Name: Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila. Metoda umożliwia wizualizację zachowania chromosomów i montażu wrzeciona podczas mejozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Christianowi Lehnerowi za dostarczenie przeciwciała CENP-C i Ericowi Joyce'owi za rekomendacje dotyczące FISH. Prace w laboratorium McKima zostały sfinansowane z grantu NIH (GM101955).

Uwaga: Zabiegi wykonuje się w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Inkubatory z kontrolowaną temperaturą służą do utrzymywania temperatury podczas chowu much i krzyżówek, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotuj muchy.
	<ol>
		<li>Kolekcje oocytów wzbogacone prometafazą.
		<ol>
			<li>Wyraźne dorosłe muchy ze zdrowych, młodych stad lub kultur krzyżowych. Butelki leżakowane przez dwa dni w temperaturze 25 °C. 
			UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wystarczą dwie zdrowe butelki, chociaż w przypadku niektórych kultur krzyżowych może być potrzebnych więcej.</li>
			<li>Po dwóch dniach zbierz z butelek ~100 do 300 samic (które w tym momencie mają od 0 do 2 dni) z butelek. Kobiety nie muszą być dziewicami. Dodaj odrobinę pasty drożdżowej z boku fiolki i umieść 30 samic i 10 do 15 mężczyzn w fiolkach z drożdżami. Fiolki do leżakowania przez dwa dni w temperaturze 25 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kolekcje oocytów wzbogacone metafazą.
		<ol>
			<li>Zbierz od ~100 do 300 samic z hodowli lub krzyżówek. Dodaj odrobinę pasty drożdżowej z boku fiolki i umieść po 30 samic (bez dodatku samców) w fiolkach z drożdżami. Fiolki leżakujące przez trzy do pięciu dni w temperaturze 25 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwory. 
	Uwaga: Roztwory można przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
	<ol>
		<li>Przygotuj zmodyfikowany bufor Robba (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sacharozy, 275 mM octan sodu, 200 mM octan potasu, 50 mM glukoza, 6 mM chlorek magnezu i 5 mM chlorek wapnia. Użyj 10 N 11:8 wodorotlenku sodu: wodorotlenek potasu, aby doprowadzić pH do 7,4. Sterylizować przez filtrację; Nie sterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić w razie potrzeby, aby przygotować ~200 ml preparatu 1x Robb's na oocyt.</li>
		<li>Rozwiązania mocujące.
		<ol>
			<li>Opcja #1: Przygotuj utrwalanie formaldehydu/heptanu. Przygotuj bufor utrwalający: 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) plus 150 mM sacharozy. Aby użyć, przygotuj świeżość za pomocą 687,5 μl buforu utrwalającego i 312,5 μl 16% formaldehydu na oocyt prep. 
			UWAGA: Nosić rękawiczki podczas używania roztworów formaldehydu w dygestorium. Utylizuj odpady zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
			<li>Opcja #2: Przygotuj utrwalanie formaldehydu/kakodylanu. Przygotuj Fix Mix: 250 mM sacharozy, 100 mM octanu potasu (pH 7,5), 25 mM octanu sodu (pH 7,0) i 25 mM EGTA (pH 8,0). Aby użyć, przygotuj świeże z 400 μl Fix Mix, 100 μl kakodylanu potasu (1 M, pH 7,2) i 500 μl 16% formaldehydu na oocyt prep. 
			UWAGA: Kakodylan potasu zawiera arsen.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj PBS/Triton X-100: 1x PBS plus 1% lub 0,05% Triton X-100. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj PBS-Tween 20-albuminę surowicy bydlęcej (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) i 0,1% Tween-20. Może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez jeden tydzień.</li>
		<li>Roztwory fluorescencji hybrydyzacji in situ (FISH).
		<ol>
			<li>Przygotuj 20X Chlorek Sodu-Cytrynian Sodu (SSC): 3 M chlorek sodu i 0,3 M cytrynian sodu.</li>
			<li>Przygotuj 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC plus 0,1% Tween-20. Przygotuj świeże, ~ 20 ml na przygotowanie oocytów.</li>
			<li>Przygotować roztwory formamidu: 2x SSC, 0,1% Tween-20, plus formamid. Przygotuj świeże, 1 ml 20% formamidu, 0,5 ml 40% formamidu i 2 ml 50% formamidu na oocyt przygotowany. 
