Name: Wykrywanie zmiany glikoproteiny powierzchniowej wariantu Trypanosoma brucei za pomocą magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę izolacji Trypanosoma brucei ekspresujących określone VSG przy użyciu magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybkie wykrywanie rzadkich przełączników antygenowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować George'owi Crossowi za ogólne porady dotyczące biologii trypanosomów. Prace te były również wspierane przez grant GCE Fundacji Billa i Melindy Gatesów dla DS, stypendium NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1325261) dla MRM oraz NIH/NIAID (grant #AI085973) dla FNP. Dziękujemy Galadrieli Hovel-Miner za użycie szczepu zawierającego gen I-SCEI i miejsce rozpoznania.

UWAGA: Przez cały czas trwania procedury konieczne jest utrzymywanie komórek na lodzie. Przez cały czas należy również używać zimnych mediów.
1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Grow Lister 427 przecedził trypanosomy krwionośne do gęstości 0,5 - 1 miliona/ml. Najlepiej jest rozpoczynać uprawy z niewielką liczbą pasożytów. Wirować 50 x 106 komórek/próbkę przez 10 minut przy 1,500 x g. Pamiętaj, aby pozostawić 1 x 106 komórek w hodowli do późniejszego wykorzystania jako kontrole przeciwciał dodatnich i ujemnych. 
	UWAGA: Protokół ten może być również stosowany w przypadku trypanosomów wyizolowanych z krwi zwierzęcej (szczegóły w dyskusji).</li>
	<li>Odpipetować lub odlać większość supernatantu (pozostawić około 750 μl). Przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g w mikrowirówce i usunąć supernatant.</li>
</ol>
2. Etykietowanie magnetyczne
<ol>
	<li>Zawiesić komórki w pożywce hodowlanej o objętości 150 μl (na przykład HMI-9 z surowicą) + pierwszorzędowe przeciwciało anty-VSG w odpowiednim rozcieńczeniu. 
	UWAGA: Przeciwciało anty-VSG jest wytwarzane we własnym zakresie i stosowane w rozcieńczeniu 1:50. Ważne jest, aby użyć pierwszorzędowego przeciwciała anty-VSG, które nie jest znakowane fluoroforem.</li>
	<li>Komórki wirowe za pomocą adaptera wirowego-60 z prędkością 6 - 8 w chłodni w temperaturze 4 °C przez 10 min. Przemyć 800 - 1.000 μl zimnego HMI-9 z serum.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g i zassać supernatant. Przemyć 1 ml HMI-9 z serum i odwirować jak wyżej. Odessać supernatant. Zawiesić osad w 100 μl HMI-9 z surowicą.</li>
	<li>Dodać 110 μl mikrokulek do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MSC). Użyj kulek anty-myszy, anty-królika lub anty-biotyny, odpowiednio do pierwszorzędowego przeciwciała anty-VSG. Dobrze wymieszaj. Wirować komórki w chłodni w temperaturze 4 °C przez 10 min.</li>
	<li>Podczas wirowania komórek ustaw jedną kolumnę/próbkę separacyjną aktywowaną magnetycznie na magnesie separacyjnym. Upewnij się, że pod kolumną znajduje się pojemnik (używamy probówki wirówkowej o pojemności 15 ml) do zbierania przepływu. Ustaw urządzenie w chłodni.</li>
	<li>Dodać 2 ml HMI-9 z surowicą do kolumny wstępnej. Po zalaniu umieścić probówkę wirówkową o pojemności 15 ml pod kolumną, aby zebrać przepływ z każdej próbki.</li>
	<li>Po 10-minutowej inkubacji w kroku 2.4 dodać 800-1 000 μl zimnego HMI-9 z surowicą. Wirować w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g i usunąć supernatant w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Przemyć 1 ml HMI-9 surowicą i powtórzyć czynność, pozostawiając 100 μl supernatantu.</li>
	<li>Energicznie potrząśnij probówką wirówkową i sprawdź wzrokowo probówkę, aby upewnić się, że osad jest całkowicie zawieszony. Dodaj 1 ml HMI-9 z surowicą i pipetą w górę iw dół, aby upewnić się, że komórki są dobrze zawieszone.</li>
</ol>
3. Separacja magnetyczna
<ol>
