Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest określenie liczby podjednostek w homooligomerycznych kompleksach białkowych w lizatach komórkowych przy użyciu niedenaturującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii komórki, takie jak stan oligomeryczny białek zaangażowanych w fundamentalne procesy komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona oczyszczania homooligomerycznych kompleksów białkowych ani specjalistycznego, drogiego sprzętu.

Dzięki temu można go przeprowadzić w większości laboratoriów. W eksperymencie tym wykorzystuje się dwa typy komórek: komórki A549 wykazujące endogenną ekspresję białka MxA (Myxovirus resistance A protein) oraz virocells z nadekspresją MxA.

Wysiej komórki A549 oraz virocells do płytek sześciodołkowych, stosując dwa mililitry pożywki wzrostowej na dołek. Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia zbierz komórki.

Przemyj każdą studzienkę jednym mililitrem PBS, a następnie odklej komórki, dodając 0,5 mililitra 0,25% roztworu Trypsyny-EDTA na około pięć minut w temperaturze pokojowej. Gdy tylko komórki oddzielą się od naczynia, dodaj 0,5 mililitra pożywki wzrostowej i ostrożnie wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół. Przenieś komórki z każdej studzienki do probówki o pojemności dwóch mililitrów i odwiruj je w wirówce stołowej w celu uzyskania osadu.

Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Przemyj komórki, dodając 1 mL lodowatego PBS i ostrożnie pipetując zawiesinę komórkową w górę i w dół. Zcentryfuguj komórki w wirówce laboratoryjnej w celu uzyskania osadu.

Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety, uważając, aby nie odpiąć osadu komórkowego. Dodaj 200 µL lodowatego buforu do lizy, resuspenduj komórki, pipetując ciecz w górę i w dół, a następnie umieść próbki na lodzie. Natychmiast zabezpiecz lizat przed światłem, owijając probówki folią aluminiową, ponieważ jodoacetamid zawarty w buforze do lizy jest światłoczuły.

Inkubować na lodzie przez 30 minut. Zastosowanie jodooctanu jest kluczowe, ponieważ jodooctan nieodwracalnie chroni grupę tiolową wolnych cystein poprzez tworzenie wiązania tioeterowego i zapobiega sztucznej agregacji białek. Następnie usunąć szczątki komórkowe poprzez wirowanie w schłodzonej wirówce stołowej.

Podczas wirowania przygotować kolumny do dializy o progu odcięcia masy cząsteczkowej 10 000. Przymocować kolumny do boi wypornościowej i umieścić je w zlewce wypełnionej schłodzonym buforem do dializy w celu wyrównania stanu równowagi w kolumnach. Nie dotykać membrany.

Umieść mieszadło magnetyczne w zlewce, a następnie przenieś zlewkę do pomieszczenia chłodniczego. Przy użyciu mieszadła magnetycznego zapewniając delikatne mieszanie, inkubuj przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu wyrównania temperatury. Po 20 minutach wyjmij kolumny z buforu do dializy i z pływaka.

Przenieś oczyszczone lizaty do przygotowanych kolumn dializacyjnych, pipetując w taki sposób, aby nie dotknąć membrany. Przymocuj kolumny do pływaka. Umieść je z powrotem w zlewce wypełnionej buforem do dializy, a następnie przenieś zlewkę do chłodni.

Dializować lizat przez co najmniej cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, uważnie mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego, aby usunąć małe metabolity i sole, które mogłyby zakłócić nieodtwarzającą elektroforezę w żelu poliakryloamidowym. Po zakończeniu dializy przenieść każdą zdializowaną próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Osady usunąć poprzez wirowanie w wirówce laboratoryjnej.

Elektroforezę należy przeprowadzić niezwłocznie po dializie lizatów, aby zapobiec dysocjacji oligomerycznych kompleksów białkowych. Napełnić wewnętrzną i zewnętrzną komorę żelu schłodzonym buforem do elektroforezy. Przed przeprowadzeniem właściwego rozdziału, nieodtwarzający żel poliakrylamidowy należy poddać wstępnej elektroforezie w schłodzonym buforze przy natężeniu 25 mA na żel przez 15 minut w temperaturze 4 °C.

Wymieszać 15 µL przygotowanego lizatu z pięcioma µL 4X buforu do próbek. Nanieść na żel wybrany natywny standard białkowy oraz 15 µL próbki. Prowadzić elektroforezę przy natężeniu 25 mA przez cztery godziny w temperaturze 4 °C.

Po zakończeniu nieodtwarzającej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, rozmontuj żel i ostrożnie przenieś go do buforu SDS. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu. Przygotuj dwie gąbki, cztery arkusze celulozowego papieru filtracyjnego oraz membranę do transferu na każdy żel i namocz je w buforze do transferu.

Złóż kanapkę w następującej kolejności, od dołu do góry: jedna gąbka, dwa arkusze papieru filtrowanego z celulozy, membrana do transferu, żel, dwa arkusze papieru filtrowanego z celulozy i jedna gąbka. Umieść kanapkę w komorze do transferu, upewniając się, że membrana jest skierowana w stronę bieguna dodatniego, a żel w stronę bieguna ujemnego.

Napełnij komorę do transferu schłodzonym buforem do transferu. Aby uzyskać najlepsze wyniki przenoszenia białek, prowadź transfer przy natężeniu 90 mA przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia rozmontuj kanapkę.

Inkubować membranę w roztworze Ponceau S przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby zwizualizować standard białkowy. Odbarwić membranę, umieszczając ją w wodzie dejonizowanej i przepłukując. Po przeniesieniu membrany do kuwety zaznaczyć prążki standardu białkowego za pomocą pisaka.

Zablokuj membranę buforem blokującym przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie białka docelowe są wizualizowane za pomocą immunobarwienia przy użyciu króliczego przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciwko MxA, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Virocele pozbawione endogennego MxA zostały przetransfekowane rekombinowanym MxA typu dzikiego oraz monomerową i dimerową wariacją MxA.

Migracja wariantów rekombinowanego białka MxA przy ich oczekiwanej masie cząsteczkowej potwierdziła ich stan oligomeryczny. Ektopowo ekspresowany typ dziki MxA migrował jako tetramer. Białka rekombinowane te zostały następnie wykorzystane do oceny stanu oligomerycznego endogennego ludzkiego białka MxA pochodzącego z komórek A549 stymulowanych interferonem alfa.

Wynik wykazał, że rozmiar MxA w lizatach komórek A549 stymulowanych interferonem alfa odpowiada tetramerowi. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w półtora dnia. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać, aby nie zamrażać i nie rozmrażać próbek w trakcie całego procesu, ponieważ mogłoby to zniszczyć oddziaływania białkowe lub spowodować agregację białek.

Ponadto podczas pracy z odczynnikami światłoczułymi, takimi jak jodoacetamid, ważne jest chronienie próbek przed światłem podczas etapu lizy. Po nieodtłuszczającej elektroforezie SDS-PAGE można zastosować inne metody, takie jak ekstrakcja białek z żelu i analiza aktywności enzymatycznej AsiS lub elektroforeza w drugim wymiarze, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące aktywności enzymatycznej i charakterystyki potencjalnych kompleksów hetero-oligomerycznych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii komórki do badania składu oligomerycznych kompleksów białkowych w hodowlach komórkowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat przygotowywania lizatów komórkowych z kultur komórek w celu badania białek oligomerycznych w analizie PAGE w warunkach niedenaturujących. Należy pamiętać, że praca z jodoacetamidem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i ochronników oczu.