Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Ogólnym celem tego protokołu składania DNA jest umożliwienie powtarzalnej, skalowalnej, zautomatyzowanej, wysokowydajnej produkcji urządzeń DNA. Prace te są odpowiedzią na zapotrzebowanie na solidny i przyjazny dla użytkownika przepływ pracy oprogramowania, który może generować instrukcje pipetowania dla osoby zajmującej się obsługą cieczy w oparciu o wysokopoziomowe projekty urządzeń DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że automatyczne przygotowanie reakcji jest powtarzalne i skalowalne oraz wymaga zaledwie 4% czasu pracy w porównaniu z przygotowaniem ręcznym.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy automatyzacji mogą być trudne do nauczenia się i stanowią połączenie metod eksperymentalnych i obliczeniowych. Na potrzeby tego badania opracowano narzędzie programowe, które może zautomatyzować generowanie skryptów. Korzystając z dowolnej przeglądarki internetowej, przejdź do MoCloAssembly.

com i prześlij pliki GenBank dla wszystkich części DNA, które zostaną uwzględnione w projekcie kombinatorycznego urządzenia DNA. Po przesłaniu wszystkich plików wybierz żądane części DNA. Można wybierać zarówno kolekcje części, jak i poszczególne artykuły.

Przeciągnij części na puste płótno. Uporządkuj części DNA w taki sposób, aby pięć nawisów pierwszych i trzy nawisy pierwsze dla każdej części pasowały. Umieść typy części w zamierzonej ostatecznej kolejności części DNA.

Kliknij złóż w prawym dolnym rogu strony. Należy pamiętać, że narzędzie programowe wygeneruje tylko prawidłowe zespoły do zbudowania na podstawie czterech zwisów par zasad, które otaczają każdą część po trawieniu enzymem BSA1. Przejdź do zakładki Plany i pobierz pliki wygenerowane przez narzędzie.

Pliki te będą zawierały czytelne dla człowieka mapy płyt dla naukowców w celu przygotowania próbek DNA, a także odczynników niezbędnych do reakcji, listę wyboru dla osoby zajmującej się obsługą cieczy oraz w pełni opatrzone adnotacjami pliki GenBank dla wszystkich urządzeń DNA, które mają zostać złożone. Przed rozpoczęciem modułowego składania DNA należy przygotować plazmidowe DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Najważniejszym etapem tej procedury jest prawidłowe wypełnienie płytki nastawczej i płytki odczynnikowej przy użyciu map płytki wygenerowanych przez narzędzie.

Postępując zgodnie z mapą płytek w pliku PDF wygenerowanym przez narzędzie do montażu, umieść wskazaną objętość każdej rozcieńczonej części DNA w odpowiednim dołku na 96-dołkowej płytce PCR z pełną osłoną. Trzymaj tę płytkę nastawczą na lodzie, aż będzie potrzebna. Na lodzie przygotować główną mieszankę reakcyjną z następującymi składnikami.

Na każde 20 mikrolitrów reakcji dodaj dwa mikrolitry buforu ligazy DNA 0X T4, 0,5 mikrolitra ligazy DNA T4 i jeden mikrolitr enzymu BSA1. Postępując zgodnie z mapą płytki odczynnika na płytce z odczynnikiem w wygenerowanym pliku PDF, rozprowadź główną mieszaninę enzymów do odpowiednich dołków nowej 96-dołkowej płytki PCR z pełną osłoną. Płytkę z odczynnikiem należy przechowywać na lodzie lub na 96-dołkowym zimnym bloku.

Aby rozpocząć tę procedurę, umieść płytkę nastawczą i płytkę odczynnika na pokładzie urządzenia do obsługi cieczy. Dołącz pustą, 96-dołkową płytkę do PCR z pełną spódnicą. Pusta płytka będzie płytą wyjściową, na której montowane są reakcje.

Przygotuj oprogramowanie sterujące do obsługi cieczy, tworząc instancje każdej próbki i przygotowanej płytki odczynnika, upewniając się, że nazywasz je dokładnie tak, jak pojawiają się na mapach płytek generowanych przez MoCloAssembly. com w tym koryto z czystą wodą dejonizowaną oznaczoną zbiornikiem. Korzystając z polecenia Worklist w oprogramowaniu sterującym, załaduj plik GWL wygenerowany przez nasze narzędzie programowe, a następnie kolejne polecenie Worklist, które wykona plik GWL załadowany w pierwszym poleceniu.

Wykonaj skrypt za pomocą polecenia Uruchom oprogramowania kontrolera. Po tym, jak zrobotyzowany pracownik do obsługi cieczy zakończy wykonywanie skryptu, usuń wszystkie płytki z pokładu urządzenia do obsługi cieczy. Zachowaj pozostałe DNA, uszczelniając płytkę nastawczą aluminiową folią uszczelniającą i przechowując w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Uszczelnij płytę wyjściową folią samoprzylepną, umieść w termocyklerze lub bloku grzewczym i uruchom z następującymi parametrami cyklu: 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, 50 stopni Celsjusza przez pięć minut, 80 stopni Celsjusza przez 10 minut i trzymaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zachować sterylność, procedurę tę należy wykonywać w pobliżu otwartego ognia.

