Zaburzenia krążących miRNA w zespole jelita drażliwego wykryte za pomocą multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości
30 listopada 2016
Opisujemy użycie multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości, która określa ilościowo ekspresję genów poprzez kodowanie kreskowe i liczenie cząsteczek w substratach biologicznych bez potrzeby amplifikacji. Wykorzystaliśmy platformę do ilościowego określenia ekspresji mikroRNA (miRNA) we krwi pełnej u osób z zespołem jelita drażliwego i bez niego.
Ogólnym celem tego protokołu kwantyfikacji multipleksowych kwasów nukleinowych jest cyfrowe ilościowe określenie ekspresji mikroRNA we krwi pełnej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu zaburzeń trawienia. Pomaga w identyfikacji rozregulowanych mechanizmów molekularnych i sygnatur biomarkerów, takich jak mikroRNA.
Główną zaletą tej techniki jest to, że kwantyfikacja mikroRNA nie opiera się na amplifikacji. Technologia ta cyfrowo zlicza cele molekularne i jest w dużej mierze zautomatyzowana. Aby oczyścić całkowite RNA, rozmrażaj i inkubuj wcześniej pobrane i zamrożone próbki krwi pełnej przez dwie godziny.
Użyj wahliwego wirnika kubełkowego, aby odwirować probówki z prędkością 5 000 g w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut. Następnie usunąć supernatanty, ostrożnie wlewając je lub pipetując do rurki odpływowej, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodaj cztery mililitry wody wolnej od RNaz do granulki.
Bezpiecznie załóż nakrętkę i wiruj, aż granulka widocznie się rozpuści. Następnie ponownie odwirować probówkę i usunąć supernatant. Następnie dodaj 350 mikrolitrów buforu BM1 do osadu i wiruj, aż osad widocznie się rozpuści.
Następnie przenieś próbkę do dwumililitrowej probówki do przetwarzania w celu automatycznej ekstrakcji całkowitego RNA. Korzystając z dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji RNA, przeprowadź automatyczne oczyszczanie wewnątrzkomórkowego RNA, w tym mikroRNA z próbki krwi pełnej, ładując wstępnie załadowane końcówki pipet, probówki wirówkowe, i odczynniki dostarczone w zestawie do oczyszczania RNA do zrobotyzowanego systemu ekstrakcji RNA. Z menu wyboru protokołów wybierz protokół Blood miRNA PartA i rozpocznij bieg.
Zakończ ekstrakcję RNA i przechowuj próbki zgodnie z protokołem tekstowym. Przygotuj próbki mikroRNA, najpierw używając wody wolnej od RNaz, aby znormalizować 12 próbek RNA do 33 nanogramów na mikrolitr. Z wodą wolną od nukleaz przygotuj rozcieńczenie 1 na 500 kontroli mikroRNA dostarczonych w zestawie testowym i trzymaj na lodzie.
Następnie przygotuj mieszankę wzorcową wyżarzania, łącząc 13 mikrolitrów buforu do wyżarzania, 26 mikrolitrów odczynnika mikro R-tag i 6,5 mikrolitrów kontroli mikroRNA. Do każdej z 12 probówek paskowych o pojemności 0,2 mililitra dodaj 3,5 mikrolitra mieszanki wzorcowej do wyżarzania, a następnie dodaj 3 mikrolitry próbki RNA. Przesuń probówki, aby się wymieszać, odwiruj je z prędkością 2000 razy g za pomocą mini wirówki stołowej i uruchom probówki w termocyklerze za pomocą następującego programu.
Następnie przygotuj główną mieszankę do podwiązywania, łącząc trzy mikrolitry buforu ligacyjnego i 19,5 mikrolitra PEG. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra głównej mieszanki ligacji do każdej z reakcji. Po wymieszaniu i odwirowaniu probówek włóż je z powrotem do termocyklera w temperaturze 48 stopni Celsjusza na pięć minut.
Następnie dodaj jeden mikrolitr ligazy bezpośrednio do każdej próbki, będąc jeszcze w bloku termocyklera, i inkubuj probówki za pomocą następującego programu. Delikatnie wymieszaj i odwiruj probówki, a następnie dodaj jeden mikrolitr enzymu oczyszczającego ligację do każdej próbki. Następnie inkubuj probówki w termocyklerze, jak pokazano tutaj.
Po inkubacji dodaj do próbek 40 mikrolitrów wody wolnej od RNaz przed zmieszaniem i odwirowaniem. Aby przeprowadzić hybrydyzację mikroRNA, należy rozmrozić zestawy sond reporterowych i wychwytujących dostarczone na lodzie i odwirować je w dół. Dodaj 130 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego do zestawu kodów reporterowych 2 i wymieszaj, aby utworzyć główną mieszankę hybrydyzacji.
