Name: Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj bezpieczną metodę badania reakcji bakterii na etylen przy użyciu kwasu 2-chloroetylofosfonowego (CEPA). Technika ta eliminuje konieczność obchodzenia się z niebezpiecznym gazowym etylenem w laboratorium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Dario Bonetty za dostarczenie nasion Arabidopsis thaliana i za pomoc techniczną w odniesieniu do testu potrójnej odpowiedzi, a także Simone Quaranta za pomoc z FT-IR. Prace te były wspierane przez grant Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC-DG) dla JLS, stypendium dla absolwentów Ontario (OGS) dla RVA oraz stypendium dla absolwentów Queen Elizabeth II w dziedzinie nauki i technologii (QEII-GSST) dla AJV.

1. Odczynniki
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 500 mM CEPA (144,49 g/mol) oraz roztwór zawierający zarówno 500 mM NaCl (58,44 g/mol), jak i 500 mM NaH2PO4·H2O (137,99 g/mol) w zakwaszonej (pH 2,5) wodzie ultra-czystej lub 0,1 N HCl. Mieszać za pomocą wortexa aż do uzyskania klarownych roztworów.</li>
	<li>Rozcieńczyć szeregowo (10x) roztwory 500 mM w tym samym rozpuszczalniku, aby uzyskać roztwory zapasowe o stężeniu 5 mM i 50 mM.</li>
	<li>Przygotować 10 mM roztwór kwasu 1-aminocyklopropano-karboksylowego (ACC; 101,1 g/mol) w wodzie ultra-czystej.</li>
	<li>Przefiltrować roztwory zapasowe w celu sterylizacji i przechowywać alikwoty w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przefiltrować celulazę w celu sterylizacji. Przechowywać alikwoty w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Weryfikacja produkcji etylenu podczas rozkładu kwasu 2-chloroetylofosfonowego: Potrójny test odpowiedzi
<ol>
	<li>Sterylizacja powierzchniowa nasion Arabidopsis thaliana ekotypu Columbia metodą fazy gazowej: 
	OSTRZEŻENIE: Następujący krok powoduje wydzielanie toksycznego chloru. Sterylizację nasion należy przeprowadzać w dygestorium.
	<ol>
		<li>Przygotować szczelny pojemnik o wystarczającej głębokości, aby pomieścił on zlew szklany o pojemności 250 ml do sterylizacji nasion, i umieścić go w dygestorium.</li>
		<li>Przenieść nasiona A. thaliana do probówki do mikrocentryfugi i umieścić probówkę w statywie. Statyw z otwartą probówką włożyć do szczelnego pojemnika. 
		Uwaga: Nie napełniać poszczególnych probówek powyżej połowy ich objętości, aby gazowy chlor mógł dotrzeć do nasion znajdujących się na dnie.</li>
		<li>Włożyć do szczelnego pojemnika zlew o pojemności 250 ml zawierający 100 ml handlowego wybielacza. Ostrożnie dodać 3 ml stężonego HCl do wybielacza i natychmiast zamknąć pojemnik pokrywą. 
		OSTRZEŻENIE: Wybielacz i HCl reagują, tworząc toksyczny chlor, który służy do sterylizacji powierzchniowej nasion.</li>
		<li>Inkubować nasiona w obecności chloru przez 4 hr w dygestorium. 
		Uwaga: Dłuższy czas sterylizacji obniży efektywność kiełkowania.</li>
		<li>Po sterylizacji pozwolić na odgazowanie chloru w dygestorium przez co najmniej 1 hr, a następnie zamknąć probówkę do mikrocentryfugi. Pozostawić mieszaninę wybielacza i HCl w dygestorium przez co najmniej 24 hr przed utylizacją. 
		Uwaga: Sterylne nasiona można przechowywać w temperaturze pokojowej do natychmiastowego użycia.</li>
		<li>Nasiona do długoterminowego przechowywania trzymać w temperaturze 4 °C. Przed otwarciem probówki do mikrocentryfugi doprowadzić nasiona do temperatury pokojowej, aby zapobiec kondensacji. Przechowywać nasiona w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytek agarowych w podzielonych na 4 sektory szalkach Petriego (90 x 15 mm):
	<ol>
		<li>Przygotować 110 ml pożywki wzrostowej dla siewek A. thaliana: podstawowa pożywka 1x Murashige and Skoog (MS)15 (4,33 g/L) zawierająca 1% (w/v) sacharozy i 0,8% (w/v) agaru. Dostosować pH pożywki MS do wartości 6 za pomocą NaOH.</li>
		<li>Przygotować 100 ml pożywki do wzrostu bakterii do rozkładu CEPA: pożywka Schramm and Hestrin (SH)16 zawierająca 1,5% (w/v) agaru. Dostosować pH pożywki SH do wartości 7 za pomocą NaOH.</li>
		<li>Sterylizować pożywki w autoklawie, a następnie schłodzić w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C.</li>
		<li>Po ostygnięciu agaru MS, przelać 40 ml do sterylnej kolby. Aby przygotować pożywkę dla kontroli pozytywnej siewek A. thaliana, uzupełnić 40 ml porcję agaru MS o 40 µl 10 mM ACC, aby uzyskać końcowe stężenie 10 µM ACC.</li>
		<li>Wlać 5 ml pożywki do odpowiednich kwadrantów podzielonych szalek Petriego (Figura 1) i pozwolić agarowi zastygnąć. Wszystkie płytki przygotować w trzech powtórzeniach. 
		Uwaga: CEPA nie jest dodawana do pożywki wzrostowej aż do późniejszego etapu protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat szalki Petriego i wyniki; wzrost roślin w warunkach pożywek MS i SH z zastosowaniem ACC/CEPA." src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Układ płytek agarowych użytych do testu potrójnej odpowiedzi z CEPA. Schemat przedstawia kwadranty specyficzne dla kontroli negatywnej (A), kontroli pozytywnej (B) oraz płytek eksperymentalnych (C). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Augimeri i Strap9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="3">
	<li>Stratyfikacja nasion A. thaliana w celu zapewnienia synchronicznej kiełkowania:
	<ol>
		<li>Na każdy kwadrant zawierający agar MS lub MS+ACC nanieść około pięćdziesięciu nasion A. thaliana. Nasiona powinny być rozmieszczone równomiernie, aby ułatwić późniejsze usuwanie i analizę siewek.</li>
