Name: Mysi model kolonizacji pochwy paciorkowcami grupy B (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj metodę kolonizacji pochwy paciorkowcami grupy B u myszy, osiągającą ponad 90% skuteczność bez znieczulenia. Model ten umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza i czynników bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować kierownikowi wiwarium i personelowi Uniwersytetu Stanowego w San Diego za wsparcie w hodowli zwierząt. Podczas tej pracy K.A.P. był wspierany przez stypendium ARCS oraz stypendium Fundacji Inamori. K.S.D. jest wspierany przez grant R01, NS051247, z National Institutes of Health.

Wszystkie prace na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Biuro Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi na Uniwersytecie Stanowym w San Diego i przeprowadzone zgodnie z przyjętymi standardami weterynaryjnymi. Do opracowania tej metody wykorzystano samice myszy w wieku 8 - 16 tygodni.
1. Przygotowanie i dootrzewnowe wstrzyknięcie β-estradiolu
<ol>
	<li>Odmierzyć β-estradiol (0,5 mg/mysz) na papierze wagowym, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE). UWAGA: β-estradiol może być wchłaniany przez skórę i powierzchnię błony śluzowej.</li>
	<li>Przenieś β-estradiol do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wiruj, aż wszystkie grudki zostaną usunięte, a β-estradiol stanie się drobnym proszkiem. Pobrać olej sezamowy (100 μl/mysz) do strzykawki o pojemności 10 ml. Strzykawka filtruje olej sezamowy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej β-estradiol za pomocą filtra 0,45 μm. Wirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml, aż β-estradiol stanie się jednorodną zawiesiną w oleju sezamowym.</li>
	<li>Pobrać zawiesinę β-estradiolu do nowej strzykawki o pojemności 10 ml. Z 18 G, 1-calowym. igła, podwielokrotność 100 μl zawiesiny do 1 ml strzykawek tuberkulinowych. Przygotować jedną strzykawkę dla każdej myszy. Umieść nowy, sterylny 26 G, 1/2 cala. igły na każdej strzykawce tuberkuliny.</li>
	<li>Podawać 0,5 mg β-estradiolu zawieszonego w 100 μl oleju sezamowego (5 mg/ml) każdej myszy na 24 godziny przed inokulacją bakteryjną. Wstrzyknąć każdą mysz w jamę otrzewnową, w dolnych kwadrantach brzucha, po prawej lub lewej stronie linii środkowej, jak opisano wcześniej28, 
	UWAGA: Nie jest konieczne czyszczenie ani przycinanie miejsca wstrzyknięcia.</li>
</ol>
2. Inokulacja dopochwowa za pomocą GBS
<ol>
	<li>Na jeden dzień przed inokulacją należy wyhodować 5 ml płynnej kultury przez noc interesującego szczepu GBS, takiego jak A909 (serotyp Ia), w bulionie Todda Hewitta (THB) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Subkultura przez noc GBS w objętości 1:10 do świeżego THB i inkubacja w temperaturze 37 °C. Wyhodować bakterie do połowy fazy logarytmicznej (OD600 = 0,4-0,5). UWAGA: Zwykle zajmuje to od 2 do 3 godzin, w zależności od szczepu GBS.</li>
	<li>Przenieść subkulturę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osadzać bakterie w granulkach o masie 3 000 × g przez 5 minut. Odessać supernatant. Zawiesić osad bakteryjny w 200 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Używając zawieszonego osadu, doprowadzić 3 - 5 ml PBS (1 ml na 10 myszy) dokładnie do OD600 = 0,4 w nowej 5-mililitrowej probówce hodowlanej. Będzie to stężenie ~ 1 × 108 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml. Przenieść do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i ponownie granulować bakterie w ilości 3 000 × g przez 5 minut. Odessać supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w PBS na poziomie 1/10 pierwotnej objętości. Na przykład, jeśli 3 ml OD600 = 0,4 zostało granulowane, to ponownie zawiesić je w 300 μl PBS. UWAGA: Jest to końcowa zawiesina bakteryjna (~ 1 ×10 9 CFU/ml) stosowana do inokulacji zwierząt.</li>
