Name: Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych limfocytów T pomocniczych myszy i ich transdukcji retrowirusowej do badania funkcji mikroRNA. Protokół umożliwia analizę szlaków regulacyjnych w różnicowaniu komórek T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC) (BB/H018573/1) oraz grant BD Biosciences.

<ol><li>Baumjohann, D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+regulation+of+T+helper+cell+differentiation+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).</li>
<li>Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+T-helper-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of T-helper-cell differentiation.</a> Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).</li>
<li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+immunity%3A+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342 (6155), 1242454(2013).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Expression+in+Embryonic+Stem+Cells+and+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+and+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells.</a> Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).</li>
<li>Miller, A. D., Rosman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+retroviral+vectors+for+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Improved retroviral vectors for gene transfer and expression.</a> BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).</li>
<li>Grez, M., Akgün, E., Hilberg, F., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+virus%2C+a+recombinant+murine+retrovirus+with+expression+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs%3A+are+the+answers+in+sight%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight?</a> Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li>
<li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li>
<li>Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+is+essential+for+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dicer is essential for mouse development.</a> Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).</li>
<li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Dicer+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A role for Dicer in immune regulation.</a> J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li>
<li>Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAseIII+enzyme+Drosha+is+critical+in+T+cells+for+preventing+lethal+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease.</a> J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).</li>
<li>Liston, A., Lu, L. F., O'Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer-dependent+microRNA+pathway+safeguards+regulatory+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function.</a> J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).</li>
<li>Zhou, X., Jeker, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+miRNA+disruption+in+T+reg+cells+leads+to+uncontrolled+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity.</a> J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-15b%2F16+Enhances+the+Induction+of+Regulatory+T+Cells+by+Regulating+the+Expression+of+Rictor+and+mTOR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR.</a> J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).</li>
<li>Sauer, S., Bruno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+signaling+controls+Foxp3+expression+via+PI3K%2C+Akt%2C+and+mTOR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).</li>
<li>Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+influences+Th+cell+differentiation+by+controlling+the+capacity+for+IL-2-induced+IL-4+production+by+naive+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells.</a> Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+regulate+T-cell+production+of+interleukin-9+and+identify+hypoxia-inducible+factor-2a+as+an+important+regulator+of+T+helper+9+and+regulatory+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation.</a> Immunology. 149, 74-86 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów w publikacji tej pracy.