		<li>Płytki z nasionami inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 3-4 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozkład CEPA na pożywce bakteryjnej (SH) i przeprowadzenie testu potrójnej odpowiedzi:
	<ol>
		<li>Po stratyfikacji naświetlać nasiona światłem fluorescencyjnym przez 2 h.</li>
		<li>Na kwadranty płytek eksperymentalnych zawierających agar SH (pH 7; Rysunek 1) nanieść 10 µl roztworu zapasu CEPA o stężeniu 500 mM, aby uzyskać końcowe stężenie CEPA wynoszące 1 mM.</li>
		<li>Uszczelnić płytki folią laboratoryjną i przykryć folią aluminiową, aby stworzyć ciemne środowisko dla nasion.</li>
		<li>Kiełkować nasiona, inkubując płytki w ciemności w temperaturze 23 °C przez 3 dni, stroną z agarem skierowaną w dół. 
		Uwaga: Płytki można układać w stosy, jednak kontrole negatywne powinny znajdować się na spodzie, ponieważ etylen jest lżejszy od powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych z testu potrójnej odpowiedzi:
	<ol>
		<li>Za pomocą wysterylizowanych płomieniem pincet wyjmować pojedyncze siewki z płytki odpowiadającej każdej serii badawczej i oglądać pod mikroskopem stereoskopowym lub cyfrowym USB. Upewnić się, że dolne części siewek są wyrównane, a następnie wykonać zdjęcie.</li>
		<li>Wyjąć 30 siewek z każdego kwadrantu (60 siewek na powtórzenie biologiczne i 180 siewek na serię badawczą). Ułożyć je na powierzchni z czarnym tłem i sfotografować wraz z linijką.</li>
		<li>Zmierzyć długość podykotylu (mm) siewek z powtórzeń, używając oprogramowania ImageJ17. Ustawić skalę, klikając i przeciągając narzędzie *Straight* w celu zaznaczenia odległości 10 mm. Wybrać opcję „Set Scale” w zakładce „Analyze” i ustawić znaną odległość na 10. Używając narzędzia *Segmented*, zaznaczyć długość podykotylu i nacisnąć klawisz M, aby zmierzyć odległość. Porównać średnie z powtórzeń biologicznych za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem wielokrotnych porównań Tukeya. Różnice uznaje się za istotne, jeśli p &lt; 0.05.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza pH w trakcie wzrostu bakterii
<ol>
	<li>Hodowla i miareczkowanie kultur startowych Komagataeibacter xylinus w trzech powtórzeniach:
	<ol>
		<li>Zaszczep pojedynczą kolonię K. xylinus do 5 ml pożywki SH (pH 5) uzupełnionej o 0,2% (v/v) wysterylizowanej przez filtr celulazy. Inkubować kultury w temperaturze 30 °C przy mieszaniu 150 rpm aż do osiągnięcia OD600 na poziomie 0,3 do 0,4 (około 72 h).</li>
		<li>Zebrać kultury startowe poprzez wirowanie (2 000 x g; 4 °C; 10 min). Komórki przemyć dwukrotnie 5 ml sterylnego 0,85% (w/v) roztworu NaCl i resuspendować osad komórkowy. Przechowywać komórki w lodzie.</li>
		<li>Określić liczbę komórek za pomocą komory liczbowej Petroffa-Haussera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaszczepianie kultur do analizy pH:
	<ol>
		<li>Do dwunastu kolb o pojemności 500 ml z foliiowymi pokrywkami dodać 150 ml bulionu SH (pH 7) uzupełnionego o 0,2% (v/v) wysterylizowanej przez filtr celulazy. Zaszczepić kolby kulturami startowymi K. xylinus w stężeniu 105 komórek/ml. Wykorzystując trzy kultury startowe, przygotować trzy repliki biologiczne dla każdej próby.</li>
		<li>Uzupełnić kultury o 300 µl roztworów stokowych CEPA o stężeniach 5, 50 lub 500 mM, aby uzyskać końcowe stężenia CEPA wynoszące odpowiednio 0,01, 0,1 i 1,0 mM. Kultury kontrolne nie traktowane uzupełnić o 300 µl rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia CEPA.</li>
		<li>Uszczelnić kolby, mocno przyklejając folie do ścianek, i inkubować kultury przez 14 dni w temperaturze 30 °C przy mieszaniu 150 rpm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Codziennie, w sposób aseptyczny, pobierać z każdej kolby próbki o objętości 5 ml i osadzać komórki przez wirowanie (2 000 x g; 4 °C; 10 min). Przenieść nadfiltr do czystej probówki i zmierzyć pH każdej repliki biologicznej za pomocą pH-metru.</li>
	<li>Przeanalizować dane z przebiegu czasowego, wykreślając średnie pH replik biologicznych. 
	Uwaga: Ważne jest, aby pH kultury nie spadło poniżej 3,5; pH kultury równe 5 znacznie redukuje uwalnianie etylenu z CEPA, a pH poniżej 3,5 całkowicie hamuje uwalnianie etylenu.</li>
	<li>W celu kontroli poziomu chloru i fosforanów przeprowadzić identyczny eksperyment, stosując 0,01, 0,1 i 1,0 mM roztworu NaCl-NaH2PO4, korzystając odpowiednio z roztworów stokowych 5, 50 i 500 mM.</li>
</ol>
4. Morfologia kolonii
<ol>
	<li>Hodowla kultur startowych K. xylinus w trzech powtórzeniach:
	<ol>
		<li>Pojedynczą kolonię K. xylinus zaszczepić do 5 ml podłoża SH (pH 5) uzupełnionego o 0,2% (v/v) sterilizowanej filtrem celulazy. Kultury inkubować w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 150 rpm do momentu osiągnięcia OD600 na poziomie od 0,3 do 0,4 (około 72 h).</li>
		<li>Kultury startowe zebrać poprzez wirowanie (2,000 x g; 4 °C; 10 min). Komórki przemyć 5 ml sterylnej soli fizjologicznej, a następnie resuspender osad komórkowy. Komórki przechowywać w lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 24 płytki z agarem zawierające 25 ml podłoża SH (pH 7) z dodatkiem 1,5% (w/v) agaru.</li>
	<li>Po zastygnięciu agaru, nanieść 50 µl roztworów stokowych CEPA o stężeniach 5, 50 i 500 mM na agar, aby uzyskać końcowe stężenia CEPA wynoszące odpowiednio 0,01, 0,1 i 1,0 mM. Przygotować płytki kontrolne nieleczone oraz kontrolne z rozpuszczalnikiem, które nie zawierają dodatków lub zawierają naniesione 50 µl rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia badanych związków.</li>
