Name: Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę northern blotting do pomiaru modyfikacji m6A w RNA z tkanek myszy. Technika umożliwia wykrywanie metylacji w rRNA, mRNA i małych RNA, wspierając badania nad epigenetyką RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

C.Y.W. otrzymał wsparcie od National Health Research Institute (NHRI-EX101-9925SC), National Science Council (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) oraz Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 i CMRPG3C1763).

UWAGA: Całkowity poziom RNAm 6A obejmuje rRNA, mRNA i inne małe RNA. Ponieważ rybosomalne RNA ma liczne modyfikacjem6A, pomiar poziomów m6A będzie musiał uwzględniać ten fakt.
1. Izolacja RNA
<ol>
	<li>Za pomocą roztworu do odkażania rybonukleazy (rozpylonego na ręczniki papierowe) przetrzyj pipety i powierzchnie stołu laboratoryjnego. Zwilż ręczniki papierowe wodą bez nukleaz i ponownie wytrzyj pipety i powierzchnie stołu laboratoryjnego.</li>
	<li>Ekstrakcja RNA
	<ol>
		<li>Całkowita izolacja RNA
		<ol>
			<li>Za pomocą mieszadła górnego homogenizować 50-100 mg tkanki lub 5-10 x 106 komórek w 1 ml roztworu do izolacji RNA utrzymywanego w temperaturze 4 °C. 
			UWAGA: Do próbek tkanki tłuszczowej od myszy może być wymagane więcej tkanki (100-150 mg) ze względu na niższe stężenia RNA w niej. Próbki pochodzące z serca, wątroby, mięśni szkieletowych, płuc, mózgu i makrofagów myszy zostały wykorzystane wcześniej4.</li>
			<li>Inkubować homogenaty próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Dodać 100 μl 1-bromo-3-chloropropanu (BCP) na 1 ml homogenatu próbki. Potrząsaj energicznie probówkami przez 15 s i przystąp do izolacji całkowitego RNA zgodnie z instrukcjami producenta24.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oczyszczanie poliadenylowanego mRNA z wyizolowanego całkowitego RNA
		<ol>
			<li>Oczyść poliadenylowane mRNA przy użyciu dostępnych zestawów lub protokołów.
			<ol>
				<li>Dokładnie wstrząśnij, aby ponownie zawiesić każdy z następujących roztworów: 2x roztwór wiążący, kulki polistyrenowe oligo(dT) i roztwór do mycia. Przed użyciem upewnij się, że koraliki oligo(dT) ogrzewają się do temperatury pokojowej.</li>
				<li>Przenieść 120 μl roztworu elucyjnego na preparat do probówki i podgrzać do temperatury 70 °C w bloku grzewczym.</li>
				<li>Pobrać pipetę do 500 μg całkowitego RNA do probówki mikrowirówkowej. W przypadku wody bez nukleaz dostosuj objętość do 250 μl.</li>
				<li>Dodaj 250 μl 2x roztworu wiążącego do całkowitego roztworu RNA i krótko zwiruj, aby wymieszać zawartość.</li>
				<li>Dodaj 15 μl kulek oligo(dT) i dokładnie wymieszaj.</li>
				<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 70 °C przez 3 minuty.</li>
				<li>Wyjmij próbkę z bloku grzewczego i pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 minut.</li>
				<li>Wirować przy 15 000 x g przez 2 min.</li>
				<li>Ostrożnie usunąć supernatant, pozostawiając około 50 μl.</li>
				<li>Dodać 500 μl roztworu myjącego, aby ponownie zawiesić osad przez pipetowanie.</li>
				<li>Odpipetować zawiesinę do zestawu z filtrem wirowym/probówką zbiorczą.</li>
				<li>Wirować przy 15 000 x g przez 2 min. Wyjąć kolumnę z probówki zbiorczej i wyrzucić przepływ. Zwróć kolumnę do probówki zbiorczej.</li>
				<li>Odpipetować 500 μl roztworu myjącego na filtr wirowy.</li>
				<li>Wirować przy 15 000 x g przez 2 min.</li>
				<li>Przenieś filtr wirowy do świeżej probówki zbiorczej.</li>
				<li>Odpipetować 50 μl roztworu elucyjnego podgrzanego do temperatury 70 °C na środek filtra wirowego.</li>
				<li>Inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 70 °C. Wirować przy 15 000 x g przez 1 min.</li>
				<li>Odpipetować dodatkowe 50 μl roztworu elucyjnego podgrzanego do temperatury 70 °C na środek filtra wirowego.</li>
				<li>Powtórz krok 1.2.2.1.18.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Dodać 100 μg/ml glikogenu, 0,1 objętości 3 M buforu octanu sodu (pH 5,2) i 2,5 objętości bezwzględnego etanolu. Wytrącać przez noc w temperaturze -80 °C.</li>
			<li>Wirować przy 15 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
			<li>Umyj granulat 1 ml 75% etanolu. Wirować przy 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć etanol.</li>
			<li>Suszyć na powietrzu przez 3-5 min.</li>
			<li>Dodaj 10 μl wody wolnej od nukleaz, aby rozpuścić osad.</li>
			<li>Przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwalifikacja i kwantyfikacja RNA
	<ol>
		<li>Za pomocą spektrofotometru oznaczyć stężenie RNA, odnotowując absorbancję przy 260 nm i 280 nm. Stosunek A260/A280 powinien wynosić 1,8-2,2.</li>
		<li>Sprawdź jakość próbki RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym0,8% 25, 
		UWAGA: Nienaruszone eukariotyczne całkowite RNA powinno wykazywać intensywne prążki 28S i 18S rRNA. Stosunek intensywności pasma 28S do 18S rRNA dla dobrego preparatu RNA wynosi ~2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Elektroforeza i transfer żelu
UWAGA: Protokoły przygotowania buforu podano w tabeli 1.
<ol>
	<li>Preparat żelu formaldehydowego (1%)
	<ol>
		<li>Wypłucz wszystkie urządzenia do elektroforezy wodą z węglanu dietyloironianu (DEPC).</li>
		<li>Rozpuść 2,5 g agarozy w 215 ml wody DEPC całkowicie w kuchence mikrofalowej.</li>
		<li>Dodać 12,5 ml 10 kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS) i 22,5 ml 37% formaldehydu.</li>
		<li>Wlej go do aparatu do elektroforezy za pomocą grzebienia o grubości 1,5 mm.</li>
		<li>Wyeliminuj bąbelki lub wepchnij je na krawędzie żelu czystym grzebieniem.</li>
		<li>Pozwól żelowi zestalić się w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Wymieszać 1-10 μg całkowitego RNA i 11,3 μl buforu próbki.</li>
		<li>Zmieszać 2 μg markera RNA (1 μg/μl) z 11,3 μl buforu próbki.</li>
		<li>Do próbek z ppkt 2.2.1 i 2.2.2 dodać wodę wolną od nukleaz do całkowitej objętości 16 μl.</li>
		<li>Podgrzewać w temperaturze 60 °C przez 5 minut, a następnie schłodzić na lodzie.</li>
		<li>Zmieszać 16 μl próbki z ppkt 2.2.3 z 4 μl barwnika śledzącego, który zawiera 0,1 μg/μl bromku etydyny na lodzie. 
		UWAGA: Bromek etydyny jest prawdopodobnie teratogenny i toksyczny w przypadku wdychania. Przeczytaj kartę charakterystyki bromku etydyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforezy
	<ol>
		<li>Dodaj 200 ml buforu 10x MOPS do 1,800 ml ddH2O, aby utworzyć bufor do pracy 1x MOPS.</li>
		<li>Użyj bufora do biegania 1x MOPS, aby przepłukać dołki żelu.</li>
		<li>Uruchom żel pod napięciem 20 V przez 5 minut.</li>
		<li>Załaduj próbki RNA do studzienek żelu.</li>
		<li>Przykryj folią, aby uniknąć ekspozycji na światło. Praca pod napięciem 35 V przez około 17 godzin (noc)</li>
		<li>Zbadaj i sfotografuj żel w świetle UV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>przelać
	<ol>
		<li>Pokrój żel, aby usunąć niewykorzystaną porcję.</li>
		<li>Przygotuj 500 ml 10x buforu SSC (250 ml 20x buforu SSC i 250 ml wody DEPC).</li>
		<li>Przemyć żel dwukrotnie 10x buforem SSC przez 20 minut z wytrząsaniem przy 50 obr./min.</li>
		<li>Wytnij 1 arkusz bibuły filtracyjnej wystarczająco duży, aby służył jako bibuła knotowa, która pochłania bufor transferowy z tacy transferowej (Rysunek 1).</li>
		<li>Wytnij 4 kawałki bibuły filtracyjnej do tego samego rozmiaru co żel.</li>
		<li>Wytnij 1 arkusz dodatnio naładowanej membrany nylonowej do tego samego rozmiaru co żel.</li>
		<li>Zaznacz nacięcie na żelu i membranie jako znacznik, aby zapewnić prawidłową orientację.</li>
		<li>Namocz membranę w 2x buforze SSC na 15 minut.</li>
		<li>Wlej 500 ml buforu 10x SSC do tacki transferowej.</li>
		<li>Połóż duży arkusz bibuły filtracyjnej na szklanej płycie i zwilż bibułę filtracyjną buforem transferowym.</li>
		<li>Rozwałkuj bąbelki za pomocą pipety.</li>
		<li>Namocz 2 kawałki wstępnie pociętej bibuły filtracyjnej w buforze transferowym i umieść je na środku bibuły filtracyjnej z kroku 2.4.5. Usuń wszelkie bąbelki.</li>
		<li>Połóż żel górną stroną do dołu na bibule filtracyjnej.</li>
		<li>Połóż membranę na żelu. Wyrównaj nacięcia żelu i membrany.</li>
		<li>Umieść 2 kawałki wstępnie przyciętej bibuły filtracyjnej na wierzchu membrany i zwilż bibułę filtracyjną buforem transferowym.</li>
		<li>Usuń wszelkie bąbelki między warstwami.</li>
		<li>Nałóż folię na żel, aby upewnić się, że ręczniki wchłaniają tylko bufor przechodzący przez żel i membranę.</li>
		<li>Ułóż ręczniki papierowe na bibule filtracyjnej.</li>
		<li>Umieść duży szklany talerz na ręcznikach.</li>
		<li>Umieść ciężarek na wierzchu stosu.</li>
		<li>Przechowywać przez noc, aby umożliwić przeniesienie RNA z żelu do błony.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wykrywanie N 6-metyladenozyny 
<ol>
	<li>Sieciowanie membranowe
	<ol>
		<li>Utrzymuj membranę wilgotną w buforze 2x SSC.</li>
		<li>Umieść 2 arkusze bibuły filtracyjnej zanurzone w 10-krotnym buforze SSC w sieciowniku UV.</li>
		<li>Umieść membranę na bibule filtracyjnej, stroną zaadsorbowaną przez RNA skierowaną do góry.</li>
		<li>Wybierz "tryb automatycznego sieciowania" (120 000 μJ) i naciśnij przycisk "Start", aby rozpocząć naświetlanie.</li>
		<li>Zbadaj membranę i żel za pomocą łapacza obrazu żelu UV, aby potwierdzić transfer RNA z żelu do membrany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunoblotting (Immunoblotting)
	<ol>
		<li>Zablokuj membranę w 5% beztłuszczowym mleku w soli fizjologicznej buforowanej trisem z buforem Tween 20 (TBST) w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.</li>
		<li>Przemyć trzykrotnie buforem TBST przez 15 min.</li>
		<li>Inkubować błonę przez noc w roztworze przeciwciała m6A (N 6-metyloadenozyny) (1:1 000 w 5% buforze TBST z mleka beztłuszczowego) w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć membranę trzykrotnie buforem TBST przez 15 minut.</li>