Nadekspresja genów za pośrednictwem retrowirusa jest potężnym sposobem analizy funkcji pomocniczych limfocytów T, ponieważ ich rozwój i funkcja są często determinowane przez poziom ekspresji kluczowych regulatorów. Wymagana jest jednak ostrożna interpretacja wyników, ponieważ poziomy ekspresji znacznie przekraczające poziomy genu endogennego mogą wprowadzać wiele artefaktów. Dlatego tę technikę należy połączyć z innymi w celu zweryfikowania istotności funkcji. Na przykład nadekspresja powinna być uzupełniona zmniejszoną ekspresją za pomocą siRNA lub nokautów genów, jeśli są dostępne. W przypadku miRNA uzupełniliśmy eksperymenty z nadekspresją eksperymentami blokowania, używając wirusów, które nadmiernie eksprymowały sztuczne miejsca docelowe miRNA, które działały jako konkurencyjne inhibitory miRNA 15. Transdukowane komórki retrowirusowe mogą być również wykorzystywane w testach biochemicznych obejmujących analizę RNA i białek. Jednak głównym ograniczeniem tych eksperymentów jest wydajność transdukcji, w wyniku której powstaje mieszana populacja komórek transdukowanych i nietransdukowanych. W związku z tym testy te najprawdopodobniej będą wymagały sortowania populacji GFP+ . Wreszcie, testy różnicowania in vitro powinny być połączone z eksperymentami in vivo , a jednym ze sposobów osiągnięcia tego jest adoptywne przeniesienie transdukowanych limfocytów T do myszy i śledzenie ich różnicowania i wpływu na odpowiedź immunologiczną.
Jednym z kluczowych ograniczeń tego systemu jest rozmiar genomu RNA, który można umieścić w retrowirusowym kapsydzie. Z naszego doświadczenia wynika, że maksymalny rozmiar wkładki do systemu retrowirusowego MIG, który zapewnia dobrą produkcję wirusa, wynosi 3-3,5 kb. Dlatego większe geny nie mogą być analizowane za pomocą tego systemu, ponieważ dają one słabe miana wirusa. Jednak większość genów jest mniejsza niż ten rozmiar, więc ten system jest przydatny w szerokiej gamie badań genów.
W przypadku transdukcji retrowirusowej zastosowano kilka alternatyw w ramach tych protokołów. Wielu badaczy wykorzystało linie komórkowe do pakowania, które stabilnie wyrażają geny retrowirusowe (na przykład odniesienie 16). Najwyższe miana uzyskaliśmy jednak przy użyciu standardowych komórek HEK 293T z kotransfekcją wektora wirusa pomocniczego pCL-Eco. Izolację naiwnych limfocytów T pomocniczych można również osiągnąć poprzez sortowanie komórek, a nie protokół kolumny do separacji kulek magnetycznych i komórek, ale wymaga to dostępu do sortownika komórek, a koszty czasu sortowania są zwykle wyższe niż w przypadku odczynników kulkowych. Wreszcie, istnieją wariacje na temat warunków aktywacji stosowanych do różnicowania limfocytów T pomocniczych w różne podzbiory. Na przykład stymulacja komórek TCR zbyt długo przed ekspozycją na warunki indukujące Treg może hamować ich indukcję 16. Może to stanowić problem, ponieważ ekspresja retrowirusowa wymaga podziału komórek wywołanego przez stymulację komórek. Niemniej jednak znaleźliśmy skuteczną indukcję Treg przy użyciu tego protokołu z aktywacją O/N przed transdukcją retrowirusową.
W ramach tych protokołów pomyślne zastosowanie wymaga kilku czynników. Preparaty retrowirusów o wysokim mianie wymagają skutecznej transfekcji komórek HEK 293T, dlatego ważna jest wysoka jakość DNA i precyzyjnie przygotowane 2x HBS. Ponadto gęstość komórek HEK 293T musi wynosić około 50% w momencie transfekcji, ponieważ dobra ekspresja transfekowanego DNA wymaga, aby komórki aktywnie rosły, a to zostanie zahamowane, jeśli komórki są zbyt rzadkie lub gęste. Komórki o optymalnej gęstości podczas transfekcji powinny osiągnąć konfluencję w pewnym momencie na etapach zbierania wirusa, ale będą nadal wytwarzać zapasy wirusa o wysokim mianie aż do ostatniego pobrania. Skuteczne różnicowanie pomocniczych limfocytów T wymaga dobrej jakości komórek, dlatego należy upewnić się, że izolowane komórki mają czystość zilustrowaną na rysunku 1. Podobnie jakość komórek zależy od myszy, od których zostały odizolowane. Do tych badań wykorzystaliśmy 6-8 tygodniowe myszy C57BL/6. Starsze myszy mogą mieć mniej naiwne komórki, a inne szczepy mogą różnić się różnicowaniem. Na przykład myszy BALB / c są bardziej podatne na odpowiedzi Th2 niż myszy C57BL / 6 17 , więc jak wspomniano powyżej, limfocyty T C57BL / 6 mogą być trudne do wywołania odpowiedzi Th2. Ponadto każdy z warunków różnicowania może się nieznacznie różnić w zależności od laboratorium, a efekt nadekspresji genów może stać się widoczny tylko w warunkach nieoptymalnych, więc może być konieczne miareczkowanie stężeń cytokin w różnych warunkach polaryzacji. Wreszcie, wpływ nadekspresji genu lub warunków polaryzacji na proliferację komórek może wpływać na wydajność transdukcji, więc pomiar efektów genu będącego przedmiotem zainteresowania może wymagać optymalizacji czasu i stężenia odczynników polaryzujących. Optymalizacja wszystkich tych czynników powinna prowadzić do pouczających wyników dzięki temu systemowi.