	<li>Upewnij się, że kolumny są zagruntowane zgodnie z powyższym opisem. Zastosuj komórki do kolumny. Zbierz przepływ z komórkami wyrażającymi niedominujący VSG. 1 ml pożywki + trypanosomów zwykle potrzebuje 6 - 7 minut, aby przepłynąć przez kolumnę.</li>
	<li>Przemyć 2x 1 ml HMI-9 surowicą i zebrać przepływ do tej samej probówki, co w kroku 3.1.</li>
	<li>Podzielić przepływowy (3 ml) na dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Można je połączyć później lub połowę można użyć do wyizolowania RNA itp.</li>
	<li>Zdejmij kolumnę z magnesu. Dodać 3 ml HMI-9 z surowicą do kolumny i zanurzyć kolumnę w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, aby uzyskać komórki wykazujące ekspresję wyjściowego, dominującego VSG. Usunąć 300 μl eluowanego materiału do późniejszej analizy. Utrzymuj te komórki na lodzie.</li>
	<li>W celu użycia jako kontrola dodatnia i ujemna należy pobrać około 1 miliona komórek z początkowej hodowli komórek kontrolnych rosnących w temperaturze 37 °C (tych, w których nie przewiduje się częstej zmiany) i pipetować je do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Komórki kontroli dodatniej zostaną wybarwione przeciwciałem znakowanym fluoroforem w kroku 4.1. Ujemne komórki kontrolne pozostają niezabarwione przez pozostałą część protokołu.</li>
	<li>Wirować próbki przepływowe i dodatnią próbkę kontrolną przeciwciał w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g i usunąć supernatant. 
	UWAGA: Kolejne 300 μl podwielokrotności eluowanych komórek można zastosować jako kontrolę pozytywną do barwienia anty-VSG.</li>
</ol>
4. Barwienie w celu identyfikacji zanieczyszczeń i przełączników
<ol>
	<li>Zawiesić przepływające próbki i dodatnie komórki kontrolne w 100 μl HMI-9 z surowicą + pierwszorzędowym, znakowanym fluoroforem przeciwciałem anty-VSG w odpowiednim rozcieńczeniu. 
	UWAGA: Znakowane przeciwciało anty-VSG jest wytwarzane we własnym zakresie i używane w rozcieńczeniu 1:1,000. Znakowany fluoroforem anty-VSG może pochodzić z tego samego źródła, co nieznakowane przeciwciało na etapie separacji MACS. Po wykonaniu kroku 3.5 w dwóch probówkach do mikrowirówek należy umieścić 3 ml próbki przepływowej.</li>
	<li>Aby przeanalizować cały przepływ za pomocą cytometrii przepływowej, połącz granulki w dwóch probówkach mikrowirówek, jednocześnie ponownie zawieszając próbki w 100 μl HMI-9 z surowicą + przeciwciałem anty-VSG. Dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Wirować komórki w chłodnym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C przez 10 min. Dodać 800 - 1 000 μl zimnego HMI-9 z surowicą. Wirować próbki w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g i usunąć supernatant w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała.</li>
	<li>Przemyć komórki 1 ml HMI-9 z surowicą. Wirować próbki w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g i usunąć supernatant. Podczas tego ostatniego wirowania odwirować wymyte próbki z kroku 3.4 i próbkę kontroli ujemnej.</li>
	<li>Zawiesić wszystkie przepływowe i eluowane próbki w: 148,5 μl HMI-9 z surowicą, 25 μl absolutnych kulek zliczających i 1,5 μl roztworu barwiącego jodku propidyny (łącznie 175 μl). Zawiesić dodatnie i ujemne próbki kontrolne przeciwciał w 175 μl HMI-9 z surowicą. Należy pamiętać o zapisaniu liczby bezwzględnych kulek do liczenia/25 μl dla konkretnej użytej partii.</li>
	<li>Przepuść wszystkie próbki przez cytometr przepływowy i zbierz dane. Martwe komórki barwią się jako PI+. Zanieczyszczenia barwią się jako PI-VSG+. Przełączniki barwią się jako PI-VSG-8. </li>
	<li>Obliczanie częstotliwości przełączania na podstawie danych cytometrii przepływowej. 
	UWAGA: Instrukcje dotyczące obliczania częstotliwości przełączania można znaleźć w pliku uzupełniającym <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Cytometria przepływowa Calculations.docx</a> i Tabela 1.</li>
</ol>

