Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii
10 listopada 2016
Przedstawione tutaj protokoły ułatwiają wygodne badanie reakcji bakteryjnych etylenu poprzez wykorzystanie kwasu 2-chloroetylofosfonowego (). Etylen jest wytwarzany in situ w wyniku rozkładu w wodnym pożywce bakteryjnej, co pozwala obejść wymóg stosowania czystego gazu etylenowego.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie prostej i bezpiecznej metody badania odpowiedzi bakterii na etylen. Metoda ta pozwoli odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące interakcji między roślinami a mikroorganizmami, takich jak rola, jaką etylen odgrywa w adhezji i kolonizacji roślin przez bakterie. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że nie wymaga ona specjalistycznego sprzętu i jest znacznie bezpieczniejsza niż praca z etylenem w postaci gazowej w laboratorium.
Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat wpływu etylenu na produkcję celulozy bakteryjnej, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów związanych z roślinami w celu badania in vitro procesów pośredniczących w kolonizacji roślin przez etylen. W ramach przygotowania należy sporządzić 100 mililitrów pożywki wzrostowej dla siewek Arabidopsis oraz 100 mililitrów pożywki bakteryjnej do rozkładu CEPA. Po osiągnięciu przez pożywkę dla arabidopsis temperatury pokojowej, należy odlać 40 mililitrów do sterylnej kolby i uzupełnić tę porcję o 40 mikrolitrów 10 milimolarnego ACC.
Następnie napełnij ćwiartki płytki pięcioma mililitrami pożywki i poczekaj, aż agar stężeje. Przeciwległe ćwiartki wszystkich płytek zawierają pożywkę dla bakterii oraz pożywkę dla arabidopsis. Zastosuj trzy różne konfiguracje pożywek.
Obróbka CEPA zostanie przeprowadzona w późniejszym etapie protokołu. Przygotuj każdą konfigurację płytek w trzech powtórzeniach. Po ostygnięciu agaru równomiernie rozmieść około 50 nasion w każdym kwadrancie pożywki dla arabidopsis.
Następnie inkubować płytki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Po zakończeniu inkubacji nasion wystawić je na światło fluorescencyjne przez dwie godziny. Następnie nanieść 10 µL 500 mM roztworu stokowego CEPA na agar bakteryjny jednej konfiguracji płytek.
Końcowe stężenie CEPA w agarze wyniesie 1 mM. Teraz szczelnie zamknij wszystkie płytki folią laboratoryjną i owiń je folią aluminiową. Następnie umieść płytki w ciemnym miejscu w temperaturze 23 °C stroną z agarem do dołu i inkubuj przez trzy dni, aby nasiona wykiełkowały.
Po wykiełkowaniu nasion użyć wysterylizowanych w płomieniu pęsety, aby usunąć siewki odpowiadające każdej z grup badawczych. Z każdego kwadrantu wybrać 30 siewek, co da łącznie 180 siewek na jedną grupę. Wykonać zdjęcia siewek pod mikroskopem stereoskopowym lub za pomocą cyfrowego aparatu o wysokiej rozdzielczości na czarnym tle, umieszczając obok linijkę w celu zachowania skali.
Następnie zmierz długość ich podkotyledonu za pomocą oprogramowania ImageJ. Używając narzędzia linii prostej (straight tool), odlicz 10 milimetrów, a następnie wybierz opcję Set Scale w zakładce Analyze, aby ustawić skalę. Następnie użyj narzędzia Segmented znajdującego się w menu narzędzia linii prostej (Straight Line tool), aby zmierzyć każdy podkotyledon, i naciśnij klawisz M, aby obliczyć ich długości.
Analiza błony (pellicle assay) jest standardowym narzędziem analitycznym w badaniu produkcji celulozy bakteryjnej. Analiza pH i morfologii została szczegółowo opisana w kolejnym protokole. W ramach przygotowania należy zebrać komórki z kultur startowych w trzech powtórzeniach i określić ich liczbę za pomocą komory liczniczej Petroffa-Hausera.