Odpowiedź immunologiczna musi być wysoce regulowana, aby wyeliminować infekcje, ale zapobiec atakom na własne tkanki, które prowadzą do autoimmunizacji. Limfocyty T pomocnicze odgrywają zasadniczą rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej i podjęto wiele wysiłków, aby zrozumieć ich rozwój i funkcję (zilustrowane w kilku ostatnich przeglądach 1-3). Jednak pozostaje wiele pytań i wykorzystano wiele podejść do badania mechanizmów kontrolujących rozwój i funkcję limfocytów T pomocniczych. Obejmowały one zarówno systemy hodowli komórkowych in vitro, jak i całe zwierzęta. Systemy hodowli komórkowych, zwłaszcza te wykorzystujące linie komórkowe, oferują korzyści w postaci łatwości użycia i możliwości generowania dużej ilości materiału do przeprowadzania zaawansowanych analiz biochemicznych. Cierpią jednak z powodu ograniczonej zdolności do reprodukcji rzeczywistych warunków występujących w odpowiedzi immunologicznej. W przeciwieństwie do tego, eksperymenty na całych zwierzętach oferują korzyść w postaci trafności, ale mogą cierpieć z powodu trudności w manipulacji i zdolności do przeprowadzania precyzyjnych kontroli, a także z powodu dużych kosztów i implikacji etycznych. Niemniej jednak zdecydowana większość badań nad pomocniczymi limfocytami T nadal wymaga wykorzystania doświadczeń na całych zwierzętach z udziałem pierwotnych limfocytów T ze względu na niezdolność linii komórkowych do powielania dokładnych etapów zachodzących u całego zwierzęcia. Dlatego ważne jest, aby stosować opłacalne podejścia, które są wysoce pouczające. 
Genetyka jest potężnym narzędziem do badania rozwoju i funkcji limfocytów T pomocniczych, jednak tradycyjne metody obejmujące nokautowanie genów lub transgeny są czasochłonne i kosztowne, więc często są poza zasięgiem małych laboratoriów. Jednak transdukcja retrowirusowa oferuje potężne, szybkie i opłacalne podejście genetyczne do badania mechanizmów działania określonych produktów genowych. Dlatego jest powszechnie stosowany w pracach badających rozwój i funkcję limfocytów T pomocniczych. 
Zoptymalizowaliśmy procedurę transdukcji retrowirusowej limfocytów T pomocniczych. Wykorzystuje retrowirusowy wektor ekspresyjny pMIG (mysi wirus komórek macierzystych - wewnętrzne miejsce wejścia rybosomalnego - zielone białko fluorescencyjne), w którym interesujący gen może zostać sklonowany, a tym samym ulegnięty ekspresji z długiego końcowego powtórzenia retrowirusa (LTR) 4. Ponadto za wprowadzonym genem będącym przedmiotem zainteresowania znajduje się wewnętrzna sekwencja wejściowa rybosomu (IRES), po której następuje gen białka zielonej fluorescencji (GFP), dzięki czemu transdukowane komórki mogą łatwo śledzić ich ekspresję GFP. Wektor został pierwotnie uzyskany z wektorów wirusa mysich komórek macierzystych (MSCV), które zawierają mutacje w miejscach wiązania represorów w LTR, dzięki czemu są one odporne na wyciszanie, a tym samym dają wysoką ekspresję w wielu typach komórek, w tym w pomocniczych limfocytach T 5,6. Produkcja retrowirusa o wysokim mianie wymaga prostego protokołu transfekcji przejściowej komórek 293T ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) z wektorem MIG i wektorem wirusa pomocniczego, który wyraża retrowirusowe geny GAG, Pol i Env. W tym celu wirus pomocniczy pCL-Eco vector 7 dobrze sprawdza się w wytwarzaniu niekompetentnych retrowirusów o wysokim mianie replikacji. 
Tutaj opisane są te protokoły produkcji retrowirusowej i transdukcji pierwotnych mysich limfocytów T, oprócz niektórych naszych wyników, wykorzystując to podejście do badania regulacji miRNA ekspresji genów kontrolujących różnicowanie limfocytów T pomocniczych. miRNA to małe RNA o długości około 22 nukleotydów, które po transkrypcji regulują ekspresję genów, celując w homologiczne sekwencje w białku kodującym informacyjne RNA oraz hamując translację i indukcję Niestabilność wiadomości 8,9. miRNA odgrywają kluczową rolę w rozwojowej regulacji genów. Są one niezbędne na najwcześniejszych etapach rozwoju, ponieważ zarodki, które nie są w stanie wytwarzać miRNA, umierają na bardzo wczesnym etapie 10. Ponadto miRNA są ważne w późniejszym rozwoju wielu tkanek. Uważa się, że działają one poprzez precyzyjne dostrojenie ekspresji genów wymaganych do programów rozwojowych 1. W pomocniczych limfocytach T miRNA odgrywają wiele ról i są niezbędne do rozwoju regulatorowych limfocytów T (Treg) 11-14. Zastosowaliśmy transdukcję retrowirusową jako sposób na przeanalizowanie mechanizmów regulacji różnicowania limfocytów Treg 15 przez miRNA. Dzięki takim badaniom ważne indywidualne miRNA zostały określone przez nadekspresję za pośrednictwem retrowirusa. Następnie zidentyfikowano odpowiednie geny regulowane przez te miRNA, aby zrozumieć szlaki molekularne regulowane przez miRNA w różnicowaniu limfocytów T pomocniczych.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna roztwór</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Wektor</td> <td>MIGAddgene</td><td>Plasmid 9094</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco wektor</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 12371</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne mysz CD4 zestaw komórek&nbsp;</td><td>Invitrogen (Dynabeads)</td><td>11415D</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Streptawidyny&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-102</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do separacji komórek MS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do separacji komórek LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD25 Biotenylowane MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>85059</td><td>klon 7D4</td></tr><tr><td>CD62L Biotenylowany MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553149</td><td>klon MEL-14</td></tr><tr><td>Polybrene (bromek heksadimetryny)</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD3</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>klon 145-2C11&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-CD28</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>klon 37.51&nbsp;</td></tr><tr><td>Klon anty-IL-4</td><td>559062 BD Biosciences</td><td></td><td>11B11</td></tr><tr><td>Anty-IFN-gamma</td><td>Klon 559065 BD Biosciences</td><td></td><td>XMG1.2</td></tr><tr><td>Klon 554425 anty-IL-2</td><td>BD BiosciencesJES6-5H4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany IL-12 p70</td><td>eBiosciences</td><td>14-8121</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany IL-4</td><td>BD Biosciences</td><td>550067</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany TGF-beta</td><td>eBiosciences</td><td>14-8342-62</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana IL-6</td><td>eBiosciences</td><td>14-8061</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>PMA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBiosciences</td><td>00-4506</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td>Paraformaldehyd jest toksyczny, dlatego należy zachować odpowiednią ostrożność podczas obchodzenia się&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw barwiących Foxp3</td><td>eBiosciences</td><td>00-5523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4&nbsp; FITC</td><td>eBiosciences</td><td>11-0041</td><td>klon GK1.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-CD8a perCP-cy5.5</td><td>eBiosciences</td><td>45-0081-80</td><td>klon 53-6.7&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-MHCII PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0920</td><td>&nbsp; klon HIS19</td></tr><tr><td>Anti-CD25 PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0251-82</td><td>&nbsp; klon PC61.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-CD62L PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0621-82</td><td>klon MEL-14&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-CD44 APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0441</td><td>klon IM7&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-IFN-gamma FITC&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>11-7311-81</td><td>klon XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554435</td><td>klon 11B11</td></tr><tr><td>Anti-IL-9 PE lub APC</td><td>eBiosciences/Biolegend</td><td>50-8091-82/514104</td><td>klon RM9A4</td></tr><tr><td>Anti-IL-17a PE</td><td>BD Biosciences</td><td>559502</td><td>klon TC11-18H10</td></tr><tr><td>Anti-Foxp3&nbsp; APC lub PE</td><td>eBiosciences</td><td>17-5773-82/12-5773-80&nbsp;</td><td>klon FJK-16s</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza/Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, wolny kwas</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Dysodowy EDTA</td><td>Sigma</td><td>D2900000</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>237205</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr></tbody></table>