		<li>Inkubować błonę w sprzężonym z HRP roztworze przeciwciała przeciwko królikowi osła (1:2 000 w 5% buforze TBST z mleka beztłuszczowego) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć membranę trzykrotnie buforem TBST przez 15 minut.</li>
		<li>Nałożyć ulepszone podłoże chemiluminescencyjne (0,125 ml nacm2 membrany).</li>
		<li>Uchwyć chemiluminescencję przy optymalnych ustawieniach imagera cyfrowego, zgodnie z instrukcjami producenta26.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>m6A Kwantyfikacja
	<ol>
		<li>Zmierz względną intensywność chemiluminescencyjną m6A za pomocą oprogramowania ImageJ.
		<ol>
			<li>W menu oprogramowania ImageJ wybierz opcję "Plik", aby otworzyć odpowiedni plik.</li>
			<li>Wybierz narzędzie "Prostokąt" z ImageJ i narysuj ramkę wokół sygnałów.</li>
			<li>Jeśli rybosomalne RNA nie jest przedmiotem eksperymentów, należy unikać prążków rybosomalnego RNA 18S i 28S m6A do obliczeń.</li>
			<li>Kliknij "Command" i "1", aby potwierdzić wybrany pas ruchu.</li>
			<li>Naciśnij "Command" i "3", aby wyświetlić wybraną działkę.</li>
			<li>Kliknij narzędzie "Proste" i narysuj linie, aby oddzielić podzielony na segmenty obszar.</li>
			<li>Kliknij narzędzie "Różdżka", aby zarejestrować pomiary.</li>
			<li>Eksportuj dane.</li>
			<li>Znormalizuj poziomy m6A za pomocą pasma rybosomalnego RNA 18S z barwienia bromkiem etydyny.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thammana, P., Held, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+16S+RNA+during+ribosome+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro.</a> Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).</li>
<li>Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+epitranscriptome%3A+N6-methyladenosine+and+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).</li>
<li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyl-adenosine+%28m6A%29+in+RNA%3A+an+old+modification+with+a+novel+epigenetic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+FTO+in+adipose+tissue+decreases+Angptl4+translation+and+alters+triglyceride+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism.</a> Sci Signal. 8 (407), 127(2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-adenosine+methylation+in+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">N6-adenosine methylation in MiRNAs.</a> PLoS One. 10 (2), 0118438(2015).</li>
<li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+N6-methyladenosine+in+bacterial+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Fustin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-methylation-dependent+RNA+processing+controls+the+speed+of+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock.</a> Cell. 155 (4), 793-806 (2013).</li>
<li>Geula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells.+m6A+mRNA+methylation+facilitates+resolution+of+naive+pluripotency+toward+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. , SREP18874 (2016).</li>
<li>Jia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+in+nuclear+RNA+is+a+major+substrate+of+the+obesity-associated+FTO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO.</a> Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).</li>
<li>Du, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+association+study+of+the+m6A+genes+with+major+depressive+disorder+in+Chinese+Han+population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population.</a> J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+RNA+N6-methyladenosine+and+the+role+of+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).</li>
<li>Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+circadian+rhythms+and+inhibits+the+CLOCK-BMAL1-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription.</a> Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).</li>
<li>Heyn, H., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Adenine+Code+for+DNA%3A+A+Second+Life+for+N6-Methyladenine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine.</a> Cell. 161 (4), 710-713 (2015).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+m%286%29A+Reader+YTHDC1+Regulates+mRNA+Splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing.</a> Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+stop+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+N6-methyladenosine+residues+in+bovine+prolactin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).</li>
<li>Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N6-methyladenosine+in+expression+of+Rous+sarcoma+virus+RNA%3A+analyses+utilizing+immunoglobulin+specific+for+N6-methyladenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nucleic+Acid+Res+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine.</a> Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).</li>
<li>Golovina, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+site-specific+detection+of+m6A+nucleoside+presence+in+RNA+based+on+high-resolution+melting+%28HRM%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis.</a> Nucleic Acids Res. 42 (4), 27(2014).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li>
<li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li>
<li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+Methylated+Cytidine+and+Adenosine+in+Cellular+and+Tissue+RNA+by+Nano-Flow+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+Coupled+with+the+Stable+Isotope-Dilution+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method.</a> Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445(2010).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. 6, 18874(2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+reversible+and+dynamic+N-methyladenosine+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome.</a> Nat Chem Biol. , (2016).</li>
<li>Sanschagrin, S., Yergeau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+16S+ribosomal+RNA+gene+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li>
<li>Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+ribosomal+RNA+for+mosquito+gut+metagenomic+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Mishima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-Northern+Blotting%3A+Detection+of+RNA+Modifications+by+Using+Antibodies+against+Modified+Nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides.</a> PLoS One. 10 (11), 0143756(2015).</li>
<li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA+modifications+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Modyfikacje RNA odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu i fizjologii komórek. Obecna wiedza na temat regulacji, funkcji i homeostazy tych modyfikacji jest nadal badana i poszerzana8. Dlatego potrzebna jest precyzyjna i złota metoda oceny modyfikacji RNA. Zmodyfikowana metoda northern blotting zapewnia precyzyjną kwantyfikację modyfikacji RNA i wyraźne rozgraniczenie modyfikacji w różnych RNA. Chociaż metoda wymaga co najmniej 3 dni, można ją ustandaryzować i stosować w różnych projektach eksperymentalnych. Co więcej, przy użyciu różnych przeciwciał może wykrywać różne modyfikacje RNA27.
Ważne jest, aby oddzielić różne RNA podczas analizy modyfikacji RNA. Rybosomalny RNA stanowi dużą część całkowitej ilości RNA28,29. Wyniki analizy modyfikacji RNA tylko w całkowitym RNA będą reprezentować głównie zmiany rRNA. Metylacja i inne tego typu modyfikacje rRNA mogą potencjalnie maskować zmiany w innych RNA. Dzięki procedurze separacji żelu modyfikacje mRNA i innych małych RNA mogą być dokładniej analizowane.
Mapowanie całego transkryptomu z immunoprecypitacją i sekwencjonowaniem m6A zapewnia szczegółowy wgląd w modyfikację każdego typu RNA22. Dostarcza informacji o konkretnych RNA i rozdzielczości około 80-120 pz. Chociaż m6A-Seq może porównywać modyfikacje między różnymi warunkami eksperymentalnymi, wybór odpowiednich standardów i kontroli dla takich eksperymentów jest trudny18. Immunoprecypitacja jest trudna do odtworzenia, często powoduje znaczne różnice między powtórzeniami. Ponadto m6A-Seq wymaga fragmentacji próbek RNA przed immunoprecypitacją i sekwencjonowaniem30. Proces fragmentacji może potencjalnie wywoływać nadmierne wpływy na pierwotne modyfikacje RNA. Jeśli eksperyment nie wymaga informacji o konkretnym genie, ale wymaga różnych warunków do porównania, obecna metoda zapewnia lepszą wizualizację i kontrolę dla różnych konfiguracji eksperymentalnych. 
Modyfikacja RNA jest ważnym krokiem w regulacji kontroli transkrypcji31. Jednak homeostaza i mechanizmy regulacyjne różnych modyfikacji RNA w różnych sferach fizjologicznych są nadal niejasne. Korzystając z obecnej zmodyfikowanej metody northern blot, można określić ilościowo i porównać różne modyfikacje RNA. Co więcej, zmiany i regulacje modyfikacji RNA mogą być badane bardziej szczegółowo. W przyszłości możliwe będzie również połączenie danych eksperymentalnych zarówno z klasycznego protokołu northern blotting, jak i zmodyfikowanego northern blotting, co zapewni lepszy wgląd w biologię RNA.
Najważniejszym czynnikiem decydującym o powodzeniu zmodyfikowanego protokołu northern blotting jest integralność próbki RNA. RNA z pewną dozą degradacji może dawać dobre wyniki klasycznego northern blot, ale może to potencjalnie mieć znaczący wpływ na zmodyfikowane wyniki northern blot. Modyfikacje RNA w różnych tkankach lub liniach komórkowych mogą się również znacznie różnić. Ważne jest, aby przed wykonaniem ostatecznych eksperymentów przetestować odpowiednie ładunki próbek RNA dla różnych tkanek.
Ponieważ procedury blottingu zostały tradycyjnie nazwane na cześć dr Southern i różnych kierunków geograficznych, proponujemy nazwę "northeastern" blotting dla obecnej techniki.

