Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka
11 listopada 2016
Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.
Ogólnym celem tej procedury jest równoległa ocena bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich pierwotnych komórek endokrynnych hodowanych i synchronizowanych en vitro. Metoda ta może pomóc w zbadaniu czasowego wzorca wydzielania komórek i tego, jak może być ono regulowane przez autonomiczne zegary okołodobowe komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam monitorować okołodobowe lucyferyny jako aktywność reporterową i jednocześnie zbierać pożywkę odpływową do pomiaru poziomu wydzielanych hormonów i miokin. Aby wprowadzić okołodobowe reportery bioluminescencji do komórek pierwotnych za pomocą transdukcji lentiwirusa, najpierw przenieś 3,5 cm szalki Petriego zawierające ludzkie mioblasty przy zbiegu od 30% do 50% do komory laminarnej. Zastąp ludzką pożywkę mioblastową 2 ml pożywki wzrostowej. Następnie przenieś pierwotną hodowlę komórkową, pipetując roztwór lentiwirusa do naczynia, aby uzyskać wielokrotność infekcji równą trzech. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych. Zmień podłoże następnego dnia. Aby uzyskać synchronizację en vitro, dodaj 10 mikromolowych aktywatorów cyklazy adenylowej w 2 ml pożywki na 3,5 cm szalki Petriego zawierającej wcześniej transfekowane komórki pierwotne. Inkubować komórki przez 60 minut w temperaturze 37
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje metody monitorowania okołodobowej bioluminescencji równolegle z aktywnością wydzielniczą ludzkich komórek wysepek trzustkowych oraz pierwotnych miotub). Podejście to obejmuje lentiwirusową dostawę genu reporterowego rdzenia zegara biologicznego (lucyferazy), a następnie synchronizację in vitro i ciągłą perifuzję komórek w celu zbierania pożywki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Chronobiologia
Wstęp
- Rytmy okołodobowe odgrywają kluczową rolę w funkcjach komórkowych.
- Monitorowanie bioluminescencji może dostarczyć informacji na temat aktywności komórkowej.
- Ludzkie komórki wysepek trzustkowych są niezbędne do sekrecji insuliny.
- Pierwotne miotuby są ważne dla badania fizjologii mięśni.
Cel badania
- Zbadanie związku między rytmami okołodobowymi a aktywnością wydzielniczą.
- Opracowanie metody monitorowania funkcji komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Pogłębienie wiedzy na temat procesów metabolicznych w komórkach ludzkich.
Zastosowane metody
- Lentiwirusowa dostawa genów w celu ekspresji reporterowej lucyferazy.
- Synchronizacja kultur komórkowych in vitro.
- Ciągła perifuzja w celu zbierania pożywki.
- Pomiar bioluminescencji do oceny rytmów okołodobowych.
Główne wyniki
- Pomyślne monitorowanie dobowej bioluminescencji w ludzkich komórkach wysepek trzustkowych.
- Wykazanie aktywności wydzielniczej pierwotnych miotub.
- Ustanowienie niezawodnej metody badania rytmów komórkowych.
- Dostarczenie informacji na temat zależności między biologią dobową a funkcją komórkową.
Wnioski
- Badanie oferuje nowatorskie podejście do monitorowania aktywności komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia wpływu rytmów okołodobowych na metabolizm.
- Potencjalne zastosowania w badaniach nad cukrzycą oraz w fizjologii mięśni.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego oraz sekrecji hormonów w pierwotnych hodowlach komórek ludzkich umożliwia bezpośrednią analizę regulacji czasowej w ludzkich układach hormonalnych i mięśniowych. Podejście to zwiększa wiarygodność predykcyjną walidacji celu poprzez powiązanie molekularnych oscylatorów okołodobowych z funkcjonalnymi produktami wydzielniczymi. Integracja tych pomiarów na etapie odkrywania wspiera optymalizację ryzyka w rozwoju programów metabolicznych i chronobiologicznych w całym portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez korelację aktywności genów zegarowych z wydzielaniem hormonów i miokin w pierwotnych ludzkich komórkach.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez zaburzanie kluczowych genów zegarowych i kwantyfikację wynikających z tego efektów sekrecyjnych.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze szlaków dla celów metabolicznych i endokrynnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane, zsynchronizowane systemy komórek pierwotnych w celu opracowania wiarygodnych testów.
- Zapewnia ilościowe, rozdzielone w czasie odczyty zarówno ekspresji genów, jak i aktywności wydzielniczej.
- Umożliwia powtarzalną ocenę wpływu związków lub perturbacji genetycznych na wyniki regulowane przez rytm okołodobowy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników in vitro z istotną dla choroby fizjologią człowieka poprzez wykorzystanie pierwotnych komórek wysepek trzustkowych i mięśniowych.
- Wspiera translacyjne odkrywanie biomarkerów poprzez powiązanie zaburzeń zegara molekularnego z funkcjonalnymi fenotypami wydzielniczymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej w badaniach nad metabolizmem i chronobiologią.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesną fazę odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących regulacji okołodobowej w ludzkich komórkach pierwotnych, co wspiera zarówno walidację celów terapeutycznych, jak i ciągłość translacyjną.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia bezpośrednie badanie funkcji genów okołodobowych oraz ich wpływu na szlaki wydzielnicze.
- Przesiewanie: Zapewnia zsynchronizowane, gotowe do analizy modele pierwotnych komórek z ilościowymi wynikami do oceny związków.
- Analityka: Generuje rozdzielone w czasie dane dotyczące bioluminescencji i sekrecji, umożliwiając rzetelne porównanie statystyczne pomiędzy różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy zaburzenia zegara molekularnego z istotnymi dla chorób fenotypami wydzielniczymi w ludzkich komórkach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do oceny regulacji okołodobowej w różnych typach pierwotnych komórek i celach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje długoterminowe, równoległe przepływy pracy pomiarowej w pierwotnych komórkach ludzkich.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez powiązanie wyników molekularnych i funkcjonalnych w układach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów z zakresu metabolizmu i chronobiologii z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu transdukcji lentiwirusowej, hodowli komórek pierwotnych oraz pomiaru bioluminescencji.
- Wymagany jest dostęp do zsynchronizowanych systemów perfuzji oraz czułych testów na hormony/miokiny.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności gromadzenia danych w czasie.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych typów komórek pierwotnych lub punktów końcowych sekrecji.
- Dla każdej aplikacji należy zweryfikować stabilność reportera oraz długoterminową hodowlę.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