Następnie przygotuj cztery główne mieszaniny pożywek (master mix) z różnymi stężeniami CEPA. Dla każdej mieszaniny odmierz 60 ml pożywki SH o pH 7 i dodaj 120 µl roztworu zapasowego CEPA o stężeniu zero, 5, 50 lub 500 mM, aby uzyskać końcowe stężenia CEPA wynoszące odpowiednio zero, 0,1, 0,1 lub 1,0 mM. Wymieszaj pożywki, delikatnie obracając kolbami.
Jeden zestaw pożywek jest potrzebny dla każdego z trzech powtórzeń, a czwarty zestaw jest niezbędny jako kontrola sterylności. Należy zatem podzielić każdą 60 mililitrową partię pożywki na cztery alikwoty po 14 mililitrów. Następnie należy schłodzić alikwoty o objętości 14 mililitrów przed zaszczepieniem ich odpowiednimi kulturami startowymi, aby uzyskać końcowe stężenie 100 000 komórek na mililitr.
Wszystkie zaszczepione probówki należy trzymać w lodzie, aby zapobiec produkcji celulozy. Pozostałe alikwoty o objętości 14 ml należy przeznaczyć dla sterylnych studni kontrolnych. Następnie z każdej mieszaniny głównej o objętości 14 ml należy nanieść alikwoty o objętości 2 ml do sześciu studni sterylnej płytki 24-dołkowej, co daje łącznie cztery napełnione płytki na każdą analizowaną kulturę startową.
Starannie szczelnie zamknąć płytki folią parafinową i inkubować je statycznie przez siedem dni w temperaturze 30 °C. W trakcie inkubacji należy równolegle inkubować 25 ml kultury ciekłej, aby okresowo mierzyć kwasowość pożywki. Jeśli kwasowość spadnie poniżej pH 5, wzrost organizmu będzie hamował rozkład CEPA do etylenu, co czyni go niekompatybilnym z niniejszym testem.
Tydzień później zbierz i zmierz masę mokrą, grubość, masę suchą oraz krystaliczność pellikuli. Aby zebrać pellikulę z płytki, dociśnij jeden jej bok, aby unieść przeciwległą krawędź, a następnie chwyć ją pęsetą. Trzymając pellikulę, odłóż ją na trzy sekundy na świeży ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar pożywki.
Następnie zważ każdą błonę i zapisz tę wartość jako masę mokrą. Potem ułóż błony wzdłuż linijki i sfotografuj je z boku za pomocą cyfrowego aparatu o wysokiej rozdzielczości. Przeanalizuj te zdjęcia w celu określenia grubości błon.
Następnie przenieś poszczególne błony do dołków płytki sześciodołkowej. Poddaj je działaniu 12 mililitrów 0,1 normalnego wodorotlenku sodu w temperaturze 80°C przez 20 minut w celu lizy komórek. Następnie usuń wodorotlenek sodu i zneutralizuj poddane działaniu odczynnika błony, dokładnie przemywając je 12 mililitrami ultraczystej wody przez 24 godziny z wytrząsaniem w płytce sześciodołkowej.
Podczas tej inkubacji wymieniaj wodę co sześć godzin. Po zakończeniu inkubacji błony powinny być białe. Następnie umieść błony na matach silikonowych i susz je w temperaturze 50 °C przez 48 godzin, aby przygotować je do pomiaru suchej masy.
Krystaliczność otoczek można analizować za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera. Siewki arabidopsis thaliana hodowane w ciemności wykazały fenotyp potrójnej odpowiedzi, charakteryzujący się krótkim i grubym podsłupiem z wyraźnie zaznaczonym hakiem wierzchołkowym, w obecności ACC oraz w obecności etylenu powstałego w wyniku rozkładu CEPA na pożywce SH, lecz nie w warunkach bez dodatków. Wyraźnie widać, że długość podsłupia w przypadku nasion poddanych działaniu czynników była istotnie mniejsza niż w niepoddanych kontrolach.