Dynamiczne i odwracalne modyfikacje RNA odgrywają ważną rolę w homeostazie RNA. Czterdzieści lat temu stwierdzono, że modyfikacje N 6-metyloadenozyny (m6A) są obfite w transkryptomach eukariotycznych1. Pełnią one różne funkcje w informacyjnym RNA (mRNA), rybosomalnym RNA (rRNA), małym jąderkowym RNA, transferowym RNA i mikroRNA2. Modyfikacjem6AmRNA wpływają na ich splicing3, translację4, degradację5 i lokalizację2. Ponadto wpływają na biogenezę rybosomów i funkcję mikroRNA6. Ewolucyjne zachowanie modyfikacji m6A RNA obserwuje się u bakterii jednokomórkowych do wielokomórkowych ludzi7. Określenie ról modyfikacji m6A jest obecnie przedmiotem szeroko zakrojonych badań. Oczekuje się, że wysiłki te dostarczą nowych informacji na temat kontroli transkrypcji. Ostatnie badania pokazują, że inne modyfikacje chemiczne mRNA8 również odgrywają kluczową rolę w metabolizmie RNA. 
Rytmy okołodobowe9, pluripotencja komórek macierzystych10, metabolizm trójglicerydów4, zwłóknienie11, otyłość12 i duża depresja13 to tylko kilka przykładów procesów, w których modyfikacje m6A kontrolują wyniki. Wiele transkryptów genów zegara okołodobowego ma miejsca m6A14. Modulacja metylazy m6A lub demetylazy wywołuje zmiany w okresie okołodobowym15. Mettl3, transferaza m6A, jest regulatorem pluripotencji komórek macierzystych. Niedobór Mettl3 prowadzi do wczesnej śmiertelności zarodka i nieprawidłowego przygotowania linii w stadiumpoimplantacyjnym 10. Niedobór demetylazy m6A związanej z masą tłuszczową i otyłością (FTO), w adipocytach, wpływa na mobilizację kwasów tłuszczowych i masę ciała poprzez posttranskrypcyjną regulację Angptl44. Badania te ujawniają, że m6Anie tylko kontroluje przetwarzanie mRNA, ale także odgrywa kluczową rolę w rozwoju embrionalnym i patofizjologii. Funkcja modyfikacji m6A ma implikacje dla rozważań terapeutycznych w przyszłości.
Dostępnych jest kilka metod pomiaru modyfikacji m6A RNA16-18. Tradycyjnie, chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) są stosowane do badania rozkładu m6A w kilku RNA19,20. Spektrometria mas jest czułym narzędziem do wykrywania modyfikacjim6Aw RNA. Jednak RNA musi zostać wycięte przez RNazę na krótkie fragmenty przed analizą za pomocą spektrometrii mas21. Immunoprecypitacja i sekwencjonowanie metylo-RNA (m6A-Seq)22 immunoprecypituje pofragmentowane RNA przeciwciałami specyficznymi dla m6A i przeprowadza równoległe sekwencjonowanie RNA. Ta metoda generuje krajobrazy m6A dla całego transkryptomu. Mapowanie w wysokiej rozdzielczości sieciowania i immunoprecypitacjim6A w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu (miCLIP) dodatkowo mapuje modyfikacje m6A w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu23. Obie metody dostarczają szczegółowych informacji na temat modyfikacji m6A w całym transkryptomie, z informacjami o specyficznych genach. Jednak kwantyfikacja i standaryzacja w obu metodach są trudne, jeśli eksperymenty wymagają porównania wielu warunków. Co więcej, fragmentacja RNA dla m6A-Seq zmienia oryginalną strukturę RNA, co może wpływać na natywne poziomy m6A. Aby wykryć globalne modyfikacjem6ARNA i ich zmiany w różnych warunkach eksperymentalnych, przedstawiamy metodę, która wykorzystuje zmodyfikowany protokół northern blot. Metoda ta polega na rozdzieleniu RNA według masy cząsteczkowej przy użyciu elektroforezy żelowej18. Ta procedura zapewnia lepszą standaryzację i kwantyfikację dla eksperymentów, które obejmują wiele warunków lub próbek. Dostarcza również specyficznych informacji o modyfikacjim6Adla różnych RNA, niezależnie od tego, czy jest to rRNA, mRNA czy mikroRNA.

