Name: Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Poznaj metodę usuwania tkanki mięśniowej z larw Drosophila w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka. Technika poprawia stosunek sygnału do szumu i umożliwia zastosowanie mikroskopii superrozdzielczej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Gary'emu Laevsky'emu za pomocne dyskusje na temat mikroskopii. Ta praca została sfinansowana z grantów NIH R01GM061107 i R01GM067758 dla E.R.G.

Uwaga: Procedura usuwania mięśni (Rysunek 1) jest modyfikacją wcześniej opisanych metod przygotowania filetów larwalnych. Kroki, które poprzedzają i następują po usunięciu mięśni, są pokrótce przedstawione, a czytelnik jest odsyłany do poprzednich prac 10, 11 w celu uzyskania bardziej szczegółowych opisów.
1. Rozkrój larwy w zimnej soli fizjologicznej
<ol>
	<li>Przygotować robocze rozcieńczenie zimnego roztworu soli fizjologicznej HL3.115 lub zimnego roztworu soli fizjologicznej11 HL3.1 wolnego od Ca2+ (Tabela 1). Umieść larwę w naczyniu z elastomeru silikonowego z taką ilością zimnego soli fizjologicznej, aby pokryć dno naczynia. 
	UWAGA: Zobacz Dyskusja dotycząca wyboru soli fizjologicznej.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x HL3.1 sól fizjologiczna (pH 7,2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 5 mM SZYBY SZARE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 70 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 5 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 1,5 mM CaCl2 (pominąć dla soli fizjologicznej bez Ca2+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 4 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 10 mM NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 5 mM trehalozy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 115 mM sacharozy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uwaga: Kompozycja naśladuje hemolimfę owada</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Skład zimnej soli fizjologicznej.
<ol start="2">
	<li>Ustaw larwę brzuszną stroną do góry. Brzuszną powierzchnię larwy można rozpoznać po brzusznych pasach zębowych, a stronę grzbietową po pierwotnych rurkach tchawicy larwalnej biegnących od przedniej do tylnej. Rozciągnij larwę w kierunku przednio-tylnym i przypnij głowę i ogon do naczynia preparacyjnego z elastomeru silikonowego za pomocą szpilek do owadów. Użyj cienkich nożyczek do preparowania, aby ciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej, zaczynając od jednego końca i postępując w kierunku drugiego. 
	UWAGA: Ta orientacja zachowuje powszechnie badane grzbietowe skupisko neuronów da.</li>
	<li>Po rozcięciu larwy przypnij cztery rogi do naczynia preparacyjnego, tak jakbyś otwierał książkę. Użyj kleszczy, aby chwycić i usunąć narządy wewnętrzne, w tym OUN, jelito i tchawicę. Wyreguluj szpilki owadów tak, aby filet był napięty, ale nie maksymalnie rozciągnięty. 
	UWAGA: Mięśnie są zakotwiczone w ścianie ciała na granicach segmentów. Chociaż mięśnie pokrywają większość ściany ciała, są nieobecne w wąskim obszarze w pobliżu grzbietowej linii środkowej.</li>
</ol>
2. Usuwanie mięśni
<ol>
	<li>Zlokalizuj grzbietową linię środkową larwy, w której nie ma tkanki mięśniowej. Ustaw pojedynczy ząb kleszczowy tak, aby można go było włożyć pod tkankę mięśniową w możliwie najbardziej płaskiej orientacji.</li>
	<li>Zaczynając od grzbietowej linii środkowej, w pobliżu przedniej granicy segmentu, ostrożnie wsuń kleszcze między mięsień a naskórek, uważając, aby zminimalizować kontakt kleszczyków z naskórkiem.</li>
	<li>Pociągnij kleszcze do góry, aby zerwać przyczep mięśnia do ściany ciała w jednym punkcie kotwiczenia. Powtórz ten proces dla pozostałych segmentów półkuli będących przedmiotem zainteresowania. 
	UWAGA: Ten protokół optymalizuje zachowanie tylnej części każdego pola dendrytowego neuronu da. Aby zachować przednią część pola dendrytowego, najlepiej jest umieścić bolec kleszczowy na tylnym końcu każdego segmentu.</li>
	<li>Ponownie wyreguluj szpilki owadów tak, aby filet larwalny był maksymalnie rozciągnięty we wszystkich kierunkach.</li>
	<li>Utrwal filet, gdy jest jeszcze przypięty do naczynia preparującego, używając zimnego, świeżo przygotowanego 4% formaldehydu w PBS przez 25 minut.</li>
	<li>Spłucz 5 razy w PBS.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie odciągnij tkankę mięśniową od pozostałych punktów kotwiczenia, uważając, aby zminimalizować kontakt z naskórkiem.</li>
	<li>Odpiąć filet i wyjąć go z naczynia preparacyjnego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wykonaj wszystkie kolejne etapy mycia, blokowania i barwienia immunofluorescencyjnego, jak opisano wcześniej11.</li>
</ol>
3. Zamontuj filet larwalny
<ol>
	<li>Najpierw usuń głowę i ogon za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych, aby próbka była jak najbardziej płaska. Zamocować filet na szkiełku nakrywkowym w utrwalaczu zapobiegającym blaknięciu, tak aby wewnętrzna powierzchnia fileta była skierowana w stronę szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Umieść szkiełko mikroskopowe na szkiełku nakrywkowym i delikatnie dociśnij, aby rozproszyć medium mocujące. Odwróć szkiełko mikroskopu i uszczelnij szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą lakieru do paznokci. Preparaty można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej jeden miesiąc.</li>
</ol>