	<li>Zachować 50 μl tej zawiesiny do seryjnego rozcieńczania i powlekania na agarze THB w celu określenia dokładnego inokulum.</li>
	<li>Zaszczepić każdą mysz 10 μl końcowej zawiesiny bakteryjnej, tak aby każdej myszy podano 1 ×10 7 jtk.
	<ol>
		<li>Aby zaszczepić, należy ręcznie unieruchomić mysz, zabezpieczając luźną skórę na karku między kciukiem a palcem wskazującym przewodnika, a następnie unieruchamiając ogon, jak opisano wcześniej28.</li>
		<li>Pobrać 10 μl GBS przygotowanego w kroku 2.6 do końcówki pipety o objętości 200 μl z żelem. Włóż końcówkę na 5 do 10 mm do światła pochwy i dozuj 10 μl inokulum. 
		UWAGA: Końcówki do ładowania żelem są preferowane w stosunku do standardowych końcówek o pojemności 200 μl, aby zminimalizować ryzyko urazu lub urazu narządów, szczególnie u młodszych lub mniejszych myszy.</li>
		<li>Bezpośrednio po zaszczepieniu zwolnij kark i unieś tylny koniec myszy, unosząc mysz za ogon i chodząc przednimi łapami po twardej powierzchni przez ~ 1 min.</li>
		<li>Sprawdź wzrokowo otwór pochwy pod kątem cofania się inokulum. W przypadku zaobserwowania przepływu wstecznego, można użyć świeżej końcówki pipety do manipulowania lub powiększania otworu pochwy, ułatwiając wchłanianie przepływu wstecznego do światła. Dodatkowo przepływ zwrotny może być odessany za pomocą pipety i ponownie zaszczepiony. 
		UWAGA: W przypadku podawania środków miejscowych, organizmów probiotycznych lub białek będących przedmiotem zainteresowania, do dróg pochwowych można podać objętość do 20 μl w buforze fizjologicznym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wymaz z pochwy w celu ilościowego określenia obciążenia GBS
<ol>
	<li>Przygotuj jedną probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml na mysz, dodając 100 μl PBS. Tuż przed pobraniem wymazu należy go wstępnie zwilżyć w PBS.</li>
	<li>Unieruchomić mysz zgodnie z opisem w kroku 2.7.1 i włożyć wacik na 10 mm do światła pochwy. Delikatnie obróć wacik 4 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara i 4 razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, lekko naciskając na ścianę pochwy.</li>
	<li>Przenieś wacik do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml ze 100 μl PBS. Przed posiewem należy wirować probówkę mikrowirówki przez ~15 sekund, aby uwolnić bakterie z wacika. Każdą próbkę należy seryjnie rozcieńczyć w PBS i rozcieńczyć 20 μl roztworów w stosunku 1:10 do 1:10 000 na płytkach agarowych z podłożem różnicowym, przygotowanych zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Kolonie GBS będą miały kolor jasnoróżowy lub fioletowy. Inna endogenna flora zostanie zahamowana lub pojawi się jako niebieskie, białe lub szare kolonie.</li>
</ol>
4. Zbieranie płynu do płukania pochwy
<ol>
	<li>Unieruchom, jak opisano w kroku 2.7.1. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl z żelem odpipetuj 20 μl PBS do światła pochwy. Delikatnie odpipetować całą objętość w górę i w dół 4 razy w obrębie światła, a następnie pobrać całą objętość do tej samej końcówki pipety. UWAGA: Jeśli płyn do płukania jest gęsty od śluzu, do zebrania końcowego płynu płukanego można użyć standardowej końcówki pipety o pojemności 200 μl.</li>