<table><tbody><tr><td>Roztwór RNaseZap</td><td>Protokół Ambion</td><td>AM9782</td><td>1.1</td></tr><tr><td>Roztwór odczynnika TRI</td><td>Protokół Ambion</td><td>AM9738</td><td>1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-bromo-3-chloropropan (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td>Protokół 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>JTbaker</td><td>8006</td><td>Protokół 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Protokół 1.2.1.3</td></tr><tr><td>GenElute mRNA Miniprep Kit</td><td>Sigma</td><td>MRN70</td><td>Protokół 1.2.2.1</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td>Protokół 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Fluka</td><td>71183</td><td>Protokół 1.2.2.2</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9930</td><td>Protokół 1.2.2.6</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Protokół 2.1.1</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>JT Baker</td><td>A426</td><td>Protokół 2.1.2</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Protokół 2.1.3</td></tr><tr><td>37% roztwór formaldehydu</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Protokół 2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA, sól disodowa</td><td>JT Baker</td><td>8993</td><td>Protokół 2.1.3 10x Bufor MOPS</td></tr><tr><td>formamid</td><td>Sigma</td><td>F7503</td><td>Protokół 2.2.1</td></tr><tr><td>RNA Marker Millennium</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td>Protokół 2.2.2</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td>Protokół 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>Protokół 2.2.5 barwnik śledzący</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td>Protokół 2.2.5 barwnik śledzący</td></tr><tr><td>Ksylen Cyanol FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>Protokół 2.2.5 barwnik śledzący</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek sodu</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Protokół 2.4.2 20x bufor SSC</td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td>Protokół 2.4.2 20x bufor SSC</td></tr><tr><td>Bibuła Hybond Protokół</td><td>RPN6101M</td><td>GE Healthcare</td><td>2.4.4</td></tr><tr><td>Membrana GE Hybond-N+</td><td>GE Healthcare RPN303B Protokół 2.4.6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td>Protokół 3.1.2</td></tr><tr><td>Gel Catcher 1500</td><td>Technologia ANT</td><td>Gel Catcher 1500</td><td>Protokół 3.1.5</td></tr><tr><td>Anty-m6A (N6-metyloadenozyna)</td><td>Układy synaptyczne</td><td>202003</td><td>Protokół 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd całe Ab</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td>Protokół 3.2.5</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>Protokół 3.2.8</td></tr></tbody></table>