			UWAGA: Nosić rękawice podczas stosowania roztworów formamidu w dygestorium. Utylizuj odpady zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
			<li>Przygotuj roztwór hybrydyzacyjny: 2x SSC, 50% formamid i 10% siarczan dekstranu (w/v). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sondy FISH.
		<ol>
			<li>Zamów oligonukleotydy (patrz tabela 1 dla sekwencji) z oczyszczaniem HPLC i pożądaną modyfikacją 5' fluorescencyjną (np. Cy3 lub Cy5). Zawiesić w Tris-EDTA (TE) przy 50 ng/μl. 
			UWAGA: Oligonukleotydy należy chronić przed ekspozycją na światło przez cały czas.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zbiór oocytów Drosophila w późnym stadium
<ol>
	<li>Ponieważ oocyty Drosophila z nienaruszonymi błonami przyklejają się do plastiku i szkła, należy wstępnie pokryć wnętrze jednej probówki o pojemności 5 ml i jednej pipety Pasteura na preparat oocytów PTB.</li>
	<li>Znieczulij wszystkie ~100 do 300 drożdżaków muchowych dwutlenkiem węgla i dodaj do blendera zawierającego ~100 ml 1x Robb's Buffer. Pulsuj trzy razy (~1 sekunda każdy). Trzymaj oocyty w Robb's przez <20 minut, aby uniknąć aktywacji. 
	UWAGA: Alternatywnie, oocyty mogą być ręcznie preparowane od samic. Zaletą tej metody jest to, że wymaga mniej samic. Należy jednak zachować ostrożność, aby ograniczyć narażenie na dwutlenek węgla do zaledwie kilku minut, aby uniknąć artefaktów związanych z niedotlenieniem7.</li>
	<li>Przefiltrować przez duże oczka (~1,500 μm) do zlewki o pojemności 250 ml, aby usunąć duże części ciała. Jeśli na siatce pozostało wiele nienaruszonych brzuchów, ponownie zmiel materiał za pomocą dodatkowego bufora Robba i ponownie przefiltruj. Pozostaw na ~ 2 minuty, a następnie odessaj górną warstwę, usuwając jak najwięcej dużych części ciała.</li>
	<li>Przefiltrować przez małe oczka (~300 μm) do zlewki o pojemności 250 ml. Wypłucz pozostałe oocyty z pierwszej zlewki za pomocą dodatkowej pipety Robba i powlekanej pipety Pasteura. Niech się uspokoi ~ 3 min; oocyty ulegną ustabilizowaniu. Odessać wszystko oprócz ~10 ml.</li>
	<li>Wlej tyle 10 ml, ile zmieści się w powlekanej tubce o pojemności 5 ml. Pozostaw do osadzenia, usuń płyn i powtórz z pozostałą częścią. Wypłucz pozostałe oocyty ze zlewki za pomocą dodatkowej pipety Robba i powlekanej pipety Pasteura. Pozostaw w probówce o pojemności 5 ml na ~ 3-5 minut.</li>
</ol>
3. Leczenie farmakologiczne (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Pokryj drugą probówkę o pojemności 5 ml PTB dla każdego preparatu oocytów. Dodaj odpowiedni rozpuszczalnik (kontrola) lub lek do 1 ml Robb's każdy na każdy preparat oocytów (Tabela 2).</li>
	<li>Podziel oocyty na drugą powlekaną probówkę o pojemności 5 ml. Pozostaw do spoczynku, usuń płyn i dodaj 1 ml rozpuszczalnika Robb's plus do jednej probówki i 1 ml leku Robb's plus do drugiej probówki. Nutian przez odpowiedni czas do leczenia farmakologicznego (Tabela 2). Niech się uspokoi.</li>
</ol>
4. Fiksacja
<ol>
	<li>Odessać cały płyn i natychmiast dodać 1 ml Fix.</li>
	<li>Opcja #1: Utrwalanie formaldehydu/heptanu (bufor utrwalający plus 5% formaldehydu).