W 12 nowych probówkach paskowych o pojemności 0,2 mililitra dodaj 20 mikrolitrów głównej mieszanki hybrydyzacji. Denaturuj próbki mikroRNA przygotowane właśnie w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez pięć minut i schładzaj je na lodzie. Następnie dodaj 5 mikrolitrów próbek mikroRNA do każdej z probówek paskowych zawierających główną mieszankę hybrydyzacji.
Zaprogramuj termocykler na 65 stopni Celsjusza, w temperaturze obliczonej objętościowo 30 mikrolitrów, a podgrzewaną pokrywę na ustawienie czasu Forever, aby nie spadła do 4 stopni Celsjusza pod koniec cyklu. Dodaj 5 mikrolitrów sondy wychwytującej do każdej probówki i wymieszaj. Następnie, po ich odwirowaniu, należy natychmiast umieścić probówki w termocyklerze w temperaturze 65 stopni Celsjusza.
Próbki należy inkubować nie krócej niż 12 godzin i nie dłużej niż 30 godzin. Ustaw stację przygotowawczą, najpierw podgrzewając wkład i talerze do temperatury pokojowej. Następnie odkręć talerze.
Aby załadować stację przygotowawczą, otwórz drzwi stacji i załaduj płytki z odczynnikami, wkład, końcówki pipet, przygotowane próbki w probówkach paskowych o pojemności 0,2 mililitra oraz dwie puste probówki z 12 probówkami o pojemności 0,2 mililitra w odpowiednie miejsca w robocie. Zdjąć nakrętki z tubką z paskiem i pokrywę płytki odczynnika. Następnie zamknij drzwi stacji przygotowawczej i uruchom odpowiedni test z panelu sterowania.
Aby zobrazować i policzyć kody kreskowe unieruchomionych i zorientowanych kompleksów trójdzielnych, wyjmij kartridż ze stacji przygotowawczej, użyj dostarczonej pokrywy do jego uszczelnienia i umieść go w analizatorze cyfrowym w dowolnym dostępnym gnieździe. Użyj ekranu dotykowego, aby utworzyć plik definicji kasety lub CDF. Upewnij się, że odpowiedni plik biblioteki reportera jest przypisany do każdej próbki w CDF.
Po zakończeniu skanowania pobierz pliki danych z analizatora cyfrowego za pomocą dysku USB lub za pośrednictwem poczty e-mail, przed przetworzeniem i analizą danych, zgodnie z powiązanym protokołem kontroli jakości i analizy. System testowania platformy ekspresji genów zmniejsza szum techniczny dzięki swojej wysoce zautomatyzowanej naturze, a unikalna chemia, której używa, zapewnia bardzo precyzyjne dane dotyczące ekspresji genów. Przedstawione tutaj kontrpróby techniczne wykazują wysoką odtwarzalność zarówno w endogennej, jak i wirusowej kwantyfikacji ekspresji mikroRNA, która jest możliwa.
Korzystając z tej metody, kodowane wirusowo i endogenne ludzkie mikroRNA, które wykazują odchylenie od oczekiwanej ekspresji, zdefiniowanej przez zdrowych uczestników badania, mogą zostać zidentyfikowane jako cele zainteresowania w IBS. Precyzja i czułość metody pozwala na wykrycie perturbacji wśród celów o niskiej ekspresji, a także wiarygodną obserwację subtelnych perturbacji. Liczby te pokazują niektóre perturbacje w krążących mikroRNA w podtypach IBS i IBS w porównaniu ze zdrowymi kontrolami.
Przedstawiono tutaj dwa najważniejsze różnicowo podwyższone mikroRNA u uczestników IBS. Krzywe na tym wykresie skrzypcowym wskazują częstotliwość zliczeń dla miR-150. Pionowe słupki reprezentują pierwszy i trzeci kwartyl, a czerwony kwadrat wskazuje medianę.
Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić bardziej ukierunkowane testy niestandardowe oparte na tej samej technologii w celu walidacji sygnatur biomarkerów w większych kohortach i zbadania podstawowych powiązań RNA i białek. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami biomedycznymi do szybkiego, precyzyjnego i precyzyjnego opracowywania paneli biomarkerów diagnostycznych dla chorób.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia platformę ekspresji genów wielokanałową o wysokiej wydajności zaprojektowaną do ilościowego określania ekspresji mikroRNA w próbkach pełnej krwi. Metoda ta pozwala na dokładne pomiary bez amplifikacji, co czyni ją odpowiednią do badań nad stanami takimi jak zespół jelita drażliwego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Analiza ekspresji genów
- Ilościowe określanie mikroRNA
- Badania nad zaburzeniami trawiennymi
Tło
- MikroRNA odgrywają kluczową rolę w regulacji genów.