metoda pomiaru modyfikacji rna n 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N 6-metylodenozyna (m6A) modyfikacje RNA są zróżnicowane i wszechobecne wśród eukariontów. Występują w mRNA, rRNA, tRNA i mikroRNA. Ostatnie badania wykazały, że te odwracalne modyfikacje RNA wpływają na splicing, translację, degradację i lokalizację RNA. Wiele procesów fizjologicznych, takich jak rytmy okołodobowe, pluripotencja komórek macierzystych, zwłóknienie, metabolizm trójglicerydów i otyłość, jest również kontrolowanych przez modyfikacje m6A. Immunoprecypitacja/sekwencjonowanie, spektrometria mas i zmodyfikowane northern blotting to tylko niektóre z metod powszechnie stosowanych do pomiaru modyfikacji m6A. W niniejszym artykule przedstawiamy technikę blottingu północno-wschodniego do pomiaru modyfikacji m6A. Obecny protokół zapewnia dobrą separację wielkości RNA, lepszą akomodację i standaryzację dla różnych projektów eksperymentalnych oraz jasne rozgraniczenie modyfikacji m6A w różnych źródłach RNA. Chociaż wiadomo, że modyfikacje m6A mają kluczowy wpływ na fizjologię człowieka w odniesieniu do rytmów okołodobowych i otyłości, ich rola w innych stanach (pato)fizjologicznych jest niejasna. W związku z tym badania nad modyfikacjami m6A mają ogromne możliwości, aby dostarczyć kluczowych informacji na temat fizjologii molekularnej.