<ol><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+Drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li>
<li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li>
<li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111(2011).</li>
<li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li>
<li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC%2C+NANCHUNG%2C+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisano protokół ręcznego usuwania tkanki mięśniowej z filetów larwalnych Drosophila . Protokół ten modyfikuje wcześniej opisane techniki preparacji larw10,11. Po wycięciu larwy w naczyniu z elastomeru silikonowego znajduje się grzbietowa linia środkowa. Pojedynczy ząb kleszcza, w możliwie najbardziej płaskiej orientacji, jest ostrożnie wprowadzany między tkankę mięśniową a naskórek, w pobliżu grzbietowej linii środkowej. Kleszcze są delikatnie ciągnięte do góry, aby oddzielić tkankę mię...

Neurony dendrytyczne larwalne (da) Drosophila dostarczają cennego modelu do badania rozwoju neuronów ze względu na ich podatność na manipulacje genetyczne i łatwość, z jaką można je obrazować. Te neurony czuciowe odegrały zasadniczą rolę w identyfikacji licznych szlaków kontrolujących morfogenezę dendrytów1-3.
Cztery klasy neuronów da (klasa I - IV) unerwiają naskórek larw. Neurony te leżą między błoną podstawną a naskórkiem, a ich dendryty tworzą w dużej mierze dwuwymiarowe tablice4,5. Spośród czterech klas, neurony da klasy IV mają najsilniej rozgałęzione altanki i, podobnie jak neurony czuciowe innych zwierząt, opracowanie tych altan wymaga do ich rozwoju czynników wewnętrznych, a także wskazówek z sąsiednich tkanek, zwłaszcza naskórka6-9.
Badania mające na celu określenie, jak takie czynniki neuronalne i pozaneuronalne kontrolują morfogenezę dendrytów, korzystają z możliwości wykrywania ekspresji białek in situ za pomocą immunofluorescencji. Zewnętrzny naskórek larwy jest nieprzepuszczalny dla przeciwciał, ale przeszkoda ta może być łatwo pokonana przez przygotowanie filetów larwalnych za pomocą dobrze znanych metod preparacji10,11. Jednak tkanka mięśniowa ściany ciała, która leży tuż wewnątrz błony podstawnej, stwarza kilka wyzwań w kierunku wizualizacji neuronów da i komórek naskórka. Po pierwsze, tkanka mięśniowa, która wyściela większość ściany ciała, znacznie zasłania sygnały fluorescencyjne emanujące z tkanki neuronalnej lub naskórka. To znacznie zmniejsza stosunek sygnału do szumu w próbce. Po drugie, wiele istotnych białek może ulegać ekspresji w tkance mięśniowej, a także w neuronach lub naskórku. Ten sygnał fluorescencyjny pochodzący z mięśni prawdopodobnie jeszcze bardziej zaciemni wykrywanie sygnału fluorescencyjnego z neuronu lub naskórka. Wreszcie, postępy w technologiach mikroskopowych pozwalają obecnie na obrazowanie próbek w rozdzielczości subdyfrakcyjnej i mogą być szczególnie pomocne w rozpoznawaniu lokalizacji białek, które ulegają ekspresji w neuronach i otaczających komórkach naskórka12,13. Jednak obrazowanie za pomocą mikroskopii superrozdzielczej korzysta z silnego stosunku sygnału do szumu i bliskiej odległości próbki od szkiełka nakrywkowego. Oprócz zmniejszenia stosunku sygnału do szumu, mięsień ściany ciała larwy oddala neurony od szkiełka nakrywkowego, ograniczając w ten sposób lepszą rozdzielczość obrazu, którą można osiągnąć za pomocą metod mikroskopii superrozdzielczej. Oprócz wyzwań związanych z analizą immunofluorescencyjną, tkanka mięśniowa stanowi barierę dla zapisu elektrofizjologicznego z neuronów czuciowych w ścianie ciała larwy. Jego usunięcie jest zatem korzystne dla neurofizjologicznej manipulacji neuronami czuciowymi14.
Tutaj opisana jest metoda ręcznego usuwania tkanki mięśniowej larw Drosophila. Pokazujemy, że nasz protokół pozwala na obrazowanie immunofluorescencyjne białek, które w przeciwnym razie są zasłonięte przez tkankę mięśniową, poprawia stosunek sygnału do szumu do wizualizacji neuronów da klasy IV i umożliwia zastosowanie mikroskopii superrozdzielczej w celu lepszego rozróżniania relacji przestrzennych białek i struktur komórkowych w neuronach da i naskórku.