transdukcja retrowirusowa limfocytów t pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Rozwój i funkcja limfocytów T pomocniczych musi być ściśle regulowana, aby wywołać odpowiednią odpowiedź immunologiczną, która eliminuje określone patogeny, a jednocześnie zapobiega autoimmunizacji. Wykorzystano wiele podejść obejmujących różne organizmy modelowe, aby zrozumieć mechanizmy kontrolujące rozwój i funkcję limfocytów T pomocniczych. Jednak badania z wykorzystaniem modeli mysich okazały się bardzo pouczające ze względu na dostępność systemów genetycznych, komórkowych i biochemicznych. Jedno z podejść genetycznych u myszy stosowanych przez wiele laboratoriów obejmuje transdukcję retrowirusową pierwotnych limfocytów T pomocniczych. Jest to potężne podejście ze względu na jego względną łatwość, dzięki czemu jest dostępne dla prawie każdego laboratorium z podstawowymi umiejętnościami w zakresie biologii molekularnej i immunologii. W związku z tym wiele genów w formach dzikich lub zmutowanych można łatwo przetestować pod kątem funkcji w limfocytach T pomocniczych, aby zrozumieć ich znaczenie i mechanizmy działania. Zoptymalizowaliśmy to podejście i opisaliśmy tutaj protokoły produkcji retrowirusów o wysokim mianie, izolacji pierwotnych mysich limfocytów T pomocniczych oraz ich transdukcji przez retrowirusy i różnicowania w kierunku różnych podzbiorów pomocniczych. Wreszcie, zastosowanie tego podejścia opisano w odkrywaniu mechanizmów wykorzystywanych przez mikroRNA (miRNA) do regulacji szlaków kontrolujących rozwój i funkcję limfocytów T pomocniczych.