	<li>Na płytkach wyizolować pojedyncze kolonie, nakładając pętlą ok. 5 μl kultury startowej K. xylinus, a następnie uszczelnić je folią parafinową. Wszystkie płytki zaszczepić w trzech powtórzeniach. Płytki inkubować przez pięć dni w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Wykonać zdjęcia kolonii przy 20-krotnym powiększeniu za pomocą cyfrowego mikroskopu USB i jakościowo ocenić morfologię kolonii oraz produkcję celulozy na podłożu stałym. 
	Uwaga: Celuloza objawia się jako mętna substancja wzdłuż brzegu kolonii.</li>
	<li>W celu kontroli poziomu chloru i fosforanów przeprowadzić identyczny eksperyment, stosując roztwór NaCl-NaH2PO4 o stężeniach 0,01, 0,1 i 1,0 mM, wykorzystując odpowiednio roztwory stokowe 5, 50 i 500 mM.</li>
</ol>
5. Analizy błony (pellicle)
<ol>
	<li>Wysiew i kwantyfikacja kultur startowych K. xylinus w trzech powtórzeniach:
	<ol>
		<li>W trzech powtórzeniach zaszczep pojedynczą kolonię K. xylinus do 5 ml pożywki SH (pH 5) uzupełnionej o 0,2% (v/v) sterylizowanej przez filtr celulazy. Inkubować kultury w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 150 rpm do osiągnięcia OD600 na poziomie 0,3 do 0,4 (około 72 h).</li>
		<li>Zebrać kultury startowe poprzez wirowanie (2,000 x g; 4 °C; 10 min). Przemyć komórki dwukrotnie 5 ml sterylnej soli fizjologicznej i resuspender osad komórkowy. Przechowywać komórki w lodzie.</li>
		<li>Kwantyfikować komórki przy użyciu komory licznikowej Petroffa-Haussera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie mieszanin głównych (Master Mixes) do szczepienia płytek 24-dołkowych:
	<ol>
		<li>Uzupełnić 60 ml pożywki SH (pH 7) o 120 µl roztworów stokowych CEPA o stężeniach 5, 50 i 500 mM, aby uzyskać końcowe stężenia CEPA wynoszące odpowiednio 0,01, 0,1 i 1,0 mM. Kolejne 60 ml pożywki SH (pH 7) uzupełnić o 120 µl rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia CEPA. Wymieszać za pomocą voretexa.</li>
		<li>Podzielić każde 60 ml pożywki zawierającej CEPA na cztery aliquoty po 14 ml. Trzy z aliquotów 14 ml zaszczepić biologicznymi powtórzeniami kultury startowej w stężeniu 105 komórek/ml. Przechowywać probówki z komórkami w lodzie, aby zapobiec produkcji celulozy. 
		Uwaga: Pozostały aliquot 14 ml zostanie wykorzystany do sterylnych dołków kontrolnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szczepienie płytek 24-dołkowych:
	<ol>
		<li>Każdą próbę przetestować na oddzielnej płytce z trzema rzędami powtórzeń biologicznych i jednym rzędem kontroli sterylnych (Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat eksperymentu z hodowlą drobnoustrojów; metoda: wysiew komórek, inkubacja, analiza błon." src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat blokowy ilustrujący protokół stosowany w teście i analizie błon. Roztwór treściwy medium SH o pH 7 uzupełniony o CEPA (60 ml) jest rozdzielany na trzy oddzielne powtórzenia biologiczne oraz kontrolę sterylną (po 14 ml na każdą próbkę). Następnie kultury te są rozdzielane na sześć powtórzeń technicznych (po 2 ml) do płytki 24-dołkowej i uszczelniane folią parafinową. Po inkubacji przez 7 dni w temperaturze 30 °C błony są zbierane i charakteryzowane poprzez oznaczenie masy mokrej, grubości, masy suchej oraz krystaliczności za pomocą FT-IR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku</a>
<ol start="2" style="margin-left: 40px;">
	<li>Z 14 ml master mixu odmierzyć po 2 ml do każdego z sześciu dołków sterylnej płytki 24-dołkowej. Powtórzyć czynność dla trzech powtórzeń biologicznych oraz kontroli sterylnej (Rysunek 2). Powtórzyć dla każdej grupy badawczej.</li>
	<li>Uszczelnić płytki folią parafinową i inkubować w warunkach statycznych przez 7 dni w temperaturze 30 °C.</li>
</ol>
<ol start="4">
	<li>Zbiór i pomiar masy mokrej, grubości, masy suchej (wydajności celulozy) oraz krystaliczności błony (Rysunek 2):
	<ol>
		<li>Naciśnij jeden bok błony, aby unieść przeciwległą krawędź, a następnie usuń poszczególne błony za pomocą pęsety. Trzymając je, połóż na świeżym ręczniku papierowym na 3 sec, aby usunąć nadmiar pożywki przed zważeniem w celu określenia masy mokrej.</li>
		<li>Ułóż błony obok linijki i sfotografuj je z boku, używając cyfrowego aparatu o wysokiej rozdzielczości.</li>
		<li>Za pomocą oprogramowania ImageJ17 zmierz grubość błony na lewym ramieniu, prawym ramieniu oraz w centrum każdej błony. Wyciągnij średnią ze wszystkich powtórzeń technicznych dla każdego powtórzenia biologicznego.</li>
		<li>Przenieś poszczególne błony do studzienek płytki 6-dołkowej. Poddaj błony działaniu 12 ml 0.1 N NaOH w temperaturze 80 °C przez 20 min w celu lizy komórek.</li>
		<li>Usuń NaOH i zneutralizuj błony, przemywając je ultra-czystą wodą przez 24 hr z mieszaniem. Wymieniaj wodę co 6 hr. 
		Uwaga: Po zakończeniu etapu przemywania błony powinny być białe.</li>
		<li>Umieść błony na matach silikonowych i susz w temperaturze 50 °C przez 48 hr do uzyskania stałej masy. Po wysuszeniu zdejmij je z mat i zmierz masę błon na wadze analitycznej, aby określić wydajność celulozy bakteryjnej.</li>