	<ol>
		<li>Mocuj przez 2,5 minuty na nutatorze. Dodaj 1 ml heptanu i wiruj 1 min. Odstawić ~1 min.</li>
		<li>Usuń cały płyn, a następnie dodaj 1 ml 1x PBS. Wir 30 sek. Odstawić ~1 min.</li>
		<li>Usuń cały płyn, a następnie napełnij probówkę 1x PBS. 
		UWAGA: Oocyty można wykorzystać natychmiast lub przechowywać na nutatorze przez kilka godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcja #2: Utrwalanie formaldehydu/kakodylu (Fix Mix plus 8% formaldehydu i 100 mM kakodylatu).
	<ol>
		<li>Fix przez 6 minut na nutatorze. Odstaw na 2 minuty. Usuń płyn, a następnie napełnij probówkę 1x PBS. 
		UWAGA: Oocyty można wykorzystać natychmiast lub przechowywać na nutatorze przez kilka godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Usuwanie membran ("Rolling")
<ol>
	<li>Używając powlekanej pipety Pasteura, dodaj ~500 do 1,000 oocytów do matowej (piaskowanej) części szkiełka podstawowego. Usuń wszystkie części ciała i obce materiały za pomocą kleszczy. Nie pozwól, aby oocyty wyschły; dodaj 1x PBS w razie potrzeby.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na oocytach i delikatnie "zwijaj" oocyty, aż wszystkie błony zostaną usunięte (najlepiej sprawdza się przeciąganie krawędzi szkiełka nakrywkowego po oocytach). Okresowo sprawdzaj postęp pod mikroskopem, dodając w razie potrzeby więcej 1x PBS. Uważaj, ponieważ zbyt duży nacisk zniszczy oocyty. 
	UWAGA: Tylko w przypadku immunofluorescencji przejdź do kroku 6. W przypadku FISH (z immunofluorescencją lub bez) przejdź do kroku 7.</li>
</ol>
6. Barwienie przeciwciał oocytów Drosophila
<ol>
	<li>Ekstrakcja i blokowanie
	<ol>
		<li>Zwinięte oocyty przepłukać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej ~15 ml PBS/1% Triton X-100. Nutować oocyty w tym roztworze nie krócej niż 1,5 godziny i nie dłużej niż 2 godziny. Ten krok umożliwia penetrację przeciwciał.</li>
		<li>Pozwól oocytom osiąść ~2 min. Usuń płyn wraz z jak największą liczbą błon, a następnie dodaj PBS/0,05% Triton X-100, 
		UWAGA: Błony osiadają wolniej niż zwinięte oocyty.</li>
		<li>Pozwól oocytom osiąść ~ 2 minuty, a następnie usuń wszystko oprócz ~ 1 ml płynu. Przenieś oocyty do wyskalowanej probówki o pojemności 1,5 ml i usuń pozostały płyn. Dodaj 1 ml PTB do blokowania i nutowania przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie przeciwciał
	<ol>
		<li>Wstępne wchłanianie drugorzędowych przeciwciał przeciwko zarodkom. 
		UWAGA: Ten krok eliminuje barwienie tła z niespecyficznych interakcji przeciwciał z białkami Drosophila.
		<ol>
			<li>Pobieranie i utrwalanie zarodków Drosophila (~25 μl) zgodnie z typową procedurą8. Przechowywać w metanolu w temperaturze -20 °C.</li>
			<li>Usunąć metanol z zarodków, dodać 800 μl metanolu plus 200 μl 1x PBS i nutować przez 15 min. Usunąć 500 μl supernatantu i zastąpić 500 μl 1x PBS. Następnie nutuj przez 15 minut. Powtórz dwa razy (w sumie ~1 godzina prania), a następnie zakończ w PTB. 
			UWAGA: Zarodki mogą być wykorzystane natychmiast lub trzymane na nutatorze przez kilka godzin w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Usunąć płyn, napełnić PTB do 200 μl na preparat oocytów i dodać znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe w odpowiednich rozcieńczeniach (pamiętając, że końcowa objętość wyniesie 300 μl; patrz krok 7.4). Nutować w temperaturze 4 °C przez noc (najlepiej) lub w temperaturze pokojowej przez 3 do 4 godzin. 