<table><tbody><tr><td>Pęseta Dumont #5</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki, 8 cm, proste, ostrza 5 mm, końcówki 0,1 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>do płytek preparacyjnych</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów Austerlitz, 0,1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła Fostec 8375</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade medium montażowe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>do mikroskopii konfokalnej</td></tr><tr><td>Prolong Diamentowy uchwyt zapobiegający blaknięciu</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>do mikroskopii oświetlenia strukturalnego</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe z mikro, 22 x 22 mm, nr 1,5</td> Szkiełka mikroskopowe <td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus, 25 x 75 x 1,0 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-Coracle</td><td>Badania rozwojowe Supernatant Hybridoma Bank</td><td>C615.16</td><td>, rozcieńczony 1:50</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-Disc</td><td>duże Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>supernatant, rozcieńczony 1:50</td></tr><tr><td>Królik anty-dsCzerwone przeciwciało</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>rozcieńczone 1:1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze Kozi, Alexa Fluor 568 sprzężone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>rozcieńczone 1:1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie Koza, Alexa Fluor 488 sprzężone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>rozcieńczone 1:500</td></tr></tbody></table>

usuwanie tkanki mięśniowej drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Neurony dendrytyczne larwalne (da) larwalne Drosophila są popularnym modelem do badania mechanizmów morfogenezy neuronów. Neurony Da rozwijają się w komunikacji z komórkami naskórka, które unerwiają, a zatem ich analiza korzysta z wizualizacji in situ białek wyrażanych zarówno neuronalnie, jak i naskórkowo za pomocą immunofluorescencji. Tradycyjne metody przygotowania filetów larwalnych do eksperymentów immunofluorescencyjnych pozostawiają nienaruszoną tkankę mięśniową, która pokrywa większość ściany ciała, co stanowi kilka wyzwań dla obrazowania białek neuronalnych i naskórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę usuwania tkanki mięśniowej z filetów larwalnych Drosophila. Protokół ten umożliwia obrazowanie białek, które w przeciwnym razie byłyby zasłonięte przez tkankę mięśniową, poprawia stosunek sygnału do szumu i ułatwia wykorzystanie mikroskopii superrozdzielczej do badania rozwoju neuronów.

Przedstawiamy użyteczność procedury usuwania mięśni w celu poprawy stosunku sygnału do szumu w eksperymentach z immunofluorescencją, aby umożliwić jednoczesną wizualizację białek złączy szczelinowych Coracle (Cora) i Discs-large (Dlg) wraz z neuronami da klasy IV znakowanymi markerem błonowym CD4-tdTomato.
Białko Cora było wcześniej wykorzystywane do identyfikacji pasm, w których dendryty neuronów da są otoczone przez komórki epidermy, i jest jednym z wielu zid...

Badania morfogenezy neuronów za pomocą neuronów dendrytycznych larw Drosophila korzystają z wizualizacji in situ białek neuronalnych i naskórkowych za pomocą immunofluorescencji. Opisujemy procedurę, która poprawia analizę immunofluorescencyjną neuronów da i otaczających komórek naskórka poprzez usunięcie tkanki mięśniowej ze ściany ciała larwy.

Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest usunięcie tkanki mięśniowej z larwy drosofilia w ramach przygotowania do analizy immunofluorescencyjnej arboryzacji dendrytycznej larwalnej lub neuronów da oraz tkanki nabłonkowej. W dniu dzisiejszym zaprezentujemy metodę, która poprawia wizualizację czynników neuronalnych i pozaneuronalnych zaangażowanych w morfogenezę dendrytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona obrazowanie immunofluorescencyjne białek, które w przeciwnym razie byłyby przesłonięte przez tkankę mięśniową, poprawia stosunek sygnału do szumu oraz umożliwia zastosowanie mikroskopii superrozdzielczej.Na początek do naczynia z elastomeru silikonowego należy wlać tyle zimnej soli fizjologicznej, aby zakryła jego dno. Do naczynia należy przenieść badaną larwę i umieścić je pod stereomikroskopem, dbając o odpowiednie ustawienie oświetlenia.Ułóż larwę stroną brzuszną do góry, którą można zidentyfikować po brzusznych pasmach kolców brzusznych. Rozciągnij larwę w kierunku przednio-tylnym i za pomocą szpilek entomologicznych przymocuj głowę oraz odwłok do dna naczynia. Używając precyzyjnych nożyczek sekcyjnych, przetnij larwę wzdłuż linii środkowej brzucha od jednego końca do drugiego.Rozpostrzyj larwę i przypnij tkankę kutykuli w czterech rogach, aby leżała płasko. Za pomocą pęsety usuń narządy wewnętrzne, w tym OUN, jelita i tchawki. Dostosuj położenie szpilek entomologicznych tak, aby preparat był napięty, ale nie maksymalnie rozciągnięty.Zlokalizuj linię środkową grzbietową larwy, w miejscu braku tkanki mięśniowej, a następnie umieść ząb pęsety wewnątrz tej granicy. Wsuń ząb pomiędzy mięsień a sklepkę, starając się zminimalizować kontakt ze sklepką. Aby ograniczyć uszkodzenia sklepki, wykonuj sekcję przy użyciu jak najpłaskich zębów pęsety i spróbuj przeprowadzić proces w soli fizjologicznej zawierającej wapń. Może to pomóc w stworzeniu przestrzeni pomiędzy mięśniem a sklepką.Następnie pociągnij pęsetą do góry, aby przerwać przyczep mięśnia do ściany ciała w jednym punkcie zakotwiczenia. Powtórz ten proces dla pozostałych analizowanych segmentów mięśniowych. Ponownie ustaw szpilki entomologiczne tak, aby maksymalnie rozciągnąć płaty larwalne we wszystkich kierunkach.Aby utrwalić filet, najpierw usunąć roztwór soli fizjologicznej, a następnie dodać zimny, świeżo przygotowany 4% formaldehyde w PBS, tak aby pokrył dno naczynia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Przepłukać filet pięć razy w PBS, aby usunąć nadmiar formaldehyde.Następnie za pomocą pęsety ostrożnie oddziel tkankę mięśniową od pozostałych punktów mocowania, ponownie minimalizując kontakt z naskórkiem. Na koniec odepnij filet i wyjmij go z naczynia sekcyjnego.Umieścić go w czystej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Dalsze etapy przemywania, blokowania i immunostainingu należy przeprowadzić w tej probówce. Aby zamocować filet do obrazowania, należy wyjąć próbkę z probówki i ułożyć ją powierzchnią wewnętrzną do dołu na szkiełku nakrywce w kropli PBS.Odetnij głowę i ogon. Następnie usuń PBS, absorbując go za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Dodaj jedną kroplę medium montażowego Antifade.Umieść szkiełko podstawowe na szkiełku nakrywce, a następnie delikatnie dociśnij je za pomocą chusteczki laboratoryjnej, aby rozprowadzić medium montażowe. Odwróć preparat i nałóż bezbarwny lakier do paznokci na każdą krawędź, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe. Przedstawione obrazy konfokalne ukazują eksperymenty z immunofluorescencją w celu wizualizacji białka złączy przegrodowych Coracle (Cora) oraz neuronów da.W tym przypadku obrazy tkanek z usuniętym mięśniem oraz tkanek z nienaruszonym mięśniem zostały wykonane przy tych samych warunkach mocy lasera. W przypadku tkanek z nienaruszonym mięśniem zwiększono moc lasera, aby zrekompensować interferencję mięśnia i uzyskać porównywalny obraz. Na obrazach uzyskanych z filetów z usuniętym mięśniem wyraźnie można było wykryć cora na granicach komórek epidermalnych w przerywanych śladach wzdłuż dendrytów neuronów da klasy czwartej.I zarysowując neuron, soma. W przeciwieństwie do tego, lokalizacja cora w tych domenach była ledwo wykrywalna w próbkach mięśni. Tutaj cora była w dużej mierze widoczna w mięśniach, tchawce i złączach nerwowo-mięśniowych, a fluorescencja z tych tkanek przesłoniła większość cora w nabłonku.Próbki obrazowano również za pomocą mikroskopii strukturalnego oświetlenia 3D, aby ustalić, czy usunięcie mięśni poprawia wizualizację przy wyższej rozdzielczości. Ponownie, w przypadku próbek z nienaruszonymi mięśniami konieczne było zwiększenie mocy i czasu ekspozycji, aby zniwelować wpływ zakłóceń wywołanych przez tkankę mięśniową. Rozdzielczość obrazu wydawała się ostrzejsza w próbkach po usunięciu mięśni, zaobserwowano mniej artefaktów, a barwienie cora ścieżek dendrytów było łatwiejsze do rozróżnienia.Błony dendrytów mogą być również mierzone na poziomie 114 nanometrów w stanie wyłączonym mięśnia. Natomiast w filetach z włączonym mięśniem ich szerokość wynosi 272 nanometry. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ograniczyć liczbę larw poddanych sekcji przed utrwaleniem, tak aby upływ czasu nie przekroczył 25 minut.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat tego, jak usuwać tkankę mięśniową z larwy drosophila. Niniejszy protokół pomoże w przeprowadzeniu analizy immunofluorescencyjnej neuronów sensorycznych larw oraz komórek epidermy, które one unerwiają. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

