Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

Ogólnym celem zmodyfikowanej techniki northern blotting jest pomiar modyfikacji N6-metyloadenozyny, n6A w RNA oraz wykrywanie modyfikacji w różnych rodzajach RNA. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące roli epigenetyki RNA, takie jak modyfikacje N6-metyloadenozyny. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie skutecznej separacji RNA, lepsza standaryzacja planów doświadczalnych oraz wyraźne wyznaczenie modyfikacji n6A w cząsteczkach RNA.

Ta metoda pozwala na uzyskanie wglądu w modyfikacje n6A w RNA i może być również zastosowana do innych modyfikacji RNA przy użyciu różnych przeciwciał detekcyjnych. Aby rozpocząć eksperyment, rozpyl roztwór do dekontaminacji z rybonukleazy na ręczniki papierowe i przetrzyj pipety oraz powierzchnie stołu laboratoryjnego. Namocz ręczniki papierowe w wodzie wolnej od nukleaz i ponownie przetrzyj pipety oraz powierzchnie stołu laboratoryjnego.

Przygotować roztwór do izolacji RNA przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza i dodać jeden mililitr roztworu do około 75 miligramów tkanki mysiej. Tkankę należy zhomogenizować za pomocą mieszadła górnego. Następnie dodać 100 mikrolitrów 1-bromo-3-chloropropanu lub BCP na każdy jeden mililitr homogenatu próbki.

Energicznie wstrząśnij probówki przez 15 sekund, a następnie przystąp do izolacji całkowitego RNA. Za pomocą spektrofotometru określ stężenie RNA, odnotowując absorbancję przy 260 nanometrach i 280 nanometrach. Sprawdź jakość próbki RNA, wykonując elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym.

Opłucz cały sprzęt do elektroforezy wodą z dietylopirokarbonianem lub wodą DEPC. W kolbie Erlenmeyera połącz 2,5 g agarozy, a następnie 215 ml wody DEPC i całkowicie rozpuść mieszaninę w kuchence mikrofalowej. Po rozpuszczeniu roztworu dodaj 12,5 ml 10X buforu MOPS.

Do kolby dodaje się 22,5 ml 37% formaldehydu. Następnie roztwór wlewa się do aparatury elektroforetycznej z grzebieniem o grubości 1,5 mm. Używając czystego grzebienia, należy wypchnąć pęcherzyki powietrza na krawędzie żelu.

Pozostawić żel do stężenia w temperaturze pokojowej. Następnie, używając wcześniej przygotowanego 1X buforu do elektroforezy MOPS, przepłukać oczka żelu i przeprowadzić wstępny przebieg elektroforezy. Nanieść próbki RNA do oczek żelu, a następnie przeprowadzić elektroforezę.

Następnego dnia należy zbadać i sfotografować żel w świetle UV. Aby przygotować transfer, należy wyciąć żel i usunąć nieużywaną część. Przygotuj 500 mililitrów 10X buforu SSC (saline sodium citrate).

Przemyj żel dwukrotnie buforem 10X SSC. Wytnij arkusz papieru filtracyjnego wystarczająco duży, aby pokrył żel. Wytnij cztery kawałki papieru filtracyjnego o tym samym rozmiarze co żel.

Następnie należy wyciąć arkusz dodatnio naładowanej membrany nylonowej o rozmiarze odpowiadającym rozmiarowi żelu. Na żelu oraz membranie należy zaznaczyć nacięcie, które będzie służyć jako marker zapewniający prawidłową orientację. Membranę należy namoczyć w buforze 2X SSC.

Wlej 500 mililitrów buforu 10X SSC do kuwety transferowej. Połóż duży arkusz papieru filtracyjnego na płytce szklanej i zwilż papier filtracyjny buforem do transferu. Następnie za pomocą pipety usuń powstałe pęcherzyki powietrza.

Namocz dwa kawałki dociętego papieru filtracyjnego w buforze transferowym i umieść je na środku papieru filtracyjnego. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie połóż żel stroną górną do dołu na papierze filtracyjnym, a na żelu połóż membranę, upewniając się, że wcięcia żelu i membrany są ze sobą wyrównane.

Następnie na membranie należy umieścić dwa kawałki wcześniej wyciętego papieru filtracyjnego. Należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się między warstwami. Dookoła żelu należy zastosować folię spożywczą, aby ręczniki papierowe wchłaniały wyłącznie bufor przechodzący przez żel i membranę.

Następnie na papierze filtracyjnym ułożyć stos ręczników papierowych. Na wierzchu ręczników położyć większą szklaną płytkę, a na niej obciążnik, i pozostawić RNA do przeniesienia z żelu na membranę przez noc. Po zakończeniu transferu membranę należy przechowywać w wilgotnym stanie w buforze 2X SSC.

Namocz dwa arkusze papieru filtracyjnego w buforze 10X SSC, a następnie umieść je w urządzeniu do sieciowania UV (UV cross linker). Upewnij się, że strona, w która wchłonął się RNA, jest skierowana do góry, a następnie połóż membranę na papierze filtracyjnym. Wybierz tryb automatycznego sieciowania i naciśnij przycisk start, aby rozpocząć naświetlanie.

Obejrzyj membranę i żel za pomocą detektora obrazów żeli UV, aby potwierdzić transfer RNA z żelu na membranę. Zablokuj membranę w 5% roztworze mleka odtłuszczonego w buforze TBST w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Inkubuj membranę przez noc w roztworze przeciwciał m6A w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia przemyj membranę trzy razy buforem TBST przez 15 minut. Następnie inkubuj membranę w roztworze koniugowanego z HRP przeciwciała osiołczego anty-króliczego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie przemyj membranę trzy razy buforem TBST przez 15 minut.

Nanieś wzmocniony substrat do chemiluminescencji. Zarejestruj chemiluminescencję za pomocą obrazownika cyfrowego. Na koniec przystąp do kwantyfikacji m6A i zmierz względną intensywność chemiluminescencji m6A przy użyciu programu Image J. Próbki RNA z wątroby myszy pobierano w odstępach czterogodzinnych i analizowano za pomocą zmodyfikowanej techniki northern blotting.

Wyraźnie wykryto metylację rRNAs, mRNAs oraz małych RNA. Reprezentatywne analizy m6A przeprowadzono dla całkowitego RNA oraz RNA bez rRNA z wątrób myszy typu dzikiego. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu czterech dni.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny epigenetyki RNA do eksploracji wpływu na fizjologię człowieka w zakresie rytmu okołodobowego i otyłości.