Trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie mikrosfer z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA) do dostarczania wybranych związków do hodowlanych, nienaruszonych wysepek trzustkowych w celu zbadania wpływu poszczególnych substancji na proliferację dorosłych komórek beta trzustki. Metoda ta może być stosowana do testowania różnych związków dostarczanych lokalnie w sposób o spowolnionym uwalnianiu do nienaruszonych wysepek. Główną zaletą tej metody jest możliwość łatwego dostosowania jej do alternatywnych biomateriałów transportowych, różnych związków oraz różnych testów końcowych.

Metoda ta daje również możliwość dostarczania interesujących związków równocześnie z przyjętym transferem wysepek in vivo. Sposób przygotowania mikrosfer PLGA zaprezentuje Taylor Kavanaugh, doktorant w moim laboratorium. Rozpocznij od dodania 1 mg fluorescencyjnie znakowanego związku do 100 µL wody dejonizowanej, aby utworzyć pierwszą fazę wodną.

Następnie rozpuść 65 mg PLGA w 750 µL dichlorometanu w fiolce scyntylacyjnej i poddaj mieszaninę sonikacji przez 10 do 30 sekund przy mocy 160 W, aby całkowicie rozpuścić PLGA. W ten sposób powstaje faza olejowa. Dodaj całą pierwszą fazę wodną do fazy olejowej, dodając ją kroplami.

Następnie należy użyć homogenizatora ręcznego, aby zemulgować roztwór przy 20 000 rpm przez 30 sekund, tworząc pierwszą fazę wodno-olejową. Następnie całą pierwszą fazę wodno-olejową należy dodać kroplami do 15 ml 1% roztworu PVA i zemulgować w sposób przedstawiony powyżej. W kolejnym kroku całą objętość emulsji należy przenieść do kolby okrągłodennej o pojemności 200 ml i użyć rotacyjnego odparowacza, aby usunąć rozpuszczalnik w celu wytworzenia fazy wodnej, przy próżni 635 mmHg przez jedną godzinę.

Przenieś one milliliter fazy wodnej do każdej z 14 probówek do mikrowirówki i osadź mikrosfery poprzez wirowanie. Po zakończeniu wirowania, używając mikropipety, usuń 900 microliters roztworu wodnego z każdej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przemyj mikrosfery w one milliliter wody dejonizowanej, a następnie ostrożnie usuń 900 microliters supernatantu.

Następnie do pozostałych 100 µL supernatantów dodaje się 900 µL wody dejonizowanej. Po tym krótko miesza się próbki w wirówce typu vortex i poddaje sonikacji, aby resuspender osady. Po wyizolowaniu wysepek z wybranych zwierząt doświadczalnych, 40 wysepek o zbliżonej wielkości wysiewa się do jednego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej w 200 µL pożywki do hodowli wysepek.

Następnego ranka resuspenduj jedną alikwotę mikrosfer w medium przedanalitycznym w taki sposób, aby końcowe stężenie badanego związku w probówce wynosiło 10 ng/µL, a następnie sonikuj mikrosfery w łaźni wodnej z lodem przez 10 minut przy mocy 160 W, stosując impulsy o długości 10 s w temperaturze 4 °C. Następnie ostrożnie usuń 100 µL medium do hodowli wysepek z każdej dołki, uważając, aby nie przemieścić wysepek, i inkubuj hodowle z 100 µL medium analitycznego zawierającego mikrosfery. Po trzech dniach ostrożnie odlej medium analityczne ze wszystkich dołek, nie naruszając wysepek, a następnie delikatnie przemyj wysepki dwukrotnie w 200 µL PBS.

Wyspy przylegają do płytki 96-dołkowej jedynie słabo. Dlatego kluczowe jest, aby delikatnie usuwać pożywkę i PBS z każdego dołka, tak aby wyspy nie zostały przypadkowo oderwane i usunięte. Po drugim przemyciu delikatnie zanurz wyspy w 100 µL roztworu trypsyny z EDTA na trzy minuty w temperaturze pokojowej, wykonując delikatne pipetowanie po upływie dwóch minut.