Sukces tego systemu eksperymentalnego wymaga wysokiej czystości populacji limfocytów T oraz preparatów retrowirusów o wysokim mianie. Reprezentatywne wyniki przedstawiono tutaj jako przykłady udanych eksperymentów. Rysunek 1 przedstawia typową czystość populacji przed i po selekcji na każdym etapie protokołu izolacji naiwnych limfocytów T pomocniczych. Rysunek 2 i 3 ilustrują analizę produkcji retrowirusów poprzez ekspresję GFP w transfektowanych komórkach HEK 293T (Rysunek 2) oraz transdukowanych limfocytach T (Rysunek 3). Wydajność transfekcji komórek HEK 293T może znacznie różnić się w zależności od konstrukcji retrowirusowych, ale często nie koreluje to z poziomem produkcji retrowirusów obserwowanym na podstawie liczby limfocytów T GFP+. Ponadto liczba limfocytów T GFP+ może się różnić w zależności od warunków polaryzacji. Co więcej, średni poziom ekspresji GFP i wstawionego genu może się różnić w zależności od liczby zintegrowanych kopii wirusa, wpływu miejsca integracji na transkrypcję oraz potranskrypcyjnych mechanizmów regulacyjnych wpływających na transkrypt wirusowy.
Wreszcie, Rycina 4 przedstawia typowe wyniki zaobserwowane podczas różnicowania limfocytów T pomocniczych przy nadekspresji miRNA miR-15b/16. Wyniki te ukazują zmienność, która może wystąpić w ramach pojedynczego eksperymentu, dlatego rzeczywiste efekty muszą zostać potwierdzone analizą statystyczną wielu powtórzeń eksperymentalnych z wykorzystaniem różnych preparatów limfocytów T pomocniczych. W tych eksperymentach odpowiedzi Th2 mogą być trudne do zaobserwowania w linii C57BL/6 użytej w badaniu, ponieważ wykazuje ona skłonność do odpowiedzi Th1. Podobnie, barwienie na IL-9 może być trudne do wykrycia powyżej poziomu tła. Dlatego niezbędne jest wykonanie kontroli izotypowych oraz odpowiednia kompensacja, aby zapewnić prawidłowe bramkowanie ekspresji cytokin. W naszych wynikach stwierdzono, że miR-15b/16 nasila indukcję iTreg poprzez hamowanie szlaku sygnałowego mTOR poprzez supresję ekspresji komponentów Rictor i mTOR 15. miR-15b/16 może czasami wpływać na różnicowanie Th0, Th1 i Th17 w pojedynczych eksperymentach, jednak nie stwierdzono istotnego efektu po analizie wielu powtórzeń eksperymentalnych. W przeciwieństwie do tego, nadekspresja miR-15b/16 istotnie hamuje różnicowanie Th9 (patrz referencja 18).
<img alt="Schematy cytometrii przepływowej selekcji CD4, CD25, CD62L w analizie komórek odpornościowych; wizualizacja danych." src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Typowa czystość limfocytów T pomocniczych na poszczególnych etapach izolacji. Przedstawiono reprezentatywne wyniki cytometrii przepływowej dla wskazanych antygenów z bramki żywych komórek wyznaczonej na wykresach rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC). (A) Przed i po negatywnej selekcji CD4. Pokazano profile ekspresji CD4, CD8a i MHCII. Ilustrują one wzbogacenie populacji limfocytów T pomocniczych oraz utratę limfocytów T cytotoksycznych i komórek wykazujących ekspresję MHC klasy II. Prawidłowe oczyszczanie powinno skutkować uzyskaniem ~90% limfocytów T CD4+ na tym etapie. (B) Selekcja CD25. Po lewej stronie znajdują się profile ekspresji CD4, CD8a i MHCII, a po prawej profile ekspresji CD4 i CD25 przed i po selekcji. Na tym etapie &gt;95% komórek poddanych negatywnej selekcji CD25 powinno być CD4+ CD25-. (C) Selekcja CD62L. Profile ekspresji CD4, CD8a i MHCII przedstawiono po lewej stronie. Po prawej stronie pokazano profile ekspresji CD62L i CD44 dla komórek przed i po selekcji CD62L, wraz z profilem ekspresji CD4 i CD62L komórek po selekcji. Po selekcji CD62L niemal wszystkie komórki pamięci (CD44+) zostają usunięte, pozostawiając silnie wzbogaconą populację naiwnych limfocytów T pomocniczych, która zawiera 10-15% komórek efektorowych (CD62Llow). Dla wszystkich profili FACS przez cały czas utrzymywano jednakowe ustawienia i skale dla konkretnych parametrów. Liczby reprezentują procent komórek w obrębie bramkowanej populacji. Nieznaczny spadek wielkości komórek po wstępnej selekcji wynika prawdopodobnie ze stresu mechanicznego podczas protokołu. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej; wykresy rozrzutu; ekspresja GFP w komórkach 293T; wydajność transfekcji." src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Analiza komórek HEK 293T po transfekcji retrowirusowej. Przedstawiono ekspresję GFP w komórkach HEK 293T, które nie były transfekowane lub zostały poddane transfekcji i przeanalizowane po zebraniu nadekspresji z kultur wirusowych. Analiza GFP została przeprowadzona na żywych komórkach z bramki na wykresie FSC i SSC w pierwszym panelu. Liczby reprezentują procent komórek GFP+ w obrębie bramkowanego obszaru. Typowa wydajność transfekcji mieści się w zakresie 30-90%. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej, ekspresja GFP, pMIG-miR-15b/16, różnicowanie limfocytów T, wykresy rozrzutu." src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza pomocniczych limfocytów T transdukowanych retrowirusem. Ekspresja GFP jest przedstawiona w transdukowanych retrowirusem pomocniczych limfocytach T po różnicowaniu w warunkach polaryzacji Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 i Treg przez trzy dni. Analizę ograniczono do żywych i aktywowanych komórek wskazanych na panelu FSC/SSC. Efektywność transdukcji może wynosić od 10-75% w zależności od konstruktu i warunków polaryzacji. Podobnie może różnić się średnia intensywność fluorescencji ekspresji GFP. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej różnicowania komórek odpornościowych; markery IL-4, IFNγ, Foxp3; sześć wykresów." src="/files/ftp_upload/54698/54698fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wpływ nadekspresji miR-15b/16 na różnicowanie pomocniczych limfocytów T w różnych warunkach polaryzacji. Przedstawiono reprezentatywne profile cytokin dla populacji komórek GFP+ z Ryciny 3. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Protokół przygotowania buforów, zawiera przepisy na NaCl, KCl, Na2HPO4, CaCl2, NH4Cl do eksperymentów laboratoryjnych." src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Bufory użyte w tych protokołach. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę jako arkusz Excel.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="3">Warunki polaryzacji limfocytów T pomocniczych</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Th0</td>
			<td >anti-IL-4 </td>
			<td >5 µg/ml</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >anti-IFN-γ </td>
			<td >5 µg/ml</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Th1</td>
			<td >recombinant-IL-12 </td>
			<td >20 ng/ml</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >anti-IL-4 </td>
			<td >5 µg/ml</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Th2</td>
			<td >recombinant IL-4 </td>
			<td >40 ng/ml </td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >anti-IFN-γ </td>
			<td >5 µg/ml</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Th9</td>
			<td >recombinant TGF-β </td>
			<td >2.5 ng/ml</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >recombinant IL-4</td>
			<td >40 ng/ml </td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >anti-IFN-γ </td>
			<td >10 µg/ml</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Th17</td>
			<td >recombinant TGF-β</td>
			<td >2.5 ng/ml </td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >recombinant IL-6</td>
			<td >50 ng/ml </td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >anti-IFN-γ</td>
			<td >5 µg/ml</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >anti-IL-4 </td>
			<td >5 µg/ml</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >anti-IL-2 </td>
			<td >5 µg/ml</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tregs</td>
			<td >recombinant TGF-β</td>
			<td >2.5 ng/ml </td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >recombinant IL-2</td>
			<td >5 ng/ml </td>
		</tr >
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Warunki polaryzacji podzbiorów pomocniczych limfocytów T.

