Zaburzenia krążących miRNA w zespole jelita drażliwego wykryte za pomocą multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości

Ogólnym celem niniejszego protokołu multipleksowej kwantyfikacji kwasów nukleinowych jest cyfrowa kwantyfikacja ekspresji mikroRNA w krwi pełnej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad zaburzeniami układu trawiennego. Pomaga ona w identyfikacji rozregulowanych mechanizmów molekularnych oraz sygnatur biomarkerów, takich jak mikroRNA.

Główną zaletą tej techniki jest to, że ilościowe oznaczenie mikroRNA nie opiera się na amplifikacji. Technologia ta cyfrowo zlicza cele molekularne i jest w dużej mierze zautomatyzowana. Aby oczyścić całkowity RNA, rozmrozić i inkubować wcześniej pobrane i zamrożone próbki krwi pełnej przez dwie godziny.

Użyj rotora z uchwytami wahadłowymi, aby odwirować probówki z prędkością 5 000 ×g w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut. Następnie usuń nadsącz, ostrożnie przelewając go lub przenosząc pipetą do probówki z odpadami, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodaj cztery mililitry wody wolnej od RNaz do osadu.

Mocno zakręć nakrętkę i wierzgaj w wirówce (vortex), aż osad zostanie całkowicie rozpuszczony. Następnie ponownie odwiruj probówkę i usuń nadfiltr. Potem dodaj 350 µL buforu BM1 do osadu i wierzgaj w wirówce (vortex), aż osad zostanie całkowicie rozpuszczony.

Następnie przenieś próbkę do dwumililitrowej probówki procesowej do zautomatyzowanej ekstrakcji całkowitego RNA. Korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu do ekstrakcji RNA, przeprowadź zautomatyzowaną puryfikację wewnątrzkomórkowego RNA, w tym mikroRNA z próbki krwi pełnej, ładując do robotycznego systemu ekstrakcji RNA przygotowane końcówki pipet, probówki do wirowania, bufory oraz odczynniki dostarczone w zestawie do puryfikacji RNA. Z menu wyboru protokołów wybierz protokół Blood miRNA PartA i uruchom proces.

Należy dokończyć ekstrakcję RNA i przechowywać próbki zgodnie z opisem w protokole. Przygotować próbki microRNA, normalizując najpierw 12 próbek RNA do stężenia 33 nanogramów per microliter przy użyciu wody wolnej od RNaz. W wodzie wolnej od nukleaz przygotować rozcieńczenie 1:500 kontroli microRNA dostarczonych w zestawie do analizy i przechowywać je w lodzie.

Następnie przygotuj mieszaninę główną (master mix) do hybrydyzacji, łącząc 13 µL buforu do hybrydyzacji, 26 µL odczynnika micro R-tag oraz 6,5 µL kontroli microRNA. Do każdej z 12 probówek paskowych o objętości 0,2 ml dodaj 3,5 µL mieszaniny głównej do hybrydyzacji, a następnie dodaj 3 µL próbki RNA. Wymieszaj zawartość probówek poprzez lekkie potrząsanie, odwiruj je przy 2000 ×g w miniaturowej wirówce stołowej, a następnie inkubuj probówki w termocyklerze zgodnie z poniższym programem.

Następnie przygotuj mieszankę ligacyjną (master mix), łącząc 3 µL buforu do ligacji i 19,5 µL PEG. Następnie dodaj 2,5 µL mieszanki ligacyjnej do każdej z reakcji. Po wymieszaniu i odwirowaniu zawartości probówek, umieść je ponownie w termocyklerze w temperaturze 48 °C na pięć minut.

Następnie dodaj jeden mikrolitr ligazy bezpośrednio do każdej próbki, gdy ta wciąż znajduje się w bloku termocyklera, i inkubuj probówki zgodnie z poniższym programem. Delikatnie wymieszaj i odwiruj probówki, a następnie dodaj jeden mikrolitr enzymu do oczyszczania ligacji do każdej próbki. Następnie inkubuj probówki w termocyklerze, jak pokazano tutaj.

Po inkubacji dodać 40 µL wody wolnej od RNaz do próbek, a następnie wymieszać i odwirować. Aby przeprowadzić hybrydyzację microRNA, rozmrozić w lodzie dostarczone zestawy sond reporterowych i wychwytujących, a następnie je odwirować. Dodać 130 µL buforu do hybrydyzacji do zestawu Reporter Code Set 2 i wymieszać w celu przygotowania mieszaniny głównej (master mix) do hybrydyzacji.