			UWAGA: Wstępnie wchłonięte przeciwciała zostaną użyte w kroku 6.2.4. 
			UWAGA: Próbki należy przechowywać w ciemności tak długo, jak to możliwe po dodaniu przeciwciał fluorescencyjnych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usunąć płyn z oocytów, napełnić PTB do 300 μl i dodać przeciwciała pierwszorzędowe w odpowiednich rozcieńczeniach. Nutować w temperaturze 4 °C przez noc (preferowane) lub w temperaturze pokojowej przez 3 do 4 godzin.</li>
		<li>Płucz oocyty cztery razy po 15 minut każdym 1 ml PTB.</li>
		<li>Usunąć płyn z oocytów, dodać 200 μl supernatantu z zarodków (wstępnie wchłonięte przeciwciała drugorzędowe). Następnie napełnij PTB do 300 μl. Nutować w temperaturze pokojowej przez 3 do 4 godzin (najlepiej) lub w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Myj oocyty raz przez 15 minut 1 ml PTB, usuń płyn. Następnie dodać 0,5 μl Hoechst 33342 i 500 μl PTB i nutować przez 7 min.</li>
		<li>Płukać oocyty dwukrotnie przez 15 minut każdy 1 ml PTB. 
		UWAGA: Oocyty mogą być natychmiast zamontowane na szkiełku podstawowym lub mogą być przechowywane w PTB w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania gotowości do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. FISH (Kontynuuj od kroku 5 powyżej)
<ol>
	<li>Przepłukać zwinięte oocyty do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej ~15 ml 2x SSCT. Niech oocyty osiądą ~2 min. Usuń wszystko oprócz ~0,5 ml płynu wraz z jak największą liczbą membran. 
	UWAGA: Błony osiadają wolniej niż zwinięte oocyty.</li>
	<li>Przenieś oocyty do probówki o pojemności 0,5 ml i usuń pozostały płyn. Kolejno dodawać i usuwać 500 μl roztworów formamidu 20%, 40% i 50%, nutując przez 10 minut w każdym roztworze. 
	UWAGA: Oocyty wolniej się osadzają przy wyższej zawartości procentowej formamidu.</li>
	<li>Usunąć płyn, a następnie dodać 500 μl 50% roztworu formamidu i nutować w temperaturze 37 °C przez 1 do 5 godzin. 
	UWAGA: Dłuższe inkubacje skutkują lepszą penetracją sondy.</li>
	<li>Usunąć płyn, pozostawiając nie więcej niż ~100 μl oocytów, i dodać 36 μl roztworu hybrydyzacyjnego plus 2 μl sondy (50 ng/μl) i 2 μl wody lub 2 μl drugiej sondy (Tabela 1).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 91 °C przez 3 minuty (tylko FISH) lub w temperaturze 80 °C przez 20 minut (FISH plus immunofluorescencja), a następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez noc. 
	UWAGA: Te czynności można wykonać w termocyklerze.</li>
	<li>Nie usuwaj płynu. Dodać 500 μl 50% roztworu formamidu i nutować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Pozostawić do spoczynku, usunąć płyn, dodać 500 μl 50% roztworu formamidu i nutować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Pozostawić do spoczynku, usunąć płyn, dodać 500 μl 20% roztworu formamidu i nutować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Wykonaj trzy szybkie płukania w 500 μl 2x SSCT (pozwól osiąść, wyjąć, następnie dodaj płyn, odwróć kilka razy, powtórz.) Pozostaw do spoczynku, usuń płyn, a następnie dodaj 500 μl PTB i nutate przez 4 godziny.</li>
</ol>
8. Barwienie przeciwciał po FISH
<ol>
	<li>Usunąć płyn z oocytów, napełnić PTB do 300 μl i dodać 10 μl przeciwciała anty-α-tubuliny sprzężonego z FITC. Alternatywnie można zastosować inne przeciwciała, zgodnie z powyższym protokołem. Nutate w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	<li>Płukać oocyty raz przez 15 min 500 μl PTB, usunąć płyn, następnie dodać 0,5 μl Hoechst 33342 i 500 μl PTB i nutować przez 7 min.</li>
	<li>Przemyj oocyty dwukrotnie przez 15 minut każdy 500 μl PTB. 
