Name: Trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metodę podawania związków do wysepek trzustkowych myszy przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer PLGA. Technika ta umożliwia badanie proliferacji komórek β i ma zastosowanie w terapii cukrzycy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Bethany Carboneau (Vanderbilt University) za krytyczną lekturę tego rękopisu. Dziękujemy również Anastasii Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) za izolację wysp trzustkowych oraz dr Alvinowi C. Powersowi (Vanderbilt University Medical Center) i dr Davidowi Jacobsonowi (Vanderbilt University) za korzystanie z wirówki i urządzenia do hodowli tkankowych. Badania te obejmowały wykorzystanie Islet Procurement and Analysis Core Centrum Badań i Szkoleń nad Cukrzycą Vanderbilt wspieranego przez DK20593 grantu NIH. Praca ta była wspierana przez stypendium podoktoranckie American Heart Association (14POST20380262) dla RCP oraz granty z Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592) i Departamentu Spraw Weteranów (1BX00090-01A1) dla M.A.G.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i wykonane zgodnie z Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Etykietowanie COI za pomocą fluoroforu (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Wybierz barwnik fluorescencyjny, który będzie reagował z wolną aminą pierwszorzędową (np. na białku), taki jak estry sukcynimidylu lub pochodne fluoresceiny, aby uwidocznić ładunek mikrosferyczny. Rozpuścić 8x molowy nadmiar (w stosunku do moli COI) fluoroforu w 200 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
	<li>Zawiesić 50 mg COI do końcowej objętości 800 μl w roztworze nośnika (końcowe stężenie 62,5 ng/μl). Rozwiązanie dla pojazdu będzie się różnić w zależności od źródła COI. 
	UWAGA: Typowe roztwory dla pojazdów obejmują sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) lub DMSO.</li>
	<li>Dodać cały roztwór fluoroforu/DMSO z kroku 1.1 i ponownie zawiesić COI. Wirować przez noc w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej (RT) przez 4 godziny.</li>
	<li>Po reakcji znakowania usuń nadmiar fluoroforu za pomocą kolumny odsalającej.
	<ol>
		<li>Opróżnij bufor magazynowy z kolumny odsalającej i spłucz 16 ml wody dejonizowanej. Odrzuć cały przepływ.</li>
		<li>Dodaj fluorescencyjnie oznakowany COI do kolumny odsalającej. Eluować 1,2 ml wody dejonizowanej i zebrać przepływ.</li>
		<li>Powtórzyć etap elucji dodatkowo cztery razy, za każdym razem dodając 1,2 ml wody dejonizowanej i zbierając przepływ jako oddzielną próbkę.</li>
		<li>Cały pobrany przepływ przez próbki zamrozić w temperaturze -80 °C i poddać liofilizacji zgodnie z instrukcjami producenta przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikrosfery z ładunkiem COI metodą odparowywania rozpuszczalnika emulsyjnego typu woda w oleju w wodzie
<ol>
	<li>Dodać 1 mg znakowanego fluorescencyjnie COI do 100 μl wody dejonizowanej, aby utworzyć pierwszą fazę wodną (W1).</li>
	<li>Rozpuścić 65 mg poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (50:50 Laktyd: Glikolid, masa cząsteczkowa 54 000 - 69 000) w 750 μl dichlorometanu w probówce do mikrowirówki. Ultradźwięki przez 10 - 30 sekund (przy 160 W), aby całkowicie rozpuścić PLGA. W ten sposób powstaje faza olejowa (O).</li>
	<li>Dodaj całą fazę W1 wygenerowaną w kroku 2.1 do fazy O w sposób kroplowy. Emulgować za pomocą ręcznego homogenizatora przy 20 000 obr./min przez 30 sekund, aby utworzyć fazę W1/O.</li>
	<li>Dodać całą fazę W1/O kroplami do 15 ml 1% (wagowo-objętościowo) wodnego roztworu poli(alkoholu winylowego) (PVA) i emulgować za pomocą ręcznego homogenizatora przy 20 000 obr./min przez 30 sekund.</li>
	<li>Przenieść całą emulsję wytworzoną w kroku 2.4 do kolby okrągłodennej o pojemności 200 ml i poddać próżni 635 mm Hg za pomocą wyparki obrotowej przez 1 godzinę w celu usunięcia rozpuszczalnika i wytworzenia fazy wodnej.</li>
	<li>Podwielokrotność 1 ml fazy wodnej wytworzonej w kroku 2,5 do czternastu probówek mikrowirówek. Odwirowywanie roztworu wodnego w probówkach do mikrowirówek o sile 7 500 x g przez 8 min. 
	UWAGA: Na tym etapie mikrosfery są obecne w pozostałym roztworze wodnym i są skoncentrowane na dnie probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć 900 μl roztworu wodnego z probówek do mikrowirówek za pomocą mikropipety, pipetując tak, aby nie naruszyć mikrosfer znajdujących się na dnie probówki do mikrowirówki.
	<ol>
		<li>Umyj mikrosfery z nadmiaru PVA, dodając 1 ml wody dejonizowanej do każdej probówki mikrowirówki. Odwirować przy 7 500 x g przez 8 minut i ponownie ostrożnie usunąć 900 μl roztworu wodnego z probówek do mikrowirówek za pomocą mikropipety, pipetując tak, aby nie naruszyć mikrosfer na dnie probówki do mikrowirówki. 
		UWAGA: Pozostałe 100 μl roztworu wodnego zawiera wytworzone mikrosfery.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wodny roztwór mikrosfery wytworzony w kroku 2.7 zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Liofilizować mikrosfery za pomocą liofilizatora zgodnie z zaleceniami producenta i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Zmierz wydajność ładowania COI, całkowicie rozpuszczając mikrosfery PLGA i określając stężenie białka w stosunku do krzywej standardowej wolnego białka7.</li>
	<li>Jako kontrolę ujemną należy wytworzyć partię "ślepych" mikrosfer (zwanych dalej mikrosferami kontrolnymi). 
