Charakterystyka transportu elektronów przez żywe biofilmy

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest określenie ilości prądu, który może być przewodzony przez żywy materiał in situ, a także mechanizmu wykorzystywanego przez żywy materiał do transportu prądu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie elektrochemii drobnoustrojów, takie jak: W jaki sposób niektóre biofilmy mogą przenosić elektrony na setki mikronów, aby wspierać metabolizm komórkowy? Główną zaletą tej techniki jest to, że elektrody interdigitowane dają bardzo wysoki stosunek sygnału do szumu i można je skalować tak, aby pasowały do wielu różnych konfiguracji reaktora.

Metody te mogą dostarczyć informacji na temat wielokomórkowego transportu elektronów w biofilmach na długości wielu komórek. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak folie polimerowe przewodzące prąd elektryczny. Naukowcy nowi w tej metodzie będą mieli trudności, ponieważ wymaga ona bipotencjostatu do ustawiania potencjałów obu elektrod osobno i mierzenia prądu na każdej elektrodzie osobno.

Na początek zaopatrz się w dostępne na rynku elektrody IDA wzorowane na podłożu nieprzewodzącym lub zsyntetyzuj je przy użyciu standardowych metod litograficznych. Przygotuj przewodzącą srebrną żywicę epoksydową zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą pręta do mieszania lub końcówki pipety. Następnie umieść drut na każdej złotej podkładce i zabezpiecz je na miejscu za pomocą taśmy laboratoryjnej.

Przykryj drut i podkładkę srebrną żywicą epoksydową za pomocą pręta mieszającego lub końcówki pipety. Ostrożnie przenieś aparat do piekarnika o temperaturze 80 stopni Celsjusza na godzinę, aby się utwardził. Po utwardzeniu żywicy epoksydowej użyj multimetru, aby zapewnić przewodność elektryczną między końcem drutu a podkładkami.

Rezystancja między przewodem a podkładkami powinna być mniejsza niż pięć omów. Użyj również multimetru, aby sprawdzić, czy żadna przewodząca żywica epoksydowa nie łączy wielu elektrod, ponieważ może to spowodować zwarcie matrycy. Jeśli przewodząca żywica epoksydowa łączy wiele przewodów, użyj rysika, aby odizolować przewody.

Następnie zdejmij końcówkę stożkowej rurki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów, aby użyć jej jako formy do materiału izolacyjnego. Użyj igły o rozmiarze 21, aby zrobić dwa małe otwory w dnie formy, przez które wystają druty. Włóż IDA do formy i włóż druty przez otwory w dolnej części formy.

Następnie przygotuj termiczny elektryczny i wodoodporny materiał izolacyjny. Często odpowiednie są ognioodporne żywice poliuretanowe. Odpipetuj izolator do formy, tak aby srebrna żywica epoksydowa była całkowicie pokryta i pozostaw izolator do wyschnięcia zgodnie ze specyfikacją producenta.

Aby skonfigurować ogniwo elektrochemiczne, włóż IDA, elektrodę licznikową i elektrodę odniesienia do ogniwa elektrochemicznego. Napełnij ogniwo elektrochemiczne sterylnym podłożem odpowiednim do wzrostu biofilmu. W przypadku Geobacter sulfurreducens należy użyć pożywki słodkowodnej z wyłączeniem fumaranu.

Następnie podłącz elektrody do potencjostatu. Podłącz jedną elektrodę IDA do przewodu roboczego, drugą elektrodę IDA do przewodu roboczego dwóch, elektrodę odniesienia do przewodu odniesienia, a przeciwelektrodę do przewodu przeciwprądowego. Wykonaj eksperyment kontrolny, wykonując woltamperometrię cykliczną na elektrodzie pierwszej i przytrzymując elektrodę drugą w obwodzie otwartym, aby upewnić się, że elektrody nie są połączone.