	<li>W przypadku oszczędzania płynu z płukania do analizy cytokin lub oznaczania ilościowego CFU, należy go przelać do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,7 ml. W przypadku określania stadium rui należy nanieść co najmniej 5 μl płynu do płukania na szkiełko podstawowe i obserwować komórki w 100-krotnym powiększeniu pod mikroskopem świetlnym. UWAGA: Przykłady etapów rujowych znajdują się na rysunku 1.</li>
</ol>
5. Sekcja tkanek i homogenizacja
<ol>
	<li>Dla każdej myszy przygotuj trzy probówki z nakrętką o pojemności 2 ml (po jednej na każdą tkankę: pochwę, szyjkę macicy i macicę). Napełnij każdą probówkę dużą ilością (0,4 - 0,5 g) 1,0 mm kulek cyrkonu, aby pokryć stożkowate dno tuby.</li>
	<li>Przygotowane probówki należy sterylizować w autoklawie przed pobraniem tkanki przez 30 minut w temperaturze 121 °C, zwłaszcza w przypadku ilościowego określania obciążenia bakteryjnego. Do każdej probówki dodać 500 μl sterylnego PBS. Zważyć każdą probówkę po autoklawowaniu i zapisać do wykorzystania w przyszłości w celu obliczenia masy odzyskanej tkanki.</li>
	<li>Poświęć mysz przy użyciu zatwierdzonych metod instytucjonalnych, takich jak uduszenie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy. Spryskaj brzuszną część brzucha 70% EtOH. Sterylnymi nożyczkami otwórz jamę brzuszno-miedniczną, unieś skórę pleców i mięśnie brzucha oraz przemieszcz jelita tak, aby drogi rodne były odsłonięte.</li>
	<li>Wysterylizuj nożyczki 70% EtOH, w razie potrzeby wytrzyj do czysta i przetnij oba rogi macicy w połowie długości między trzonem macicy a jajnikami. Za pomocą nożyczek i kleszczy oddziel tłuszcz trzewny, błony i pęcherz moczowy z dala od dróg rodnych, poruszając się doogonowo.</li>
	<li>Wysterylizuj nożyczki zgodnie z opisem w kroku 5.4. Przetnij pochwę poprzecznie jak najbliżej sromu, aby oddzielić drogi rodne od ciała. Podnieś i usuń nienaruszony układ rozrodczy i umieść go na sterylnej szalce Petriego.</li>
	<li>Za pomocą nowej żyletki oddziel macicę od szyjki macicy jednym poprzecznym cięciem. Wysterylizuj żyletkę 70% EtOH, a następnie oddziel szyjkę macicy od pochwy jednym poprzecznym cięciem. UWAGA: Do szyjki macicy nadal będzie przyczepiona minimalna ilość tkanki macicy. Do szyjki macicy nadal będzie przyczepiona minimalna ilość tkanki pochwy.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś każdą z tkanek do odpowiednich 2-mililitrowych probówek zawierających PBS i kulki homogenizujące. Oczyść kleszcze 70% EtOH pomiędzy czynnościami z każdą tkanką.</li>
	<li>Zważ każdą probówkę z zakrętką o pojemności 2 ml i odejmij pierwotną wagę probówki, aby określić masę tkanki. Masa tkanek zazwyczaj waha się między 20 - 100 mg. Szczelnie zamknij rurki z nakrętką i homogenizuj tkanki przez 1 minutę z maksymalną prędkością w homogenizatorze tkankowym.</li>
	<li>Aby określić ilościowo obciążenie bakteryjne, należy seryjnie rozcieńczyć 25 μl homogenatu tkankowego i rozcieńczenia płytki w stosunku 1:10 do 1:10 000 na płytkach agarowych z podłożem różnicowym. Inkubować płytki zgodnie z opisem w kroku 3.3. W celu przechowywania próbek do oznaczania ilościowego cytokin należy zamrozić homogenaty tkanek w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby pogłębić wiedzę na temat interakcji GBS zarówno z gospodarzem, jak i innymi drobnoustrojami w kontekście gospodarza, potrzebny jest model zwierzęcy. W pracy opisano techniczne aspekty ustalenia kolonizacji pochwy GBS u myszy. Protokół ten osiąga > 90% kolonizacji myszy bez użycia środków znieczulających do zaszczepiania bakterii lub pobierania próbek wymazów, środków immunosupresyjnych umożliwiających kolonizację, wstępnego mycia pochwy lub dodatków zagęszczających inokulum. Co więcej, model ten wykazuje solidną odtw...