Rozmrozić wymaganą liczbę kompetentnych porcji komórek E. coli potrzebnych na lodzie. Podczas rozmrażania komórek przygotuj płytki agarowe LB zawierające odpowiedni antybiotyk. Przygotuj mieszankę wzorcową zawierającą IPTG i X-GAL.

Odpipetować 100 mikrolitrów wzorca na powierzchnię każdej płytki i użyć szklanych kulek, aby równomiernie pokryć płytkę. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut przed posiewem bakterii. Przygotować płytkę transformacyjną, rozdzielając 10 mikrolitrów kompetentnych komórek do każdej reakcji na nową 96-dołkową płytkę PCR na lodzie.

Dodać od jednego do trzech mikrolitrów każdej reakcji z płytki wyjściowej do odpowiedniego dołka na płytce transformacyjnej i inkubować na lodzie przez pięć minut. Uszczelnij płytkę transformacyjną folią samoprzylepną i poddaj szokowi termicznemu w termocyklerze w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Natychmiast umieść talerz na lodzie na dwie minuty.

Do tych samych dołków płytki transformacyjnej dodać 150 mikrolitrów pożywki SOC, uszczelnić uszczelką klejącą i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 900 obr./min przez godzinę. Po upływie jednej godziny umieścić pełną zawartość każdej studzienki płytki transformacyjnej na przygotowanych wcześniej płytkach agarowych LB. Użyj szklanych koralików, aby równomiernie pokryć powierzchnię talerza.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia po przemianie przygotuj jeden lub kilka 96-dołkowych bloków hodowli głębinowej z 1,5 mililitra bulionu LB na studzienkę. Używając sterylnej wykałaczki i pracując w pobliżu otwartego ognia, wybierz pojedyncze białe kolonie z każdej płytki agarowej LB przekształconych reakcji i zaszczepij blok hodowli głębinowej.

Uszczelnij blok hodowli uszczelką przepuszczającą gaz i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 900 obr./min przez noc. Następnie wyizoluj DNA osocza z kultur bakterii za pomocą dowolnego dostępnego na rynku zestawu i prześlij do sekwencjonowania Sangera w celu weryfikacji klonów. Czasy montażu reakcji porównano we wszystkich trzech modalnościach.

Ręczny montaż trwał dwie godziny i 10 minut, z czego cały czas był to czas pracy praktycznej. Osoba zajmująca się obsługą cieczy potrzebowała podobnej ilości czasu na wykonanie poleceń pipetowania, jednak tylko pięć minut z tego czasu było zajęte ręcznie. Dozownik akustyczny zajmował znacznie mniej czasu na przenoszenie płynów i przy minimalnym czasie pracy.

Ten wykres przedstawia koszt reakcji dla każdej metody montażu. Koszt ten obejmuje cenę użytych enzymów i końcówek do pipet. Prawidłowe sekwencje uzyskano dla 95% z 96 zestawów ręcznych i płynów.

Tylko 12 z pełnych 96 zestawów zostało przekształconych z próbek przygotowanych przez dozownik akustyczny, a 83% było prawidłowych. Dwie reakcje nie przyniosły żadnych białych kolonii, prawdopodobnie z powodu niewystarczającego wymieszania kropelek DNA i głównej mieszanki enzymów na płytce wyjściowej. Porównanie skuteczności reakcji klonowania mierzonej stosunkiem białych kolonii do całkowitej liczby kolonii pokazuje porównywalne wartości procentowe dla reakcji składanych ręcznie i z cieczą.

Korzystając z naszego narzędzia, naukowcy mogą wykorzystać roboty do obsługi cieczy do konstruowania kombinatorycznych bibliotek DNA. Metoda ta jest powtarzalna, skalowalna, oszczędza cenny czas badaczy i zmniejsza prawdopodobieństwo błędów pipetowania, które wynikają z wykonywania przez ludzi powtarzalnych, złożonych zadań pipetowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak generować zestawy kombinatoryczne do modułowych reakcji klonowania za pomocą naszego narzędzia online oraz jak wykonać dwa wygenerowane skrypty pipetowania na robocie do obsługi cieczy.

Wyobrażamy sobie, że zautomatyzowane składanie DNA za pomocą robotów do obsługi cieczy będzie tylko jednym z kroków w przyszłych laboratoriach biologii syntetycznej. Spodziewamy się, że wraz ze wzrostem złożoności projektu takie podejścia będą coraz bardziej powszechne i cieszymy się, że udało nam się wykonać ten pierwszy krok w tym procesie.