Wiele eksperymentalnych systemów zostało wykorzystanych do zrozumienia mechanizmów regulujących rozwój i funkcję limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano podejście genetyczne wykorzystujące transdukcję retrowirusową, które jest ekonomiczne, efektywne czasowo, a co najważniejsze, bardzo pouczające w identyfikacji szlaków regulacyjnych.

Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest izolacja pierwotnych mysich limfocytów T pomocniczych oraz ich transdukcja retrowirusowymi konstruktami ekspresyjnymi dla genu zainteresowania. W celu zrozumienia mechanizmów regulujących rozwój i funkcję limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej wykorzystano wiele układów eksperymentalnych. W niniejszej pracy opisujemy podejście genetyczne z wykorzystaniem transdukcji retrowirusowej, która jest ekonomiczna, czasochłonna i dostarcza cennych informacji w identyfikacji szlaków regulacyjnych.Wykorzystaliśmy tę technikę do analizy funkcji mikroRNA, które są ważnymi regulatorami ekspresji genów. Dzięki transdukcji retrowirusowej mogliśmy badać funkcję poszczególnych mikroRNA oraz różnicowanie pomocniczych limfocytów T. Mój współpracownik, Oliver Garden, zaprezentuje izolację pierwotnych limfocytów T, natomiast ja zaprezentuję transdukcję retrowirusową.Na 24 godziny przed transfekcją przesiać konfluencyjną płytkę z komórkami w stosunku 1:10 na płytkę 10 centymetrową, tak aby następnego dnia komórki osiągnęły około 50% konfluencji. Na około godzinę przed transfekcją usunąć medium z komórek i ostrożnie dodać 9 mililitrów świeżego medium dla HEK293 T, aby zapobiec odklejeniu się komórek od płytki. Do probówki z okrągłym dnem o pojemności sześciu mililitrów lub stożkowej probówki 15-mililitrowej dodać pięć mikrogramów DNA retrowirusowego, pięć mikrogramów DNA wirusa pomocniczego oraz wodę do uzyskania objętości 420 mikrolitrów.Następnie dodaj 80 µl 2,5 M chlorku wapnia, aby uzyskać końcową objętość 500 µL. Po tym dodaj powoli, kropla po kropli, 500 µL 2x HBS do mieszaniny DNA, delikatnie mieszając na wortexie, aby roztwór był stale mieszany, a fosforan wapnia wytrącał się w postaci kryształów o jednolitym rozmiarze. Następnie przenieś mieszaninę DNA z fosforanem wapnia do komory z laminarnym przepływem powietrza.Powoli dodaj mieszaninę do komórek, stale i delikatnie kołysząc płytką, a następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze. Aby zebrać wirusa następnego dnia, usuń medium i nakarm komórki 10 mililitrami świeżego medium HEK293 T, uważając, aby nie oderwać komórek od płytki. Wieczorem nakarm komórki 3,5 mililitrami świeżego medium HEK293 T i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 godzin.Po około 12 godzinach należy zebrać pożywkę, a następnie ponownie zasilić komórki 3,5 ml świeżej pożywki dla HEK293 T. Zabieg zbierania pożywki należy powtórzyć jeszcze dwukrotnie w odstępach około 12 godzin, co pozwoli na zgromadzenie około 10 ml zapasu wirusa. W tej procedurze należy umieścić śledzionę i węzły chłonne w sitku do komórek, a następnie rozetrzeć je za pomocą tłoka strzykawki 5 ml.Następnie opłucz je jednym lub dwoma mililitrami medium R10. Potem przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki stożkowej i dopełnij objętość do 14 mililitrów za pomocą R10. Centryfuguj komórki przy 600 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie usuniąć supernatant, odlewając go jednym zdecydowanym ruchem, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Potem dodać do komórek dwa mililitry zimnego buforu do lizy erytrocytów. Wymieszać, a następnie umieścić komórki na lodzie na 3,5 minuty, delikatnie mieszając przez cały ten czas.Następnie dodaj 12 ml pożywki R10 i natychmiast odwiruj przy 600 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powtórz etapy płukania jeszcze dwukrotnie przy użyciu pożywki R10, aby usunąć z komórek pozostałości buforu do lizy krwinek czerwonych i zapobiec śmierci limfocytów. Na tym etapie odmierz do każdej probówki stożkowej 8-10 × 10⁷ komórek i odwiruj je przy 600 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odlej nadosad od jednym zdecydowanym ruchem, aby nie zakłócić osadu komórkowego. Następnie resuspenduj komórki w 100 µL inaktywowanego termicznie FBS. Dalej, dodaj do komórek 100 µL mieszaniny przeciwciał i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając na rotatorze.Następnie ponownie zawiesić kuleczki w fiolce, mieszając je na wortexie przez ponad 30 sekund. Następnie przenieść kuleczki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 2 ml medium R10 na każdy jeden mililitr kuleczek. Umieścić probówkę w magnesie na jedną minutę.Następnie odlej supernatant i resuspenduj kuleczki w 4 ml pożywki R10. Po zakończeniu inkubacji z przeciwciałami przemyj komórki, dodając 10 ml pożywki R10 do każdej probówki, a następnie wiruj przy 600 ×g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlej supernatant jednym zdecydowanym ruchem, aby nie zaburzyć osadu komórkowego, a następnie resuspenduj komórki w 