	UWAGA: Oocyty mogą być natychmiast zamontowane na szkiełku podstawowym lub mogą być przechowywane w PTB w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania gotowości do obrazowania. Utrzymuj oocyty w ciemności tak długo, jak to możliwe po dodaniu przeciwciał fluorescencyjnych.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td fo:width="1in">Powtórz nazwę</td>
			<td fo:width="1in">Chromosom</td>
			<td>Sekwencja oligologyczna*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okręg wyborczy 359</td> TGL
			<td>Z</td>
			<td>GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC powiedział:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AACAC (Organizacja Zarządzania Kryzysowego</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>AACACAACACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodeca powiedział:</td>
			<td>3</td>
			<td>CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTCGGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,686</td> jedn.
			<td>2+3</td>
			<td>AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG</td> powiedział:
		</tr>
		<tr>
			<td>AATAT (Sieć Ratratów)</td>
			<td>4(+Y)</td>
			<td>AATATAATAATATAATATAATATATAATAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*359 sekwencja od Erica Joyce'a, komunikacja osobista, inne sekwencje od Sullivana i wsp.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sondy FISH dla powtórzeń centromerowych Drosophila.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>lek</td>
			<td>rozpuszczalnik</td>
			<td>Koncentracja zapasów</td>
			<td>Końcowe stężenie</td>
			<td>Czas zabiegu</td>
			<td>efekt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kolchicyna</td>
			<td>etanol</td>
			<td>125 mM</td>
			<td>150 μM</td>
			<td>10 min lub 30 min</td>
			<td>destabilizować mikrotubule niekinetochorowe (10 min)9 lub wszystkie (30 min) mikrotubule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paklitaksel</td>
			<td>Dmso</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>Czas trwania: 10 min</td>
			<td>stabilizują mikrotubule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binukleina 2</td>
			<td>Dmso</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>25 μM</td>
			<td>Czas trwania: 20 min</td>
			<td>hamują kinazę Aurora B10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Leczenie farmakologiczne.

<ol><li>Bridges, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-disjunction+as+proof+of+the+chromosome+theory+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity.</a> Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+assembly+in+Drosophila+females%3A+behavior+of+nonexchange+chromosomes+and+the+effects+of+mutations+in+the+nod+kinesin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein.</a> J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).</li>
<li>Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtubule-destabilizing+kinesin+motor+regulates+spindle+length+and+anchoring+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes.</a> J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86 (1), 135-146 (1996).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gilliland, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+transiently+sequesters+mps1+and+polo+to+collagenase-sensitive+filaments+in+Drosophila+prometaphase+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes.</a> PLoS One. 4 (10), e7544(2009).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+and+End-On+Kinetochore+Attachments+Are+Coordinated+to+Achieve+Bi-orientation+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).</li>
<li>Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleine+2%2C+an+isoform-specific+inhibitor+of+Drosophila+Aurora+B+kinase%2C+provides+insights+into+the+mechanism+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis.</a> ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+gamma-tubulin+in+the+acentriolar+female+meiotic+spindle+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila.</a> EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).</li>
<li>Endow, S. A., Komma, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+dynamics+during+meiosis+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes.</a> J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).</li>
<li>Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthies%2C+HJ+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).</li>
<li>Colombié, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+Incenp+crucial+to+the+assembly+of+the+acentrosomal+metaphase+spindle+in+female+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis.</a> Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Klasyfikacja oocytów Drosophila
Chociaż wydłużony kariosom jest często obserwowany w oocytach prometafazy, użycie kształtu kariosomu do odróżnienia oocytów prometafazy od metafazy może być problematyczne. Podczas prometafazy kariosom zaczyna się jako okrągły kształt, wydłuża się, a następnie cofa do okrągłego kształtu, gdy oocyt zbliża się do zatrzymania metafazy. Oznacza to, że wiele oocytów prometafazy nie ma wydłużonego kariosomu. Ponadto, jeśli badane są zmutowane...