<ol><li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li>
<li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li>
<li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li>
<li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li>
<li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li>
<li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li>
<li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jeśli chodzi o technikę eksperymentalną, najbardziej krytycznym elementem protokołu jest utrzymywanie wszystkich próbek w niskiej temperaturze. Trypanosomy bardzo szybko internalizują przeciwciało związane ze swoją powierzchnią9, ale proces ten jest zależny od ruchliwości i nie wpływa na test, o ile komórki są utrzymywane w temperaturze 4 °C. Wszystkie próbki należy zawsze przechowywać na lodzie, a pipetowanie powinno odbywać się szybko, aby zminimalizować narażenie na środowisko laboratoryjne o temperaturze 2...

Pasożyt pierwotniaka, Trypanosoma brucei, jest czynnikiem wywołującym choroby, które dotykają ludzi (poprzez Trypanosoma brucei gambiense i Trypanosoma brucei rhodesiense) i zwierzęta (poprzez Trypanosoma brucei brucei) w całej Afryce Subsaharyjskiej. Jest przenoszony na żywiciela ssaków przez ślinę wektora muchy tse-tse. Zarówno ludzka, jak i zwierzęca trypanosomatoza afrykańska powoduje poważne obciążenie ekonomiczne w regionach endemicznych, a niewiele leków jest dostępnych lub opracowywanych w celu leczenia którejkolwiek z tych chorób. Zrozumienie mechanizmów unikania odpowiedzi immunologicznej ma kluczowe znaczenie dla opracowania leków na trypanosomatozę. Antygenowa odmiana gęstej, wariantowej powłoki glikoproteiny powierzchniowej (VSG), która pokrywa pasożyta, jest jednym z podstawowych sposobów, za pomocą których T. brucei unika odpowiedzi przeciwciał ssaków. W genomie trypanosomu istnieje około 2000 wariantów genu VSG, ale tylko jeden jest transkrybowany w danym momencie z jednego z ~15 miejsc ekspresji. "Zamiana" ekspresji VSG może nastąpić albo przez skopiowanie genu VSG do aktywnego miejsca ekspresji, albo przez transkrypcyjną aktywację wcześniej cichego miejsca ekspresji (omówione w1).
Chociaż wiele pracy poświęcono na zrozumienie zmienności antygenowej u T. brucei, czynniki wpływające na częstotliwość przełączania są nadal słabo poznane. Dotychczasowe badania były utrudnione przez fakt, że podczas gdy przełączanie zachodzi stochastycznie in vitro, częstotliwości przełączania są bardzo niskie, rzędu 1 na około 106 komórek2. Utrudnia to zmierzenie, czy dany czynnik zwiększa czy zmniejsza częstotliwość przełączania, ponieważ przełączanie jest trudne do wykrycia w pierwszej kolejności. Przed 2009 r. metody izolowania osób zmieniających populację były długotrwałe i pracochłonne. Obejmowały one przechodzenie trypanosomów przez myszy uodpornione przeciwko dominującemu VSG, a następnie pobieranie komórek dzień później3 lub liczenie setek komórek za pomocą immunofluorescencji4,5. Inna strategia opiera się na selekcji pod kątem lekooporności w celu wyizolowaniaosób zmieniających 6. Ponieważ afrykańskie trypanosomy hodowane in vitro zazwyczaj składają się z dużej populacji wyrażającej jeden główny wariant i znacznie mniejszej populacji przełączników wyrażających alternatywne warianty, w tym artykule odnosimy się do głównego wariantu jako dominującego, rozpoczynającego VSG. Robiąc to, w żaden sposób nie chcemy sugerować, że ten główny wariant ma większą przydatność niż inne warianty w populacji.
Tutaj opisujemy metodę, która może wiarygodnie zmierzyć liczbę trypanosomów wyrażających niedominujący VSG w danej populacji w ciągu 3 - 4 godzin. Metoda ta jest szczególnie przydatna, gdy chce się ustalić, czy dana manipulacja genetyczna lub leczenie farmakologiczne zwiększa liczbę przełączanych komórek w populacji. Zamiast pozbywać się populacji komórek wykazujących ekspresję dominującą, rozpoczynając VSG za pomocą leków lub środków immunologicznych, komórki te są eliminowane poprzez najpierw pokrycie ich kulkami magnetycznymi sprzężonymi z przeciwciałem przeciwko dominującemu VSG, a następnie wyizolowanie ich na kolumnie magnetycznej. Przełączona populacja jest następnie zbierana w przepływie i ponownie barwiona przeciwciałem anty-VSG znakowanym fluoroforem w celu identyfikacji zanieczyszczeń. Oznaczanie ilościowe uzyskuje się poprzez dodanie określonej liczby bezwzględnych kulek zliczających do każdej próbki, tak aby można było określić stosunek kulek do komórek i wykorzystać je do ilościowego określenia liczby przełączników w populacji7.