removal-drosophila-muscle-tissue-from-larval-fillets-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół demonstruje sposób przeprowadzania sekcji larw Drosophila w celu przygotowania ich do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.

Disekcja NMJ larw Drosophila

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Ten film opisuje, jak przygotować filety larwalne używane do wizualizacji neuronów sensorycznej arboryzacji dendrytycznej (da) i związanych z nimi komórek naskórka. Przedstawiony protokół pokazuje szczegółowo, jak usunąć tkankę mięśniową ze ściany ciała przy jednoczesnym zachowaniu morfologii komórek, co poprawia barwienie immunologiczne i wizualizację inaczej zasłoniętych neuronów da i komórek naskórka.

Przygotowanie filetów larwalnych: metoda wizualizacji nienaruszonych neuronów czuciowych i związanych z nimi komórek naskórka

Mięśnie lotu Drosophila są używane jako modelowy system dla rozwoju i fizjologii mięśni. Ten film opisuje muskulaturę lotu dorosłych osobników i przedstawia protokół analizy rozwijających się pośrednich mięśni lotu, które są odpowiednie do sekwencjonowania RNA z poczwarek.

Drosophila Rozwarstwienie mięśni lotu pośredniego późnej poczwarki (IFM): metoda wysokoprzepustowego pobierania tkanek

W tym filmie włókna nerwowe larw Drosophila są zanurzone w barwniku FM, który wiąże się z lipidami błony komórkowej. Mikroelektroda ssąca i impulsy elektryczne stymulują proces endocytozy, wprowadzając barwnik FM do nowo powstałych pęcherzyków endocytarnych. Ta metoda, która wizualizuje presynaptyczne etapy neuroprzekaźnictwa, jest przydatna do badania funkcji synaptycznych i uwalniania neuroprzekaźników.

Ładowanie i rozładowywanie barwnika FM za pośrednictwem mikroelektrod w komórkach nerwowych larw Drosophila

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Mięsień lotu Drosophila to potężny model do badania regulacji transkrypcji, alternatywnego splicingu, metabolizmu i mechanobiologii. Przedstawiamy protokół preparacji znakowanych fluorescencyjnie mięśni lotnych z żywych poczwarek w celu wygenerowania wysoce wzbogaconych próbek, idealnych do proteomiki i głębokiego sekwencjonowania. Próbki te mogą dostarczyć ważnych mechanistycznych wglądów w różne aspekty rozwoju mięśni.

Sekcja mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych

Ten raport przedstawia nową procedurę przygotowania próbki do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Metoda ta jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną i jest szczególnie przydatna w analizie ultrastrukturalnej połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila.

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Drosophila to potężny model do zrozumienia podstawowych mechanizmów miogenezy. Ten protokół do sekcji i przygotowania przecięć półklatki piersiowej umożliwia mikroskopową analizę mięśni pośrednich lotów zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłych. Protokół ten umożliwia konfokalne obrazowanie morfologii komórkowej, lokalizacji białek, struktury mięśni oraz wielu innych aspektów miogenezy.

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

Poznaj metodę usuwania tkanki mięśniowej z larw Drosophila w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka. Technika poprawia stosunek sygnału do szumu i umożliwia zastosowanie mikroskopii superrozdzielczej.

Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka (Wideo) | JoVE Journal

Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka

Przeglądaj więcej filmów