		<li>Przeanalizuj krystaliczność błon za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR), wykonując 32 skany z rozdzielczością 4 cm-1 w zakresie od 4,000 do 650 cm-1. Oblicz wskaźnik krystaliczności, CI(IR), korzystając z A1437/A895; stosunku absorbancji „pasma krystalicznego” do „pasma amorficznego”, zgodnie z wcześniejszym opisem18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby kontrolować poziomy chloru i fosforanów, przeprowadź identyczny eksperyment, stosując roztwór NaCl-NaH2PO4 o stężeniach 0.01, 0.1 oraz 1.0 mM, używając odpowiednio roztworów stokowych 5, 50 i 500 mM.</li>
	<li>Analiza danych dotyczących błon:
	<ol>
		<li>Oblicz stopień hydratacji błony, wyznaczając różnicę między masą mokrą a masą suchą błony.</li>
		<li>Wyciągnij średnią z wartości wszystkich powtórzeń technicznych, aby uzyskać pojedynczą wartość dla każdego powtórzenia biologicznego do analizy statystycznej. Porównaj grupy badawcze za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya. Różnice uznaje się za istotne, gdy p &lt;0.05.</li>
		<li>Znormalizuj dane jako procent kontroli nieleczonej i przedstaw średnie z powtórzeń biologicznych na wykresie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Guzmán, P., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+triple+response+of+Arabidopsis+to+identify+ethylene-related+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants.</a> Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).</li>
<li>Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+research+on+the+plant+hormone+ethylene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Growth+Regul%22%5BJournal%5D)">History of research on the plant hormone ethylene.</a> J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).</li>
<li>Schaller, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+and+the+regulation+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Ethylene and the regulation of plant development.</a> BMC Biol. 10 (1), (2012).</li>
<li>Hua, J., Sakai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EIN4+and+ERS2+are+members+of+the+putative+ethylene+receptor+gene+family+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).</li>
<li>Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insensitivity+to+ethylene+conferred+by+a+dominant+Mutation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana.</a> Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).</li>
<li>Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tomato+gene+for+the+ethylene-forming+enzyme+by+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).</li>
<li>Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ethylene+removal+with+Pseudomonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hazard.+Mater%22%5BJournal%5D)">Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains.</a> J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).</li>
<li>Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+chemotaxis+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+other+Pseudomonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Environ%22%5BJournal%5D)">Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species.</a> Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).</li>
<li>Augimeri, R. V., Strap, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phytohormone+ethylene+enhances+bacterial+cellulose+production%2C+regulates+CRP%2FFNRKx+transcription+and+causes+differential+gene+expression+within+the+cellulose+synthesis+operon+of+Komagataeibacter+%28Gluconacetobacter%29+xylinus+ATCC+53582%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582.</a> Front. Microbiol. 6, 1459(2015).</li>
<li>Zhang, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ethylene+gas+and+comparison+of+ethylene+responses+induced+by+ethylene%2C+ACC%2C+and+ethephon%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon.</a> Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).</li>
<li>Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+preparation+and+its+application+to+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal.+Behav%22%5BJournal%5D)">Ethylene preparation and its application to physiological experiments.</a> Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).</li>
<li>Warner, H. L., Leopold, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+evolution+from+2-chloroethylphosphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).</li>
<li>Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution.</a> Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).</li>
<li>Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+water+vapor+pressure+on+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Schramm, M., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+production+of+cellulose+at+the+air%2Fliquid+interface+of+a+culture+of+Acetobacter+xylinum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum.</a> J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+cellulose-structure+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cellul.+Chem.+Technol%22%5BJournal%5D)">Amorphous cellulose-structure and characterization.</a> Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj metody przedstawiają produkcję in situ etylenu z do badania odpowiedzi bakterii na etylen przy użyciu organizmu modelowego K. xylinus. Ta metoda jest bardzo przydatna, ponieważ etylen można wytwarzać poprzez uzupełnienie dowolnego środowiska wodnego o pH większym niż 3,510,11 , negując potrzebę stosowania czystego gazu etylenowego lub specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Metoda ta nie ogranicza się do badania wpływu etylenu pochodzącego z na bakterie, ale może być również ...