Streptococcus agalactiae, Streptococcus grupy B (GBS), to zamknięta w kapsułkach, Gram-dodatnia bakteria, która jest często izolowana z jelit i dróg moczowo-płciowych zdrowych dorosłych. W latach siedemdziesiątych XX wieku GBS stał się głównym czynnikiem zakaźnej śmiertelności noworodków, z ponad 7000 przypadków chorób noworodkówrocznie1. Choroba GBS o wczesnym początku (EOD) występuje w pierwszych godzinach lub dniach życia, pojawia się jako zapalenie płuc lub niewydolność oddechowa i często przekształca się w sepsę, podczas gdy choroba o późnym początku (LOD) następuje po kilku miesiącach i objawia się bakteriemią, która często rozwija się w zapalenie opon mózgowo-rdzeniowychtypu 2. Od 2002 roku Centers for Disease Control and Prevention zaleca matkom z dodatnim wynikiem GBS powszechne badania przesiewowe w kierunku kolonizacji pochwy GBS w późnej ciąży i śródporodowej profilaktyce antybiotykowej (IAP)1. Pomimo zmniejszenia liczby przypadków choroby o wczesnym początku do około 1000 rocznie w Stanach Zjednoczonych z powodu IAP, GBS pozostaje główną przyczyną sepsy noworodków o wczesnym początku, a występowanie o późnym początku pozostajenienaruszone1. Niezależnie od tego, czy w macicy, podczas porodu, czy nawet w późnych przypadkach, narażenie noworodków na GBS wymaga przeżycia, przejścia przez wiele środowisk i barier gospodarza, unikania odporności, a w przypadku zapalenia opon mózgowych przekroczenia wysoce regulowanej bariery krew-mózg2. Przed tymi zjadliwymi interakcjami w obrębie noworodka następuje początkowa kolonizacja dróg pochwowych matki. Wskaźniki kolonizacji pochwy przez matkę GBS wahają się od 8 do 18% w krajach rozwiniętych i rozwijających się, z szacowanym średnim wskaźnikiem 12,7%3,4. Kolonizacja dróg pochwowych przez GBS w czasie ciąży może mieć charakter stały, przerywany lub przemijający u poszczególnych kobiet5. Co ciekawe, wiek matki > 36 lat wiąże się z uporczywą kolonizacją6. Zidentyfikowano liczne biologiczne i społeczno-ekonomiczne czynniki ryzyka kolonizacji pochwy przez GBS. Czynniki biologiczne obejmują kolonizację przewodu pokarmowego GBS i brak Lactobacillus w jelitach. Jednak pochodzenie etniczne, otyłość, higiena i aktywność seksualna są również związane z nosicielstwem pochwy GBS7.
Chociaż GBS jest znany z powodowania infekcji u noworodków, powoduje również różne infekcje u matki, zarówno okołoporodowe, jak i poporodowe. Nosicielstwo GBS jest zwiększone u kobiet z zapaleniem pochwy8, a w niektórych przypadkach może być nawet jednostką chorobową9. Dodatkowo wznoszenie się GBS w układzie rozrodczym w czasie ciąży może skutkować infekcją wewnątrzowodniową lub zapaleniem błony płodowej10. Ponadto nawet w 3,5% ciąż GBS rozprzestrzenia się do pęcherza moczowego, powodując infekcję dróg moczowych lub bezobjawową bakteriurię11. Bakteriuria GBS w czasie ciąży wiąże się ze zwiększonym ryzykiem gorączki śródporodowej, zapalenia błon płodowych, przedwczesnego porodu i przedwczesnego pęknięcia błon płodowych12. Podsumowując, obecność GBS w drogach pochwowych jest związana z infekcjami wielu tkanek gospodarza, a zdolność do wyeliminowania GBS z tej niszy jest niezbędna zarówno dla zdrowia matki, jak i noworodka.
Do niedawna, większość prac badających interakcje GBS z drogą szyjno-pochwową ograniczała się do modeli komórkowych in vitro 13-15. Te eksperymenty in vitro ujawniły czynniki bakteryjne, które są ważne dla przylegania, w tym białka powierzchniowe, takie jak pilusy i powtórzenia bogate w serynę17,18, a także dwuskładnikowe systemy regulacyjne15,19 i globalną odpowiedź transkrypcyjną nabłonka pochwy na GBS19. Jednak, aby w pełni wyjaśnić interakcje gospodarz-mikroorganizm w drogach oddechowych, niezbędny jest solidny model zwierzęcy. Wczesne prace wykazały, że GBS można odzyskać z dróg pochwowych zaszczepionych myszy20,21 i szczurów22 zarówno w ciąży, jak i poza nią. W 2005 roku krótkoterminową kolonizację pochwy GBS modelowano na myszach w celu zbadania skuteczności enzymu litycznego fagowego w leczeniu pochwy GBSprzez okres 24 godzin. Kilka lat później opracowano długoterminowy model mysiej kolonizacji pochwy GBS w celu zbadania czynników gospodarza i bakterii decydujących o trwałości GBS. Model ten zidentyfikował liczne czynniki GBS przyczyniające się do kolonizacji, w tym przydatki powierzchniowe17,18 i dwuskładnikowe systemy GBS19,24. Model ten przyczynił się do identyfikacji mechanizmów odpowiedzi gospodarza19,25 i został wykorzystany do przetestowania kilku strategii terapeutycznych, w tym peptydów immunomodulujących26 i probiotyków27. Protokół ten zawiera niezbędne wskazówki do inokulacji GBS w drogach pochwowych myszy, a następnie śledzenia kolonizacji i pobierania próbek do dalszych analiz.

