Name: Analiza importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj metodę analizy importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych Arabidopsis thaliana. Technika ta pozwala badać mechanizmy regulacyjne importu białek pod wpływem stresu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem dla PJ od Rady Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC; grant ref. BB/K018442/1).

1. Wzrost rzodkiewnika i leczenie stresu
<ol>
	<li>Przygotować 1 l pożywki Murashige i Skoog (MS), dodając 4,3 g mieszaniny soli bazowej MS, 10 g sacharozy, 0,5 g kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) do wody dejonizowanej do 1 l i dostosować pH do 5,7 wodorotlenkiem potasu (KOH). Dodać 6 g fitoagaru i sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 120 °C.
	<ol>
		<li>Przed zestaleniem należy wlać pożywkę do okrągłych płytek Petriego (średnica 9 cm, wysokość 1,5 cm, z 20 - 25 ml pożywki MS na płytkę). Pozostaw płytki do wyschnięcia przez ~1 godzinę w okapie z przepływem laminarnym przed zamknięciem pokrywek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść nasiona Arabidopsis thaliana w probówce o pojemności 1,5 ml w celu sterylizacji powierzchniowej, dodając 1 ml 70% (v/v) etanolu zawierającego 0,02% (v/v) Triton X-100 i ciągle wstrząsając przez 5-10 minut. Dla każdego genotypu/warunku przygotuj 10 szalek Petriego, z których każda zawiera ~100 - 150 sadzonek.</li>
	<li>Odczekać około 10 sekund, aż nasiona osiądną na dnie probówki, a następnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie. Dodaj 1 ml 100% etanolu i ponownie potrząsaj probówką przez 10 minut.</li>
	<li>Przygotuj okap z przepływem laminarnym podczas sterylizacji nasion. Weź jeden kawałek bibuły filtracyjnej na próbkę, złóż go na pół, aby ułatwić siew, i namocz go w 100% etanolu w kapturze. Poczekaj, aż całkowicie wyschnie. Należy pamiętać, że stosuje się 100% etanol, ponieważ odparowuje on szybciej niż 70% etanolu.</li>
	<li>Przenieść nasiona na bibułę filtracyjną, pipetując za pomocą końcówki do pipet o pojemności 1 ml wyciętej ~5 mm od drobnego końca. Pozostaw je do wyschnięcia, co powinno zająć około 10 - 15 minut.</li>
	<li>Zasiej ~ 100 - 150 wysterylizowanych nasion równomiernie na każdej pożywce Petriego MS i uszczelnij każdą płytkę taśmą chirurgiczną.</li>
	<li>Przechowuj płytki do góry nogami w temperaturze 4 °C przez 2 - 4 dni, aby pobudzić i zsynchronizować kiełkowanie. Stare nasiona mogą wymagać dłuższego przechowywania (do tygodnia) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieś płytki do komory do hodowli tkanek roślinnych i pozostaw je do góry nogami. Rośliny uprawiać przez 8 dni w cyklu długiego dnia (16 h 100 μmol·m−2·s−1 jasny, 8 h ciemny) w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>W celu leczenia stresu, gdy rośliny mają 8 dni, w okapie przepływowym przenieś je z podłoża agarowego, delikatnie zeskrobując je ręcznie w rękawicach wysterylizowanych etanolem, do wysterylizowanej kolby z płynnym podłożem MS zawierającym stresor (np. 200 mM mannitol). Unikaj przenoszenia pożywki agarowej. Przykryj otwór kolby wysterylizowaną folią i pozwól roślinom rosnąć w tych samych warunkach, co w kroku 1.8 przez dodatkowe 2 dni na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym potrząsaniem (~100 obr./min).</li>
</ol>
2. Wytwarzanie białka prekursorowego przez transkrypcję/translację in vitro
Uwaga: Protokół ten zakłada użycie prekursora fotosystemu Arabidopsis I podjednostki D (pPsaD) jako matrycy/preproteiny, ale metoda jest kompatybilna z innymi.