Etylen olefinowy (C2H4) został po raz pierwszy odkryty jako hormon roślinny w 1901 roku, kiedy zaobserwowano, że siewki grochu, uprawiane w laboratorium, które używało lamp gazowych na węgiel, wykazywały nieprawidłową morfologię, w której łodygi (hipokotyle) były krótsze, grubsze i wygięte na boki w porównaniu do normalnych sadzonek grochu; fenotyp później nazwany potrójną odpowiedzią1,2. Kolejne badania wykazały, że etylen jest niezbędnym fitohormonem, który reguluje wiele procesów rozwojowych, takich jak wzrost, reakcja na stres, dojrzewanie owoców istarzenie się. Arabidopsis thaliana, organizm modelowy do badań nad biologią roślin, został dobrze przebadany pod kątem jego reakcji na etylen. Kilka mutantów odpowiedzi etylenu wyizolowano poprzez wykorzystanie fenotypu potrójnej odpowiedzi obserwowanego w ciemno rosnących siewkach A. thaliana w obecnościetylenu 1,4,5. Biosyntetycznym prekursorem do produkcji etylenu w roślinach jest kwas 1-aminocyklopropanowokarboksylowy (ACC)6 i jest powszechnie stosowany podczas testu potrójnej odpowiedzi w celu zwiększenia endogennej produkcji etylenu, która prowadzi do fenotypupotrójnej odpowiedzi 1,4,5.
Chociaż reakcja etylenu jest szeroko badana u roślin, wpływ egzogennego etylenu na bakterie jest znacznie niedostatecznie zbadany, pomimo bliskiego związku bakterii z roślinami. Jedno z badań wykazało, że niektóre szczepy Pseudomonas mogą przetrwać przy użyciu etylenu jako jedynego źródła węgla i energii7. Jednak tylko dwa badania wykazały, że bakterie reagują na etylen. Pierwsze badanie wykazało, że szczepy Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida i P. syringae były chemotaktyczne w stosunku do etylenu przy użyciu testu czopa agarozowego, w którym stopiona agaroza została zmieszana z buforem chemotaksji zrównoważonym czystym gazem etylenowym8. Jednakże, zgodnie z naszą wiedzą, nie ma dalszych doniesień o zastosowaniu czystego gazu etylenowego do scharakteryzowania reakcji bakterii na etylen, prawdopodobnie ze względu na trudności w obchodzeniu się z gazami w laboratorium bez specjalistycznego sprzętu. Drugi raport dotyczący odpowiedzi bakterii na etylen wykazał, że etylen zwiększa produkcję celulozy bakteryjnej i wpływa na ekspresję genów w bakterii związanej z owocami, Komagataeibacter (dawniej Gluconacetobacter) xylinus9. W tym przypadku związek uwalniający etylen, kwas 2-chloroetylofosfonowy (), został użyty do produkcji etylenu in situ w pożywce bakteryjnej, z pominięciem konieczności stosowania czystego gazu etylenowego lub specjalistycznego sprzętu.
wytwarza etylen w stosunku molowym 1:1 powyżej pH 3,510,11 poprzez katalizowaną zasadą, reakcję pierwszego rzędu12-14. Degradacja jest dodatnio skorelowana z pH i temperaturą13,14 i prowadzi do produkcji etylenu, chlorku i fosforanu. zapewnia naukowcom zainteresowanym badaniem reakcji bakterii na etylen wygodną alternatywę dla gazowego etylenu.
Ogólnym celem poniższych protokołów jest dostarczenie prostej i efektywnej metody badania odpowiedzi bakterii na etylen i obejmuje walidację fizjologicznie istotnych poziomów produkcji etylenu z rozkładu w pożywce bakteryjnej, analizę pH hodowli w celu zapewnienia, że rozkład nie jest zaburzony podczas wzrostu bakterii, oraz ocenę wpływu etylenu na morfologię i fenotyp bakterii. Demonstrujemy te protokoły za pomocą K. xylinus, jednak protokoły te można dostosować do badania odpowiedzi etylenu u innych bakterii przy użyciu odpowiedniej pożywki wzrostowej i analiz fenotypowych.

<table><tbody><tr><td>Kwas 1-aminocyklopropanowo-karboksylowy (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Biosyntetyczny prekursor etylenu w roślinach</td></tr><tr><td>4-sektorowa szalka Petriego</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>Do testowania potrójnej odpowiedzi</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>Do zestalania podłoża</td></tr><tr><td>Aparat Canon Rebel T1i DLSR</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>Do zdjęć błonek</td></tr><tr><td>Celulaza z Trichoderma reesei ATCC 26921&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Roztwór wodny</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>Dla SH medium</td></tr><tr><td>Wybielacz komercyjny</td><td>Life Marka</td><td>57800861874</td><td>Wybielacz do sterylizacji nasion</td></tr><tr><td>Skoncentrowany HCl</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Kwas solny do regulacji pH</td></tr><tr><td>Cyfrowy mikroskop USB</td><td>Podłączany</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>zdjęć kolonii</td></tr><tr><td>Etefon (&ge; 96%; Kwas 2-chloroetylofosfonowy)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Związek uwalniający etylen</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Dla podłoża SH</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Bakteryjna rurka do mikrowirówki alfaproteobacterium wytwarzająca celulozę</td></tr><tr><td></td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1,7 ml probówka do mikrowirówki</td></tr><tr><td>Murashige i Skoog (MS) podstawowa Średnie&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Pożywka wzrostowa Arabidopsis thaliana</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Fosforan dwuzasadowy siedmiowodny do podłoża SH</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>Chlorek sodu do roztworu soli fizjologicznej i kontrolnego</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Fosforan sodu, monozasadowy monohydrat do roztworu kontrolnego</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>Wodorotlenek sodu do regulacji pH</td></tr><tr><td>Folia parafinowa</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>Do uszczelniania płyt i kolb</td></tr><tr><td>Pepton (bakteriologiczny)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>Do podłoża SH</td></tr><tr><td>Studzienka licząca Petroff-Hausser</td><td>Hausser naukowy</td><td>3900</td><td>Komora do liczenia komórek bakteryjnych</td></tr><tr><td>Filtr sterylizacyjny z polieterosulfonu 0,2 i mikro; m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Do sterylizacji celulazy</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Sacharoza na pożywkę MS</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Do podłoża SH</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Etylen (C2H4) to gazowy fitohormon, który bierze udział w wielu aspektach rozwoju roślin, odgrywając dominującą rolę w starzeniu się i dojrzewaniu owoców. Egzogenny etylen stosowany we wczesnym okresie rozwoju roślin wyzwala fenotyp potrójnej odpowiedzi; Krótszy i grubszy hipokotyl z przesadnym haczykiem wierzchołkowym. Pomimo ścisłego związku między roślinami a bakteriami, wpływ egzogennego etylenu na bakterie został w znacznym stopniu przeoczony. Wynika to częściowo z trudności w kontrolowaniu gazowego etylenu w laboratorium bez specjalistycznego sprzętu. Kwas 2-chloroetylofosfonowy () to związek, który po rozpuszczeniu w środowisku wodnym o pH 3,5 lub wyższym rozkłada się na etylen, chlor i fosforan w stosunku molowym 1:1:1:1. W tym miejscu opisujemy zastosowanie do produkcji etylenu in situ do badania odpowiedzi etylenu u bakterii przy użyciu związanej z owocami, wytwarzającej celulozę bakterii Komagataeibacter xylinus jako organizmu modelowego. Protokoły opisane w niniejszym dokumencie obejmują zarówno weryfikację produkcji etylenu z za pomocą testu potrójnej odpowiedzi Arabidopsis thaliana, jak i wpływ egzogennego etylenu na produkcję celulozy K. xylinus, właściwości błonki i morfologię kolonialną. Protokoły te można dostosować do badania wpływu etylenu na inne drobnoustroje przy użyciu odpowiednich pożywek wzrostowych i analiz fenotypowych. Zastosowanie zapewnia naukowcom prostą i wydajną alternatywę dla czystego gazu etylenowego do rutynowego określania odpowiedzi bakterii na etylen.