1 ml pożywki R10.Następnie do probówki z komórkami traktowanymi przeciwciałami należy dodać 2 mililitrów przemytych kulek i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając na rollerze. Następnie mieszaninę komórek i kulek należy resuspender, delikatnie pipetując pięć razy, a potem umieścić probówkę w magnesie do kulek na dwie minuty. NadCzynność przenosi się supernatant zawierający komórki wyselekcjonowane negatywnie do nowej probówki i powtarza proces selekcji negatywnej jeszcze raz.W tej procedurze odwiruj limfocyty T CD4-dodatnie przy 600 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawieś w 150–200 µL medium R10 na 10⁸ komórek. Następnie dodaj do komórek 2 µL roztworu stokowego biotynilowanych przeciwciał monoklonalnych CD25 i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając na walcarku. Po tym czasie przemyj komórki, dodając 10 ml buforu do kolumn do separacji komórek, i odwiruj przy 600 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Następnie należy usunąć jak największą ilość supernatantu i zawiesić komórki w objętości końcowej wynoszącej około 90 µL na 10⁷ komórek. Następnie należy dodać 20 µL kuleczek streptawidyny na 10⁷ komórek i wymieszać delikatnie, potrząsając probówką. Następnie inkubować je przez 15 minut w temperaturze 4 °C.Podczas inkubacji komórek należy przygotować kolumny MS. Po zakończeniu inkubacji przemyć komórki, dodając 10 mililitrów buforu do kolumn do separacji komórek, a następnie wirując przy 600 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić komórki w 500 µL buforu do kolumn do separacji komórek na każde 10⁸ komórek.Następnie nałóż 500 µL zawiesiny komórkowej na kolumnę i zbierz przelew. Przepuść go przez kolumnę jeszcze raz i ponownie zbierz przelew. Następnie przemyj kolumnę trzykrotnie, używając po 500 µL buforu do kolumn do separacji komórek, a każdy przelew dodaj do zebranych komórek CD25 negatywnych.Przeprowadź płukanie, wiązanie kulek z streptawidyną oraz przygotowanie kolumny do separacji komórek zgodnie z wcześniejszymi opisami, ale zastosuj kolumnę LS. Tym razem odrzuć frakcję przepływową i wypłucz komórki z kolumny za pomocą dołączonego tłoka. Podczas izolowania naiwnych limfocytów T, pokryj 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej przeciwciałami anty-CD3 oraz anty-CD28 rozcieńczonymi w DPBS i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 °C.Bezpośrednio przed hodowlą komórek przemyj płytkę 250 µL DPBS na dołek, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Następnie usuń DPBS i dodaj 1 mL naiwnych komórek T CD4 dodatnich w medium R10 na noc. Następnego dnia odwiruj komórki z prędkością 900 ×g przez 10 minut w temperaturze 30 °C.Następnie zebrać pożywkę i dodać 1 milliliter supernatantu z hodowli wirusa, przygotowanego zgodnie z protokołem produkcji wirusa. Następnie dodać 1 microliter polybrene o stężeniu eight milligrams per milliliter oraz 10 microliters HEPES 1 molar, aby wspomóc wchłanianie wirusa, a następnie wirować komórki przy 900 times G przez 90 minutes w temperaturze 30 degrees celsius. Aby zróżnicować komórki, ostrożnie usunąć supernatant z hodowli wirusa i dodać 1 milliliter wcześniej zebranej pożywki, ponieważ zawiera ona IL2 oraz inne czynniki wzrostu limfocytów T.Następnie należy dodać odczynniki wskazane w tabeli 2 towarzyszącego manuskryptu i hodować komórki przez trzy do czterech dni, aby zróżnicować je w konkretne podgrupy. Rysunek ten przedstawia typową czystość populacji przed i po selekcji na każdym etapie protokołu izolacji naiwnych limfocytów T pomocniczych. Profile ekspresji CD4, CD8A, MHC II, CD25, CD62L i CD44 ilustrują utratę komórek MHC klasy 2 oraz limfocytów T cytotoksycznych, regulacyjnych i pamięci.Daje to populację, w której ponad 95% stanowią limfocyty T CD4+, z czego około 85% do 90% to komórki naiwne, a pozostałe 10% do 15% to komórki efektorowe. Na tej rycinie pokazano ekspresję GFP w komórkach HEC293 T, które nie były transfekowane lub zostały poddane transfekcji, a następnie przeanalizowano po zebraniu nadsączów z kultur wirusowych. Analiza GFP została przeprowadzona na żywych komórkach wyznaczonych w bramce na wykresie FSE i SSE.Typowa wydajność transfekcji mieści się w zakresie od 30% do 90%. Tutaj pokazano ekspresję GFP w komórkach pomocniczych T poddanych transdukcji retrowirusowej po różnicowaniu w warunkach polaryzacji Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 i T reg przez trzy dni. Wydajność transdukcji waha się od 10% do 75% w zależności od konstruktu i warunków polaryzacji. Poniżej przedstawiono reprezentatywne profile cytokin w różnicowaniu komórek pomocniczych T w różnych warunkach polaryzacji.Po opanowaniu te techniki mogą stać się potężnym narzędziem do analizy funkcji genów oraz rozwoju i funkcji limfocytów T pomocniczych. Należy jednak pamiętać, że rzetelne wyniki zależą od jakości komórek i odczynników. Dlatego istotne jest zoptymalizowanie protokołów transdukcji oraz procesów izolacji i różnicowania limfocytów T pomocniczych.