<table><tbody><tr><td>nieznakowane przeciwciało anty-VSG</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Przeciwciało VSG jest wytwarzane w domu</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-VSG znakowane fluoroforem</td><td>nie</td> dotyczy <td>Przeciwciało</td><td>VSG jest wytwarzane w domowym</td></tr><tr><td>pożywce HMI-9</td><td>nie</td><td></td> dotyczy <td>HMI-9 jest wytwarzane w domu Jodek</td></tr><tr><td>propidium</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright absolutne kulki do liczenia</td><td>Thermofisher Naukowe</td><td>kolumny C36950</td><td></td></tr><tr><td>LD</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Magnes MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separator magnetyczny MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>adapter wirowy-60</td><td>ThermoFisher naukowy</td><td>cytometr</td> przepływowy AM10014 <td></td></tr><tr><td></td><td>Coulter</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie do analizy cytometrem przepływowym</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie zmiany glikoproteiny powierzchniowej wariantu trypanosoma brucei za pomocą magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, pasożyt pierwotniak, który powoduje zarówno ludzką, jak i zwierzęcą trypanosomatozę afrykańską (znaną odpowiednio jako śpiączka i nagana) między wektorem tse-tse a ssaczym gospodarzem. Unika układu odpornościowego gospodarza ssaków poprzez okresową zmianę gęstej, wariantowej glikoproteiny powierzchniowej (VSG), która pokrywa jego powierzchnię. Wykrycie zmienności antygenowej u Trypanosoma brucei może być zarówno kłopotliwe, jak i pracochłonne. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania liczby pasożytów, które "przełączyły się" na ekspresję nowego VSG w danej populacji. Pasożyty są najpierw barwione przeciwciałem przeciwko wyjściowemu VSG, a następnie barwione wtórnym przeciwciałem przyczepionym do kulki magnetycznej. Pasożyty wyrażające początkowy VSG są następnie oddzielane od reszty populacji poprzez przesuwanie pasożytów po kolumnie przymocowanej do magnesu. Pasożyty wyrażające dominujący, początkowy VSG są zatrzymywane w kolumnie, podczas gdy przepływ zawiera pasożyty, które wyrażają nowy VSG, a także niektóre zanieczyszczenia wyrażające początkowy VSG. Ta przepływowa populacja jest ponownie barwiona fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem przeciwko wyjściowemu VSG w celu znakowania zanieczyszczeń i jodkiem propidyny (PI), który znakuje martwe komórki. Do populacji przepływowej dodaje się znaną liczbę bezwzględnych kulek zliczających, które są widoczne za pomocą cytometrii przepływowej. Stosunek kulek do liczby zebranych komórek można następnie wykorzystać do ekstrapolacji liczby komórek w całej próbce. Cytometria przepływowa służy do ilościowego określenia populacji przełączników poprzez zliczenie liczby komórek PI ujemnych, które nie barwią się dodatnio dla początkowego, dominującego VSG. Odsetek osób zmieniających populację można następnie obliczyć na podstawie danych z cytometrii przepływowej.

