Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych
2 listopada 2016
Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.
Ogólnym celem tego podejścia mikrochirurgicznego jest stworzenie pętli tętniczo-żylnej do inżynierii tkanek aksjalnie unaczynionych i transplantowalnych oraz analizy unaczynienia in vivo oraz w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Dzięki tej metodzie możemy wykorzystać własne organizmy jako żywe bioreaktory do generowania różnych rodzajów aksjalnie unaczynionych tkanek dostosowanych do indywidualnych potrzeb pacjenta. Główną zaletą tej techniki jest to, że wygenerowana tkanka może zostać przeszczepiona wraz z dostępem naczyniowym i połączona z lokalnymi naczyniami po stronie biorcy, co zapewnia natychmiastowe dostarczanie tlenu i składników odżywczych.
Oprócz badań nad inżynierią tkankową, metoda ta może dostarczyć wglądu w procesy angiostenozy w żywym organizmie. Może ona być również zastosowana w sytuacjach patologicznych, takich jak angiogeneza nowotworowa. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na wysoką złożoność zabiegu chirurgicznego, takiego jak mikroanastomoza naczynia podmilimetrowego.
Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zetknęliśmy się z przypadkami klinicznymi z dużymi ubytkami tkanek, które wymagały przeszczepienia unaczynionej tkanki autologicznej, co wiązało się ze znacznym ograniczeniem ruchomości po stronie dawcy. Po potwierdzeniu prawidłowego znieczulenia, zważ szczura w celu obliczenia dawek leków. Następnie zastosuj maść do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu podczas znieczulenia.
Po podaniu leków przeciwbólowych i antybiotyków umieść szczura na podkładce grzewczej i podawaj izofluran w sposób ciągły. Następnie ponownie potwierdź poziom znieczulenia, wykonując test ucisku palca u nogi. Jeśli to możliwe, użyj również pulsoksymetrii, aby sprawdzić poziom znieczulenia szczura.
Następnie należy ogolić wewnętrzne strony kończyn tylnych. Po tym czasie należy zdezynfekować obszar operacyjny, stosując naprzemienne przemywanie betadyną i alkoholem. Następnie należy rozsunąć kończyny tylne i unieruchomić je za pomocą taśmy klejącej.
Na koniec umieść szczura pod mikroskopem chirurgicznym i przykryj go sterylną draperią. Przeprowadź operację zgodnie z procedurami sterylnymi. Za pomocą skalpela wykonaj podłużne nacięcie skóry w środkowej części lewego uda, od górnej części kolana do pachwiny.
Następnie, używając nożyczek sekcyjnych i mikropincety, przetnij tkankę podskórną i powięź w warstwach o długości około trzech centymetrów. Przerwij czynność, gdy wiązka naczyniowa uda zostanie odsłonięta od tętnicy miednicznej w pachwinie aż do kolana. Następnie, używając nożyczek do tkanek tłuszczowych i mikropincety, odseparuj naczynia i usuń tkankę tłuszczową.
W razie potrzeby koaguluj odnogi boczne za pomocą koagulacji elektrycznej. Po zakończeniu przykryj pole operacyjne wilgotnym kompresem i powtórz procedurę na prawej stronie szczura. Po symetrycznym wykonaniu pierwszej procedury przystąp do pobrania przeszczepu żylnego.
Najpierw należy podwiązać prawą żyłę udową, stosując koagulację elektryczną na końcach proksymalnym i dystalnym, aby uzyskać przeszczep o długości około 1 do 1,5 cm. Następnie należy usunąć przeszczep żylny za pomocą mikropincety. Do rozszerzenia otworu przeszczepu żylnego należy użyć rozszerzacza do naczyń.
Następnie przepłucz przeszczep żylny roztworem heparyny za pomocą kaniuli irygacyjnej. Przenieś przepłukany przeszczep na lewe udo i przykryj pole po prawej stronie wilgotnym kompresem. Następnie podwiąż żyłę udową po lewej stronie, proksymalnie w okolicy pachwinowej, używając mikroclampa naczyniowego.
Następnie należy koagulować żyłę udową dystalnie, w górnej części kolana, przed rozgałęzieniem. W celu wykonania anastomozy należy połączyć proksymalny koniec przeszczepu żylnego z proksymalnym końcem żyły, stosując technikę szycia koniec-do-końca przy użyciu nici 11-0. Rozpocznij od założenia dwóch pierwszych szwów w pozycjach na godzinie 12 i godzinie 6.