<table><tbody><tr><td>Olej sezamowy&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8875-1G</td><td>UWAGA: Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. &beta-estradiol może być wchłaniany przez skórę i powierzchnię błony śluzowej.</td></tr><tr><td>200 &mu; l Końcówki do pipet z żelem&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1252-0610</td><td></td></tr><tr><td>Waciki moczowo-płciowe, sterylne, z alginianu wapnia</td><td>Puritan</td><td>25-801 A 50</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar StrepB</td><td>DRG International</td><td>SB282</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt Broth</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>7161C</td><td></td></tr><tr><td>18 G, igły 1,5 cala</td><td>BD</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>26 G, igły 0,5 cala</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Filtry strzykawkowe PVDF</td><td>Whatman</td><td>6900-2504</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany fosforanem roztwór soli Dulbecco 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model kolonizacji pochwy paciorkowcami grupy b

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (Streptococcus grupy B, GBS), jest Gram-dodatnim, bezobjawowym kolonizatorem ludzkiego przewodu pokarmowego i dróg pochwy u 10 - 30% dorosłych. U osób z obniżoną odpornością, w tym noworodków, kobiet w ciąży i osób starszych, GBS może przekształcić się w inwazyjny patogen powodujący sepsę, zapalenie stawów, zapalenie płuc i zapalenie opon mózgowych. Ponieważ GBS jest wiodącym patogenem bakteryjnym noworodków, obecna profilaktyka obejmuje badania przesiewowe w kierunku kolonizacji pochwy GBS w późnej ciąży, a następnie antybiotykoterapię okołoporodową matek z dodatnim wynikiem GBS. Duże obciążenie pochwy GBS jest czynnikiem ryzyka zarówno chorób noworodków, jak i kolonizacji. Niestety, niewiele wiadomo na temat gospodarza i czynników bakteryjnych, które promują lub umożliwiają kolonizację pochwy przez GBS. Protokół ten opisuje technikę ustalania trwałej kolonizacji pochwy GBS przy użyciu pojedynczego wstępnego leczenia β-estradiolem i codziennego pobierania próbek w celu określenia obciążenia bakteryjnego. Dalej wyszczególnia metody podawania dodatkowych terapii lub odczynników będących przedmiotem zainteresowania oraz pobierania płynu z płukania pochwy i tkanek dróg rodnych. Ten mysi model pozwoli lepiej zrozumieć interakcję GBS-gospodarz w środowisku pochwy, co doprowadzi do potencjalnych celów terapeutycznych w celu kontrolowania kolonizacji pochwy matki w czasie ciąży i zapobiegania przenoszeniu wirusa na wrażliwego noworodka. Interesujące będzie również pogłębienie naszej wiedzy na temat ogólnych interakcji bakteria-gospodarz w żeńskich drogach pochwowych.

Podczas opracowywania tego modelu poczyniono szereg obserwacji dotyczących czynników wpływających na czas kolonizacji pochwy przez GBS. Aby określić, w jaki sposób faza cyklu rujowego w momencie inokulacji wpływa na trwałość kolonizacji bakterii GBS, w dniu inokulacji określono fazę cyklu u myszy na podstawie płynu z laważu pochwy. Rycina 1 przedstawia cztery fazy cyklu rujowego myszy, określone za pomocą badania preparatu bezpośredniego płynu z laważu pochwy, co jest uzn...

Celem tego protokołu jest imitacja kolonizacji pochwy przez Streptococcus grupy B (GBS) w modelu mysim. Metoda ta może być stosowana do badania odpowiedzi immunologicznych gospodarza i czynników bakteryjnych przyczyniających się do utrzymywania się GBS w pochwie, a także do testowania strategii terapeutycznych.