Schematyczny układ płytek do weryfikacji uwalniania etylenu z CEPA w podłożu SH (pH 7) za pomocą testu potrójnej odpowiedzi przedstawiono na Rysunku 1A-C. Schemat blokowy ilustrujący protokół otrzymywania pellikli przedstawiono na Rysunku 2. Siewki A. thaliana hodowane w ciemności wykazują fenotyp potrójnej odpowiedzi (krótszy i grubszy podhipokotyl z wyraźnie zaznaczoną zakrzywioną wierzchołkową częścią) w obecności ACC oraz w ...

Przedstawione tutaj protokoły ułatwiają wygodne badanie reakcji bakteryjnych etylenu poprzez wykorzystanie kwasu 2-chloroetylofosfonowego (). Etylen jest wytwarzany in situ w wyniku rozkładu w wodnym pożywce bakteryjnej, co pozwala obejść wymóg stosowania czystego gazu etylenowego.

Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie prostej i bezpiecznej metody badania odpowiedzi bakterii na etylen. Metoda ta pozwoli odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące interakcji między roślinami a mikroorganizmami, takich jak rola, jaką etylen odgrywa w adhezji i kolonizacji roślin przez bakterie. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że nie wymaga ona specjalistycznego sprzętu i jest znacznie bezpieczniejsza niż praca z etylenem w postaci gazowej w laboratorium.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat wpływu etylenu na produkcję celulozy bakteryjnej, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów związanych z roślinami w celu badania in vitro procesów pośredniczących w kolonizacji roślin przez etylen. W ramach przygotowania należy sporządzić 100 mililitrów pożywki wzrostowej dla siewek Arabidopsis oraz 100 mililitrów pożywki bakteryjnej do rozkładu CEPA. Po osiągnięciu przez pożywkę dla arabidopsis temperatury pokojowej, należy odlać 40 mililitrów do sterylnej kolby i uzupełnić tę porcję o 40 mikrolitrów 10 milimolarnego ACC.Następnie napełnij ćwiartki płytki pięcioma mililitrami pożywki i poczekaj, aż agar stężeje. Przeciwległe ćwiartki wszystkich płytek zawierają pożywkę dla bakterii oraz pożywkę dla arabidopsis. Zastosuj trzy różne konfiguracje pożywek.Obróbka CEPA zostanie przeprowadzona w późniejszym etapie protokołu. Przygotuj każdą konfigurację płytek w trzech powtórzeniach. Po ostygnięciu agaru równomiernie rozmieść około 50 nasion w każdym kwadrancie pożywki dla arabidopsis.Następnie inkubować płytki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Po zakończeniu inkubacji nasion wystawić je na światło fluorescencyjne przez dwie godziny. Następnie nanieść 10 µL 500 mM roztworu stokowego CEPA na agar bakteryjny jednej konfiguracji płytek.Końcowe stężenie CEPA w agarze wyniesie 1 mM. Teraz szczelnie zamknij wszystkie płytki folią laboratoryjną i owiń je folią aluminiową. Następnie umieść płytki w ciemnym miejscu w temperaturze 23 °C stroną z agarem do dołu i inkubuj przez trzy dni, aby nasiona wykiełkowały.Po wykiełkowaniu nasion użyć wysterylizowanych w płomieniu pęsety, aby usunąć siewki odpowiadające każdej z grup badawczych. Z każdego kwadrantu wybrać 30 siewek, co da łącznie 180 siewek na jedną grupę. Wykonać zdjęcia siewek pod mikroskopem stereoskopowym lub za pomocą cyfrowego aparatu o wysokiej rozdzielczości na czarnym tle, umieszczając obok linijkę w celu zachowania skali.Następnie zmierz długość ich podkotyledonu za pomocą oprogramowania ImageJ. Używając narzędzia linii prostej (straight tool), odlicz 10 milimetrów, a następnie wybierz opcję Set Scale w zakładce Analyze, aby ustawić skalę. Następnie użyj narzędzia Segmented znajdującego się w menu narzędzia linii prostej (Straight Line tool), aby zmierzyć każdy podkotyledon, i naciśnij klawisz M, aby obliczyć ich długości.Analiza błony (pellicle assay) jest standardowym narzędziem analitycznym w badaniu produkcji celulozy bakteryjnej. Analiza pH i morfologii została szczegółowo opisana w kolejnym protokole. W ramach przygotowania należy zebrać komórki z kultur startowych w trzech powtórzeniach i określić ich liczbę za pomocą komory liczniczej Petroffa-Hausera.Następnie przygotuj cztery główne mieszaniny pożywek (master mix) z różnymi stężeniami CEPA. Dla każdej mieszaniny odmierz 60 ml pożywki SH o pH 7 i dodaj 120 µl roztworu zapasowego CEPA o stężeniu zero, 5, 50 lub 500 mM, aby uzyskać końcowe stężenia CEPA wynoszące odpowiednio zero, 0,1, 0,1 lub 1,0 mM. Wymieszaj pożywki, delikatnie obracając kolbami.Jeden zestaw pożywek jest potrzebny dla każdego z trzech powtórzeń, a czwarty zestaw jest niezbędny jako kontrola sterylności. Należy zatem podzielić każdą 60 mililitrową partię pożywki na cztery alikwoty po 14 mililitrów. Następnie należy schłodzić alikwoty o objętości 14 mililitrów przed zaszczepieniem ich odpowiednimi kulturami startowymi, aby uzyskać końcowe stężenie 100 000 komórek na mililitr.Wszystkie zaszczepione probówki należy trzymać w lodzie, aby zapobiec produkcji celulozy. Pozostałe alikwoty o objętości 14 ml należy przeznaczyć dla sterylnych studni kontrolnych. Następnie z każdej mieszaniny głównej o objętości 14 ml należy nanieść alikwoty o objętości 2 ml do sześciu studni sterylnej płytki 24-dołkowej, co daje łącznie cztery napełnione płytki na każdą analizowaną kulturę startową.Starannie szczelnie zamknąć płytki folią parafinową i inkubować je statycznie przez siedem dni w temperaturze 30 °C. W trakcie inkubacji należy równolegle inkubować 25 ml kultury ciekłej, aby okresowo mierzyć kwasowość pożywki. Jeśli kwasowość spadnie poniżej pH 5, wzrost organizmu będzie hamował rozkład CEPA do etylenu, co czyni go niekompatybilnym z niniejszym testem.Tydzień później zbierz i zmierz masę mokrą, grubość, masę suchą oraz krystaliczność pellikuli. Aby zebrać pellikulę z płytki, dociśnij jeden jej bok, aby unieść przeciwległą krawędź, a następnie chwyć ją pęsetą. Trzymając pellikulę, odłóż ją na trzy sekundy na świeży ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar pożywki.Następnie zważ każdą błonę i zapisz tę wartość jako masę mokrą. Potem ułóż błony wzdłuż linijki i sfotografuj je z boku za pomocą cyfrowego aparatu o wysokiej rozdzielczości. Przeanalizuj te zdjęcia w celu określenia grubości błon.Następnie przenieś poszczególne błony do dołków płytki sześciodołkowej. Poddaj je działaniu 12 mililitrów 0,1 normalnego wodorotlenku sodu w temperaturze 80°C przez 20 minut w celu lizy komórek. Następnie usuń wodorotlenek sodu i zneutralizuj poddane działaniu odczynnika błony, dokładnie przemywając je 12 mililitrami ultraczystej wody przez 24 godziny z wytrząsaniem w płytce sześciodołkowej.Podczas tej inkubacji wymieniaj wodę co sześć godzin. Po zakończeniu inkubacji błony powinny być białe. Następnie umieść błony na matach silikonowych i susz je w temperaturze 50 °C przez 48 godzin, aby przygotować je do pomiaru suchej masy.Krystaliczność otoczek można analizować za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera. Siewki arabidopsis thaliana hodowane w ciemności wykazały fenotyp potrójnej odpowiedzi, charakteryzujący się krótkim i grubym podsłupiem z wyraźnie zaznaczonym hakiem wierzchołkowym, w obecności ACC oraz w obecności etylenu powstałego w wyniku rozkładu CEPA na pożywce SH, lecz nie w warunkach bez dodatków. Wyraźnie widać, że długość podsłupia w przypadku nasion poddanych działaniu czynników była istotnie mniejsza niż w niepoddanych kontrolach.Zatem etylen był uwalniany z CEPA na pożywce SH w stężeniu fizjologicznie istotnym. Wszystkie stężenia etylenu pochodzącego z CEPA znacząco zmniejszyły mokrą masę błony, ale nie wpłynęły na jej grubość, natomiast wszystkie stężenia etylenu pochodzącego z CEPA znacząco zwiększyły suchą masę błony. Ponadto nawodnienie błony zostało zmniejszone przy wszystkich stężeniach etylenu pochodzącego z CEPA.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zmierzenie pH pożywki wzrostowej, aby upewnić się, że pH nie spadnie poniżej pięciu, co zapobiegnie zahamowaniu degradacji CEPA do etylenu. Należy pamiętać, że sproszkowany CEPA jest niezwykle niebezpieczny dla błon śluzowych. Podczas realizacji tego protokołu należy zawsze zachować odpowiednie środki ostrożności.Technika ta umożliwi badaczom zainteresowanym interakcjami między roślinami a bakteriami bezpieczne badanie odpowiedzi pośredniczonych przez etylen in vitro. Pomoże to rzucić światło na to, w jaki sposób sygnały roślinne pośredniczą w kolonizacji i adhezji bakterii. Obecnie obszar ten jest słabo zbadany.

