Mysi model kolonizacji pochwy paciorkowcami grupy B

Ogólnym celem tego modelu zwierzęcego jest ustanowienie paciorkowca grupy B lub kolonizacji GBS mysich dróg pochwy. Ta metoda może pomóc nam zrozumieć kluczowe pytania dotyczące kolonizacji paciorkowców grupy B, takie jak, jakie są czynniki bakteryjne, które są ważne dla kolonizacji, a także jak reakcje gospodarza wpływają na trwałość pochwy. Główną zaletą tej techniki jest to, że inokulacja zazwyczaj powoduje ponad 90-procentową kolonizację bez użycia znieczulenia, leków immunosupresyjnych lub środków zagęszczających.

Zacznij od wirowania 0,5 miligrama beta-estradiolu na mysz w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, aż wszystkie grudki zostaną usunięte, a beta-estradiol pojawi się w postaci drobnego proszku. Następnie przefiltruj strzykawką 100 mikrolitrów oleju sezamowego na mysz do probówki przez sitko o średnicy 0,45 mikrona i ponownie przekręć rurkę. Gdy hormon jest rozprowadzany jako jednorodna zawiesina w oleju, wciągnij odczynnik do nowej, 10-mililitrowej strzykawki i podłącz igłę o rozmiarze 18, jeden cal

Podzielić 100 mikrolitrów zawiesiny na jedną, jednomililitrową strzykawkę tuberkulinową na mysz i wyposażyć każdą strzykawkę tuberkulinową w sterylną igłę o rozmiarze 26 cali. Następnie podaj 100 mikrolitrów beta-estradiolu do lewego lub prawego dolnego kwadrantu jamy otrzewnowej każdego zwierzęcia. Tego samego dnia, w którym wykonano wstrzyknięcie, wyhoduj pięciomililitrową, płynną kulturę interesującego nas szczepu GBS w bulionie Todda Hewitta lub THB, w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego ranka subkulturuj GBS w ilości od 1 do 10 objętości w świeżym THB przez dwie do trzech godzin inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż bakterie osiągną fazę logarytmiczną. Następnie przenieś subkulturę do sterylnej, stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj komórki bakteryjne. Zawiesić osad w 200 mikrolitrach sterylnego PBS.

Następnie zwiększ całkowitą objętość zawiesiny do jednego mililitra PBS na 10 myszy, aby osiągnąć OD600 0,4 w nowej, pięciomililitrowej probówce hodowlanej. Przenieś kulturę do nowej, 15-mililitrowej probówki i ponownie zagnieźdź bakterie. Następnie ponownie zawieś komórki w PBS w jednej dziesiątej pierwotnej objętości.

Zarezerwować 50 mikrolitrów bakterii do seryjnego rozcieńczania i posiewu na agarze THB, aby określić dokładną CFU inokulum. Następnie narysuj 10 mikrolitrów GBS do 200-mikrolitrowej końcówki pipety z żelem i ręcznie zabezpiecz luźną skórę na karku pierwszego zwierzęcia, między kciukiem a palcem wskazującym, a następnie unieruchomij ogon. Włóż końcówkę pipety na głębokość od 5 do 10 milimetrów do światła pochwy i dozuj całą objętość inokulum.

Następnie natychmiast zwolnij kark i unieś ogon, aby podnieść tylny koniec zwierzęcia, jednocześnie chodząc przednimi łapami po twardej powierzchni. Po minucie sprawdź wzrokowo otwór pochwy pod kątem cofania się inokulum. Tuż przed pobraniem wymazu należy wstępnie zwilżyć bawełnę w PBS i unieruchomić jedną z myszy, jak właśnie pokazano.

Włóż wacik na 10 milimetrów do światła pochwy i delikatnie obróć cztery razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara i cztery razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, lekko naciskając na ścianę pochwy. Umieść wacik w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej 100 mikrolitrów PBS i obracaj probówkę i wacik przez około 15 sekund, aby uwolnić bakterie z włókien bawełnianych. Następnie seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę w PBS i rozprowadzić 20 mikrolitrów od jednego do 10 przez jeden do 10 000 rozcieńczeń na różnej pożywce agarowej, przygotowanej zgodnie z instrukcjami producenta, do inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Kolonie GBS będą miały kolor jasnoróżowy lub fioletowy. Aby zebrać płyn do płukania pochwy, użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów z żelem, aby dozować 20 mikrolitrów PBS do światła pochwy. Delikatnie odpipetować całą objętość w górę i w dół cztery razy w obrębie światła.