Opisana tutaj metoda została wykorzystana do wykazania, że pęknięcia dwuniciowe w obrębie miejsca ekspresji VSG zwiększają liczbę komórek przełączających w populacji8. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki z populacji trypanosomów, w których w podobny sposób indukowano powstanie pęknięcia dwuniciowego w miejscu ekspresji. Porównujemy te trypanosomy z tymi, w których nie indukowano powstania pęknięcia dwuniciowego. Rycina 1 przedstawia reprezentatywne wykre...

Afrykańskie trypanosomy hodowane in vitro ulegają zmienności antygenowej w niskim tempie, tak że populacje składają się z pasożytów wyrażających dominujący wariant typu glikoproteiny powierzchniowej (VSG) i małej populacji "przełączonych" wariantów. Protokół ten opisuje szybką metodę wykrywania i ilościowego określania tych populacji.

Wykrywanie zmiany glikoproteiny powierzchniowej wariantu Trypanosoma brucei za pomocą magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Ogólnym celem tej metody jest izolacja trypanosomów wykazujących ekspresję konkretnego wariantu glikoproteiny powierzchniowej (VSG) z reszty populacji oraz identyfikacja pasożytów, które dokonały przełączenia z początkowego dominującego VSG na jakikolwiek inny VSG. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii trypanosomów, takie jak czynniki lub zdarzenia wpływające na przełączanie VSG w populacji pasożytów. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że jest ona szybsza od wcześniej opisanych metod i umożliwia łatwą kwantyfikację komórek, które przeszły przełączenie, w stosunku do tych, które go nie przeszły.Kiedy laboratorium po raz pierwszy zajęło się badaniem zmienności antygenowej, pierwszym problemem było znalezienie sposobu na wykrycie rzadkich komórek przełączających się. Ten rodzaj problemu został w rzeczywistości rozwiązany w immunologii wiele lat temu poprzez zastosowanie magnetycznego sortowania komórek (MACS) w celu wzbogacenia populacji komórek negatywnych pod kątem konkretnej cechy. Przeniesienie procesu nieselekcji do badań nad zmiennością antygenową wydawało się bardzo obiecującym pomysłem.Na początek trypanosomy krwi szczepu Lister 427 należy hodować do zagęszczenia od 0,5 do 100 000 na mililitr. Przenieść próbkę zawierającą 50 × 10⁶ komórek do probówki o pojemności 15 ml, a następnie odwirować. Zachować 1 × 10⁶ komórek oraz kulturę do późniejszego wykorzystania w charakterze pozytywnych i negatywnych kontroli przeciwciał.Odpipetuj większość supernatantu, pozostawiając w probówce około 750 µL. Przenieś komórki do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Na koniec odwiruj komórki w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 2800 ×g.Następnie odpipetuj cały nadsącz. Resuspenduj komórki w 150 µL pożywki hodowlanej z dodatkiem pierwotnego przeciwciała przeciwko powierzchniowemu glikoproteinowi wariantowemu (anty-VSG) w odpowiednim rozcieńczeniu. Następnie mieszaj komórki w vorteksie w temperaturze 4 °C przez 10 minut.Przemyć komórki od 800 do 1000 µL zimnej pożywki hodowlanej. Wirować komórki w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5200 ×g. Po odessaniu supernatantu przemyć komórki 1 mL pożywki hodowlanej i ponownie wirować.Usunąć nadsącz i resuspender osad w 100 µL pożywki hodowlanej. Dodać 110 µL mikrokulek do magnetycznej separacji komórek (MACS) odpowiedniego typu dla przeciwciała pierwszorzędowego. Dokładnie wymieszać, pipetując ciecz w górę i w dół, a następnie zawiórować w vortexie.Podczas wirowania komórek w vortexie, przygotuj kolumnę do separacji aktywowanej magnetycznie. Umieść pod nią probówkę o pojemności 15 ml w celu zbierania medium przygotowawczego. Dodaj 2 ml pożywki hodowlanej, aby przygotować kolumnę.Następnie należy wyjąć próbkę z vortexa i dodać od 800 do 1000 µL zimnej pożywki hodowlanej. Próbkę należy odwirować, a następnie odpirować nadsącz, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Osad komórkowy należy przemyć 1 mL pożywki hodowlanej i ponownie odwirować.Tym razem odessaj nadosad, pozostawiając w probówce 100 µL. Energicznie potrząśnij probówką do wirowania, aż osad zostanie całkowicie resuspendowany. Dodaj 1 mL pożywki hodowlanej i pipetuj roztwór w górę i w dół, aby całkowicie resuspendować komórki.Usuń 15 milimetrową probówkę stożkową, której użyto do zbierania medium przygotowawczego, i zastąp ją nową probówką stożkową o pojemności 15 mililitrów, aby zebrać frakcję przepływową zawierającą