Badanie mejozy jest czasami opisywane jako "genetyka genetyki". Dzieje się tak, ponieważ podstawowe właściwości dziedziczenia chromosomów i niezależnego asortymentu odbywają się poprzez segregację chromosomów podczas produkcji gamet. Ważna demonstracja chromosomowej teorii dziedziczenia pojawiła się w 1916 roku w pracy Calvina Bridgesa nad Drosophila melanogaster1. To i inne klasyczne badania genetyczne nad Drosophila w znacznym stopniu przyczyniły się do naszego zrozumienia genetyki. Badanie cytologiczne chromosomów mejotycznych w oocytach Drosophila było jednak wyzwaniem. Dzieje się tak przede wszystkim dlatego, że immunofluorescencja oocytów Drosophila w późnym stadium, kiedy wrzeciono się składa, a chromosomy są zorientowane na segregację, jest utrudniona przez obecność błon, które sprawiają, że oocyt jest nieprzepuszczalny dla przeciwciał.
Pomimo tego wyzwania, oocyty Drosophila pozostają atrakcyjnym modelem do badania zachowania chromosomów i składania wrzecion. Dzieje się tak ze względu na potężne narzędzia genetyczne dostępne u Drosophila, ale także dlatego, że oocyty zatrzymują się w metafazie I, kiedy chromosomy są zorientowane, a wrzeciono jest w pełni uformowane. Ułatwia to pobieranie i badanie dużej liczby oocytów na tym ważnym etapie podziału komórek. Ponadto prosty organizm modelowy, który jest podatny na manipulacje genetyczne w celu badania segregacji chromosomów oocytów, może stanowić ważny wkład w nasze zrozumienie zdrowia reprodukcyjnego człowieka. Błędy w liczbie chromosomów są główną genetyczną przyczyną poronień i wad wrodzonych u ludzi2. Większość tych błędów można przypisać do oocytu i są one skorelowane z wiekiem matki. Średni wiek matek w USA rośnie, co sprawia, że jest to poważny problem zdrowia publicznego.
Opisujemy tutaj metody badania cytologicznego oocytów Drosophila, w tym demonstrację, jak usunąć błony oocytów. Metody te są modyfikacjami protokołów opisanych po raz pierwszy przez Theurkaufa i Hawleya3, Zou i wsp.4 oraz Dernburg i wsp.5. Uwzględniamy również metody wzbogacania różnych etapów oocytów, oparte na protokole po raz pierwszy opisanym przez Gillilanda i wsp.Lokal mieszkalny Na koniec dodajemy instrukcje dotyczące leczenia farmakologicznego oocytów Drosophila. Łącznie metody te umożliwiają badanie cytologiczne segregacji chromosomów oocytów i składania wrzecion u Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyd</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>NIEBEZPIECZNE; po otwarciu wyrzucić po miesiącu</td></tr><tr><td>Zlewki o pojemności 250 ml</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki 5 ml</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aktywne suche drożdże</td><td>Różne</td><td></td><td>wymieszać z wodą, aby uzyskać pastę o konsystencji masła orzechowego</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-&alfa-tubulinowe sprzężone z klonem FITC</td><td>Sigma</td><td>F2168</td><td>DM1A</td></tr><tr><td>Binukleina 2</td><td>Sigma</td><td>B1186</td><td>NIEBEZPIECZNY</td></tr><tr><td>blender</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolchicyna</td><td>Sigma</td><td>C-9754</td><td>NIEBEZPIECZNE</td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>Nr 1 1/2</td></tr><tr><td>siarczan dekstranu</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanole</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5622</td><td>Pęseta Dumont o wysokiej precyzji klasy 5</td></tr><tr><td>formamid</td><td>Sigma</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka</td><td>podstawowe VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki z podziałką 1,5 ml</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>dostępne u kilku sprzedawców</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorki magnezu</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metanole</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>duże oczka (~ 1,500 &; m)</td> Różnorodność formatów <td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>i inni dostawcy, małe siatki 12 lub 14 (</td></tr><tr><td>~ 300 i mikro; m)</td> <td>Spectrum labs</td><td>146 424</td><td>różne formaty, np. , 146 422 lub 146 486</td></tr><tr><td>nutator</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipety Pasteura</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>octany potasu</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas kakodylowy</td><td>Sigma</td><td>C0125</td><td>NIEBEZPIECZNY; alternatywnie