Przenieś całą objętość z każdej studzienki do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi i dodaj 400 µL pożywki do hodowli wysepek do każdej probówki, aby zatrzymać dysocjację. Po zebraniu wysepek traktowanych mikrosferami poprzez wirowanie, użyj mikropipety, aby delikatnie usunąć nadsączniki i resuspender osady w 200 µL świeżej pożywki do hodowli wysepek. Następnie nanieś zdysocjowane wyspki na naładowane szkiełka mikroskopowe za pomocą cytocentryfugi.

Po wysuszeniu na powietrzu obrysuj wyspy markerem hydrofobowym i utrwal komórki w 75 µL czteroprocentowej paraformaldehydy w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie przemyj dwukrotnie 75 µL PBS. Po drugim przemyciu przeprowadź permeabilizację komórek za pomocą 75 µL 0,2% Triton X-100 w PBS przez 10 minut, a następnie wykonaj końcowe przemycie samymi 75 µL PBS. Aby przeprowadzić immunoznakowanie wysp, umieść preparaty stroną z komórkami do góry w komorze wilgotnościowej i usuń PBS.

Następnie zablokuj nieswoiste wiązania, dodając 75 µL normalnego surowicy osła w temperaturze pokojowej. Po godzinie zastąp surowicę 75 µL odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego i inkubuj przez kolejną godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie odessij roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i przemyj próbki, stosując 375 µL PBS w każdym cyklu płukania.

Następnie inkubować wyspki z 75 µl odpowiedniego przeciwciała wtórnego znakowanego immunofluorescencyjnie przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po zakończeniu inkubacji zastąpić roztwór przeciwciał wtórnych 75 µl preparatu Dappy na trzy minuty, a następnie płukać przez pięć minut w wodzie dejonizowanej. Po zakończeniu płukania nanieść kroplę 100 µl szybko schnącego medium montażowego zawierającego odczynnik zapobiegający blaknięciu (anti-fade) na szkiełko nakrywkowe, a następnie odwrócić preparat na szkiełku przedmiotowym stroną z próbką do dołu i nałożyć go na medium montażowe.

Największa frakcja mikrosfer będzie miała średnicę od 1-10 mikronów, choć niektóre mikrosfery mogą być większe. Po rozproszeniu nienaruszonych wysepek potraktowanych mikrosferami PLGA i ich późniejszym immunoznakowaniu często obserwuje się w próbce obszary między komórkami pozbawione jakiegokolwiek znakowania, co jest spowodowane obecnością nienaruszonych mikrosfer, które nie zostały całkowicie usunięte podczas etapów płukania. Po obrazowaniu procent komórek dodatnich pod kątem Ki67 i insuliny można określić ilościowo za pomocą oprogramowania do analizy obrazu lub poprzez ręczne przeliczenie całkowitej liczby znakowanych komórek.

Traktowanie nienaruszonych wysepek rekombinowanymi ludzkimi mikrosferami PLGA z czynnikiem wzrostu tkanki łącznej przez trzy dni, tak jak właśnie zaprezentowano, skutkuje zwiększoną proliferacją komórek beta, co dowodzi, że białko nie traci swojej funkcjonalności podczas procesu tworzenia mikrosfer. Po opanowaniu ta technika może przynieść wyniki w czasie krótszym niż tydzień, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wpływ na proliferację komórek beta w danym eksperymencie będzie się różnić w zależności od badanego związku oraz dokładnej kinetyki uwalniania z wytworzonych mikrosfer.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak kotransplantacja mikrosfer obciążonych związkiem wraz z nienaruszonymi wysepkami trzustkowymi, aby odpowiedzieć na inne pytania, na przykład czy badany związek może indukować proliferację komórek beta in vivo. PLGA ma historię zastosowań w urządzeniach i systemach dostarczania leków zatwierdzonych przez FDA, zatem stanowi dobry wybór dla badaczy i klinicystów dążących do dostarczania ładunku terapeutycznego do określonych tkanek przez dłuższy czas. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wytwarzać mikrosfery PLGA obciążone związkiem oraz jak podawać je do hodowanych nienaruszonych wysepek.

Należy pamiętać, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiedniego osobistego sprzętu ochronnego.