Aby wyhodować odpowiedni biofilm elektroaktywny, należy zaszczepić reaktor elektrochemiczny z kultury podstawowej lub wzbogacić w pożądane mikroorganizmy aktywne elektrochemicznie przy użyciu standardowych aseptycznych technik mikrobiologicznych. W przypadku standardowych testów zaszczepiaj w stosunku 1 do 20 objętości inokulum do reaktora. Ustaw mieszanie w reaktorze na żądany poziom i ustaw inkubator lub łaźnię wodną na żądaną temperaturę w oparciu o warunki wzrostu interesującego biofilmu.

Inkubować system w oparciu o specyficzne wymagania badanego mikroorganizmu, aż biofilm wypełni lukę oddzielającą dwie elektrody. W przypadku stacjonarnego biofilmu Geobacter sulfurreducens inkubować przez siedem do dziesięciu dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Rozpocznij konfigurację parametrów eksperymentalnych, które zostaną użyte do określenia bieżącej zależności potencjału dla pomiarów bramkowania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Skonfiguruj oprogramowanie bipotencjostatu, aby wykonywać pomiary bramkowania w wybranym zakresie przy wybranym napięciu drenu źródła i z żądaną szybkością skanowania. Dodatkowo należy wykonać pomiar bazowy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wykonaj pomiary bramkowania przy użyciu tych samych warunków w obrocie z rozpuszczalnym donorem lub akceptorem elektronów obecnym w stanie bez obrotu bez warunków rozpuszczalnego donora elektronów lub akceptora.

Zaopatrz się w reaktor kontrolny, aby upewnić się, że nastawa i rzeczywista temperatura medium są takie same. Umieść termometr lub termoparę w reaktorze kontrolnym, w miejscu, w którym znajdowałaby się IDA. Następnie należy wykonać pomiary prądu odkształcenia źródła w zakresie temperatur wybranych w warunkach obrotu i bez obrotu za pomocą bipotencjostatu.

W tym celu należy ustawić i utrzymać IDA na potencjale bramki, który daje maksymalny prąd przewodzony za pomocą bipotencjostatu. Zapisać maksymalny prąd przewodzony za pomocą biopotencjostatu, podczas gdy temperatura jest przełączana między zakresami temperatur wybranymi za pomocą pokładowych elementów sterujących łaźni wodnej lub inkubatora. Zmieniaj temperaturę z jednej wartości zadanej na drugą i z powrotem za pomocą wbudowanych elementów sterujących inkubatora lub łaźni wodnej.

Decyduje to o odwracalności reakcji, aby zapewnić, że cykle temperatury nie uszkadzają biofilmu. Na koniec zresetuj temperaturę z powrotem do normalnej temperatury wzrostu i pozwól systemowi się ustabilizować. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki IDA, które prawidłowo funkcjonuje w środowisku słodkowodnym.

W porównaniu z takim, w którym elektrody zostały zwarte. Reprezentatywne pomiary bramkowania elektrochemicznego przeprowadzone na biofilmie Geobacter sulfurreduces w warunkach bez obrotu przy napięciu odkształcenia źródła wynoszącym 10 miliwoltów wykazują krzywą prądu przewodzonego w kształcie piku w funkcji potencjału bramki, charakterystyczną dla przewodnictwa redoks. W tym przypadku reprezentatywne dane surowe pokazują zależność przewodzonego prądu od temperatury medium reaktora.

Spadek prądu przewodzonego wraz ze spadkiem temperatury to kolejna cecha przewodników redoks. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby upewnić się, że pasma IDA nie są zwarte przed zaszczepieniem reaktora.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię, gdy są stosowane w celu zbadania, jak zakłócić metabolizm komórkowy patogenów tworzących biofilm. Procedura ta może być zastosowana do dowolnego żywego materiału zdolnego do transportu elektronów w celu rozwiązania dodatkowych pytań, takich jak korelacja między refologią biofilmu a przewodnictwem.