	UWAGA: Wytwarzanie mikrosfer kontrolnych jest identyczne z wytwarzaniem hydrofilowych mikrosfer obciążonych COI, bez dodatku COI do 800 μl roztworu nośnika w kroku 1.2. Dopasuj cząstki kontrolne pod względem stężenia masowego PLGA w stosunku do mikrosfer PLGA obciążonych COI do testu mitogenu β komórek.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pożywek do hodowli wysp trzustkowych i pożywek do testów wstępnych
<ol>
	<li>Przygotować 200 ml pożywki do hodowli nienaruszonych wysp trzustkowych myszy: pożywka RPMI 1640 uzupełniona 11 mM glukozy, 10% surowicy końskiej, 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny (zwanych dalej pożywką do hodowli wysp trzustkowych). 
	UWAGA 1: W przeciwieństwie do płodowej surowicy bydlęcej (FBS), surowica końska nie zawiera laktogenu łożyskowego, induktora proliferacji komórek β, co zakłóca analizę w teście proliferacji. 
	UWAGA 2: Ponieważ mikrosfery PLGA nie są sterylizowane przed użyciem, dodanie antybiotyków do pożywki hodowlanej ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zanieczyszczenia mikrobiologicznego.</li>
	<li>Usunąć 25 ml pożywki do hodowli wysp trzustkowych za pomocą pipetora elektronicznego i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Uzupełnić 25 ml pożywki do hodowli wysp trzustkowych w stożkowej probówce o pojemności 50 ml o końcowym stężeniu 0,2 mM EGTA, aby uzyskać pożywkę do testu wstępnego. 
	UWAGA: Dodatek EGTA łagodnie rozluźnia kontakty komórka-komórka w wysepkach bez zmiany architektury wysp. Pomaga to zapewnić, że COI może dotrzeć do wewnętrznych komórek wysepki i pomaga zapobiegać martwicy centralnej wysepki.</li>
</ol>
4. Hodowla nienaruszonych wysepek myszy
<ol>
	<li>Wyizolować nienaruszone wyspy trzustkowe z wcześniej wybranego szczepu, płci, wieku i genotypu myszy po rutynowym trawieniu trzustkikolagenazą 8,9. Połączyć ze sobą wysepki z podobnych próbek.</li>
	<li>Podwielokrotność 40 wysepek do jednego dołka z 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w 200 μl pożywki do hodowli wysp trzustkowych. Wizualnie dopasowane pod względem wielkości wysepek na studzienkę (dokładna ocena równoważności wysepek (IEQ) między próbkami nie jest konieczna). Puste studnie bezpośrednio przylegające do studni z wysepkami należy napełnić sterylną wodą o objętości 200 μl, aby zapewnić bufor do odparowywania. Hodowla wysepek w pożywkach przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 95% powietrza i 5% CO2 .</li>
</ol>
5. Ponowne zawieszenie mikrosfer PLGA z ładunkiem COI i kontrolą
<ol>
	<li>Po całonocnym odzyskaniu wysp trzustkowych, ponownie zawiesić mikrosfery, dodając pożywkę do testu wstępnego do jednej podwielokrotności liofilizowanych mikrosfer PLGA obciążonych COI tak, aby końcowe stężenie COI w probówce mikrowirówki wynosiło 10 ng / μl (ilość COI obecna w danej ilości wygenerowanych mikrosfer została określona w kroku 2.9). Sonikować zawieszone mikrosfery obciążone COI w lodowatej łaźni wodnej przez 10 minut przy 160 W z 10-sekundowymi impulsami w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić kontrolne mikrosfery PLGA, dodając tę samą objętość pożywki do testu wstępnego do równej masy liofilizowanych kontrolnych mikrosfer PLGA. Sonikować zawieszone mikrosfery kontrolne PLGA w lodowatej łaźni wodnej przez 10 minut przy 160 W z 10-sekundowymi impulsami w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wizualnie potwierdzić, że mikrosfery są rozproszone przez pipetowanie 2 μl zawieszonych mikrosfer między dwoma szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Wizualizacja mikrosfer za pomocą obiektywu 40X w mikroskopie epifluorescencyjnym lub jasnego pola.</li>
	<li>Jeśli znaczna agregacja mikrosfer jest nadal widoczna, należy poddać sonikację w lodowatej kąpieli wodnej przez dodatkowe 10 minut przy 160 W z 10-sekundowymi impulsami w temperaturze 4 °C i powtórzyć wizualizację zawieszonych mikrosfer.</li>
</ol>
6. Traktowanie wysepek za pomocą mikrosfer PLGA obciążonych COI lub kontrolnych PLGA
<ol>
	<li>Dla każdej studzienki, która ma być poddana działaniu mikrosfer obciążonych COI, należy przygotować pożywkę do oznaczania, rozcieńczając 10 ng/μl ponownie zawieszonych mikrosfer COI pożywką do wstępnego oznaczania do końcowej objętości 100 μl i wcześniej ustalonego stężenia końcowego. 
	UWAGA: Optymalne końcowe stężenie białka będzie się różnić dla każdego COI użytego w tym teście. Idealnie byłoby, gdyby badany był zakres stężeń końcowych.</li>
	<li>Dla każdej studzienki, która ma być użyta jako kontrola, należy przygotować pożywkę do oznaczania kontrolnego, rozcieńczając ponownie zawieszone kontrolne mikrosfery PLGA wygenerowane w kroku 5.2 taką samą objętością rozcieńczenia, jaka została użyta do rozcieńczenia mikrosfer obciążonych COI w kroku 6.1. 
	UWAGA: Wysepki poddane działaniu pożywki do oznaczania kontrolnego będą służyć jako kontrola ujemna, aby umożliwić wykrycie jakiegokolwiek wpływu, jaki ślepa próba mikrosfery może mieć na wyniki doświadczalne.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć 100 μl pożywki do hodowli wysp trzustkowych z każdej studzienki za pomocą mikropipety, tak aby żadne wysepki nie zostały usunięte z dołków. Delikatnie dodać 100 μl pożywki do oznaczania lub 100 μl pożywki kontrolnej do każdej studzienki.</li>
	<li>Wysepki inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 95% powietrza i 5%CO2 przez trzy dni.</li>
</ol>
7. Rozpraszanie nienaruszonych wysepek na szkiełkach mikroskopowych
<ol>