Następnie nałóż od dwóch do trzech dodatkowych szwów pomiędzy tymi punktami od strony przedniej. Potem nałóż od dwóch do trzech kolejnych szwów od strony tylnej. Anastomoza naczyń pętli jest najbardziej krytycznym etapem protokołu.
Ważne jest, aby szwy zostały wykonane jak najdokładniej, aby zminimalizować ryzyko zamknięcia pętli naczyniowych. Następnie podwiąż tętnicę udową za pomocą zacisku naczyniowego mikro i zastosuj koagulację elektroniczną, analogicznie do podwiązania żyły udowej. Przed kontynuacją upewnij się, że naczynia w pętlach nie są skręcone.
Następnie wykonaj anastomozę dystalnego końca przeszczepu żylnego z proksymalnym końcem tętnicy, stosując tę samą technikę szwu, która została zaprezentowana wcześniej. Po wykonaniu drugiej anastomozy podaj dożylnie 25 iu heparyny. Teraz upewnij się, że naczynia pętlowe nie są skręcone, a następnie zdejmij zaciski.
Obserwuj pętlę przez około pięć minut, sprawdzając szczelność i drożność. W przypadku drożności pętla zwiększy swoją objętość, a puls tętnicy będzie widoczny. Podczas obserwacji aplikuj kroplami papawerynę na naczynia, aby zapobiec skurczom naczyniowym.
Następnie należy wstępnie napełnić komorę implantacyjną pierwszą połową mieszaniny macierzy, około pół mililitra. Potem wprowadź pętlę do komory implantacyjnej. Zamknij wejście do komory dwoma skrzepami fibryny i napełnij komorę drugą połową mieszaniny macierzy, tak aby całkowita objętość wyniosła jeden mililitr.
Następnie przymocuj komorę do uda, zamknij ją pokrywką i zabezpiecz pokrywkę niewchłanialną szyną 6-0. Następnie przymocuj komorę implantacyjną do uda dodatkową niewchłanialną szyną 6-0. Wszelkie krwawienie zatamuj za pomocą koagulacji elektrycznej.
Na koniec zamknij skórę za pomocą wchłanialnych szwów 4-0 i pokryj ranę sprayem aluminiowym. W celu inżynierii tkanki kostnej w modelu pętli tętniczo-żylnej (A-V) u szczurów wszczepiono szereg różnych substytutów kości. Unaczynienie obserwowano przy użyciu mikrotomografii komputerowej 3D.
Przedwaskularyzacja przetworzonej macierzy kostnej gąbczastej bydlęcej przez sześć tygodni doprowadziła do lepszego przeżycia wstrzykniętych osteoblastów. Pętle zostały pobrane, przekrojone i wybarwione w różnych punktach czasowych po implantacji. Na przykład barwienie H and E wykazało, że zastosowanie substytutu kostnego z hydroksyapatytu i beta-fosforanu trójwapniowego z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi doprowadziło do powstania wielu połączeń naczyniowych w ciągu sześciu tygodni.
Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje od pięciu do sześciu godzin. Zgodnie z tą procedurą można implantować szeroką gamę różnych czynników komórkowych lub przeciwciał w celu zbadania wielu różnych stanów chorobowych. Technika ta sprawdza się również w modelu pętli żylnej u owiec (dużych zwierząt).
Dzięki temu badacze będą mogli wytwarzać unaczynione tkanki w dużych ilościach istotnych klinicznie. Model ten może stworzyć możliwość badania unaczynienia w warunkach patologicznych. Przykładowo, można by badać wpływ różnych czynników wzrostu i komórek podczas tworzenia sieci naczyń nowotworowych
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje mikrochirurgiczne podejście do wytwarzania pętli tętniczo-żylnej (AV), która służy jako model do analizy unaczynienia in vivo. Technika ta jest przydatna w badaniu angiogenezy oraz w inżynierii tkanek przeszczepialnych z unaczynieniem osiowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Inżynieria tkankowa
- Biologia naczyń krwionośnych
Wprowadzenie
- Model pętli AV umożliwia badanie unaczynienia w kontrolowanym środowisku.
- Metoda ta pozwala na wykorzystanie organizmu pacjenta jako bioreaktora do regeneracji tkanek.
- Zapewnia ona natychmiastowy dostęp naczyniowy w celu dostarczania tlenu i składników odżywczych.
- Można dzięki niej uzyskać wiedzę na temat angiogenezy oraz stanów patologicznych, takich jak nowotwory.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia tkanek unaczynionych.
- Analiza procesów unaczynienia w żywych organizmach.