Następnie, używając tej samej końcówki, wyjmij cały wolumin. W celu dalszej analizy płynu płukanego należy dozować płukanie do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,7 mililitra. W celu homogenizacji wypreparowania tkanek spryskaj brzuszny brzuch zwierzęcia poddanego eutanazji 70-procentowym etanolem i użyj sterylnych nożyczek, aby otworzyć jamę brzuszno-miedniczną.

Przemieszcz jelita tak, aby układ rozrodczy był odsłonięty. Następnie przetnij oba rogi macicy, w połowie długości, między trzonem macicy a jajnikami. Za pomocą nożyczek i kleszczy oddziel tłuszcz trzewny, błony i pęcherz moczowy od dróg rodnych, przesuwając tkanki doogonowo.

Następnie przeciąć pochwę poprzecznie jak najbliżej sromu, aby oddzielić drogi rodne od ciała. Przenieś nieprawidłowy układ rozrodczy na sterylną szalkę Petriego i użyj nowej żyletki, aby oddzielić macicę od szyjki macicy w jednym, poprzecznym cięciu. Oddziel szyjkę macicy od pochwy za pomocą innego poprzecznego cięcia.

Następnie za pomocą sterylnych kleszczy przenieś każdą z tkanek do indywidualnych, wstępnie zważonych, dwumililitrowych probówek zawierających 500 mikrolitrów PBS i kulek homogenizujących. Zważ każdą probówkę o pojemności 2 mililitrów, aby określić masę tkanki. Następnie szczelnie zamknij rurki z nakrętką i homogenizuj tkanki przez jedną minutę, z maksymalną prędkością, w homogenizatorze tkankowym.

Aby określić ilościowo obciążenie bakteryjne, należy seryjnie rozcieńczyć 25 mikrolitrów homogenatu tkankowego i rozcieńczyć od 1 do 10 do 10 000 rozcieńczeń na płytkach agarowych z podłożem różnicowym, przez 24 godziny inkubacji, w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przechowywać próbki do oznaczania ilościowego cytokin, należy zamrozić homogenaty w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Na tych obrazach pokazano cztery etapy cyklu rui myszy, określone przez płyn do płukania pochwy na mokro.

Myszy zaszczepione w stadium rui były skolonizowane GBS dłużej niż jakikolwiek inny etap rui, szczególnie te w diestrus w momencie inokulacji. Utrzymująca się ruja sprzyja utrzymywaniu się GBS A909 u myszy CD-1 z 90-procentową kolonizacją obserwowaną dwa tygodnie po inokulacji. W typowym eksperymencie z jedną dawką beta-estradiolu przed inokulacją, tylko 40 do 50 procent myszy zostało skolonizowanych tydzień po inokulacji, z odzyskaną średnią GBS, która naśladuje procent kolonizacji.

Wykazanie, że utrzymywanie ciągłej rui sprzyja utrzymywaniu się GBS w pochwie u większości myszy CD-1. GBS A909 utrzymuje się w drogach pochwowych u niekrewniaczych myszy CD-1 i myszy wsobnych FVB przez około tydzień. Podczas gdy większość wsobnych myszy BALB/c i C57BL/6 zostaje skolonizowana w ciągu jednego tygodnia przez miesiąc lub dłużej.

Wizualizacja GBS GFP dodatniego u zaszczepionych zwierząt wykazuje obecność GBS przylegającego do nabłonka pochwy myszy i w bliskim sąsiedztwie innej rodzimej flory pochwy. Ważne jest, aby zapobiec przepływowi wstecznemu podczas inokulacji, aby upewnić się, że wszystkie myszy zostaną skolonizowane. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin, w zależności od liczby zwierząt.

Model ten pozwala naukowcom zajmującym się interakcjami gospodarz/patogen badać zdolność bakterii, takich jak paciorkowiec grupy B, do kolonizacji żeńskiego układu rozrodczego. Procedura ta może być wykorzystana do testowania nowych związków lub terapii probiotycznych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interwencji terapeutycznych.