konieczności stosowania kosztownych, długoterminowych badań na gryzoniach. Chociaż ta metoda może dostarczyć informacji na temat śmierci komórek indukowanej mikroglejem po ekspozycji na mikrocząsteczki. Może być również stosowany do innych modeli chorób neurodegeneracyjnych w kontekście badania potencjalnych neurotoksycznych zanieczyszczeń środowiska.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały problemy z etapem filtracji mediów. Ponieważ skuteczność filtracji może się różnić w zależności od wielkości, kształtu i stężenia nanocząstek. W przygotowaniu podgrzej DMEM uzupełniony 10% FBS i 1% PSN do 37 stopni Celsjusza.

Następnie weź zamrożone komórki mikrogleju BV2 uzyskane z pasaży 18, 25 i szybko je rozmroź w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie delikatnie przenieś rozmrożone komórki do wentylowanej kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych zawierającej 10 mililitrów pożywki i inkubuj kolbę. Po 24 godzinach wymień pożywkę i kontynuuj wzrost komórek, aż osiągną zbieg 70-80%W tym momencie odessaj pożywkę i dodaj 500 mikrolitrów ciepłego 1 np. roztworu EDTA trypsyny.

Po pozostawieniu kolby do inkubacji przez kilka kolejnych minut, użyj skrobaka, aby zebrać komórki do 5 mililitrów ciepłego DMEM. Następnie przefiltrować komórki z kolby za pomocą sitka o średnicy 70 mikronów. Powtórz tę filtrację trzy razy za pomocą tego samego sitka i zbierz komórki w 50-mililitrowej probówce.

Po przefiltrowaniu policz komórki, a następnie zasiej czarną ściankę przezroczystą płytkę dolną z 8000 komórek na studzienkę w 200 mikrolitrach uzupełnionego DMEM. Po 24 godzinach inkubacji zastąp pożywkę w studzienkach DMEM bez surowicy, aby zagłodzić mikroglej. Po kolejnych 24 godzinach inkubacji przystąp do aktywacji mikrogleju.

W tym celu należy najpierw rozcieńczyć nanocząstki srebra w DMEM bez surowicy do pożądanego stężenia roboczego. Następnie zastąp 100 mikrolitrów pożywki związkiem leczniczym. Należy pamiętać o dołączeniu kontroli ujemnej rozcieńczonego roztworu nośnika bez nanocząstek.

Teraz kontynuuj inkubację przez 24 godziny i przystąp do analizy. Na początek zbierz 200 mikrolitrów pożywki sklarowanej nad osadem z każdej płytki i załaduj ją do filtra, który usunie nanocząstki umieszczone nad mikroprobówką wirówkową. Należy pamiętać, że podczas filtrowania nanocząstek ich wielkość, kształt i stężenie są czynnikiem wpływającym na wydajność fuzji.

Dlatego wskazane jest wcześniejsze przetestowanie filtracji. Teraz odwiruj probówki z prędkością 14000 g w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie wyrzuć przepływ, który zawiera nanocząstki i umieść filtry do góry nogami w nowych probówkach zbiorczych.

Obracaj filtry do góry nogami z prędkością 1000 g przez dwie minuty, aby zebrać skoncentrowane kondycjonowane podłoże zawierające cytokiny. Następnie zwiększ objętość kolekcji do 400 mikrolitrów ze świeżo przygotowanym dodatkowym DMEM i przechowuj probówki na lodzie. Aby upewnić się, że resztkowe nanocząstki siarki zostaną usunięte z przefiltrowanych mediów, należy przygotować niefiltrowane wzorce nanocząstek w zakresie stężeń od ślepej próby do 0,2 mikrograma na mililitr w DMEM bez surowicy.

Następnie podzielić 50 mililitrów przefiltrowanych próbek i każdego wzorca na przezroczystą płytkę dolną o czarnych ściankach i zmierzyć absorbancję od 390 do 410 nanometrów. Aby zmierzyć stężenie TNF-alfa w próbkach, należy użyć połowy ich pozostałej objętości w dostępnym na rynku zestawie. Do tego testu należy ustalić komórki podwzgórza z zamrożonych zapasów.

Przy użyciu tych samych metod, które opisano w przypadku zakładania kultur mikrogleju. Ostatecznie użyj ich do wysiewu czarnościennych, przezroczystych płytek dolnych z 5000 komórek na studzienkę w 200 mikrolitrach uzupełnionego DMEM. Po 24 godzinach hodowli należy usunąć 100 mikrolitrów pożywki i zastąpić ją 100 mikrolitrami przefiltrowanej i zagęszczonej pożywki pobranej z aktywowanych kultur komórek mikrogleju, a następnie inkubować płytkę przez 24 godziny w standardowych warunkach.

Następnego dnia dodaj 22 mikrolitry odczynnika resazuryny do każdej studzienki i kontynuuj inkubację przez 20 minut. Następnie za pomocą spektrofotometru wielomodowego wykonaj pomiar fluorescencji, aby oszacować żywotność komórek pod względem względnych jednostek fluorescencji. Dzięki przedstawionemu protokołowi funkcja mikrogleju może być wykorzystywana jako zastępczy bioczujnik dla reakcji mózgu na nanocząstki.

Wydzielanie TNF-alfa przez mikroglej było znacznie zwiększone po ekspozycji na nanocząstki srebrzyste. Kiedy neurony podwzgórza zostały wystawione na działanie kondycjonowanego podłoża z mikrogleju aktywowanego nanocząstką srebra, żywotność neuronów była znacznie zmniejszona. Zasadniczo ekspozycja na nanocząstki srebra aktywowała mikroglej do stanu prozapalnego M1.

Następnie uwolnione cytokiny prozapalne przyczyniają się do śmierci otaczających komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać mikrogleju jako zastępczego bioczujnika do testowania reakcji na nanocząstki i czy ta reakcja jest neurotoksyczna. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech lub czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak profilowanie innych wydzielanych cytokin po aktywacji mikrogleju w celu fenotypu stanów aktywacji mikrogleju.