Zatem etylen był uwalniany z CEPA na pożywce SH w stężeniu fizjologicznie istotnym. Wszystkie stężenia etylenu pochodzącego z CEPA znacząco zmniejszyły mokrą masę błony, ale nie wpłynęły na jej grubość, natomiast wszystkie stężenia etylenu pochodzącego z CEPA znacząco zwiększyły suchą masę błony. Ponadto nawodnienie błony zostało zmniejszone przy wszystkich stężeniach etylenu pochodzącego z CEPA.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zmierzenie pH pożywki wzrostowej, aby upewnić się, że pH nie spadnie poniżej pięciu, co zapobiegnie zahamowaniu degradacji CEPA do etylenu. Należy pamiętać, że sproszkowany CEPA jest niezwykle niebezpieczny dla błon śluzowych. Podczas realizacji tego protokołu należy zawsze zachować odpowiednie środki ostrożności.
Technika ta umożliwi badaczom zainteresowanym interakcjami między roślinami a bakteriami bezpieczne badanie odpowiedzi pośredniczonych przez etylen in vitro. Pomoże to rzucić światło na to, w jaki sposób sygnały roślinne pośredniczą w kolonizacji i adhezji bakterii. Obecnie obszar ten jest słabo zbadany.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę badania odpowiedzi bakterii na etylen z wykorzystaniem kwasu 2-chloroetyliofosfonowego (CEPA). Technika ta umożliwia produkcję etylenu in situ w bezpieczny i wygodny sposób, eliminując konieczność operowania etylenem w formie gazowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Interakcje roślin z drobnoustrojami
- Sygnalizacja etylenu
Wstęp
- Etylen jest kluczowym hormonem roślinnym uczestniczącym w różnych procesach fizjologicznych.
- Adhezja i kolonizacja roślin przez bakterie są pod wpływem etylenu.
- Tradycyjne metody badania etylenu wiążą się z obchodzeniem się z niebezpiecznymi gazami.
- Niniejsza metoda upraszcza badanie wpływu etylenu na bakterie.
Cel badania
- Opracowanie bezpiecznego protokołu badania odpowiedzi bakterii na etylen.
- Zbadanie roli etylenu w adhezji i kolonizacji bakteryjnej.
- Przedstawienie informacji na temat wpływu etylenu na produkcję celulozy bakteryjnej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pożywek wzrostowych dla siewek Arabidopsis oraz kultur bakteryjnych.
- Suplementacja pożywki wzrostowej 10 mM ACC.
- Wykorzystanie CEPA do produkcji etylenu w badaniach bakteryjnych.
- Analiza in vitro mikroorganizmów związanych z roślinami.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia efektywne badanie roli etylenu w zachowaniu bakterii.
- Uzyskane informacje mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia procesów kolonizacji roślin.
- Protokół ten wykazuje większe bezpieczeństwo i prostotę w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w przypadku różnych mikroorganizmów związanych z roślinami, poza zakresem początkowego badania.
Wnioski
- Niniejszy protokół stanowi cenne narzędzie dla badaczy zajmujących się interakcjami między roślinami a mikroorganizmami.
- Zwiększa on bezpieczeństwo w warunkach laboratoryjnych poprzez wyeliminowanie konieczności stosowania etylenu w postaci gazowej.
- Przyszłe badania mogą rozwinąć wnioski dotyczące wpływu etylenu na bakterie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie odpowiedzi bakteryjnych pośredniczonych przez etylen dostarcza wglądu w mechanizmy interakcji między roślinami a mikroorganizmami, które są istotne dla biotechnologii rolniczej i inżynierii mikrobiomu. Metoda ta umożliwia bezpieczne i skalowalne badanie wpływu sygnalizacji gazowej na fenotypy mikrobiologiczne bez konieczności posiadania specjalistycznej infrastruktury do obsługi gazów. Wspiera ona ograniczanie ryzyka w procesach odkrywania skupionych na funkcjach mikrobiologicznych związanych z gospodarzem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie roli etylenu jako cząsteczki sygnałowej w fenotypach adhezji i kolonizacji bakteryjnej.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje CEPA do generowania fizjologicznie istotnych stężeń etylenu in vitro, co pozwala uniknąć pracy z niebezpiecznymi gazami.