Mysi model kolonizacji pochwy paciorkowcami grupy B

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Ogólnym celem tego modelu zwierzęcego jest wywołanie kolonizacji dróg pochwy myszy przez Streptococcus grupy B (GBS). Metoda ta może pomóc w zrozumieniu kluczowych kwestii dotyczących kolonizacji przez Streptococcus grupy B, takich jak czynniki bakteryjne istotne dla kolonizacji, a także wpływ odpowiedzi gospodarza na trwałość kolonizacji pochwy. Główną zaletą tej techniki jest to, że inokulacja zazwyczaj skutkuje kolonizacją przekraczającą 90 procent bez konieczności stosowania znieczulenia, leków immunosupresyjnych lub środków zagęszczających.Rozpocznij od wymieszania na wirówce 0,5 mg beta-estradiolu na mysz w 15 ml probówce stożkowej, aż do całkowitego usunięcia grudek i uzyskania postaci drobnego proszku. Następnie przefiltruj za pomocą strzykawki 100 µl oleju sezamowego na mysz do probówki przez sito o rozmiarze oczek 0,45 µm, a następnie ponownie wymieszaj zawartość probówki na wirówce. Gdy hormon zostanie rozprowadzony w oleju w formie jednorodnej zawiesiny, pobierz odczynnik do nowej strzykawki o pojemności 10 ml i załóż igłę o rozmiarze 18 G i długości jednego cala.Odpowiedź 100 µL zawiesiny do jednorazowej strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 mL na każdą mysz i wyposażyć każdą strzykawkę w sterylną igłę o rozmiarze 26 G i długości pół cala. Następnie podać 100 µL beta-estradiolu do dolnego lewego lub prawego kwadrantu jamy otrzewnowej każdego zwierzęcia. W tym samym dniu, w którym wykonano iniekcję, przygotować 5 mL nocnej hodowli płynnej interesującego szczepu GBS w pożywce Todd-Hewitt (THB) w temperaturze 37 °C.Następnego dnia rano przenieś kulturę GBS w stosunku objętości 1:10 do świeżej pożywki THB i inkubuj przez dwie do trzech godzin w temperaturze 37 °C, aż bakterie osiągną fazę średnio-logarytmiczną. Następnie przenieś subkulturę do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwiruj komórki bakteryjne. Osad resuspenduj w 200 µL sterylnego PBS.Następnie należy uzupełnić objętość zawiesiny do 1 ml PBS na 10 myszy, aby uzyskać OD600 wynoszącą 0,4, w nowej probówce hodowlanej o pojemności 5 ml. Przenieść hodowlę do nowej probówki o pojemności 15 ml i ponownie z pelletować bakterie. Następnie komórki należy resuspendować w PBS w objętości stanowiącej jedną dziesiątą objętości pierwotnej.Odbierz 50 µL bakterii do rozcieńczeń seryjnych i wysiewu na agar THB, aby określić dokładną liczbę CFU inokulum. Następnie pobierz 10 µL GBS do końcówki pipety do nakładania żelu o pojemności 200 µL, a następnie kciukiem i palcem wskazującym ręcznie unieruchom luźną skórę na karku pierwszego zwierzęcia, po czym unieruchom ogon. Wprowadź końcówkę pipety na 5 do 10 mm do światła pochwy i podaj całą objętość inokulum.Następnie natychmiast puść kark i unieś ogon, aby podnieść tylną część ciała zwierzęcia, jednocześnie prowadząc przednie łapy po twardej powierzchni. Po minucie dokonaj inspekcji wizualnej otworu pochwy, aby sprawdzić, czy nie wystąpił cofnięcie inokulatu. Bezpośrednio przed pobraniem wymazu zwilż bawełnę w PBS i unieruchom jedną z myszy w sposób przedstawiony powyżej.Wprowadź wymaz na głębokość 10 mm do światła pochwy, a następnie delikatnie obróć go cztery razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara i cztery razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, wywierając przy tym lekki nacisk na ścianę pochwy. Umieść wymaz w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 100 µL PBS, a następnie wierzchołkuj probówkę z wymazem przez około 15 s, aby uwolnić bakterie z włókien bawełny. Następnie wykonaj rozcieńczenia seryjne każdej próbki w PBS i wysej 20 µL z rozcieńczeń od 1:10 do 1:10 000 na płytki z agarem w podłożu różnicującym, przygotowanym zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24 