Wykrywanie zmiany glikoproteiny powierzchniowej wariantu Trypanosoma brucei za pomocą magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej metody jest wyizolowanie trypanosomów wyrażających określony wariant glikoproteiny powierzchniowej lub VSG od reszty populacji i zidentyfikowanie pasożytów, które przeszły z początkowego dominującego VSG na dowolny inny VSG. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii trypanosomów, takie jak, jakie są czynniki lub zdarzenia, które wpływają na przełączanie VSG w populacji pasożytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybsza niż wcześniej opublikowane metody i pozwala na łatwą kwantyfikację przełączania na ogniwa bez przełącznika.

Kiedy laboratorium po raz pierwszy zaczęło pracować nad zmiennością antygenową, pierwszym problemem było wykrycie rzadkich przełączników. Tego rodzaju problem został rozwiązany w immunologii wiele lat temu, poprzez zastosowanie sortowania komórek aktywowanego magnetycznie w celu wzbogacenia komórek, które były ujemne dla określonej cechy. Przeniesienie procesu nieselekcyjnego na wariant antygenowy wydawało się naprawdę obiecującym pomysłem.

Na początek trypanosomy krwionośne szczepu Lister 427 należy wyhodować do gęstości od 0,5 do 100 000 na mililitr. Porcję 50 razy 10 do sześciokomórkowej próbki do 15-mililitrowej probówki, a następnie odwirować. Zachowaj jeden razy 10 do sześciu komórek i hodowli, aby można je było później wykorzystać jako kontrole przeciwciał dodatnich i ujemnych.

Odpipetować większość supernatantu, pozostawiając około 750 mikrolitrów w probówce. Przenieś komórki do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Na koniec odwiruj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty w temperaturze 2800 razy g.

A następnie odpipetować cały supernatant. Zawiesić komórki w 150 mikrolitrach pożywki hodowlanej plus pierwszorzędowe przeciwciało anty wariantowe glikoproteiny powierzchniowej lub anty VSG w odpowiednim rozcieńczeniu. Następnie wiruj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Przemyć od 800 do 1000 mikrolitrów zimnej pożywki hodowlanej. Odwiruj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty w temperaturze 5200 razy g. Po zasysaniu supernatantu przemyć komórki jednym mililitrem pożywki hodowlanej i ponownie odwirować.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej. Dodać 110 mikrolitrów aktywowanych magnetycznie mikrokulek do sortowania komórek odpowiedniego typu dla przeciwciała pierwotnego. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół, a następnie wiruj.

Podczas wirowania komórek ustaw kolumnę separacyjną aktywowaną magnetycznie. Umieść pod nim 15-mililitrową rurkę, aby zebrać podłoże gruntujące. Dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej, aby zagruntować kolumnę.

Następnie usuń próbkę z wiru i dodaj 800 do 1000 mikrolitrów zimnej pożywki hodowlanej. Odwirować próbkę, a następnie usunąć supernatant w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Umyj granulowane komórki jednym mililitrem pożywki hodowlanej i ponownie odwiruj.

Tym razem odessać supernatant, ale pozostawić 100 mikrolitrów w probówce. Energicznie potrząsaj probówką wirówkową, aż osad zostanie całkowicie zawieszony. Dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej i pipetuj w górę iw dół, aby całkowicie zawiesić komórki.

Usuń 15-milimetrową stożkową rurkę używaną do zbierania pożywki zalewającej i zastąp ją nową stożkową o pojemności 15 mililitrów, aby zebrać przepływ zawierający przełączone pasożyty. Nałóż zawiesinę komórek na zagruntowaną kolumnę. Zbierz przepływ w 15-mililitrowej probówce poniżej, co zwykle zajmuje od sześciu do siedmiu minut na jeden mililitr pożywki plus trypanosomy.

Następnie przemyć kolumnę dwa razy jednym mililitrem pożywki hodowlanej i zebrać przepływ do tej samej probówki. Podziel przepływ, który powinien wynosić około trzech mililitrów, na dwie 1,5 mililitrowe probówki do mikrowirówek. Następnie umieść rurki na lodzie.

Dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej do kolumny i zanurz kolumnę w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. W ten sposób uzyska się komórki, które wyrażają początkowy dominujący VSG. Usuń 300 mikrolitrów tego eluowanego materiału i trzymaj go na lodzie, resztę można wyrzucić.

Aby uzyskać kontrolę pozytywną, należy pobrać około 100 000 komórek z początkowej hodowli komórek i pipetować je do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Powtórz to, aby utworzyć kontrolę negatywną. Odwirować próbki przepływowe i dodatnią próbkę kontrolną.

A następnie usuń i wyrzuć supernatant. Zawiesić dodatnie komórki kontrolne w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej z pierwszorzędowym przeciwciałem anty VSG znakowanym fluoroforem w odpowiednim rozcieńczeniu. Następnie ponownie zawiesić jeden przepływowy osad w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej z pierwszorzędowym przeciwciałem anty VSG znakowanym fluoroforem w odpowiednim rozcieńczeniu.

Użyj zawiesiny, aby następnie ponownie zawiesić pellet w drugiej rurze przepływowej, w wyniku czego powstanie jedna rurka basenowa. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Wiruj komórki, a następnie dodaj 800 do 1000 mikrolitrów zimnej pożywki hodowlanej.

Odwirować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty w temperaturze 5200 razy g, a następnie wyrzucić supernatant w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał. Umyj komórki jednym mililitrem pożywki hodowlanej, a następnie odwiruj komórki. Kontrole dodatnie i ujemne oraz eluowane komórki uprzednio przechowywane na lodzie.

Odrzucić supernatant. Następnie do próbek dodać 148,5 mikrolitra pożywki hodowlanej. Następnie dodaj 25 mikrolitrów bezwzględnych kulek do liczenia, a następnie 1,5 mikrolitra roztworu barwiącego jodek propidy.

Zawiesić osady kontroli dodatniej i ujemnej za pomocą 175 mikrolitrów pożywki hodowlanej. Próbki można teraz badać na cytometrze przepływowym. Te wykresy cytometrii przepływowej pokazują wyniki separacji komórek z populacji trypanosomów indukowanych w celu wytworzenia dwuniciowego pęknięcia DNA w porównaniu z komórkami nieindukowanymi.

Panele po lewej stronie pokazują rozproszenie przednie i boczne, co pozwala na wyjaśnienie żywych i martwych komórek oraz kulek dodanych do próbki. Następnie można wygenerować bramki, które określają je na podstawie charakterystyki rozproszenia. Panele po prawej stronie pokazują tylko te komórki, które można sklasyfikować jako aktywne na podstawie bramek rozproszonych wygenerowanych w panelach po lewej stronie.

Dominującym początkowym VSG w tym przypadku był VSG dwa. Komórki, które barwią się dodatnio dla jodku propidyny, są martwymi komórkami. A te są widoczne w Q jeden i Q dwóch regionach fabuły.

Komórki, które barwią się dodatnio dla dominującego VSG i ujemnie dla PI, wpadają do regionu Q trzy i są zanieczyszczeniami. Wreszcie, komórki w Q four są żywymi komórkami, które barwią się ujemnie dla dominującego VSG, które są uważane za przełączniki. Ten wykres przedstawia obliczone obserwowane częstotliwości przełączania populacji trypanosomów z indukowanymi przerwami i bez nich.

Poziom przełączania stochastycznego in vitro jest dość niski. Podczas gdy wywołanie przerwy powoduje znacznie więcej komórek, przejście na niedominujący VSG. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około trzy godziny.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby próbki były zimne przez cały czas i odpowiednio zawiesiły granulki, zwłaszcza przed izolacją na kolumnie. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA, mogą być użyte do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie VSG są wyrażane w populacji przełączników. Metody te są zwykle stosowane do pomiaru przełączania VSG, mogą być również stosowane do izolacji i kwantyfikacji pasożytów wyrażających dowolne białko powierzchniowe będące przedmiotem zainteresowania.