Po 14 dniach w normalnej fazie cyklu światło-ciemność, myszy typu dzikiego umieszczono w stałej ciemności. RNA z wątroby pobierano w odstępach 4-godzinnych i analizowano za pomocą zmodyfikowanej metody northern blotting. Wyraźnie wykryto metylację rRNA, mRNA oraz małych RNA (Rycina 2). Porównanie różnych czasów cyklicznych (CT) można dokładnie obliczyć z wykorzystaniem standardu 18S rRNA. Zaobserwowano silną oscylację okołodobową poziomu m6A w rRNA, mRNA oraz małych RNA.
Aby uniknąć zakłóceń powodowanych przez rRNA, można przeprowadzić oczyszczanie RNA poliadenylowanego, zgodnie z krokiem 1.2.2. Po oczyszczaniu rRNA można w znacznym stopniu wyeliminować, co pozwala na lepszą wizualizację innych cząsteczek RNA (Rysunek 3).
<img alt="Schemat Southern blot przedstawiający układ transferu DNA z membraną, żelem i buforem 10X SSC." src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Montaż jednostki transferu do blotowania. Przedstawiono jednostkę transferu kapilarnego do przenoszenia RNA na membranę. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy RNA; analiza modyfikacji m6A, przebieg dobowy, 28S/18S rRNA." src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Rytm dobowy poziomów m6A u myszy C57BL/6J. Rysunek przedstawia blot m6A całkowitego RNA z wątrób myszy typu dzikiego, uśmierconych w pierwszym dniu fazy ciemnej po 14 dniach normalnej fazy światło-ciemność w odstępach 4 h. Ilościowe oznaczenie przeprowadzono, analizując różnicę gęstości obrazu m6A między 18S a 28S rRNA. Zawartość m6A znormalizowano do prążka 18S rRNA z żelu z formaldehydem widocznego na dole. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza metylacji RNA; wynik elektroforezy; RNA całkowite a poliadenylowane; prążki 28S i 18S." src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Bloty m6A z rRNA lub bez rRNA. Przedstawiono reprezentatywne bloty m6A dla RNA całkowitego oraz RNA poliadenylowanego z wątrób myszy typu dzikiego. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">Bufor MOPS 10x (pH 7,0, chronić przed światłem)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">MOPS</td>
			<td>41.85</td>
			<td>g</td>
			<td>0,2 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Octan sodu</td>
			<td>4.1</td>
			<td>g</td>
			<td>0,05 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">EDTA, sól sodowa</td>
			<td>3.7</td>
			<td>g</td>
			<td>0,01 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">woda z DEPC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Suma</td>
			<td>1</td>
			<td>L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Mieszać w temperaturze pokojowej</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="3">bufor 20x SSC (pH 7,0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Chlorek sodu</td>
			<td>175.3</td>
			<td>g</td>
			<td>3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Cytrynian trisodu</td>
			<td>88.3</td>
			<td>g</td>
			<td>0,3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">woda z DEPC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Suma</td>
			<td>1</td>
			<td>L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Mieszać w temperaturze pokojowej, a następnie autoklawować</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">Barwnik śledzący</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">bufor MOPS 10x</td>
			<td>500</td>
			<td>μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Ficoll 400</td>
			<td>0.75</td>
			<td>g</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Błękit bromofenolowy</td>
			<td>0.01</td>
			<td>g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Ksylen cyjanol</td>
			<td>0.01</td>
			<td>g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">woda z DEPC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Suma</td>
			<td>5</td>
			<td>ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Przechowywać w temperaturze -20 °C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="3">woda z DEPC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Rozcieńczenie DEPC w ddH₂O w stosunku 1:10002O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Mieszać przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie autoklawować</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="3">Bufor do próbek (chronić przed światłem)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">bufor MOPS 10x</td>
			<td>200</td>
			<td>μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">37% formaldehyd</td>
			<td>270</td>
			<td>μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Formamid</td>
			<td>660</td>
			<td>μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Przechowywać w temperaturze -20 °C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Bufory i roztwory.