	<li>Po trzech dniach za pomocą mikropipety ostrożnie usunąć i wyrzucić pożywkę testową ze wszystkich studzienek, aby nie usunąć wysepek. Delikatnie dodać 200 μl PBS do wysepek, aby umyć je z podłoża do oznaczania. Ostrożnie usunąć i wyrzucić PBS za pomocą mikropipety i delikatnie umyć wysepki dodatkowymi 200 μl PBS.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić PBS za pomocą mikropipety i dodać 100 μl 0,025% trypsyny, 2 mM roztworu EDTA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Pipetuj wyspy trzustkowe w roztworze trypsyny-EDTA w górę i w dół co 2 minuty, aż wizualnie potwierdzi się, że wyspy są rozproszone na pojedyncze komórki (należy pamiętać, że niektóre małe skupiska komórek mogą być nadal obecne) za pomocą mikroskopu świetlnego. Przenieś całą objętość każdej studzienki indywidualnie do oznakowanych probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Dodaj 400 μl pożywki do hodowli wysp trzustkowych do każdej probówki mikrowirówkowej, aby zatrzymać dysocjację komórek za pośrednictwem trypsyny.</li>
	<li>Odwirować próbki przez 5 minut przy 100 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek wysepek na dnie probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Delikatnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety i ponownie zawiesić osad w 200 μl świeżej pożywki do hodowli wysp trzustkowych.</li>
	<li>Za pomocą cytowirówki odwirować zdysocjowane wysepki o masie 140 x g przez 3 minuty na naładowane szkiełka mikroskopowe.</li>
	<li>Suszenie na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie narysuj ramkę wokół zdysocjowanych wysepek za pomocą hydrofobowego pisaka do znakowania.</li>
	<li>Napraw komórki za pomocą 75 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usuń 4% PFA i delikatnie umyj komórki w 75 μl PBS dwa razy. Po umyciu przepuszczaj komórki 75 μl 0,2% Triton X-100 w PBS przez 10 min. Następnie umyć komórki 75 μl PBS. 
	Uwaga: PFA jest znany jako alergizujący, rakotwórczy i toksyczny.</li>
</ol>
8. Immunofluorescencyjne znakowanie zdysocjowanych wysp trzustkowych dla insuliny i markera proliferacji komórek, Ki67
<ol>
	<li>Przygotuj wilgotną komorę, umieszczając dwa mokre ręczniki papierowe na dnie pudełka na szkiełka mikroskopowe o pojemności 100 szkiełek.</li>
	<li>Umieść szkiełka płasko w dół (komórki skierowane do góry) w wilgotnej komorze. Przygotować próbki do etykietowania, odsysając PBS z poprzedniego etapu płukania za pomocą mikropipety i dodając 75 μl roztworu blokującego (5% normalnej surowicy osła (NDS) w PBS) do każdego szkiełka w celu zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał z próbkami. Inkubować szkiełka w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie odessać roztwór blokujący za pomocą mikropipety i dodać 75 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego zawierającego przeciwciała antyinsulinowe świnki morskiej i przeciwciała anty-Ki67 królika, rozcieńczonego 1 μg/ml w 5% NDS w PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godz. 
	UWAGA: Alternatywne markery proliferacji komórek obejmują proliferujący antygen jądrowy komórki (PCNA) i fosfohiston H3 (PH3),</li>
	<li>Delikatnie odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego za pomocą mikropipety i przepłukać komórki 75 μl PBS. Odessać PBS za pomocą mikropipety i przepłukać komórki jeszcze dwa razy, za każdym razem 75 μl PBS. Inkubować każdą próbkę z 75 μl przeciwciała drugorzędowego Cy5 przeciwko śwince morskiej i przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi Cy3 rozcieńczonego do 2 μg/ml w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze RT. 
	UWAGA: Nie należy używać przeciwciał drugorzędowych znakowanych tym samym lub spektralnie nakładającym się fluoroforem, który był już używany do znakowania mikrosfer.</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała wtórnego za pomocą mikropipety i inkubować w 75 μl 300 nM DAPI w PBS przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać DAPI za pomocą mikropipety i płukać w wodzie dejonizowanej przez 5 minut.</li>
	<li>Delikatnie odessać wodę z próbek za pomocą mikropipety. Umieść kroplę (około 100 μl) szybkoschnącego roztworu montażowego zawierającego odczynnik zapobiegający blaknięciu na szklanym szkiełku nakrywkowym. Odwróć szkiełko mikroskopu próbka stroną do dołu, na roztwór montażowy. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka za pomocą końcówki pipety, aby usunąć pęcherzyki i zetrzyj nadmiar płynu miękką chusteczką czyszczącą. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
9. Akwizycja i analiza obrazu
<ol>
	<li>Do akwizycji obrazu należy użyć mikroskopu epifluorescencyjnego z dołączoną kamerą. Dla każdego fluoroforu określ optymalny czas ekspozycji (zwykle 20 ms dla DAPI, 40 - 80 ms dla insuliny i 250 ms dla Ki67). Upewnij się, że parametry akwizycji obrazu są równe dla wszystkich próbek.</li>
	<li>Dla każdej próbki należy ręcznie policzyć 3,000 komórek insulinododatnich, a ile z nich jest również Ki67-dodatnich. Licz tylko komórki insulinododatnie, które mają dobrze zdefiniowane i wyraźnie widoczne jądro. Obliczyć procent proliferujących komórek β dla każdej próbki, dzieląc liczbę komórek Ki67-dodatnich/insulino-dodatnich przez całkowitą liczbę komórek insulinododatnich i mnożąc przez 100.</li>
	<li>Po określeniu procentu proliferujących komórek β dla każdej próbki, określ, czy istnieje statystycznie istotna różnica w proliferacji komórek β między próbkami kontrolnymi i eksperymentalnymi, analizując wyniki za pomocą jednoczynnikowej ANOVA przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania statystycznego.</li>
</ol>