h.Kolonie GBS będą miały kolor intensywnie różowy lub malwowy. Aby pobrać płukaninę z pochwy, należy za pomocą końcówki do nakładania żelu o pojemności 200 µL nanieść 20 µL PBS do światła pochwy. Następnie należy delikatnie pipetować całą objętość w górę i w dół cztery razy w obrębie światła pochwy.Następnie, używając tej samej końcówki, odciągnij całą objętość. W przypadku późniejszej analizy płynu z lavage'u, przelej go do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,7 ml. W celu homogenizacji tkanek podczas sekcji, spryskaj brzuszną stronę brzucha uśpionego zwierzęcia 70% etanolem, a następnie za pomocą sterylnych nożyczek otwórz jamę brzuszno-miedniczną.Odsuń jelita tak, aby odsłonić układ rozrodczy. Następnie przetnij oba rogi macicy w połowie ich długości, pomiędzy ciałem macicy a jajnikami. Za pomocą nożyczek i pęsety oddziel tłuszcz trzewny, błony oraz pęcherz moczowy od układu rozrodczego, przesuwając tkanki w kierunku ogonowym.Następnie należy przeciąć pochwę w poprzek jak najbliżej sromu, aby oddzielić układ rozrodczy od reszty ciała. Przenieść nienaruszony układ rozrodczy do sterylnej szalki Petriego i za pomocą nowej żyletki oddzielić macicę od szyjki macicy jednym cięciem poprzecznym. Oddzielić szyjkę macicy od pochwy kolejnym cięciem poprzecznym.Następnie, za pomocą sterylnej pęsety, przenieś każdą z tkanek do oddzielnych, wcześniej zważonych probówek o pojemności 2 ml zawierających 500 µL PBS i kulki do homogenizacji. Zważ każdą probówkę 2 ml, aby określić masę tkanki. Następnie szczelnie zakręć probówki i homogenizuj tkanki przez jedną minutę z maksymalną prędkością w homogenizatorze do tkanek.Aby określić ładunek bakteryjny, wykonaj seryjne rozcieńczenia 25 µL homogenatu tkankowego i wysiej rozcieńczenia od 1:10 do 1:10 000 na płytki z agarem z pożywką różnicującą, a następnie inkubuj przez 24 h w temperaturze 37 °C. W celu przechowywania próbek do oznaczania cytokin, zamroź homogenaty w temperaturze -20 °C. Na poniższych obrazach przedstawiono cztery fazy cyklu rujowego myszy, określone na podstawie badania płynu z płukania pochwy w preparacie świeżym.Myszy inokulowane w fazie proestrusu były kolonizowane przez GBS dłużej niż w jakiejkolwiek innej fazie cyklu rujowego, w szczególności w porównaniu do osobników znajdujących się w fazie diestrusu w momencie inokulacji. Przedłużający się estrus sprzyja persistencji GBS A909 u myszy CD-1, przy czym dwa tygodnie po inokulacji zaobserwowano 90 procent kolonizacji. W typowym eksperymencie z podaniem jednej dawki beta-estradiolu przed inokulacją, tylko od 40 do 50 procent myszy było kolonizowanych tydzień po inokulacji, a odzyskana średnia liczba GBS odpowiadała procentowi kolonizacji.Wykazanie, że utrzymywanie ciągłej rui sprzyja przetrwaniu GBS w pochwie u większości myszy CD-1. GBS A909 utrzymuje się w drogach pochwy u myszy CD-1 (outbred) oraz myszy FVB (inbred) przez około jeden tydzień. Tymczasem u większości myszy inbred BALB/c i C57BL/6 kolonizacja utrzymuje się od jednego tygodnia przez miesiąc lub dłużej.Wizualizacja dodatnich pod kątem GFP GBS u zaszczepionych zwierząt wykazuje obecność GBS przylegających do nabłonka pochwy myszy w bliskim sąsiedztwie innej rodzimej flory pochwy. Podczas inokulacji ważne jest zapobieganie cofaniu się treści, aby zapewnić kolonizację wszystkich myszy. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w ciągu jednej do dwóch godzin, w zależności od liczby zwierząt.Model ten umożliwia badaczom z zakresu interakcji gospodarz-patogen badanie zdolności bakterii, takich jak paciorkowce grupy B, do kolonizacji żeńskiego układu rozrodczego. Procedura ta może być wykorzystana do testowania nowych związków lub preparatów probiotycznych w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące interwencji terapeutycznych.