Do 12 nowych probówek paskowych o pojemności 0,2 ml dodać 20 µL mieszaniny głównej do hybrydyzacji. Denaturować świeżo przygotowane próbki microRNA w temperaturze 85 °C przez pięć minut, a następnie schłodzić je na lodzie. Następnie do każdej probówki paskowej zawierającej mieszaninę główną do hybrydyzacji dodać 5 µL próbek microRNA.

Zaprogramuj termocykler na 65 °C, przy temperaturze obliczonej dla objętości 30 µL, a pokrywę grzewczą ustaw na tryb Forever, aby temperatura nie spadała do 4 °C po zakończeniu pracy. Do każdej probówki dodaj 5 µL zestawu sond wychwytujących i wymieszaj. Następnie, po odwirowaniu, niezwłocznie umieść probówki w termocyklerze w temperaturze 65 °C.

Inkubować próbki nie krócej niż 12 godzin i nie dłużej niż 30 godzin. Przygotować stanowisko, najpierw doprowadzając kartridż i płytki do temperatury pokojowej. Następnie odwirować płytki.

Aby przygotować stację do pracy, otwórz drzwiczki stacji i umieść płytki z odczynnikami, kartridż, końcówki do pipet, przygotowane próbki w paskach probówek 0,2 ml oraz dwa puste paski probówek 12-holes 0,2 ml w odpowiednich miejscach robota. Zdejmij zakrętki z pasków probówek oraz pokrywę z płytki z odczynnikami. Następnie zamknij drzwiczki stacji i uruchom odpowiedni test z panelu sterowania.

Aby zwizualizować i policzyć kody kreskowe unieruchomionych i zorientowanych kompleksów trójdzielnych, wyjmij kartridż ze stacji przygotowawczej, użyj dostarczonej pokrywki do jego uszczelnienia i umieść go w dowolnym wolnym slocie analizatora cyfrowego. Użyj ekranu dotykowego, aby utworzyć plik definicji kartridża, CDF. Upewnij się, że w pliku CDF do każdej próbki przypisano odpowiedni plik biblioteki reporterów.

Po zakończeniu skanowania należy pobrać pliki danych z analizatora cyfrowego za pomocą dysku USB lub poczty elektronicznej, a następnie przetworzyć i przeanalizować dane zgodnie z powiązanym protokołem kontroli jakości (QC) i analizy. System testowy platformy ekspresji genów redukuje szum techniczny dzięki wysokiemu stopniowi automatyzacji, a zastosowana w nim unikalna chemia pozwala na uzyskanie precyzyjnych danych o ekspresji genów. Przedstawione tutaj powtórzenia techniczne demonstrują możliwą do osiągnięcia wysoką powtarzalność w ilościowym oznaczaniu ekspresji endogennych i wirusowych mikroRNA.

Stosując tę metodę, można zidentyfikować wirusowe oraz endogenne ludzkie mikroRNA, których ekspresja odbiega od wartości oczekiwanych (zdefiniowanych na podstawie zdrowych uczestników badania), jako cele zainteresowania w IBS. Precyzja i czułość tej metody pozwalają na wykrycie perturbacji wśród celów o niskiej ekspresji, a także wiarygodną obserwację subtelnych zmian. Powyższe rysunki przedstawiają niektóre perturbacje w krążących mikroRNA w IBS oraz w podtypach IBS w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych.

Przedstawiono tutaj dwa mikroRNA o najwyższym stopniu różnicowej nadekspresji u uczestników z IBS. Krzywe na tym wykresie skrzypcowym wskazują częstotliwość zliczeń dla miR-150. Pionowe paski reprezentują pierwszy i trzeci kwartyle, a czerwony kwadrat wskazuje medianę zliczeń.

Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić bardziej celowane, niestandardowe analizy oparte na tej samej technologii, aby zwalidować sygnatury biomarkerów w większych kohortach oraz zbadać kluczowe powiązania między RNA a białkami. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie badań biomedycznych do szybkiego, precyzyjnego i dokładnego opracowywania diagnostycznych paneli biomarkerów chorób.