<ol><li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+deficit+and+increased+beta-cell+apoptosis+in+humans+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.</a> Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).</li>
<li>Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+deterioration+determines+the+onset+and+rate+of+progression+of+secondary+dietary+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%3A+the+10-year+follow-up+of+the+Belfast+Diet+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study.</a> Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).</li>
<li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li>
<li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823(2012).</li>
<li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA-based+nanoparticles%3A+an+overview+of+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.</a> J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).</li>
<li>Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta+cell+lines+and+their+applications+in+diabetes+mellitus+research%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research.</a> ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).</li>
<li>Rui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+vascular+endothelial+growth+factor+using+poly-lactic-co-glycolic+acid+microspheres%3A+in+vitro+characterization+and+application+in+polycaprolactone+fumarate+nerve+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits.</a> Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).</li>
<li>Lacy, P. E., Kostianovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+isolation+of+intact+islets+of+Langerhans+from+the+rat+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas.</a> Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J Vis Exp. (7), e255(2007).</li>
<li>Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization+and+in-vitro+evaluation+of+sustained+release+protein-loaded+nanoparticles+based+on+biodegradable+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers.</a> Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).</li>
<li>Riley, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connective+tissue+growth+factor+modulates+adult+beta-cell+maturity+and+proliferation+to+promote+beta-cell+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice.</a> Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).</li>
<li>Mosser, R. E., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+for+small+scale+screening+of+candidate+beta+cell+proliferative+factors+using+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets.</a> Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).</li>
<li>Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+interactions+regulate+beta-cell+proliferation+in+islet-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures.</a> Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).</li>
<li>Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+regulation+of+islet+beta+cell+mass+in+mice%3A+the+role+of+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin.</a> Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li>
<li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li>
<li>Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+culture+and+preservation+strategies%3A+advances%2C+challenges%2C+and+future+outlook%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook.</a> Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).</li>
<li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+%28ROS%29+Responsive+Polymers+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications.</a> Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).</li>
<li>Makadia, H. K., Siegel, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+Lactic-co-Glycolic+Acid+%28PLGA%29+as+Biodegradable+Controlled+Drug+Delivery+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier.</a> Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).</li>
<li>Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+loaded+with+insulin-phospholipid+complex+for+oral+delivery%3A+preparation%2C+in+vitro+characterization+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation.</a> J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).</li>
<li>Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-based+technologies+for+osteoarthritis+detection+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy.</a> Drug Deliv Transl Res. , (2015).</li>
<li>Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pH-+and+temperature-responsive+microparticles+for+protein+delivery+to+ischemic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues.</a> Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).</li>
<li>Poole, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badanie proliferacji komórek β w hodowli jest zwykle utrudnione przez kilka trudności. Po pierwsze, unieśmiertelnione linie komórek β charakteryzują się wyższym stopniem proliferacji niż te, które znajdują się w endogennych komórkach β w żywych wyspach trzustkowych. Ponadto te unieśmiertelnione linie komórkowe nie mają normalnej architektury krytycznej dla normalnego funkcjonowania komórek β. Te dwa fakty utrudniają określenie, czy wyniki uzyskane przy użyciu unieśmiertelnionych linii komórek β będą prawdziwe w testach <...