przełączone pasożyty. Nanieś zawiesinę komórkową na przygotowaną kolumnę. Zbierz frakcję przepływową do probówki 15 mililitrów umieszczonej poniżej; proces ten trwa zazwyczaj od sześciu do siedmiu minut dla 1 mililitra medium z trypanosomami.Następnie przemyj kolumnę dwukrotnie 1 ml pożywki hodowlanej i zbierz filtrat do tej samej probówki. Podziel filtrat, którego całkowita objętość powinna wynosić około 3 ml, do dwóch probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Następnie umieść probówki na lodzie.Dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej do kolumny i umieść kolumnę w probówce do wirowania o pojemności 15 mililitrów. Pozwoli to na uzyskanie komórek wykazujących ekspresję początkowego dominującego VSG. Pobierz 300 µL tego eluatu i przechowuj go w lodzie; resztę materiału można odrzucić.Aby przygotować kontrolę dodatnią, należy pobrać około 100 000 komórek z kultury wyjściowej i przenieść je pipetą do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Powtórzyć tę czynność w celu przygotowania kontroli ujemnej. Odwiruj próbki przepływowe oraz próbkę kontroli dodatniej.Następnie należy usunąć i odrzucić nadsącz. Komórki kontroli pozytywnej należy resuspender w 100 µL pożywki hodowlanej z przeciwciałem przeciwko VSG znakowanym fluorophorem pierwotnym w odpowiednim rozcieńczeniu. Następnie jeden osad z przepływu należy resuspender w 100 µL pożywki hodowlanej z przeciwciałem przeciwko VSG znakowanym fluorophorem pierwotnym w odpowiednim rozcieńczeniu.Użyj zawiesiny, aby ponownie zawiesić osad w drugiej probówce z przelewem, otrzymując w ten sposób jedną probówkę z połączonym materiałem. Wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół. Wymieszaj komórki na wirówce typu vortex, a następnie dodaj od 800 do 1000 µL zimnej pożywki hodowlanej.Wirować próbki w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5200 ×g, a następnie odlać nadsącz, aby usunąć nieprzypisane przeciwciała. Przemyć komórki 1 mL pożywki hodowlanej, a następnie je odwirować. Kontrole dodatnią i ujemną oraz eluowane komórki przechowywać wcześniej w lodzie.Odlej nadsącz. Następnie dodaj do próbek 148,5 µL pożywki hodowlanej. Kolejno dodaj 25 µL kulek do zliczania bezwzględnego, a następnie 1,5 µL roztworu barwiącego jodkiem propidyny.Resuspender osady kontroli pozytywnej i negatywnej w 175 µL pożywki hodowlanej. Próbki można teraz poddać analizie na cytometrze przepływowym. Przedstawione wykresy z cytometrii przepływowej pokazują wyniki separacji komórek z populacji trypanosom indukowanych do utworzenia pęknięć dwuniciowych DNA w porównaniu z komórkami nieindukowanymi.Panele po lewej stronie przedstawiają rozproszenie przednie w stosunku do bocznego, co pozwala na rozróżnienie żywych i martwych komórek oraz kulek dodanych do próbki. Następnie można utworzyć bramki, które określają te populacje na podstawie charakterystyki rozproszenia. Panele po prawej stronie pokazują wyłącznie te komórki, które na podstawie bramek rozproszenia utworzonych w panelach lewych zostały zaklasyfikowane jako żywe.Dominującym początkowym VSG w tym przypadku był VSG dwa. Komórki wykazujące pozytywne barwienie jodkiem propidium są komórkami martwymi. Są one widoczne w regionach Q1 i Q2 wykresu.Komórki, które wykazują pozytywne barwienie dla dominującego VSG i negatywne dla PI, trafiają do regionu Q three i są uznawane za zanieczyszczenia. Ostatecznie, komórki w Q four to żywe komórki barwiące się negatywnie dla dominującego VSG, które są uznawane za komórki przełączające. Wykres ten przedstawia obliczone zaobserwowane częstotliwości przełączania populacji trypanosom z indukowanymi pęknięciami w porównaniu do populacji bez nich.Poziom stochastycznego przełączania in vitro jest dość niski. Indukowanie pęknięcia skutkuje znacznie większą liczbą komórek przełączających się na niedominujący VSG. Po opanowaniu ta technika może być wykonana w około trzy godziny.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby próbki przez cały czas pozostawały w niskiej temperaturze oraz aby odpowiednio resuspender osady, szczególnie przed izolacją na kolumnie. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład które VSG są ekspresjonowane w populacji przełączającej się. Metoda ta jest zazwyczaj stosowana do pomiaru przełączania VSG, ale może być również wykorzystana do izolacji i kwantyfikacji pasożytów ekspresjonujących dowolne interesujące białko powierzchniowe.