- Badanie złożoności angiogenezy w stanie zdrowia i choroby.
Zastosowane metody
- Techniki mikrochirurgiczne w tworzeniu pętli tętniczo-żylnej (AV).
- Mikroanastomoza naczyń o średnicy poniżej 1 mm.
- Analiza unaczynienia in vivo.
- Zastosowanie modelu do badania angiogenezy nowotworowej.
Główne wyniki
- Pętla AV skutecznie wspiera inżynierię unaczynioną tkankowo.
- Bezpośrednie połączenie z lokalnymi naczyniami poprawia dostawę składników odżywczych.
- Uzyskano wgląd w procesy angiostenozy.
- Metoda ta wykazała potencjał w zakresie spersonalizowanej inżynierii tkankowej.
Wnioski
- To podejście mikrochirurgiczne stanowi cenne narzędzie w badaniach naczyniowych.
- Umożliwia ono inżynierię tkanek do transplantacji, dostosowanych do indywidualnych potrzeb.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres jego zastosowań w stanach patologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model pętli tętniczo-żylnej (AV) zapewnia kontrolowane środowisko in vivo do badania angiogenezy i tworzenia unaczynionej tkanki, odpowiadając na krytyczną potrzebę w badaniach przedklinicznych w zakresie powtarzalnych modeli unaczynienia. Dzięki możliwości odizolowania procesów naczyniowych od wpływów systemowych, model ten wspomaga mechanistyczną weryfikację bezpieczeństwa i skuteczności kandydatów pro-angiogennych oraz anty-angiogennych. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i identyfikacji wiodących cząsteczek w zastosowaniach terapeutyki naczyniowej oraz medycyny regeneracyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych ze szlakami angiogennymi i antyangiogennymi w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowany model do funkcjonalnej walidacji celów poprzez bezpośrednią wizualizację tworzenia sieci naczyń.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez generowanie ilościowych danych o naczyniowości w celu zredukowania niepewności mechanistycznej.
Przesiew i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane unaczynione układy biologiczne do późniejszego screeningu związków i analizy biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki izolowanemu mikrośrodowisku i kontrolowanej komorze implantacyjnej.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w wielu warunkach eksperymentalnych poprzez zmianę macierzy, komórek i czynników wzrostu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera inżynierię unaczynionych tkanek, które mogą zostać przeszczepione i połączone mikrochirurgicznie z naczyńmi gospodarza w celu natychmiastowej perfuzji.
- Model przedkliniczny: Umożliwia ocenę konstruktów inżynierii tkankowej w systemie istotnym dla danej choroby przed rozpoczęciem badań na większych zwierzętach.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji niezbędnych do podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ocenę integracji naczyniowej oraz przeżywalności wszczepionych komórek lub tkanek.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model pętli AV wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu, przez identyfikację wiodących związków, aż po ocenę przedkliniczną, szczególnie w programach dotyczących biologii naczyniowej i inżynierii tkankowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie wizualizacji angiogenezy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania 3D i immunohistochemii.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testową i wyniki ilościowe poprzez mierzalną gęstość naczyniową oraz perfuzję w izolowanej komorze pętlowej.
- Analityka: Dostarcza wyników statystycznych z morfometrii naczyniowej i parametrów perfuzji, co pozwala na analizę porównawczą różnych warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez generowanie przeszczepialnych, uprzednio unaczynionych tkanek z natychmiastowym dostępem naczyniowym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma do badania różnych modulatorów angiogennych i typów tkanek w ramach wielu projektów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w odpowiedziach naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki precyzji mikrochirurgicznej i kontrolowanemu środowisku komory.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów naczyniowych i zmniejszając liczbę niepowodzeń na późnych etapach programów inżynierii tkankowej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację terapeutyków naczyniowych i kandydatów regeneracyjnych skorygowaną o ryzyko, w oparciu o zwalidowany potencjał unaczynienia.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrochirurgicznych, w szczególności w mikroanastomozach naczyń poniżej 1 mm.
- Zależne od specjalistycznego instrumentarium, w tym mikroskopów chirurgicznych, dylatatorów naczyniowych i narzędzi do koagulacji.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów chirurgicznych w obrębie zespołów oraz monitorowanie pooperacyjne drożności pętli.
- Wymaga rozważenia adaptacji przy zastosowaniu modelu w różnych typach tkanek, źródłach komórek lub składach macierzy.
- Ograniczone przez złożoność zabiegu i krzywą uczenia się, co może wpływać na wydajność oraz powtarzalność wyników między operatorami.