Komórki β trzustki są jedynymi komórkami produkującymi insulinę w organizmie i są niezbędne do utrzymania homeostazy glukozy we krwi. Podczas gdy zdrowe osoby mają wystarczającą masę i funkcję komórek β, aby prawidłowo regulować poziom glukozy we krwi, osoby z cukrzycą charakteryzują się niewystarczającą masą i/lub funkcją komórek β1,2. Zaproponowano, że indukowanie proliferacji komórek β może ostatecznie zwiększyć masę komórek β i przywrócić homeostazę glukozy u osób z cukrzycą3. Jednak ocena i walidacja potencjalnych związków proliferacyjnych komórek β w nienaruszonych wyspach trzustkowych jest konieczna, zanim będzie można opracować skuteczne terapie. Przeszczepienie ludzkich wysp trzustkowych u osób z cukrzycą przywraca homeostazę stężenia glukozy we krwi na pewien czas, ale dostępność i powodzenie tej eksperymentalnej procedury jest utrudnione przez niedobór ludzkich wysp trzustkowych dostępnych do przeszczepu oraz śmierć β komórek w wyspach trzustkowych po przeszczepie4. Nawet po odkryciu czynników, które indukują namnażanie się komórek produkujących insulinę, nadal istnieje poważne wyzwanie związane z dostarczeniem tych czynników do odpowiednich miejsc in vivo. Jedną ze strategii trwałego miejscowego dostarczania związków proliferacyjnych komórek β jest kwas poli(mlekowo-koglikolowy) (PLGA). PLGA ma historię stosowania w produktach do dostarczania leków zatwierdzonych przez FDA ze względu na wysokie bezpieczeństwo, biodegradowalność i kinetykę przedłużonego uwalniania5. W szczególności PLGA jest kopolimerem laktydu i glikolidu, który ulega degradacji w wyniku hydrolizy z wodą in vivo lub w hodowli do kwasu mlekowego i kwasu glikolowego, które są naturalnie występującymi metabolitami w organizmie. Zamknięty w kapsułkach związek leczniczy może być uwalniany do otaczającego środowiska zarówno przez mechanizmy uwalniania kontrolowane dyfuzją, jak i degradacją. Kapsułkowanie COI zapewnia ochronę przed degradacją enzymatyczną, poprawiając biodostępność odczynnika w porównaniu z niekapsułkowanym COI5. Sugerujemy, że mikrosfery PLGA mogą być używane do podawania związków kandydujących do nienaruszonych wysepek w hodowli, a ostatecznie in vivo. Testowanie skuteczności PLGA w podawaniu mitogenów z komórek β do wysp trzustkowych ex vivo ma kluczowe znaczenie przed zbadaniem protokołów transplantacji.
Obecnie nie ma techniki pomiaru proliferacji komórek β u żywych zwierząt. Eksperymenty mające na celu ocenę skuteczności potencjalnych związków proliferacyjnych in vivo wymagają zatem podawania tych związków żywym zwierzętom, a następnie preparacji i przetwarzania trzustki w celu znakowania odpornościowego. Takie protokoły są kosztowne i pracochłonne, a także wymagają podawania związku ogólnoustrojowo, bez żadnej gwarancji, że dotrą do wysp trzustkowych. I odwrotnie, kilka unieśmiertelnionych linii komórek β jest dostępnych do badania komórek produkujących insulinę w hodowli, ale te linie komórkowe nie mają architektury wysp trzustkowych i środowiska występującego w organizmach żywych6. Unieśmiertelnione linie komórek β charakteryzują się również znacznie wyższym stopniem replikacji niż endogenne komórki β in vivo, co komplikuje analizę związków indukujących proliferację. W tym badaniu opisujemy protokół, który wykorzystuje nienaruszone wysepki wyizolowane od dorosłych myszy. W przeciwieństwie do linii β-komórkowych, nienaruszone wysepki zachowują normalną architekturę wysp. Podobnie, w przeciwieństwie do eksperymentów przeprowadzanych in vivo, podawanie związków proliferacyjnych bezpośrednio do hodowanych nienaruszonych wysp trzustkowych znacznie zmniejsza ilość odczynników, które są niezbędne do dokładnego pomiaru proliferacji komórek β.
Obecne badanie wykorzystuje PLGA do podawania COI, w tym przykładzie rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu tkanki łącznej (rhCTGF). Opisana tutaj metoda daje znaczną przewagę nad podawaniem surowego związku do hodowanych wysp trzustkowych, ponieważ pozwala na ciągłe uwalnianie związku do pożywki. Warto zauważyć, że test ten można zmodyfikować w celu podawania szerokiej gamy białek i przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania dla nienaruszonych wysp trzustkowych. Można również analizować wpływ na inne typy komórek endokrynnych, w tym komórki α.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 Kwas karboksylowy, ester sukcynimidylowy, 6-izomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>Do oznaczania COI za pomocą fluoroforu</td></tr><tr><td>DMSO Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1 Do</td><td>rozpuszczania fluoroforu w kroku 1</td></tr><tr><td>Jednorazowe kolumny odsalające PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Kolumna odsalająca używana w kroku 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, poli(D,L-laktyd-ko-glikolid), zakończony estrem, masa cząsteczkowa 54 000 - 69 000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Stosowany do wytwarzania mikrosfer w kroku 2</td></tr><tr><td>Poli(alkohol winylowy) masa cząsteczkowa 89 000 - 98 000</td><td>341584 Sigma-Aldricha</td><td></td><td>Stosowany do wytwarzania mikrosfer w kroku 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>Do hodowli wysp trzustkowych</td></tr><tr><td>Dekstroza bezwodna</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Suplement do podłoża z wysp trzustkowych</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antybiotyki na podłoże wysp trzustkowych</td></tr><tr><td>Normalna surowica konia</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Suplement do podłoża z wysp trzustkowych</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli</td> wysepek <td>Corning</td><td>3603</td><td>Do hodowli wysepek</td></tr><tr><td>Kwas gliko-bi(2-aminoetyloetero)-N,N,N',N',N'-tetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Suplement do pożywki z wysepek przed testem</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytotrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>Do przędzenia komórek na szkiełkach mikroskopowych</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>Do obracania komórek na szkiełkach mikroskopowych</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Stosowany w dysocjacji wysepek</td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Do mocowania komórek</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>Do przepuszczalności komórek Normalna</td></tr><tr><td>surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Odczynniki blokujące do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Ki67</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>Do immunofluorescencji Ki67</td></tr><tr><td>Poliklonalny antyinsulinowy antyinsulinowy świnka morska</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>Do immunofluorescencji insuliny</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Dla immunofluorescencji Ki67</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>Do immunofluorescencji insuliny</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Do wizualizacji jąder w immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Szybkoschnące media montażowe</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &deg; C 4,5-litrowy kaskadowy stołowy system liofilizacji</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>Do liofilizacji mikrosfer</td></tr></tbody></table>

trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Rozwój biomateriałów znacznie zwiększył potencjał celowanego dostarczania leków do różnych typów komórek i tkanek, w tym do komórek β trzustki. Ponadto cząsteczki biomateriałów, hydrożele i rusztowania zapewniają również wyjątkową możliwość dostarczania leków, które można kontrolować, do komórek β w hodowli i w przeszczepionych modelach tkankowych. Technologie te umożliwiają badanie potencjalnych czynników proliferacji komórek β przy użyciu nienaruszonych wysp trzustkowych i systemu istotnego pod względem translacyjnym. Co więcej, określenie skuteczności i wykonalności czynników kandydujących do stymulowania proliferacji komórek β w systemie hodowli ma kluczowe znaczenie przed przejściem do modeli in vivo. W niniejszym artykule opisujemy metodę wspólnej hodowli nienaruszonych wysepek mysich z biodegradowalnymi mikrosferami poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) obciążonymi biodegradowalnymi związkami zainteresowania (COI) w celu oceny wpływu długotrwałego uwalniania czynników mitogennych in situ na proliferację komórek β. Technika ta opisuje szczegółowo, w jaki sposób generować mikrosfery PLGA zawierające pożądany ładunek przy użyciu dostępnych na rynku odczynników. Chociaż opisana technika wykorzystuje jako przykład rekombinowany ludzki czynnik wzrostu tkanki łącznej (rhCTGF), z łatwością można zastosować szeroką gamę COI. Dodatkowo metoda ta wykorzystuje płytki 96-dołkowe, aby zminimalizować ilość odczynników niezbędnych do oceny proliferacji komórek β. Protokół ten można łatwo dostosować do wykorzystania alternatywnych biomateriałów i innych cech komórek endokrynnych, takich jak przeżywalność komórek i status różnicowania.

Rysunek 1 przedstawia mikrosfery otrzymane zgodnie z powyższym protokołem. Opisany tutaj protokół pozwala na uzyskanie mikrosfer obciążonych rhCTGF o różnych rozmiarach. Największa frakcja mikrosfer będzie miała średnicę od 1 do 10 µm, choć niektóre mikrosfery mogą być większe (Rysunek 2). W razie potrzeby rozmiar mikrosfer można dostroić i zoptymalizować w oparciu o parametry wytwarzania, takie jak prędkość i czas homogenizacji, stężenie...

Tutaj prezentujemy metodologię generowania i podawania mikrosfer z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) do nienaruszonych mysich wysp trzustkowych w hodowli, a następnie analizy immunofluorescencyjnej proliferacji komórek β. Metoda ta jest odpowiednia do określania skuteczności kandydujących mitogenów β-komórkowych.

Trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie mikrosfer z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA) do dostarczania wybranych związków do hodowlanych, nienaruszonych wysepek trzustkowych w celu zbadania wpływu poszczególnych substancji na proliferację dorosłych komórek beta trzustki. Metoda ta może być stosowana do testowania różnych związków dostarczanych lokalnie w sposób o spowolnionym uwalnianiu do nienaruszonych wysepek. Główną zaletą tej metody jest możliwość łatwego dostosowania jej do alternatywnych biomateriałów transportowych, różnych związków oraz różnych testów końcowych.Metoda ta daje również możliwość dostarczania interesujących związków równocześnie z przyjętym transferem wysepek in vivo. Sposób przygotowania mikrosfer PLGA zaprezentuje Taylor Kavanaugh, doktorant w moim laboratorium. Rozpocznij od dodania 1 mg fluorescencyjnie znakowanego związku do 100 µL wody dejonizowanej, aby utworzyć pierwszą fazę wodną.Następnie rozpuść 65 mg PLGA w 750 µL dichlorometanu w fiolce scyntylacyjnej i poddaj mieszaninę sonikacji przez 10 do 30 sekund przy mocy 160 W, aby całkowicie rozpuścić PLGA. W ten sposób powstaje faza olejowa. Dodaj całą pierwszą fazę wodną do fazy olejowej, dodając ją kroplami.Następnie należy użyć homogenizatora ręcznego, aby zemulgować roztwór przy 20 000 rpm przez 30 sekund, tworząc pierwszą fazę wodno-olejową. Następnie całą pierwszą fazę wodno-olejową należy dodać kroplami do 15 ml 1% roztworu PVA i zemulgować w sposób przedstawiony powyżej. W kolejnym kroku całą objętość emulsji należy przenieść do kolby okrągłodennej o pojemności 200 ml i użyć rotacyjnego odparowacza, aby usunąć rozpuszczalnik w celu wytworzenia fazy wodnej, przy próżni 635 mmHg przez jedną godzinę.Przenieś one milliliter fazy wodnej do każdej z 14 probówek do mikrowirówki i osadź mikrosfery poprzez wirowanie. Po zakończeniu wirowania, używając mikropipety, usuń 900 microliters roztworu wodnego z każdej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przemyj mikrosfery w one milliliter wody dejonizowanej, a następnie ostrożnie usuń 900 microliters supernatantu.Następnie do pozostałych 100 µL supernatantów dodaje się 900 µL wody dejonizowanej. Po tym krótko miesza się próbki w wirówce typu vortex i poddaje sonikacji, aby resuspender osady. Po wyizolowaniu wysepek z wybranych zwierząt doświadczalnych, 40 wysepek o zbliżonej wielkości wysiewa się do jednego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej w 200 µL pożywki do hodowli wysepek.Następnego ranka resuspenduj jedną alikwotę mikrosfer w medium przedanalitycznym w taki sposób, aby końcowe stężenie badanego związku w probówce wynosiło 10 ng/µL, a następnie sonikuj mikrosfery w łaźni wodnej z lodem przez 10 minut przy mocy 160 W, stosując impulsy o długości 10 s w temperaturze 4 °C. Następnie ostrożnie usuń 100 µL medium do hodowli wysepek z każdej dołki, uważając, aby nie przemieścić wysepek, i inkubuj hodowle z 100 µL medium analitycznego zawierającego mikrosfery. Po trzech dniach ostrożnie odlej medium analityczne ze wszystkich dołek, nie naruszając wysepek, a następnie delikatnie przemyj wysepki dwukrotnie w 200 µL PBS.Wyspy przylegają do płytki 96-dołkowej jedynie słabo. Dlatego kluczowe jest, aby delikatnie usuwać pożywkę i PBS z każdego dołka, tak aby wyspy nie zostały przypadkowo oderwane i usunięte. Po drugim przemyciu delikatnie zanurz wyspy w 100 µL roztworu trypsyny z EDTA na trzy minuty w temperaturze pokojowej, wykonując delikatne pipetowanie po upływie dwóch minut.Przenieś całą objętość z każdej studzienki do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi i dodaj 400 µL pożywki do hodowli wysepek do każdej probówki, aby zatrzymać dysocjację. Po zebraniu wysepek traktowanych mikrosferami poprzez wirowanie, użyj mikropipety, aby delikatnie usunąć nadsączniki i resuspender osady w 200 µL świeżej pożywki do hodowli wysepek. Następnie nanieś zdysocjowane wyspki na naładowane szkiełka mikroskopowe za pomocą cytocentryfugi.Po wysuszeniu na powietrzu obrysuj wyspy markerem hydrofobowym i utrwal komórki w 75 µL czteroprocentowej paraformaldehydy w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie przemyj dwukrotnie 75 µL PBS. Po drugim przemyciu przeprowadź permeabilizację komórek za pomocą 75 µL 0,2% Triton X-100 w PBS przez 10 minut, a następnie wykonaj końcowe przemycie samymi 75 µL PBS. Aby przeprowadzić immunoznakowanie wysp, umieść preparaty stroną z komórkami do góry w komorze wilgotnościowej i usuń PBS.Następnie zablokuj nieswoiste wiązania, dodając 75 µL normalnego surowicy osła w temperaturze pokojowej. Po godzinie zastąp surowicę 75 µL odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego i inkubuj przez kolejną godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie odessij roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i przemyj próbki, stosując 375 µL PBS w każdym cyklu płukania.Następnie inkubować wyspki z 75 µl odpowiedniego przeciwciała wtórnego znakowanego immunofluorescencyjnie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po zakończeniu inkubacji zastąpić roztwór przeciwciał wtórnych 75 µl preparatu Dappy na trzy minuty, a następnie płukać przez pięć minut w wodzie dejonizowanej. Po zakończeniu płukania nanieść kroplę 100 µl szybko schnącego medium montażowego zawierającego odczynnik zapobiegający blaknięciu (anti-fade) na szkiełko nakrywkowe, a następnie odwrócić preparat na szkiełku przedmiotowym stroną z próbką do dołu i nałożyć go na medium montażowe.Największa frakcja mikrosfer będzie miała średnicę od 1-10 mikronów, choć niektóre mikrosfery mogą być większe. Po rozproszeniu nienaruszonych wysepek potraktowanych mikrosferami PLGA i ich późniejszym immunoznakowaniu często obserwuje się w próbce obszary między komórkami pozbawione jakiegokolwiek znakowania, co jest spowodowane obecnością nienaruszonych mikrosfer, które nie zostały całkowicie usunięte podczas etapów płukania. Po obrazowaniu procent komórek dodatnich pod kątem Ki67 i insuliny można określić ilościowo za pomocą oprogramowania do analizy obrazu lub poprzez ręczne przeliczenie całkowitej liczby znakowanych komórek.Traktowanie nienaruszonych wysepek rekombinowanymi ludzkimi mikrosferami PLGA z czynnikiem wzrostu tkanki łącznej przez trzy dni, tak jak właśnie zaprezentowano, skutkuje zwiększoną proliferacją komórek beta, co dowodzi, że białko nie traci swojej funkcjonalności podczas procesu tworzenia mikrosfer. Po opanowaniu ta technika może przynieść wyniki w czasie krótszym niż tydzień, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wpływ na proliferację komórek beta w danym eksperymencie będzie się różnić w zależności od badanego związku oraz dokładnej kinetyki uwalniania z wytworzonych mikrosfer.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak kotransplantacja mikrosfer obciążonych związkiem wraz z nienaruszonymi wysepkami trzustkowymi, aby odpowiedzieć na inne pytania, na przykład czy badany związek może indukować proliferację komórek beta in vivo. PLGA ma historię zastosowań w urządzeniach i systemach dostarczania leków zatwierdzonych przez FDA, zatem stanowi dobry wybór dla badaczy i klinicystów dążących do dostarczania ładunku terapeutycznego do określonych tkanek przez dłuższy czas. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wytwarzać mikrosfery PLGA obciążone związkiem oraz jak podawać je do hodowanych nienaruszonych wysepek.Należy pamiętać, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiedniego osobistego sprzętu ochronnego.