Opisana jest zmodyfikowana metoda northern blot do pomiaru modyfikacji N 6-metylodenozyny (m6A) w RNA. Obecna metoda może wykrywać modyfikacje w różnych RNA i kontrolach w ramach różnych projektów eksperymentalnych.

Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Ogólnym celem zmodyfikowanej techniki northern blotting jest pomiar modyfikacji N6-metyloadenozyny, n6A w RNA oraz wykrywanie modyfikacji w różnych rodzajach RNA. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące roli epigenetyki RNA, takie jak modyfikacje N6-metyloadenozyny. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie skutecznej separacji RNA, lepsza standaryzacja planów doświadczalnych oraz wyraźne wyznaczenie modyfikacji n6A w cząsteczkach RNA.Ta metoda pozwala na uzyskanie wglądu w modyfikacje n6A w RNA i może być również zastosowana do innych modyfikacji RNA przy użyciu różnych przeciwciał detekcyjnych. Aby rozpocząć eksperyment, rozpyl roztwór do dekontaminacji z rybonukleazy na ręczniki papierowe i przetrzyj pipety oraz powierzchnie stołu laboratoryjnego. Namocz ręczniki papierowe w wodzie wolnej od nukleaz i ponownie przetrzyj pipety oraz powierzchnie stołu laboratoryjnego.Przygotować roztwór do izolacji RNA przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza i dodać jeden mililitr roztworu do około 75 miligramów tkanki mysiej. Tkankę należy zhomogenizować za pomocą mieszadła górnego. Następnie dodać 100 mikrolitrów 1-bromo-3-chloropropanu lub BCP na każdy jeden mililitr homogenatu próbki.Energicznie wstrząśnij probówki przez 15 sekund, a następnie przystąp do izolacji całkowitego RNA. Za pomocą spektrofotometru określ stężenie RNA, odnotowując absorbancję przy 260 nanometrach i 280 nanometrach. Sprawdź jakość próbki RNA, wykonując elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym.Opłucz cały sprzęt do elektroforezy wodą z dietylopirokarbonianem lub wodą DEPC. W kolbie Erlenmeyera połącz 2,5 g agarozy, a następnie 215 ml wody DEPC i całkowicie rozpuść mieszaninę w kuchence mikrofalowej. Po rozpuszczeniu roztworu dodaj 12,5 ml 10X buforu MOPS.Do kolby dodaje się 22,5 ml 37% formaldehydu. Następnie roztwór wlewa się do aparatury elektroforetycznej z grzebieniem o grubości 1,5 mm. Używając czystego grzebienia, należy wypchnąć pęcherzyki powietrza na krawędzie żelu.Pozostawić żel do stężenia w temperaturze pokojowej. Następnie, używając wcześniej przygotowanego 1X buforu do elektroforezy MOPS, przepłukać oczka żelu i przeprowadzić wstępny przebieg elektroforezy. Nanieść próbki RNA do oczek żelu, a następnie przeprowadzić elektroforezę.Następnego dnia należy zbadać i sfotografować żel w świetle UV. Aby przygotować transfer, należy wyciąć żel i usunąć nieużywaną część. Przygotuj 500 mililitrów 10X buforu SSC (saline sodium citrate).Przemyj żel dwukrotnie buforem 10X SSC. Wytnij arkusz papieru filtracyjnego wystarczająco duży, aby pokrył żel. Wytnij cztery kawałki papieru filtracyjnego o tym samym rozmiarze co żel.Następnie należy wyciąć arkusz dodatnio naładowanej membrany nylonowej o rozmiarze odpowiadającym rozmiarowi żelu. Na żelu oraz membranie należy zaznaczyć nacięcie, które będzie służyć jako marker zapewniający prawidłową orientację. Membranę należy namoczyć w buforze 2X SSC.Wlej 500 mililitrów buforu 10X SSC do kuwety transferowej. Połóż duży arkusz papieru filtracyjnego na płytce szklanej i zwilż papier filtracyjny buforem do transferu. Następnie za pomocą pipety usuń powstałe pęcherzyki powietrza.Namocz dwa kawałki dociętego papieru filtracyjnego w buforze transferowym i umieść je na środku papieru filtracyjnego. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie połóż żel stroną górną do dołu na papierze filtracyjnym, a na żelu połóż membranę, upewniając się, że wcięcia żelu i membrany są ze sobą wyrównane.Następnie na membranie należy umieścić dwa kawałki wcześniej wyciętego papieru filtracyjnego. Należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się między warstwami. Dookoła żelu należy zastosować folię spożywczą, aby ręczniki papierowe wchłaniały wyłącznie bufor przechodzący przez żel i membranę.Następnie na papierze filtracyjnym ułożyć stos ręczników papierowych. Na wierzchu ręczników położyć większą szklaną płytkę, a na niej obciążnik, i pozostawić RNA do przeniesienia z żelu na membranę przez noc. Po zakończeniu transferu membranę należy przechowywać w wilgotnym stanie w buforze 2X SSC.Namocz dwa arkusze papieru filtracyjnego w buforze 10X SSC, a następnie umieść je w urządzeniu do sieciowania UV (UV cross linker). Upewnij się, że strona, w która wchłonął się RNA, jest skierowana do góry, a następnie połóż membranę na papierze filtracyjnym. Wybierz tryb automatycznego sieciowania i naciśnij przycisk start, aby rozpocząć naświetlanie.Obejrzyj membranę i żel za pomocą detektora obrazów żeli UV, aby potwierdzić transfer RNA z żelu na membranę. Zablokuj membranę w 5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze TBST w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Inkubuj membranę przez noc w roztworze przeciwciał m6A w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia przemyj membranę trzy razy buforem TBST przez 15 minut. Następnie inkubuj membranę w roztworze koniugowanego z HRP przeciwciała osiołczego anty-króliczego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie przemyj membranę trzy razy buforem TBST przez 15 minut.Nanieś wzmocniony substrat do chemiluminescencji. Zarejestruj chemiluminescencję za pomocą obrazownika cyfrowego. Na koniec przystąp do kwantyfikacji m6A i zmierz względną intensywność chemiluminescencji m6A przy użyciu programu Image J. Próbki RNA z wątroby myszy pobierano w odstępach czterogodzinnych i analizowano za pomocą zmodyfikowanej techniki northern blotting.Wyraźnie wykryto metylację rRNAs, mRNAs oraz małych RNA. Reprezentatywne analizy m6A przeprowadzono dla całkowitego RNA oraz RNA bez rRNA z wątrób myszy typu dzikiego. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu czterech dni.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny epigenetyki RNA do eksploracji wpływu na fizjologię człowieka w zakresie rytmu okołodobowego i otyłości.

