Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie liczby podjednostek w homooligomerycznych kompleksach białkowych w lizatach komórkowych przy użyciu niedenaturującej elektroforezy w żelu dodekosiarczanowo-poliakrylamidowym bez denaturacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak oligomeryczny status białek zaangażowanych w podstawowe procesy komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona oczyszczania z homooligomerycznych kompleksów białkowych ani specjalistycznego, drogiego sprzętu.

Dlatego można go wykonać w większości laboratoriów. W tym eksperymencie wykorzystuje się dwa typy komórek. Komórki A549, które wyrażają endogenne białko oporności A na myksowirusa lub MxA; i wirokomórki, które wykazują nadekspresję MxA.

Zasiaj komórki A549 i wirokomórki w sześciu naczyniach dołkowych z dwoma mililitrami pożywki wzrostowej na studzienkę. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia zbierz komórki.

Umyj każdą studzienkę jednym mililitrem PBS i przymocuj komórki, dodając 0,5 mililitra 0,25% roztworu trypsyny-EDTA przez około pięć minut w temperaturze pokojowej. Gdy tylko komórki oderwą się od naczynia, dodaj 0,5 mililitra pożywki wzrostowej i ostrożnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Przenieś komórki każdej studzienki do dwumililitrowej probówki i granuluj je za pomocą wirówki stołowej.

Ostrożnie usunąć sklarowany nad osadem przez pipetowanie, nie naruszając osadu komórkowego. Umyj komórki, dodając jeden mililitr lodowatego PBS i ostrożnie pipetując zawiesinę komórek w górę iw dół. Granuluj komórki w wirówce stołowej.

Ostrożnie usunąć sklarowany osad przez pipetowanie, nie odrywając osadu komórkowego. Dodaj 200 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy, ponownie zawieś komórki, pipetując w górę iw dół, a następnie umieść na lodzie. Natychmiast chroń lizat przed światłem, przykrywając probówki folią aluminiową, ponieważ jodoacetamid w buforze do lizy jest wrażliwy na światło.

Inkubować na lodzie przez 30 minut. Stosowanie jodoacetamidu ma kluczowe znaczenie, ponieważ jodoacetamid nieodwracalnie chroni grupę tiolową wolnych cystein, tworząc wiązanie tioeterowe i zapobiegając sztucznej agregacji białek. Następnie usuń resztki komórek przez odwirowanie we wstępnie schłodzonej wirówce stołowej.

Podczas wirowania należy przygotować kolumny dializacyjne o masie cząsteczkowej odciętej 10 000. Przymocować kolumny dializacyjne do boi pływakowej i umieścić je w zlewce wypełnionej wstępnie schłodzonym buforem do dializy w celu zrównoważenia kolumn. Nie dotykaj membrany.

Umieścić mieszadło magnetyczne w zlewce i przenieść zlewkę do chłodni. Używając mieszadła magnetycznego, aby zapewnić delikatne mieszanie, równoważ przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza. Po 20 minutach wyjąć kolumny z buforu dializacyjnego i boi pływakowej.

Przenieść oczyszczone lizaty do przygotowanych kolumn dializacyjnych za pomocą pipetowania bez dotykania membrany. Przymocuj kolumny do boi pływakowej. Umieścić je z powrotem w zlewce wypełnionej buforem do dializy, a następnie przenieść zlewkę do chłodni

Dializować lizat przez co najmniej cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ostrożnie mieszając mieszadłem magnetycznym w celu usunięcia małych metabolitów i soli, które mogłyby zakłócać elektroforezę w żelu poliakrylamidowym bez denaturacji. Po zakończeniu dializy przenieś każdą dializowaną próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Usunąć osady przez odwirowanie w wirówce stołowej.

Elektroforeza musi być wykonana natychmiast po dializie lizatów, aby zapobiec dysocjacji oligomerycznych kompleksów białkowych. Napełnij wewnętrzną i zewnętrzną komorę żelową wstępnie schłodzonym buforem do pracy. Wstępnie uruchom niedenaturujący żel poliakryloamidowy ze wstępnie schłodzonym buforem roboczym o natężeniu 25 miliamperów na żel przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wymieszać 15 mikrolitrów przygotowanego lizatu z pięcioma mikrolitrami buforu do próbki 4X. Załaduj wybrany natywny wzorzec białka i 15 mikrolitrów próbki na żel. Uruchom żel przy 25 miliamperach przez cztery godziny w czterech stopniach Celsjusza.

Po zakończeniu elektroforezy w żelu poliakryloamidowym bez denaturacji należy zdemontować żel i ostrożnie przenieść do bufora SDS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Przygotuj dwie gąbki, cztery arkusze celulozowej bibuły filtracyjnej i membranę do bibuły na żel i namocz je w buforze bibułkowym.

Ułóż kanapkę w następujący sposób od dołu do góry. Jedna gąbka, dwa arkusze celulozowej bibuły filtracyjnej, membrana bibułowa, żel, dwa arkusze celulozowej bibuły filtracyjnej i jedna gąbka. Włóż kanapkę do bibułki, upewniając się, że membrana jest skierowana w stronę bieguna dodatniego, a żel w stronę bieguna ujemnego.

Napełnij zbiornik bibuły wstępnie schłodzonym buforem do bibuły. Aby uzyskać najlepsze wyniki transferu białka, osusz w temperaturze 90 miliamperów przez noc w czterech stopniach Celsjusza. Następnego dnia zdemontuj kanapkę.

Inkubować błonę w roztworze Pąsa przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby uwidocznić wzorzec białka. Odplamić membranę, umieszczając ją w wodzie dejonizowanej i myjąc. Po przeniesieniu błony na tackę należy oznaczyć pasma wzorca białka za pomocą pisaka.

Zablokuj membranę buforem blokującym na co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie interesujące białka są wizualizowane przez barwienie immunologiczne przy użyciu króliczego przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciwko MxA, jak opisano w protokole tekstowym. Wirokomórki pozbawione endogennego MxA transfekowano rekombinowanym dzikim typem MxA oraz monomeryczną i dimeryczną wariancją MxA.

Migracja rekombinowanej wariancji MxA przy ich oczekiwanej masie cząsteczkowej potwierdziła ich stan oligomeryczny. Ektopowo wyrażony dziki typ MxA migrował jako tetramer. Te rekombinowane białka wykorzystano następnie do oceny stanu oligomerycznego endogennego ludzkiego białka MxA pochodzącego z komórek A549 stymulowanych interferonem-alfa.

Wynik ujawnił, że wielkość MxA w lizatach komórek A549 stymulowanych interferonem-alfa odpowiada tetramerowi. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w półtora dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, aby nie zamrażać i nie rozmrażać próbek podczas całej procedury, ponieważ może to zniszczyć interakcje białek lub spowodować agregację białek.

Ponadto podczas pracy z odczynnikami światłoczułymi, takimi jak jodoacetamid, ważne jest, aby chronić próbki przed światłem na etapie lizy. Po niedenaturującym SDS-PAGE można przeprowadzić inne metody, takie jak ekstrakcja żelu białkowego i aktywność enzymatyczna AsiS lub PAGE drugiego wymiaru, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak aktywność enzymatyczna i charakterystyka potencjalnych kompleksów heterooligomerycznych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki do zbadania składu oligomerycznych kompleksów białkowych w hodowanych komórkach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować lizaty komórkowe z kultur komórkowych do badania białek oligomerycznych w niedenaturującej analizie PAGE. Nie zapominaj, że praca z jodoacetamidem może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i ochrona oczu.