Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

Ogólnym celem zmodyfikowanej techniki northern blotting jest pomiar modyfikacji N6-metyloadenozyny, n6A w RNA i wykrycie modyfikacji w różnych RNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli epigenetyki RNA, takie jak modyfikacje N6-metyloadenozyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia skuteczną separację RNA, lepszą standaryzację projektów eksperymentalnych i jasne nakreślenie modyfikacji n6A w RNA.

Metoda ta może zapewnić wgląd w modyfikacje n6A w RNA, a także może być stosowana do innych modyfikacji RNA z różnymi przeciwciałami wykrywającymi. Aby rozpocząć eksperyment, rozpyl roztwór do odkażania rybonukleazą na ręczniki papierowe i wytrzyj pipety oraz powierzchnie stołu laboratoryjnego. Zwilż ręczniki papierowe wodą wolną od nukleaz i ponownie wytrzyj pipety i powierzchnie stołu laboratoryjnego.

Otrzymaj roztwór izolacyjny RNA utrzymywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza i dodaj jeden mililitr roztworu do około 75 miligramów tkanki myszy. Użyj mieszadła górnego, aby homogenizować tkankę. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 1-bromo-3-chloropropanu lub BCP na jeden mililitr homogenatu próbki.

Potrząsaj energicznie probówkami przez 15 sekund i przystąp do całkowitej izolacji RNA. Za pomocą spektrofotometru oznacz stężenie RNA, odnotowując absorbancję przy 260 nanometrach i 280 nanometrach. Sprawdź jakość próbki RNA, wykonując elektroforezę w żelu agarozowym 0,8%.

Wypłucz wszystkie urządzenia do elektroforezy dietylopirowęglanem lub wodą DEPC. Połącz 2,5 grama agarozy, a następnie 215 mililitrów wody DEPC w kolbie Erlenmeyera i całkowicie rozpuść mieszaninę w kuchence mikrofalowej. Po stopieniu roztworu dodaj 12,5 mililitra buforu 10X MOPS.

I 22,5 mililitra 37% formaldehydu do kolby. Następnie wlej roztwór do aparatu do elektroforezy za pomocą grzebienia o grubości 1,5 milimetra. Za pomocą czystego grzebienia wepchnij bąbelki na krawędzie żelu.

Pozwól żelowi zestalić się w temperaturze pokojowej. Następnie użyj wcześniej przygotowanego bufora do biegania 1X MOPS, aby przepłukać dołki żelu i wstępnie uruchomić żel. Załaduj próbki RNA do dołków żelu, a następnie uruchom żel.

Następnego dnia zbadaj i sfotografuj żel w świetle UV. Aby przygotować transfer, odetnij żel i usuń niewykorzystaną część. Przygotuj 500 mililitrów 10X soli fizjologicznej cytrynianu sodu lub buforu SSC.

Przemyj żel dwukrotnie buforem 10X SSC. Wytnij jeden arkusz bibuły filtracyjnej wystarczająco duży, aby pokryć żel. Wytnij cztery kawałki bibuły filtracyjnej do tego samego rozmiaru co żel.

Następnie wytnij jeden arkusz dodatnio naładowanej membrany nylonowej do tego samego rozmiaru co żel. Zaznacz nacięcie na żelu i membranie jako znacznik, aby zapewnić prawidłową orientację. Namocz membranę w buforze 2X SSC.

Wlej 500 mililitrów buforu 10X SSC do tacki transferowej. Połóż duży arkusz bibuły filtracyjnej na szklanej płycie i zwilż bibułę filtracyjną buforem transferowym. Następnie za pomocą pipety rozwałkuj wszelkie bąbelki.

Namocz dwa kawałki wstępnie pociętej bibuły filtracyjnej w buforze transferowym i umieść je na środku bibuły filtracyjnej. Usuń wszelkie bąbelki. Następnie połóż żel górną stroną do dołu na bibule filtracyjnej i połóż membranę na żelu, upewniając się, że nacięcia żelu i membrany są wyrównane.

Następnie umieść dwa kawałki wstępnie przyciętej bibuły filtracyjnej na wierzchu membrany. Usuń wszelkie bąbelki między warstwami. Nałóż folię na żel, aby upewnić się, że ręczniki wchłaniają tylko bufor przechodzący przez żel i membranę.

Następnie ułóż ręczniki papierowe na bibule filtracyjnej. Umieść dużą szklaną płytkę na ręcznikach i umieść ciężarek na wierzchu stosu i pozwól RNA przenieść się z żelu na membranę przez noc. Po przeniesieniu utrzymuj membranę wilgotną w buforze 2X SSC.

Zanurz dwa arkusze bibuły filtracyjnej w buforze 10X SSC, a następnie umieść arkusze w sieciowniku UV. Upewnij się, że strona wchłonięta przez RNA jest skierowana do góry, a następnie umieść membranę na bibule filtracyjnej. Wybierz tryb automatycznego sieciowania krzyżowego i naciśnij przycisk start, aby rozpocząć napromienianie.

Zbadaj membranę i żel za pomocą łapacza obrazu żelu UV, aby potwierdzić transfer RNA z żelu do membrany. Zablokuj membranę w 5% beztłuszczowym mleku w buforze TBST w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. Inkubować błonę przez noc w roztworze przeciwciała m6A w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia przemyj membranę trzykrotnie buforem TBST przez 15 minut. Następnie inkubować błonę w sprzężonym z HRP roztworze przeciwciała przeciwko królikowi osła przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie przemyć membranę trzykrotnie buforem TBST przez 15 minut.

Nałożyć ulepszone podłoże chemiluminescencyjne. Uchwyć chemiluminescencję za pomocą cyfrowego imagera. Na koniec przejdź do kwantyfikacji m6A i zmierz względną intensywność chemiluminescencyjną m6A za pomocą obrazu J. Próbki RNA wątroby myszy pobierano w odstępach czterogodzinnych i badano za pomocą zmodyfikowanej techniki northern blotting.

Metylacja rRNA, mRNA i małych RNA została wyraźnie wykryta. Reprezentatywne bloty m6A wykonano dla całkowitego RNA i bez rRNA z wątroby myszy typu dzikiego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się epigenetyką RNA do zbadania wpływu rytmu okołodobowego i otyłości na fizjologię człowieka.