Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

Ogólnym celem tego protokołu jest wyizolowanie pierwotnych mysich limfocytów T pomocniczych i transdukcja ich za pomocą retrowirusowych konstruktów ekspresyjnych dla interesującego genu. Wykorzystano wiele systemów eksperymentalnych, aby zrozumieć mechanizmy regulujące rozwój i funkcję limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy podejście genetyczne wykorzystujące transdukcję retrowirusową, które jest ekonomiczne, efektywne czasowo i bardzo pouczające w identyfikacji szlaków regulacyjnych.

Wykorzystaliśmy tę technikę do analizy funkcji mikroRNA, które są ważnymi regulatorami ekspresji genów. Korzystając z transdukcji retrowirusowej, byliśmy w stanie przetestować funkcję poszczególnych mikroRNA i różnicowanie limfocytów T wspomagających. Mój współpracownik, Oliver Garden, będzie demonstrował pierwotną izolację limfocytów T, a ja będę demonstrował transdukcję retrowirusową.

Na 24 godziny przed transfekcją należy podzielić zlewającą się płytkę komórek w stosunku 1:10 na 10-centymetrowej płytce, tak aby następnego dnia komórki były w około 50% zlewające się. Na około godzinę przed transfekcją należy usunąć pożywkę z komórek i ostrożnie dodać 9 mililetów świeżej pożywki T HEK293, aby zapobiec oderwaniu się komórek od płytki. W sześciomililitrowej okrągłej dennej lub 15-mililitrowej stożkowej probówce dodaj pięć mikrogramów retrowirusowego DNA, pięć mikrogramów DNA wirusa pomocniczego i wodę do objętości 420 mikrolitrów.

Następnie dodaj 80 mikrolitrów 2,5-molowego chlorku wapnia, aby uzyskać ostateczną objętość do 500 mikrolitrów. Następnie powoli dodawaj 500 mikrolitrów 2x HBS kropla po kropli do mieszaniny DNA, delikatnie wirując, tak aby roztwór był stale mieszany, a fosforan wapnia wytrącał się w równych kryształach. Następnie przenieś mieszaninę DNA fosforanu wapnia do okapu do hodowli tkankowej.

Powoli dodawać mieszaninę do komórek, stale i delikatnie obracając płytkę, przed ponownym umieszczeniem komórek w inkubatorze. Aby zebrać wirusa następnego dnia, usuń pożywkę i nakarm komórki 10 mililitrami świeżej pożywki HEK293 T, uważając, aby nie usunąć komórek z płytki. Wieczorem nakarm komórki 3,5 mililitra świeżej pożywki T HEK293 i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 godzin.

Po około 12 godzinach zbierz pożywkę i ponownie nakarm komórki 3,5 mililitra świeżej pożywki HEK293 T. Powtórz zbieranie pożywki jeszcze dwa razy, w odstępach około 12-godzinnych, co spowoduje zebranie około 10 mililitrów zapasu wirusa. W tej procedurze dodaj śledzionę i węzły chłonne do sitka komórkowego i maceruj za pomocą końcówki pięciomililitrowego tłoka strzykawki.

Następnie spłucz je jednym do dwóch mililitrów pożywki R10. Następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej rurki i zwiększ objętość do 14 mililitrów za pomocą R10. Odwirować komórki w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć supernatant, wylewając go jednym czystym ruchem, aby zapobiec naruszeniu podniebienia komórkowego. Następnie dodaj dwa mililitry zimnego buforu do lizy czerwonych krwinek do komórek. Wymieszaj, a następnie umieść komórki na lodzie na 3,5 minuty, delikatnie mieszając przez cały czas.

Następnie dodaj 12 mililitrów pożywki R10 i natychmiast odwiruj w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wykonaj etapy płukania jeszcze dwa razy pożywką R10, aby usunąć resztki buforu do lizy krwinek czerwonych z komórek i uniknąć śmierci limfocytów. Na tym etapie podamy od ośmiu do dziesięciu komórek razy dziesięć do siódmych na stożkową probówkę i odwirowujemy je w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odlej supernatant jednym czystym ruchem, aby zapobiec zaburzeniu podniebienia komórkowego. Następnie ponownie zawieś ogniwa i 100 mikrolitrów ciepła dezaktywowanego FBS. Następnie dodaj 100 mikrolitrów mieszanki przeciwciał do komórek i inkubuj przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza, delikatnie mieszając na wałku.

Następnie ponownie zawiesić kulki w fiolce, wirując je przez ponad 30 sekund. Następnie przenieś kulki do 15-mililitrowej stożkowej rurki i dodaj 2 mililitry pożywki R10 na mililitr kulek. Umieść rurkę w magnesie na jedną minutę.

Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś kulki w czterech mililitrach pożywki R10. Umyj komórki pod koniec inkubacji przeciwciał, dodając 10 mililitrów pożywki R10 na probówkę i odwiruj w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Wylej supernatant jednym czystym ruchem, aby zapobiec zaburzeniu podniebienia komórkowego, a następnie ponownie zawieś komórki w 1 mililitrze pożywki R10.