a-murine-model-of-group-b-streptococcus-vaginal-colonization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano kluczowe techniki stosowane w ocenie zapalenia pochwy spowodowanego przez Candida w eksperymentalnym modelu zwierzęcym. Metody te pozwalają na szybkie pobranie wymazów z pochwy oraz limfocytów z drenujących węzłów chłonnych lędźwiowych. Techniki te mogą posłużyć do stworzenia modeli mysich innych chorób dolnych dróg rodnych u samic.

Protokoły inokulacji pochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym modelu zapalenia pochwy wywołanego przez Candida u myszy

Źródło: Morrill, S. R., et al. Modele kolonizacji pochwy przez bakterie hodowane beztlenowo. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia protokół modelowania kolonizacji pochwy u myszy przy użyciu bakterii beztlenowych opornych na antybiotyki. Rozpoczyna się od leczenia hormonalnego w celu zwiększenia podatności nabłonka, a następnie inokulacji dopochwowej i koinokulacji w warunkach beztlenowych. Procedura kończy się pobraniem próbek po inokulacji i hodowlą w celu oceny kolonizacji bakteryjnej i...

Modelowanie kolonizacji pochwy myszy przez bakterie beztlenowe

Źródło: Patras, K. A., Doran, K. S. Model myszy kolonizacji pochwy grupy B Streptococcus . J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje przygotowanie i zaszczepienie pochwy u samicy myszy leczonej hormonami paciorkowcem grupy B w celu modelowania infekcji. Wyjaśnia, jak hodować i przygotowywać bakterie, podawać inokulum do lumenu pochwy oraz zapewnić skuteczną infekcję.

Ustanowienie mysiego modelu infekcji paciorkowcem grupy B pochwy

Źródło: Patras, K. A. &amp; Doran, K. S. Model myszy kolonizacji pochwy grupy B Streptococcus . J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje ilościowe określenie obciążenia paciorkowca grupy B (GBS) pochwy w modelu mysim za pomocą wymazu i hodowli chromogenicznej. Opisuje ona etapy związane z pobieraniem próbek, poszywem i liczeniem kolonii w celu ilościowego określenia obciążenia GBS w lumencie pochwy myszy.

Ilościowa identyfikacja obciążenia paciorkowca grupy B w lumenie pochwy myszy za pomocą wymazu i hodowli chromogenicznej

Ten film pokazuje proces zapoczątkowania uropatogennej infekcji Escherichia coli u samicy pęcherza myszy poprzez przezcewkowe wkroplenie cewnika. Wstrzyknięte bakterie z powodzeniem wywołują infekcję dróg moczowych w obrębie pęcherza moczowego, stanowiąc cenną platformę do badania chorób związanych z opieką zdrowotną związanych z drogami moczowymi.

Opracowanie modelu infekcji dróg moczowych u samic myszy

Neisseria meningitidis to specyficzny dla człowieka patogen, który infekuje naczynia krwionośne. W tym protokole ludzkie mikronaczynia są wprowadzane do myszy poprzez przeszczepienie ludzkiej skóry myszom z obniżoną odpornością. Bakterie w dużym stopniu przylegają do ludzkich naczyń, prowadząc do uszkodzenia naczyń krwionośnych i rozwoju wysypki plamistej zwykle obserwowanej u ludzi.

Humanizowany model myszy do badania infekcji bakteryjnych ukierunkowanych na mikrokrążenie

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

Protokół przedstawia mysi model kolonizacji pochwy za pomocą beztlenowo hodowanych ludzkich bakterii pochwy. Skupiamy się na Gardnerella vaginalis, jednocześnie zamieszczając sugestie dotyczące Prevotella bivia i Fusobacterium nucleatum. Protokół ten może być również stosowany jako przewodnik do inokulacji dopochwowych i realnego odzyskiwania innych bakterii hodowanych beztlenowo.

Modele kolonizacji pochwy myszy przez bakterie hodowane beztlenowo

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Protokół ten opisuje niezbędne kroki kolonizacji myszy z pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych, a także nieinwazyjne metody walidacji kolonizacji i oceny ekspansji pks+ E. coli w kału.

Kolonizacja przez myszą pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych

Poznaj metodę kolonizacji pochwy paciorkowcami grupy B u myszy, osiągającą ponad 90% skuteczność bez znieczulenia. Model ten umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza i czynników bakteryjnych.

Mysi model kolonizacji pochwy paciorkowcami grupy B

Przeglądaj więcej filmów