kakodylan sodu może być zastąpiony</td></tr><tr><td>potasem wodorotlenek</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>octany sodu</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorki sodu</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cytrynian sodu</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenki sodu</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sacharozy</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>taksol (paklitaksel)</td><td>Sigma</td><td>T1912</td><td>NIEBEZPIECZNE</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>wir</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy i w utrwalonych oocytach drosophila

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Segregacja chromosomów w ludzkich oocytach jest podatna na błędy, co prowadzi do aneuploidii, która jest główną genetyczną przyczyną poronień i wad wrodzonych. Badania nad zachowaniem chromosomów w oocytach z organizmów modelowych są bardzo obiecujące, jeśli chodzi o odkrycie molekularnych podstaw podatności ludzkich oocytów na aneuploidię. Drosophila melanogaster jest podatna na manipulacje genetyczne, dzięki ponad 100-letnim badaniom, społeczności i rozwojowi technik. Wizualizacja zachowania chromosomów i składania wrzecion w oocytach Drosophila wiąże się jednak ze szczególnymi wyzwaniami, przede wszystkim ze względu na obecność błon otaczających oocyt, które są nieprzepuszczalne dla przeciwciał. Opisujemy tutaj protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania składania wrzeciona mejozy I i zachowania chromosomów w oocytach Drosophila, które umożliwiają molekularną analizę segregacji chromosomów w tym ważnym organizmie modelowym.

Opisane tutaj metody pozwolą na zebranie późnych oocytów Drosophila reprezentujących trzy stadia mejozy (Rysunek 1). Oocyty w profazie odróżnia obecność otoczki jądrowej, co jest widoczne dzięki brakowi sygnału tubuliny w obszarze otaczającym kariosom (Rysunek 1A). Prometafa jest okresem po rozpadzie otoczki jądrowej, podczas którego formuje się wrzeciono. W trakcie prometafy kariosom przyjmuje charakterystyczny kształt, stając się wydłużonym, cz...

Przedstawiamy protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania dojrzałych oocytów Drosophila. Metody te pozwalają na wizualizację zachowania chromosomów oraz składania i funkcji wrzeciona podczas mejozy.

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie oocytów Drosophila do badania cytologicznego montażu wrzeciona i orientacji chromosomów podczas mejozy I. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny mejozy, takie jak sposób ustanawiania bipolarności wrzeciona oraz mechanizm bi-orientacji chromosomów w przypadku braku centrosomów. Główną zaletą tej techniki jest skuteczne usunięcie błon oocytów blokujących przenikanie przeciwciał, co umożliwia zastosowanie immunofluorescencji. W celu rozpoczęcia należy uprzednio pokryć wnętrze probówki o średnicy pięciu milimetrów oraz pipety Pasteura PTB, aby zapobiec przywieraniu oocytów do powierzchni.Do blendera wlej 100 mililitrów buforu ROB, a następnie dodaj od 100 do 300 znieczulonych much i uruchom blender pulsacyjnie trzy razy przez jedną sekundę. Uzyskaną zawiesinę przefiltruj do zlewki o pojemności 250 mililitrów przez duże sito o oczkach o wielkości około 1 500 mikrometrów. Pozostaw filtrat do osadzenia na około dwie minuty, a następnie odessij górną warstwę, usuwając jak najwięcej dużych fragmentów ciała.Ponownie przefiltruj zawiesinę do zlewki o pojemności 250 ml, przez mniejsze sito o wielkości oczek 300 µm

techniques-for-imaging-prometaphase-metaphase-meiosis-i-fixed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Barwienie immunologiczne oocytów Drosophila w późnym stadium może okazać się trudne ze względu na otaczające je błony. Ten film opisuje wysokoprzepustową metodę pozyskiwania oocytów, ich utrwalania i usuwania błon w celu barwienia immunologicznego. Przedstawiony protokół demonstruje te techniki z oocytami w późnym stadium używanymi do wizualizacji różnych etapów mejozy.

Przygotowanie utrwalonych oocytów Drosophila do barwienia immunologicznego: wysokoprzepustowa metoda utrwalania i usuwania błony zewnętrznej

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Poznaj techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila. Metoda umożliwia wizualizację zachowania chromosomów i montażu wrzeciona podczas mejozy.

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów