Name: Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metodę analizy oligomerycznego stanu białka MxA w lizatach komórkowych przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej. Technika ta pozwala określić liczbę podjednostek w kompleksach białkowych bez konieczności ich oczyszczania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana z grantu Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (Grant nr 31003A_143834) dla JP.

UWAGA: Ten protokół jest oparty na poprzednio opublikowanym niedenaturującym protokole PAGE 12. W tym badaniu stan oligomeryczny białka MxA oceniano przy użyciu komórek Vero z nadekspresją MxA lub komórek A549 stymulowanych przez IFN-α eksprymujących endogenne MxA. Opisany poniżej protokół może być wykorzystany do analizy stanu oligomerycznego dowolnego białka oprócz MxA. Może być jednak konieczna dalsza optymalizacja.
1. Przygotowanie lizatu komórkowego do niedenaturacji STRONA
UWAGA: Aby przeanalizować stan oligomeryczny ludzkiego białka MxA w komórkach Vero lub A549, pobrano 1,0 x 106 komórek. W zależności od typu komórki lub obfitości analizowanego białka należy dostosować liczbę komórek. Ważne jest również, aby chronić bufor do lizy przed ekspozycją na światło, gdy tylko zostanie dodany światłoczuły jodoacetamid.
<ol>
	<li>Wysiew 0,3 x 106 komórek A549 lub Vero na studzienkę do 6 dołków. Przechowywać komórki w 2 ml pożywki wzrostowej na studzienkę (patrz Tabela 1). Inkubować komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>Zebrać komórki, przemłukując 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i odłączyć, dodając 0,5 ml 0,25% roztworu kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) 1x przez około 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Jak tylko komórki oderwą się od naczynia, dodaj 0,5 ml pożywki wzrostowej i ostrożnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Przenieść komórki każdej studzienki do jednej probówki o pojemności 2 ml i granulować je za pomocą wirówki stołowej (5 000 x g, 4 °C, 5 min).</li>
	<li>Ostrożnie usunąć sklarowany nad osadem przez pipetowanie, nie naruszając osadu komórkowego.</li>
	<li>Przemyć komórki 1 ml lodowatego PBS, ostrożnie pipetując zawiesinę komórek w górę i w dół.</li>
	<li>Granulki w wirówce stołowej (5 000 x g, 4 °C, 5 min).</li>
	<li>Ostrożnie usunąć sklarowany osad przez pipetowanie, nie odrywając osadu komórkowego.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 200 μl lodowatego buforu do lizy (patrz Tabela 1), pipetując w górę i w dół, a następnie umieścić na lodzie.</li>
	<li>Natychmiast chronić lizat przed światłem, przykrywając probówki folią aluminiową i inkubować przez 30 minut na lodzie. 
	UWAGA: Po inkubacji przez 30 minut na lodzie nie jest już konieczna ochrona lizatu przed ekspozycją na światło, ponieważ ochrona wolnych grup tiolowych jest nieodwracalna.</li>
	<li>Usunąć resztki komórek przez odwirowanie we wstępnie schłodzonej wirówce stołowej (13 000 x g, 4 °C, 20 min).</li>
	<li>Wyrównać kolumny dializacyjne w buforze dializacyjnym (tabela 1) w chłodni w temperaturze 4 °C przez 20 minut na etapie wirowania. Użyj kolumny o masie cząsteczkowej odciętej 10 000.
	<ol>
		<li>Przymocuj kolumny do boi pływakowej i umieść je w zlewce wypełnionej buforem do dializy. Aby zapewnić delikatne mieszanie, użyj mieszadła magnetycznego. Nie dotykaj membrany. 
		UWAGA: Kolumny dializacyjne można zakupić lub przygotować z probówek o pojemności 1,5 ml zgodnie z protokołem opisanym przez Fialę i współpracowników 19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć kolumny z buforu dializacyjnego i pławy pływakowej. Przenieść oczyszczone lizaty do przygotowanej kolumny dializacyjnej za pomocą pipetowania bez dotykania membrany. Przymocować kolumny do boi pływakowej i włożyć je z powrotem do zlewki wypełnionej buforem do dializy.</li>
	<li>Dializować lizat w zlewce zawierającej lodowaty bufor do dializy (tabela 1) przez co najmniej 4 godziny (lub najlepiej przez noc) w temperaturze 4 °C, ostrożnie mieszając przy użyciu mieszadła magnetycznego. Użyć co najmniej 100 ml buforu dializacyjnego na 200 μl lizatu.</li>