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Wprowadzono metodę przeszczepiania wysp trzustkowych u myszy. Wyizolowane wysepki miesza się z hydrożelem, a mieszaninę umieszcza się w woreczku omentalnym myszy z cukrzycą. Następnie monitorowany jest poziom glukozy we krwi i wykonywana jest analiza immunohistochemiczna.

Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół walidacji in vivo terapii komórkowej opartej na hydrożelu, zilustrowany przykładem przeszczepu wysp trzustkowych. Implantacja h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) pozwala na implantację mieszaniny komórkowo-hydrożelowej między warstwami omentalnymi, w pobliżu naczyń krwionośnych, aby zmaksymalizować wszczepienie w odpowiednim środowisku metabolicznym.

Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrzomentalnych za pomocą h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

W tym protokole opisana jest metoda izolacji i przeszczepu mysich wysp trzustkowych do pachwinowej podskórnej białej tkanki tłuszczowej. Izolowane syngeniczne mysie wysepki są przeszczepiane mysiemu biorcy za pomocą hydrożelu z błony podstawnej. Monitorowany jest poziom glukozy we krwi biorców i przeprowadzana jest analiza histologiczna przeszczepów wysp trzustkowych.

Pachwinowy podskórny model przeszczepu białej tkanki tłuszczowej (ISWAT) mysich wysp trzustkowych

Tutaj prezentujemy wyrafinowane procedury chirurgiczne dotyczące skutecznego przeprowadzenia przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrz portalu, klinicznie istotnej, ale technicznie trudnej procedury chirurgicznej u myszy.

Minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj metodę podawania związków do wysepek trzustkowych myszy przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer PLGA. Technika ta umożliwia badanie proliferacji komórek β i ma zastosowanie w terapii cukrzycy.

Trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (Wideo) | JoVE Journal

Trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)

Przeglądaj więcej filmów