Następnie dodaj 2 mililitry umytych kulek do probówki z komórkami traktowanymi przeciwciałami i inkubuj przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając na wałku. Następnie ponownie zawiesić mieszaninę kulek komórkowych, delikatnie głaszcząc pięć razy przed umieszczeniem rurki w magnesie kulkowym na dwie minuty. Przenieś supernatant zawierający ujemnie wybrane komórki do nowej probówki i powtórz selekcję ujemną jeszcze raz.

W tej procedurze odwirować limfocyty T CD4 dodatnie w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić w 150 do 200 mikrolitrach pożywki R10 na dziesięć do ósmych komórek. Następnie dodaj do komórek dwa mikrolitry podstawowych biotinulowanych przeciwciał monocoil CD25 i inkubuj przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając na wałku. Następnie umyj komórki, dodając 10 mililitrów buforu kolumny do separacji komórek i odwiruj w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie usuń jak najwięcej supernatantu i ponownie zawieś komórki do końcowej objętości około 90 mikrolitrów na 10 do siódmych komórek. Następnie dodaj 20 mikrolitrów kulek streptawidyny na 10 do siódmych komórek i wymieszaj delikatnymi ruchami. Następnie inkubuj je przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Podczas inkubacji komórek przygotuj kolumny MS. Pod koniec inkubacji umyć komórki, dodając 10 mililitrów buforu kolumny do separacji komórek i odwirowując w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu kolumny separacji komórek, na 10 do ósmych komórek.

Następnie nanieść 500 mikrolitrów zawiesiny komórek na kolumnę i zebrać przepływ. Przełóż go jeszcze raz przez kolumnę i ponownie zbierz przepływ. Następnie przepłukać kolumnę trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu kolumny do separacji komórek i dodać każdy przepływ do zebranych komórek ujemnych CD25.

Wykonaj płukanie, wiązanie kulek streptawidyny i przygotowanie kolumny do separacji komórek, jak wspomniano wcześniej, ale zamiast tego użyj kolumny LS. Tym razem odrzuć przepływ i przepłucz komórki z kolumny za pomocą dostarczonego tłoka. Podczas izolowania naiwnych limfocytów T pokryj 24 płytkę do hodowli dzikich tkanek przeciwciałami anty CD3 i anty CD28 rozcieńczonymi w DPBS i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Bezpośrednio przed hodowlą komórek należy przemyć płytkę 250 mikrolitrami DPBS na dołek, aby usunąć niezwiązane przeciwciało. Następnie usuń DPBS i dodaj 1 mililitr naiwnych limfocytów T CD4-dodatnich w pożywce R10 przez noc. Następnego dnia odwiruj komórki w temperaturze 900 razy G przez 10 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Następnie zebrać pożywkę i dodać 1 mililitr supernatantu kultury wirusa, przygotowanego z protokołu produkcji wirusa. Następnie dodaj 1 mikrolitr ośmiu miligramów na mililitr polibrenu i 10 mikrolitrów jednego molowego hepes, aby wspomóc wchłanianie wirusa przed odwirowaniem komórek w temperaturze 900 razy G przez 90 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Aby zróżnicować komórki, ostrożnie usuń supernatant kultury wirusa i dodaj 1 mililitr zebranej wcześniej pożywki, ponieważ zawiera ona IL2 i inne czynniki wzrostu limfocytów T.

Następnie dodać odczynniki wskazane w Tabeli 2 dołączonego manuskryptu i hodować komórki przez trzy do czterech dni, aby zróżnicować komórki w określone podzbiory. Rysunek ten pokazuje typową czystość wybranych populacji przed i po na każdym etapie protokołu izolacji naiwnych pomocniczych limfocytów T. Profile ekspresji CD4, CD8A, MHC II, CD25, CD62L i CD44 ilustrują utratę komórek MHC klasy 2 oraz komórek T cytotoksycznych, regulatorowych i pamięci.

Powoduje to, że populacja jest większa niż 95%% procent limfocytów T CD4-dodatnich, z czego około 85% do 90% to komórki naiwne, a pozostałe 10% do 15% to komórki efektorowe. Na tym rysunku ekspresja GFP jest pokazana N w limfocytach T HEC293, które były albo nietransfekowane, albo transfekowane, i analizowane po zebraniu supernatantów z kultur wirusowych. Analizę GFP przeprowadzono na żywych komórkach z bramki na poletku FSE i SSE.

Typowa skuteczność transfekcji waha się od 30% DO 90% Tutaj ekspresja GFP jest pokazana w retro transdukowanych wirusowo limfocytach pomocniczych T po różnicowaniu w warunkach polaryzacji Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 i T reg przez trzy dni. Skuteczność transdukcji waha się od 10% do 75% w zależności od konstrukcji i warunków polaryzacji. Oto reprezentatywne profile cytokin dotyczące różnicowania limfocytów T pomocniczych w różnych warunkach polaryzacji.

Po opanowaniu, techniki te mogą być potężnym sposobem analizy funkcji genów oraz wspomagania rozwoju i funkcji limfocytów T. Pamiętaj tylko, że wyniki informacyjne zależą od jakości komórek i odczynników. Dlatego ważne jest, aby zoptymalizować protokoły transdukcji oraz izolację i różnicowanie limfocytów T pomocniczych.