- Wartość prognostyczna: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu hormonów roślinnych na tworzenie biofilmu mikrobiologicznego i przyleganie do powierzchni.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Ilościowe określenie wpływu etylenu na produkcję celulozy, morfologię błony oraz stan nawodnienia jako mierzalne wyniki.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja dawkowania CEPA w różnych stężeniach (0–1 mM) w celu ustalenia zależności dawka-odpowiedź w testach mikrobiologicznych.
- Wartość skalowalności: Kompatybilność z formatami płytek wielodołkowych dla wysokoprzepustowego przesiewania szczepów reagujących na etylen.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Łączy sygnalizację etylenu z cechami związanymi z biofilmem, które mają znaczenie dla trwałości kolonizacji roślin i przetrwania drobnoustrojów.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia, czy obserwowane fenotypy wynikają z sygnalizacji etylenu, czy z wtórnych efektów pH lub toksyczności, poprzez monitorowanie pożywki.
- Ciągłość modelu: Wykorzystuje Komagataeibacter xylinus jako system łatwy do manipulacji, który można zaadaptować do innych drobnoustrojów związanych z roślinami w procesach badawczych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta znajduje zastosowanie we wczesnych etapach badań odkrywczych, w których ocenia się odpowiedzi drobnoustrojów na sygnały pochodzące od gospodarza w celu walidacji celu oraz wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Biologia odkrywcza: Bada rolę etylenu w modulowaniu adhezji drobnoustrojów, tworzenia biofilmu oraz morfologii kolonii jako odczytów fenotypowych.
- Screening: Umożliwia odtwarzalną, ilościową ocenę produkcji celulozy i właściwości pelikli w kontrolowanych warunkach ekspozycji na etylen.
- Analityka: Generuje mierzalne punkty końcowe, w tym masę mokrą/suchą, grubość oraz krystaliczność, w celu opartego na danych porównania szczepów.
- Badania translacyjne: Łączy odpowiedź na etylen in vitro z potencjalną rolą w kolonizacji roślin i zastosowaniach w inżynierii mikrobiomu.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Zapewnia przenośne, oparte na odczynnikach źródło etylenu, które można zastosować w różnych systemach drobnoustrojowych i warunkach wzrostu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w przypisywaniu zmian fenotypowych do sygnalizacji etylenu w modelach gospodarz-mikrob.
- Wartość operacyjna: Eliminuje potrzebę stosowania butli gazowych, systemów przepływowych lub specjalistycznych komór, co obniża bariery bezpieczeństwa i stopień skomplikowania konfiguracji.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność decyzji go/no-go poprzez izolację efektów specyficznych dla etylenu od zmiennych zakłócających w testach mikrobiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów mikrobiologicznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o odpowiedź na hormony pochodzące od gospodarza.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy mikrobiologicznej w zakresie technik sterylnych, prowadzenia kultur oraz przeprowadzania analiz fenotypowych.
- Zależna od stabilnych warunków wodnych pod kątem pH (pH ≥3.5), aby zapewnić wiarygodny rozkład CEPA do etylenu.
- Wymaga monitorowania pH pożywki, aby zapobiec zahamowaniu uwalniania etylenu poniżej pH 5.0 podczas inkubacji.
- Wymaga adaptacji pożywek wzrostowych i analiz fenotypowych w przypadku rozszerzenia badań na modele mikrobiologiczne nieprodukujące celulozy.
- Wiąże się z bezpiecznym obchodzeniem się z CEPA w proszku ze względu na jego szkodliwość dla błon śluzowych, co wymaga stosowania środków ochrony indywidualnej (PPE) i protokołów zabezpieczających.