a-method-for-measuring-rna-n6-methyladenosine-modifications-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj opisujemy protokół charakterystyki biochemicznej enzymu modyfikującego RNA drożdży, Mod5, i omawiamy, jak ten protokół mógłby być zastosowany do innych enzymów modyfikujących RNA.

Test in vitro w celu wykrycia aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA jest metodą opartą na przeciwciałach, używaną do wzbogacania metylowanych fragmentów RNA. W połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem prowadzi to do identyfikacji transkryptów przenoszących modyfikację m5C.

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA do badania modyfikacji m5C u Arabidopsis

Tu opisano jest precyzyjna i możliwa do powtórzenia metoda ilościowego oceny nukleozydów/nukleotydów in vivo w roślinach. Ta metoda wykorzystuje HPLC-MS/MS.

Przygotowanie próbki roślinnej do pomiaru zawartości nukleozydów/nukleotydów za pomocą HPLC-MS/MS

Rola modyfikacji RNA w infekcjach wirusowych dopiero zaczyna być badana i może uwypuklić nowe mechanizmy interakcji wirus-gospodarz. W tej pracy przedstawiamy proces badania modyfikacji RNA m6A i m5C w kontekście infekcji wirusowych.

Badanie epitranskryptomów m6A i m5C po infekcji wirusowej: przykład z HIV

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie i ilościowy pomiar wolnych i związanych z białkami argininy i metylo-arginin za pomocą spektroskopii 1H-NMR.

Badanie metylomu argininy za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Potranskrypcyjne modyfikacje RNA reprezentują niedostatecznie zbadaną warstwę regulacji translacji, która ostatnio została powiązana z plastycznością ośrodkowego układu nerwowego. W tym miejscu opisano przygotowanie próbki i podejście oparte na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas w celu jednoczesnej charakterystyki licznych modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach.

Charakterystyka modyfikacji RNA w pojedynczych neuronach za pomocą spektrometrii mas

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Przedstawiamy tutaj protokół półilościowej oceny globalnych poziomów M⁶A za pomocą punktowego blotu. Całkowite RNA jest ekstrahowane, denaturowane, naznaczane na nylonowej membranie, badane przeciwciałem przeciw m⁶A i wizualizowane za pomocą chemiluminescencji. Intensywność sygnału, zmierzona za pomocą analizy szarości ImageJ, odzwierciedla względną obfitość metylacji, zapewniając powtarzalny przepływ pracy w badaniach.

Test punktowy do wykrywania globalnych poziomów modyfikacji N 6-metyladenozyny RNA

Protokół ten oferuje szczegółowe podejście do oceny poziomów modyfikacji m6Aspecyficznego RNA za pomocą MeRIP-qPCR.

Test MeRIP-qPCR do wykrywaniapoziomówmodyfikacji specyficznego RNA w komórkach osteosarcoma

Poznaj zmodyfikowaną metodę northern blotting do pomiaru modyfikacji m6A w RNA z tkanek myszy. Technika umożliwia wykrywanie metylacji w rRNA, mRNA i małych RNA, wspierając badania nad epigenetyką RNA.

Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

Przeglądaj więcej filmów