utilizing-ethylene-releasing-compound-2-chloroethylphosphonic-acid-as

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opracowaliśmy prosty i powtarzalny protokół badania odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie. Metoda ta minimalizuje uszkadzanie i manipulację liściem w porównaniu do wcześniej opisanego zastosowania preparatów z naskórka liści.

Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Źródło: Nathoo, N., et al. Hydroponiczny system kouprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych roślina/mikroorganizm oraz sygnalizacji. J. Vis. Exp. (2017).Ten film przedstawia hydroponiczny system wspólnej uprawy do badania interakcji między roślinami a bakteriami w sterylnych warunkach. Sadzonki roślin przenosi się do sterylnego, kwaśnego podłoża wzrostowego, inkubuje i sprawdza pod kątem zanieczyszczenia przed zaszczepieniem Agrobacterium. Aktywowane bakterie...

System wspólnej uprawy do badania reakcji molekularnych gospodarzy roślinnych i bakterii oddziałujących na siebie

Źródło: Augimeri, R. V. i wsp., Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania odpowiedzi etylenu u bakterii. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje wpływ etylenu wytwarzanego przez kwas 2-chloroetylofosfonowy () na wzrost bakterii i produkcję celulozy. Etylen aktywuje szlaki sygnałowe, które stymulują syntezę celulozy, co skutkuje zwiększonym tworzeniem błonki. Wyniki te podkreślają reakcję bakterii na etylen.

Badanie reakcji bakterii na etylen przy użyciu związku uwalniającego etylen

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Opisujemy prostą metodę badania kultur bakteryjnych pod kątem produkcji związków hamujących inne bakterie.

Zastosowanie techniki miękkiego nakładki agarowej do badań przesiewowych pod kątem związków hamujących wytwarzanych przez bakterie

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie zarysu kompleksowych badań biochemicznych i funkcjonalnych ligaz ubikwityny typu E3 typu RING. Ten wieloetapowy potok, ze szczegółowymi protokołami, weryfikuje aktywność enzymatyczną badanego białka i pokazuje, jak powiązać tę aktywność z funkcjonowaniem.

Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do przeprowadzenia eksperymentu z etykietowaniem zbliżeniowym (PL) na ogórku (Cucumis sativus L.) przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2)-AirID jako modelu. Metoda opisuje budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, infiltrację biotyny, ekstrakcję białek i oczyszczanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa.

Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

Obecny protokół opisuje metodę, która pozwala na analizę ekspresji genów w pojedynczych komórkach w populacjach Pseudomonas syringae hodowanych w roślinnym apoplastie.

Jednokomórkowa analiza ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Poznaj bezpieczną metodę badania reakcji bakterii na etylen przy użyciu kwasu 2-chloroetylofosfonowego (CEPA). Technika ta eliminuje konieczność obchodzenia się z niebezpiecznym gazowym etylenem w laboratorium.

Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii

Przeglądaj więcej filmów