- Zrozumienie ich ekspresji może dostarczyć informacji na temat różnych chorób.
- Obecne metody często polegają na amplifikacji, co może wprowadzać zmienność.
- Niniejsze badanie ma na celu przezwyciężenie tych ograniczeń dzięki nowatorskiemu podejściu.
Cel badania
- Opracowanie metody do cyfrowej ilościowej analizy mikroRNA we krwi.
- Zidentyfikowanie dysregulowanych mechanizmów molekularnych w zespole jelita drażliwego.
- Ustanowienie biomarkerów dla zaburzeń trawienia.
Stosowane metody
- Automatyczna ekstrakcja RNA z próbek pełnej krwi.
- Przygotowanie próbek mikroRNA przy użyciu specyficznych reagentów.
- Procesy hybrydyzacji i ligowania do wykrywania mikroRNA.
- Cyfrowa analiza danych ekspresji genów przy użyciu specjalistycznej platformy.
Główne wyniki
- Metoda wykazała wysoką precyzję w ilościowym określaniu poziomów mikroRNA.
- Powtórzenia techniczne wykazały reprodykowalność wyników.
- Zidentyfikowano mikroRNA, które odbiegają od zdrowych profili ekspresji.
- Wykryto niewielkie zaburzenia w celach o niskiej ekspresji.
Wnioski
- Platforma wielokanałowa zapewnia solidne narzędzie do badania mikroRNA we krwi.
- Może pomóc w zrozumieniu molekularnej podstawy zaburzeń trawienia.
- To podejście może prowadzić do odkrycia nowych biomarkerów dla zespołu jelita drażliwego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This multiplexed high-throughput gene expression platform enables robust, amplification-free quantification of circulating miRNAs, supporting biomarker discovery in digestive disorders such as irritable bowel syndrome. By providing high sensitivity and reproducibility in detecting low-expression miRNA perturbations, the method enhances target validation confidence and reduces mechanistic ambiguity in early discovery. Its automated workflow and digital counting approach improve assay standardization and scalability for cross-functional R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying dysregulated circulating miRNAs as potential biomarkers in IBS.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise, amplification-free quantification that minimizes technical variability.
- Predictive Value: Facilitates detection of subtle miRNA perturbations, improving confidence in target relevance and portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates highly reproducible, quantitative miRNA expression data suitable for assay standardization and biomarker panel development.
- Operational Value: Reduces investigator effects via largely automated sample preparation and robotic processing, enhancing throughput and consistency.
- Scalability: Permits multiplexed analysis of up to 800 transcripts per reaction, enabling efficient screening of miRNA signatures across cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports validation of circulating miRNA biomarkers discovered in human samples for further preclinical investigation.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of miRNA expression changes with disease subtypes, aiding in pathophysiological understanding.
- Predictive Confidence: Enables reliable detection of low-abundance miRNAs, improving biomarker sensitivity and reducing false-negative risk in translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven biomarker screening to assay validation, supporting progression from early discovery to lead identification in digestive disorder research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying miRNA expression changes in whole blood, clarifying dysregulated molecular pathways in IBS.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs with high linearity and sensitivity, supporting reliable compound or biomarker evaluation.
- Analytics: Provides digital barcode counts and normalized expression data that facilitate statistical comparison across conditions and cohorts.
- Translational Research: Connects circulating miRNA findings to disease relevance, supporting biomarker continuity into preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for miRNA profiling applicable across multiple therapeutic areas beyond gastrointestinal disorders.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing technical noise and enabling detection of low-expression miRNA changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automation, minimizing batch effects and user variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust biomarker data, reducing late-stage failure risk due to poorly validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of miRNA biomarkers based on reproducible, quantifiable expression changes in clinically relevant samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, automated liquid handling systems, and digital image analysis for accurate miRNA quantification.
- Dependent on access to robotic prep stations, digital analyzers, and proprietary fluorescent probe sets with color-coded barcodes.
- Necessitates cross-team standardization of sample collection, RNA normalization, and hybridization protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to different biofluids or tissue types beyond whole blood.
- Limited by the need for specialized reagents and equipment, which may constrain adoption in low-resource settings despite high reproducibility.