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System biosensingu z modulacją magnetyczną jest wykorzystywany do szybkiego, czułego i prostego wykrywania analiz biologicznych, takich jak cząsteczki DNA i białka.

Szybka homogeniczna detekcja w testach biologicznych z wykorzystaniem systemu biosensingu z modulacją magnetyczną

Opisano metodę izolacji przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Metoda umożliwia kwantyfikację oraz charakterystykę fenotypową wyizolowanych leukocytów po barwieniu przeciwciałami fluorescencyjnymi, a następnie analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Pasożyt malarii atakuje i replikuje się w czerwonych krwinkach. Dokładna ocena inwazji merozoitu i parazytemii ma zatem kluczowe znaczenie w ocenie przebiegu zakażenia malarią. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru tych parametrów w mysim modelu malarii.

In vivo (in vivo) Ocena pasożytytemii zarodźca gryzoni i inwazji merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej

Ten manuskrypt opisuje użycie bioluminescencyjnego szczepu afrykańskich trypanosomów do śledzenia późnych stadiów infekcji i pokazuje, jak obrazowanie na żywo in vivo może być wykorzystane do wizualizacji infekcji w ośrodkowym układzie nerwowym w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu wykrycia późnego stadium zakażenia trypanosomatozą afrykańską

Dodanie znacznika do białka to potężny sposób na uzyskanie wglądu w jego funkcję. W tym miejscu opisujemy protokół endogennego znakowania setek białek Trypanosoma brucei równolegle, tak aby możliwe było znakowanie skali genomu.