retroviral-transduction-helper-t-cells-as-genetic-approach-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Przedstawiamy szybki i elastyczny protokół dla systemu ekspresji in vivo opartego na pojedynczym receptorze limfocytów T (TCR).  Wektory retrowirusowe są wykorzystywane do transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu zbadania rozwoju i funkcji pojedynczych komórek T in vivo jako alternatywy dla myszy transgenicznych TCR.

Transdukcja retrowirusowa komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia myszy retrogenicznych receptora komórek T

Tutaj opisujemy protokół mapowania całego genomu miejsc integracji wektorów retrowirusowych opartych na wirusie mysiej białaczki Moloneya w komórkach ludzkich.

Skanowanie retrowirusowe: mapowanie miejsc integracji MLV w celu zdefiniowania regionów regulatorowych specyficznych dla komórki

Przedstawiamy 9-dniowy protokół transdukcji i ekspansji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej makaków rezusów, który daje komórki o doskonałej koekspresji interesujących genów w liczbie wystarczającej do badań infuzyjnych skuteczności komórek.

Transdukcja i ekspansja pierwotnych limfocytów T w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu pamięci centralnej

Ten protokół opisuje izolację podwójnie ujemnych tymocytów z grasicy myszy, a następnie transdukcję retrowirusową i kohodowlę w systemie kohodowli linii komórek zrębu szpiku kostnego z ekspresją delta 4 (OP9-DL4) w celu dalszej analizy funkcjonalnej.

Współhodowla i transdukcja mysich tymocytów na komórkach zrębowych z ekspresją 4 podobną do delta w celu badania onkogenów w białaczce z komórek T

Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV

Przedstawiamy protokół retrowirusowej transdukcji przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T od transgenicznych myszy Cas9, zapewniając efektywną alternatywę dla edycji genów w badaniu różnicowania Th17.

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

Przedstawiamy ulepszone protokoły transdukcji retrowirusowej receptorów transportowych i konkurencyjnego naprowadzania w celu zbadania lokalizacji limfocytów specyficznych dla narządów i mikrośrodowisk za pośrednictwem receptorów. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów transportu komórek odpornościowych i ma potencjalne zastosowania w przyszłych badaniach podstawowych i terapeutycznych.

Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

Poznaj metodę izolacji pierwotnych limfocytów T pomocniczych myszy i ich transdukcji retrowirusowej do badania funkcji mikroRNA. Protokół umożliwia analizę szlaków regulacyjnych w różnicowaniu komórek T.

Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję (Wideo) | JoVE Journal

Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

Przeglądaj więcej filmów