	<li>Przenieść pobraną próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml. Usunąć osady przez odwirowanie w wirówce stołowej (13 000 x g, 4 °C, 20 min). Aby zapobiec dysocjacji oligomerycznych kompleksów białkowych, należy postępować zgodnie z protokołem (punkt 2) bezpośrednio po dializie. Nie zamrażaj przygotowanych lizatów.</li>
</ol>
2. Elektroforeza
UWAGA: Elektroforeza została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem z pewnymi modyfikacjami 22. W opisanym poniżej protokole zastosowano prefabrykowane żele gradientowe (gradient 4-15%). Alternatywnie żele można przygotować w laboratorium. Bardzo ważne jest, aby wykluczyć wszelkie czynniki denaturujące, takie jak SDS, aby zapobiec dysocjacji oligomerycznych kompleksów białkowych. Czas elektroforezy został zoptymalizowany pod kątem różnych stanów oligomerycznych ludzkiego białka MxA. Jednak może się różnić w przypadku innych białek, w zależności od wielkości kompleksu oligomerycznego, a także zakresu separacji, który ma zostać osiągnięty w celu analizy kompleksu. Dlatego optymalny czas elektroforezy należy określić empirycznie. Dla optymalnej rozdzielczości analizowanych oligomerów prąd nie powinien przekraczać 25 mA.
<ol>
	<li>Zmontuj niedenaturujący żel PAGE w komorze żelu. Napełnić komorę wewnętrzną i zewnętrzną wstępnie schłodzonym buforem roboczym (Tabela 1).</li>
	<li>Żel należy wstępnie uruchomić za pomocą wstępnie schłodzonego buforu bieżącego o natężeniu 25 mA na żel przez 15 minut w chłodni w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zmieszać 15 μl wyżej przygotowanych lizatów z 5 μl 4 x buforu do próbki (tabela 1). Nie gotować próbki.</li>
	<li>Załaduj 15 μl próbki i wybrany natywny wzorzec białka na żel. Uruchom żel w temperaturze 25 mA przez 4 godziny w chłodni w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W przypadku analiz półilościowych można przeprowadzić protokół oznaczania ilościowego białka (np. test białka Bradforda 23) w celu zapewnienia obciążenia równych ilości białka całkowitego na pas</li>.
</ol>
3. Western Blot
UWAGA: Poniżej opisany jest protokół systemu wet western blot. Można użyć dowolnej membrany bibułowej. Aktywuj membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) w 100% metanolu przed zrównoważeniem w buforze bibułkowym. Technika półsuchych western blot może być stosowana alternatywnie, ale musi być zoptymalizowana pod kątem dużych kompleksów oligomerycznych.
<ol>
	<li>Zdemontuj żel i ostrożnie przenieś go do bufora SDS (Tabela 1).</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Przygotuj 2 gąbki, 4 arkusze celulozowej bibuły filtracyjnej i membranę bibułową na żel. Namocz je w buforze bibułkowym (tabela 1).</li>
	<li>Złóż kanapkę w następujący sposób (od dołu do góry): 1 gąbka, 2 arkusze celulozowej bibuły filtracyjnej, membrana, żel, 2 arkusze celulozowej bibuły filtracyjnej, 1 gąbka.</li>
	<li>Włóż kanapkę do bibułki. Upewnij się, że membrana jest skierowana w stronę bieguna dodatniego, podczas gdy żel jest skierowany w stronę bieguna ujemnego.</li>
	<li>Napełnij zbiornik bibuły wstępnie schłodzonym buforem do bibuły.</li>
	<li>Osusz w 90 mA przez noc w temperaturze 4 °C, aby uzyskać najlepsze wyniki transferu białka.</li>
	<li>Zdemontuj kanapkę i zwizualizuj wzorzec białka, inkubując membranę w roztworze Ponceau S przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odbarwić membranę, ostrożnie zmywając Ponceau S wodą dejonizowaną, aż będzie wyraźnie widać pasma wzorca białkowego.</li>
	<li>Zaznacz pasma wzorca białka za pomocą pisaka. 
	UWAGA: Resztki Ponceau S mogą zakłócać barwienie immunologiczne. Aby tego uniknąć, membranę można dalej odbarwiać poprzez inkubację w 0,1 M NaOH przez 1 minutę, a następnie mycie wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Zablokować membranę za pomocą buforu blokującego (patrz tabela 1) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wizualizacja białka będącego przedmiotem zainteresowania poprzez barwienie immunologiczne przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko białku, które ma być analizowane. 
	UWAGA: Ludzkie białko MxA wizualizowano przy użyciu króliczego przeciwciała poliklonalnego specyficznego dla ludzkiego Mx1 rozcieńczonego w stosunku 1:1,000 w buforze blokującym (Tabela 1). Roztwór przeciwciała inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C. Alternatywnie można użyć przeciwciała monoklonalnego anty-MxA (klon 143) (dane nie pokazane) 24.</li>
</ol>

<ol><li>Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine+zipper-mediated+homo-oligomerization+regulates+the+Rho-GEF+activity+of+AKAP-Lbc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc.</a> J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).</li>
<li>Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+cell-cell+adhesion+by+classical+cadherins%3A+Critical+role+for+low-affinity+dimerization+through+beta-strand+swapping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).</li>
<li>Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TBP+dimerization+in+preventing+unregulated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression.</a> Mol Cell. 3, 717-727 (1999).</li>
<li>Torshin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+oligomerization+as+intermediate+level+of+signal+transduction%3A+analysis+of+protein-protein+contacts+and+active+sites+in+several+glycolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes.</a> Front Biosci. 4, 557-570 (1999).</li>
<li>Goodsell, D. S., Olson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+symmetry+and+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Structural symmetry and protein function.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).</li>
<li>Flydal, M. I., Martinez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine+hydroxylase%3A+function%2C+structure%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation.</a> IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).</li>
<li>Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MxA+protein%3A+an+interferon-induced+dynamin-like+GTPase+with+broad+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity.</a> J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).</li>
<li>Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mx+GTPases%3A+dynamin-like+antiviral+machines+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity.</a> Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).</li>
<li>Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+backfolding+of+the+carboxyl-terminal+end+of+MxA+protein+is+a+prerequisite+for+its+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization.</a> J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).</li>
<li>Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+GTPase-negative+MxA+mutant+with+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity.</a> J Virol. 74, 8202-8206 (2000).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+myxovirus+resistance+protein+a+reveals+intra-+and+intermolecular+domain+interactions+required+for+the+antiviral+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function.</a> Immunity. 35, 514-525 (2011).</li>
<li>Nigg, P. E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+GTP-binding+Requirements+of+MxA+for+Viral+Target+Recognition+and+Antiviral+Activity+against+Influenza+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus.</a> J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oligomerization+in+the+stalk+region+of+dynamin-like+MxA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA.</a> Nature. 465, 502-506 (2010).</li>
<li>Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiparallel+leucine+zipper-directed+protein+reassembly%3A+Application+to+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein.</a> J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).</li>
<li>Patching, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+spectroscopy+for+characterisation+of+membrane+protein-ligand+interactions+and+its+potential+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Wyatt, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Scattering+and+the+Absolute+Characterization+of+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules.</a> Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins.</a> Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced+antiviral+protein+MxA+interacts+with+the+cellular+RNA+helicases+UAP56+and+URH49%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49.</a> J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).</li>
<li>Stertz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced%2C+antiviral+human+MxA+protein+localizes+to+a+distinct+subcompartment+of+the+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum.</a> J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).</li>
<li>Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+human+MxA+GTPase+into+highly+ordered+dynamin-like+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers.</a> J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).</li>
<li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+%28Orthomyxoviridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).</li>
<li>Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missorting+of+LaCrosse+virus+nucleocapsid+protein+by+the+interferon-induced+MxA+GTPase+involves+smooth+ER+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes.</a> Traffic. 5, 772-784 (2004).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+RNA+helicase+UAP56+is+required+for+prevention+of+double-stranded+RNA+formation+during+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection.</a> J Virol. 85, 8646-8655 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy prostą metodę, która pozwala na szybkie określenie stanu oligomerycznego białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków za pomocą niedenaturującego PAGE, a następnie analizę Western blot. Główną zaletą tego podejścia jest to, że stan oligomeryczny danego białka można określić na podstawie lizatów całokomórkowych bez wcześniejszego oczyszczania białka. Może to być ważne w przypadku białek, które oligomeryzują lub pełnią swoją funkcję w połączeniu z czynnikami pomocniczymi. Ponadto białka są nadal ...

Czwartorzędowa struktura białka odgrywa kluczową rolę w wielu procesach komórkowych. Szlaki sygnałowe, ekspresja genów oraz aktywacja/dezaktywacja enzymów zależą od prawidłowego składania kompleksów białkowych 1-4. Proces ten, znany również jako homo- lub heterooligomeryzacja, jest spowodowany nieodwracalnymi kowalencyjnymi lub odwracalnymi elektrostatycznymi i hydrofobowymi oddziaływaniami białko-białko. Oligomeryzacja nie tylko różnicuje różne procesy komórkowe bez zwiększania rozmiaru genomu, ale także zapewnia białkom strategię budowania stabilnych kompleksów, które są bardziej odporne na denaturację i degradację 5. Defekty oligomeryzacji mają wpływ na funkcję białek i mogą prowadzić do rozwoju chorób. Na przykład enzym hydroksylaza fenyloalaniny tworzy kompleks tetrameryczny. Niektóre mutacje w kompleksie białkowym mogą osłabiać tworzenie tetramerów i prowadzić do choroby fenyloketonurii 6.
Ludzkie białko MxA jest indukowanym przez interferon (IFN) przeciwwirusowym białkiem efektorowym, wywierającym szerokie działanie przeciwwirusowe przeciwko różnym wirusom RNA oraz DNA 7. Należy do nadrodziny dużych GTPaz podobnych do dynaminy i ma zdolność do tworzenia dużych struktur oligomerycznych in vitro 8. Sugeruje się, że oligomeryzacja chroni MxA przed szybką degradacją 9,10. Pomimo intensywnych wysiłków wielu grup badawczych, molekularny mechanizm działania pozostaje w dużej mierze nieuchwytny, a rola stanu oligomeryzacji MxA dla jego funkcji przeciwwirusowej jest przedmiotem dyskusji 9,11,12. W związku z tym Gao i współpracownicy zaproponowali model, w którym MxA wywiera swoją aktywność przeciwwirusową poprzez interakcję z nukleoproteinami wirusa w postaci dużych, przypominających pierścienie struktur oligomerycznych 11. Jednak niedawno wykazaliśmy, że dimery MxA wykazują działanie przeciwwirusowe i oddziałują z nukleoproteiną wirusa grypy A 12. Opierając się na strukturze krystalicznej MxA, Gao i współpracownicy zidentyfikowali kilka reszt aminokwasowych w regionach interfejsu, które są krytyczne dla jego oligomeryzacji in vitro i funkcji przeciwwirusowej 11,13. Dlatego, aby wyjaśnić, który stan oligomeryczny MxA wywiera aktywność przeciwwirusową, staraliśmy się ustalić prosty protokół szybkiego określenia stanu oligomerycznego mutantów interfejsu MxA ulegających ekspresji w komórkach ludzkich, a także endogennego MxA ulegającego ekspresji po stymulacji IFNα.
Chociaż istnieje wiele technik, które są powszechnie używane do badania interakcji między białkami, takich jak test komplementacji rozszczepionego zielonego białka fluorescencyjnego (split-GFP) 14, powierzchniowy rezonans plazmonów 15 i rezonansowy transfer energii rezonansu Förstera (FRET) 16, nie dostarczają one informacji o dokładnej stechiometrii oligomerycznego kompleksu białkowego. Do zbadania tego konkretnego aspektu bardzo przydatne są techniki takie jak rozpraszanie światła pod wieloma kątami (MALS) 17 i ultrawirowanie analityczne 18 . Zazwyczaj białka analizowane tymi metodami są białkami oczyszczonymi. Procesy oligomeryzacji mogą również zależeć od innych czynników komórkowych. Jeśli te czynniki są nieznane, analiza jest trudniejsza. Ponadto niektóre białka są trudne do ekspresji w E. coli i do oczyszczenia. Dlatego metody te nie są optymalnym wyborem do analizy oligomeryzacji białek w środowisku komórkowym. Ponadto techniki te wymagają drogich instrumentów, które nie są łatwo dostępne.
Niedenaturująca elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE), chromatografia wykluczania wielkości lub chemiczne sieciowanie, a następnie konwencjonalny dodecylosiarczan sodu (SDS)-PAGE są użytecznymi narzędziami do charakterystyki powstawania oligomerów z lizatów komórkowych 2,19,20. Metody te nie wymagają specjalistycznego sprzętu i można je łatwo wykonać w standardowym laboratorium. Początkowo oceniliśmy różne protokoły chemicznego sieciowania, które niezmiennie prowadziły do niespecyficznej agregacji i wytrącania MxA. W związku z tym przetestowaliśmy następnie protokoły PAGE, które nie podlegają denaturacji. Ponieważ niedenaturujący PAGE wyklucza stosowanie SDS, migracja białek zależy od ich natywnego ładunku. Niebieski natywny PAGE wykorzystuje coomassie brilliant blue G250 do ładowania białek ogólnym ładunkiem ujemnym, podobnym do SDS, ale nie denaturuje białka 21. Niestety, błękit brylantowy coomassie wytrąca się w obecności wysokich soli i kationów dwuwartościowych (np. Mg2+), które często są zawarte w do lizy. W zależności od zastosowanych, analiza próbki może być trudna bez dalszej optymalizacji kroków, które mogłyby mieć wpływ na oligomeryczny kompleks białkowy.
Tutaj prezentujemy prosty protokół oparty na wcześniej opublikowanej metodzie 22 do określenia oligomeryzacji ludzkiego białka MxA pochodzącego z lizatów komórkowych za pomocą niedenaturującego PAGE.

<table><tbody><tr><td>Jednostki dializacyjne Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>Wstępna równowaga w buforze dializacyjnym (jeśli pożądane jest usunięcie glicerolu) Może być wykonany samodzielnie zgodnie z Fiala et al. 2011</td></tr><tr><td>4&ndash; 15% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 10-dołkowe,</td> <td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td>Wstępny przebieg w buforze do pracy w celu dostosowania systemu buforowego</td></tr><tr><td>cKompletne, Mini, wolne od EDTA</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11836170001</td><td>stosować 1 tabletkę na 50 ml</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4&nbsp; butelka 500 ml Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td><silny>TOKSYCZNY</silny> nosić rękawice i chronić oczy</td></tr><tr><td>NativeMark Unstained Protein Standard&nbsp; 50 &mikro; l</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 57030</td><td>obciążenie 5 i mikro; l / dołek</td></tr><tr><td>Komórki A549</td><td>ATCC ATCC</td><td>CCL185</td><td>Rosną w pożywce wzrostowej (patrz <silny>Tabela 1</silny>)</td></tr><tr><td>Komórki Vero</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL81</td><td>Wzrost w pożywce wzrostowej (patrz <silny>Tabela 1</silny>)przeciwciało</td></tr> <tr><td>anty-Mx1</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00004599_D01P</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:1 000</td></tr><tr><td>ECL Przeciwciało przeciw królikowi IgG, całe przeciwciało połączone z peroksydazą chrzanową (od osioł)</td><td>GE-Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:10 000</td></tr><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA (1x)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Life Technologies</td><td>Thermo Fisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid&nbsp; &nbsp; 5 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>stock&nbsp; 100 mM</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM +4,5g/l Gluc,+L-Glut,+Pirogronian life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Pen&nbsp; Paciorkowiec 100 x&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140 - 130</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x Stock, 100 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Technologie życiowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>350500-038</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodowa, dializowana, pochodzenie z USA 500 ml Gibco Partia: 42G9552K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna z celulozy</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>GE-Healthcare</td><td>10600022</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Biosolve</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>fluorek sodu (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-7920</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>cKompletne, Mini, wolne od EDTA</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Calbiochem</td><td>6555204</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 10% roztwór</td><td>Amresco</td><td>N907</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biosolve</td><td>0007132391BS</td><td></td></tr><tr><td>orthovanadan sodu (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Glycerophospate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Mleko w proszku</td><td>Migros/Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Millipore</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>kloryd sodu (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu (MgCl2)</td> <td>Amresco</td><td>288</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu (NaOH)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>S-8045</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego mxa przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Tworzenie kompleksów oligomerycznych jest kluczowym warunkiem dla prawidłowej struktury i funkcji wielu białek. Indukowane interferonem przeciwwirusowe białko efektorowe MxA wywiera szerokie działanie przeciwwirusowe przeciwko wielu wirusom. MxA jest GTPazą podobną do dynaminy i ma zdolność tworzenia struktur oligomerycznych wyższego rzędu. Jednak to, czy oligomeryzacja MxA jest wymagana dla jego aktywności przeciwwirusowej, jest kwestią dyskusyjną. Opisujemy tutaj prosty protokół oceny stanu oligomerycznego endogennie lub ektopowo wyrażanego MxA we frakcji cytoplazmatycznej ludzkich linii komórkowych za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym bez denaturacji (PAGE) w połączeniu z analizą Western blot. Kluczowym etapem protokołu jest wybór detergentów, które zapobiegną agregacji i/lub wytrącaniu się białek szczególnie związanych z błonami komórkowymi, takimi jak MxA, bez zakłócania ich aktywności enzymatycznej. Innym kluczowym aspektem protokołu jest nieodwracalna ochrona wolnych grup tiolowych reszt cysteiny przez jodoacetamid, aby zapobiec sztucznym interakcjom białka. Protokół ten nadaje się do prostej oceny stanu oligomerycznego MxA, a ponadto umożliwia bezpośrednią korelację aktywności przeciwwirusowej mutantów interfejsu MxA z ich odpowiednimi stanami oligomerycznymi.

Za pomocą nieodtوارającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) przeanalizowano stan oligomeryczny ludzkiego białka MxA typu dzikiego, mutantów interfejsu dimerycznego MxA(R640A) i MxA(L617D) oraz mutanta interfejsu monomerycznego MxA(M527D) w lizatach komórkowych 12. Komórki lizeowano w buforze zawierającym 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) oraz jodoacetamid, aby zapewnić solubilizację białek i ochronę wolnych grup tiolowych (patrz Rycina 1). Zgodnie z wcześniejszym opisem, sol...

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest określenie liczby podjednostek w homooligomerycznych kompleksach białkowych w lizatach komórkowych przy użyciu niedenaturującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii komórki, takie jak stan oligomeryczny białek zaangażowanych w fundamentalne procesy komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona oczyszczania homooligomerycznych kompleksów białkowych ani specjalistycznego, drogiego sprzętu.Dzięki temu można go przeprowadzić w większości laboratoriów. W eksperymencie tym wykorzystuje się dwa typy komórek: komórki A549 wykazujące endogenną ekspresję białka MxA (Myxovirus resistance A protein) oraz virocells z nadekspresją MxA.Wysiej komórki A549 oraz virocells do płytek sześciodołkowych, stosując dwa mililitry pożywki wzrostowej na dołek. Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia zbierz komórki.Przemyj każdą studzienkę jednym mililitrem PBS, a następnie odklej komórki, dodając 0,5 mililitra 0,25% roztworu Trypsyny-EDTA na około pięć minut w temperaturze pokojowej. Gdy tylko

characterization-multi-subunit-protein-complexes-human-mxa-using-non

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

Ten film opisuje multimeryczną STRONĘ do oddzielania natywnych kompleksów białkowych od homogenatów tkankowych. Technika ta jest hybrydą niebieskich technik native-page i SDS-PAGE. Oddzielone kompleksy można scharakteryzować i zbadać pod kątem ich roli w funkcjonowaniu komórki.

Multimer-PAGE do separacji natywnych kompleksów białkowych: hybrydowa technika separacji składająca się z Blue native-PAGE i SDS-PAGE w celu oddzielenia nienaruszonych białek multimerycznych od lizatu tkankowego

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Mucyny to glikokoniugaty o dużej masie cząsteczkowej, o rozmiarach od 0,2 do 200 megadaltonów (MDa). Ze względu na swój rozmiar mucyny nie przenikają do konwencjonalnych żeli poliakrylamidowych i wymagają większych porów do separacji. Zapewniamy szczegółowy protokół elektroforezy w żelu agarozowym mucyny w celu oceny względnej kwantyfikacji i zbadania składania polimerów.

Elektroforeza w żelu mucynowo-agarozowym: Western Blotting dla glikoprotein o dużej masie cząsteczkowej

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Opisano protokół wyjaśniający organizację i skład kompleksu białek tylakoidowych roślin za pomocą elektroforezy w naturalnym żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) i 2D-SDS-PAGE. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem Arabidopsis thaliana, ale może być stosowany do innych gatunków roślin z niewielkimi modyfikacjami.

Analiza kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy w niebieskim natywnym żelu

Ten protokół opisuje połączenie chromatografii wykluczającej rozmiar z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) dla absolutnej charakterystyki białek i kompleksów w roztworze. SEC-MALS określa masę cząsteczkową i wielkość czystych białek, natywnych oligomerów, heterokompleksów i zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny.

Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS)

Poznaj metodę analizy oligomerycznego stanu białka MxA w lizatach komórkowych przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej. Technika ta pozwala określić liczbę podjednostek w kompleksach białkowych bez konieczności ich oczyszczania.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Przeglądaj więcej filmów