Wysokoprzepustowe znakowanie genów u Trypanosoma brucei

Wirusy lub pęcherzyki zewnątrzkomórkowe były wychwytywane immunologicznie za pomocą nanocząsteczek magnetycznych 15 nm sprzężonych z przeciwciałami rozpoznającymi antygeny powierzchniowe. Uchwycone wiriony lub pęcherzyki znakowano fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko innym antygenom powierzchniowym. Powstałe kompleksy rozdzielono w silnym polu magnetycznym i przeanalizowano za pomocą konwencjonalnych cytometrów przepływowych wyzwalanych fluorescencją.

Wirometria przepływowa do analizy widm antygenowych wirionów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ta metoda oddzielania trypanosomów od krwi zależy od tego, czy ich ładunek powierzchniowy jest mniej ujemny niż u komórek krwi ssaków. Zakażoną krew umieszcza się i poddaje działaniu środka ciężkości na kolumnie wymieniacza anionowego. Ta metoda, najbardziej odpowiednia diagnostyka trypanosomatozy afrykańskiej, dostarcza oczyszczonych pasożytów do badań immunologicznych, biologicznych, biochemicznych, farmaceutycznych i biologii molekularnej.

Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe)

Aspiracja cienkoigłowa to technika, dzięki której komórki są uzyskiwane z uszkodzenia lub narządu za pomocą cienkiej igły. Odessany materiał jest rozmazywany, barwiony i badany pod mikroskopem w celu diagnozy lub wykorzystywany do biologii molekularnej, cytometrii lub analizy in vitro. Jest tani, prosty, szybki i powoduje minimalną traumę.

Wykrywanie pasożytów trypanosoma zewnątrznaczyniowego za pomocą aspiracji cienkoigłowej

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie instrukcji, jak mierzyć zdolność przeciwciał obecnych w surowicach lub osoczu osób, naturalnie narażonych na zakażenie Plasmodium falciparum, do opsonizacji i indukowania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami (IE).

Pomiar naturalnie nabytych przeciwciał indukujących fagocytozę przeciwko pasożytom Plasmodium falciparum za pomocą testu opartego na cytometrii przepływowej

Na całym świecie medyczne pasożyty krwi były automatycznie badane za pomocą prostych kroków na niskokodowej platformie AI. Udoskonalono prospektywną diagnostykę filmów krwi dzięki zastosowaniu metody wykrywania i klasyfikacji obiektów w hybrydowym modelu głębokiego uczenia. Współpraca aktywnego monitorowania i dobrze wyszkolonych modeli pomaga zidentyfikować punkty zapalne transmisji trypanosomów.

Doskonała automatyczna identyfikacja pasożytów trypanosomów dzięki zastosowaniu hybrydowego modelu głębokiego uczenia

Opisujemy metodę badania, jak pH reaguje na sygnały środowiskowe w glikosomy krwiobiegowej formy afrykańskich trypanosomów. Podejście to obejmuje czujnik białka dziedzicznego wrażliwego na pH w połączeniu z cytometrią przepływową w celu pomiaru dynamiki pH, zarówno jako test przebiegu w czasie, jak i w formacie wysokoprzepustowego badania przesiewowego.

Pomiar dynamicznych zmian pH glikosomalnego u żywego Trypanosoma brucei

Poznaj metodę izolacji Trypanosoma brucei ekspresujących określone VSG przy użyciu magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybkie wykrywanie rzadkich przełączników antygenowych.

Wykrywanie zmiany glikoproteiny powierzchniowej wariantu Trypanosoma brucei za pomocą magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie zmiany glikoproteiny powierzchniowej wariantu Trypanosoma brucei za pomocą magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów