Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka
11 listopada 2016
Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.
Ogólnym celem tej procedury jest równoległa ocena bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich pierwotnych komórek endokrynnych hodowanych i synchronizowanych en vitro. Metoda ta może pomóc w zbadaniu czasowego wzorca wydzielania komórek i tego, jak może być ono regulowane przez autonomiczne zegary okołodobowe komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam monitorować okołodobowe lucyferyny jako aktywność reporterową i jednocześnie zbierać pożywkę odpływową do pomiaru poziomu wydzielanych hormonów i miokin. Aby wprowadzić okołodobowe reportery bioluminescencji do komórek pierwotnych za pomocą transdukcji lentiwirusa, najpierw przenieś 3,5 cm szalki Petriego zawierające ludzkie mioblasty przy zbiegu od 30% do 50% do komory laminarnej. Zastąp ludzką pożywkę mioblastową 2 ml pożywki wzrostowej. Następnie przenieś pierwotną hodowlę komórkową, pipetując roztwór lentiwirusa do naczynia, aby uzyskać wielokrotność infekcji równą trzech. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych. Zmień podłoże następnego dnia. Aby uzyskać synchronizację en vitro, dodaj 10 mikromolowych aktywatorów cyklazy adenylowej w 2 ml pożywki na 3,5 cm szalki Petriego zawierającej wcześniej transfekowane komórki pierwotne. Inkubować komórki przez 60 minut w temperaturze 37
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje metody monitorowania okołodobowej bioluminescencji równolegle z aktywnością wydzielniczą ludzkich komórek wysepek trzustkowych oraz pierwotnych miotub). Podejście to obejmuje lentywiralną transfekcją genu reporterowego rdzenia zegara biologicznego (lucyferazy), a następnie synchronizację in vitro i ciągłą perfuzję komórek w celu zbierania pożywki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Chronobiologia
Wprowadzenie
- Rytmy okołodobowe odgrywają kluczową rolę w funkcjach komórkowych.
- Monitorowanie bioluminescencji może dostarczyć informacji na temat aktywności komórkowej.
- Ludzkie komórki wysepek trzustkowych są niezbędne dla wydzielania insuliny.
- Pierwotne miotuby są ważne dla badania fizjologii mięśni.
Cel badania
- Zbadanie związku między rytmami okołodobowymi a aktywnością wydzielniczą.
- Opracowanie metody monitorowania funkcji komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Pogłębienie zrozumienia procesów metabolicznych w komórkach ludzkich.
Zastosowane metody
- Lentiwirusowa dostawa genów dla ekspresji reportera lucyferazy.
- Synchronizacja kultur komórkowych in vitro.
- Ciągła perfuzja w celu zbierania pożywki.
- Pomiar bioluminescencji do oceny rytmów okołodobowych.
Główne wyniki
- Skuteczny monitoring okołodobowej bioluminescencji w ludzkich komórkach wysepek trzustkowych.
- Wykazanie aktywności wydzielniczej pierwotnych miotub.
- Opracowanie niezawodnej metody badania rytmów komórkowych.
- Przedstawienie wniosków dotyczących współzależności między biologią okołodobową a funkcją komórkową.
Wnioski
- Badanie oferuje nowatorskie podejście do monitorowania aktywności komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia wpływu rytmów okołodobowych na metabolizm.
- Potencjalne zastosowania w badaniach nad cukrzycą i fizjologią mięśni.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych kulturach ludzkich komórek umożliwia bezpośrednią analizę regulacji czasowej w ludzkich układach endokrynnych i mięśniowych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną podczas walidacji celów terapeutycznych poprzez powiązanie molekularnych oscylatorów okołodobowych z funkcjonalnymi efektami wydzielniczymi. Integracja tych pomiarów na etapie odkrywania wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie programów z zakresu metabolizmu i chronobiologii w całym portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez korelację aktywności genów zegarowych z sekrecją hormonów i miokin w pierwotnych ludzkich komórkach.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez zaburzanie kluczowych genów zegarowych i kwantyfikację wynikających z tego efektów sekrecyjnych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze ścieżek dla celów metabolicznych i endokrynnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Umożliwia stworzenie zwalidowanych, zsynchronizowanych systemów pierwotnych komórek do stabilnego opracowywania testów.
- Zapewnia ilościowe, rozdzielone w czasie odczyty zarówno ekspresji genów, jak i aktywności wydzielniczej.
- Umożliwia powtarzalną ocenę wpływu związków lub perturbacji genetycznych na wyniki regulowane przez rytm okołodobowy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie wyników in vitro z fizjologią człowieka istotną dla przebiegu choroby dzięki zastosowaniu pierwotnych komórek wysp i mięśni.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie zaburzeń zegara molekularnego z funkcjonalnymi fenotypami wydzielniczymi.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną w badaniach nad metabolizmem i chronobiologią.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsza metoda łączy etap wczesnego odkrywania z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących regulacji okołodobowej w ludzkich komórkach pierwotnych, co wspiera zarówno walidację punktów uchwytu, jak i ciągłość translacyjną.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia bezpośrednie testowanie funkcji genów okołodobowych oraz ich wpływu na szlaki wydzielnicze.
- Przesiewanie: Zapewnia zsynchronizowane, gotowe do analizy modele pierwotnych komórek z ilościowymi wynikami służącymi do oceny związków.
- Analityka: Generuje rozdzielone w czasie dane o bioluminescencji i sekrecji, co pozwala na rzetelne porównania statystyczne między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy zaburzenia zegara molekularnego z fenotypami wydzielniczymi istotnymi dla chorób w komórkach ludzkich.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do oceny regulacji okołodobowej w różnych typach pierwotnych komórek i celach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstw
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje długoterminowe, równoległe przepływy pracy pomiarowej w pierwotnych komórkach ludzkich.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie wyników molekularnych i funkcjonalnych w systemach istotnych dla danej choroby.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów z zakresu metabolizmu i chronobiologii z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie transdukcji lentiwirusowej, hodowli pierwotnych komórek oraz pomiarów bioluminescencji.
- Niezbędny jest dostęp do zsynchronizowanych systemów perfuzji oraz czułych testów na hormony/miokiny.
- Konieczna jest standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności zbierania danych w serii czasowej.
- Możliwa jest potrzeba adaptacji metody dla różnych typów pierwotnych komórek lub punktów końcowych sekrecji.
- Dla każdego zastosowania należy zwalidować stabilność długoterminowej hodowli i reportera.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