<ol>
	<li>Sklonuj sekwencję kodującą (CDS) pPsaD do miejsca wielokrotnego klonowania (MCS) wektora SK pBlueScript II (lub innego podobnego wektora z promotorem T7) 13. Oczyść plazmid (pBSK-pPsaD) za pomocą zestawu do izolacji DNA i zweryfikuj sekwencję za pomocą sekwencjonowania DNA. 
	UWAGA: Wszystkie te kroki wykorzystują standardowe techniki klonowania molekularnego.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie plazmidowego DNA pBSK-pPsaD za pomocą spektrofotometru ustawionego do pomiaru absorbancji przy 260 nm. Rozcieńczyć plazmid do końcowego stężenia 10 ng/μl.</li>
	<li>Przeprowadzić PCR 20 μl (przez 35 cykli), używając rozcieńczonego plazmidu jako matrycy. Przygotować reakcję w następujący sposób: 2 μL 10× buforu polimerazy, 2 μL 2 mM dNTPs, 1 μL 5 mM M13 startera do przodu (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'), 1 μL 5 mM startera wstecznego M13 (5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'), 1 μL rozcieńczony plazmid pBSK-pPsaD, 1 U polimerazy Taq i wody destylowanej, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji do 20 μl. Użyć standardowego programu PCR, jak następuje: 95 °C, 5 min; 35 cykli [95 °C, 30 s; 56 °C, 30 s; 72 °C, 30 s); i 72 °C, 5 min.</li>
	<li>Przeprowadzić 5 μl produktu PCR na 1% (w/v) żelu agarozowym w buforze TAE (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM kwas octowy, 1 mM EDTA) w celu sprawdzenia poprawności amplifikacji cDNA i określić ilościowo odpowiednie pasmo w stosunku do wzorców w celu potwierdzenia stężenia. Pozostałą część produktu należy przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych zastosowań.</li>
	<li>Przygotować reakcję o objętości 50 μl przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcji/translacji na bazie lizatu retikulocytów królika, zgodnego z DNA PCR, w następujący sposób: 40 μl lizatu retikulocytów z systemu transkrypcji/translacji, 2,5 μl znakowanej radioaktywnie [35S] metioniny, 11 μCi/ml (aktywność specyficzna: >1,000 Ci/mmol), 2,5 μl sterylnej wody destylowanej i 5 μl produktu pPsaD PCR (100 - 800 ng). 
Ostrzeżenie: Podczas pracy z materiałem radioaktywnym należy nosić rękawice, odzież laboratoryjną i okulary ochronne. Monitoruj i odkażaj powierzchnię roboczą i sprzęt. Wszystkie odpady radioaktywne należy utylizować w zatwierdzonym pojemniku na odpady.</li>
	<li>Inkubować reakcję przez 90 minut w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C. Zatrzymaj reakcję, umieszczając próbkę na lodzie.</li>
	<li>Pobrać 1 μl reakcji jako próbkę badaną (ta sama objętość może również służyć jako kontrola wejściowa dla kroku 5.7) w celu weryfikacji za pomocą standardowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), a następnie autoradiografii, fluorografii lub obrazowania luminoforowego. Na dobry wynik wskazuje obserwacja wyraźnego i silnego prążka odpowiadającego masie cząsteczkowej pPsaD (~23 kD). Pozostałą część reakcji należy przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszych zastosowań.</li>
</ol>
3. Izolacja chloroplastów
<ol>
	<li>Przygotuj następujące roztwory podstawowe:
	<ol>
		<li>Przygotować bufor izolacyjny chloroplastów (CIB, 2x): 0,6 M sorbitolu, 10 mM chlorku magnezu (MgCl2), 10 mM kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego (EGTA), 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 20 mM wodorowęglanu sodu (NaHCO3), 40 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES); dostosować do pH 8,0 za pomocą KOH. Przygotować 2 litry 2x CIB, przygotować porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania. Aby zrobić 1x CIB, rozcieńczyć 2x CIB 1:1 wodą destylowaną; Można to przygotować świeżo w dniu eksperymentu z izolacją chloroplastów.</li>
		<li>Przygotować HEPES-MgSO, 4-bufor sorbitolowy (HMS, 1x): 50 mM HEPES, 3 mM siarczan magnezu (MgSO4), 0,3 M sorbitol; dostosować do pH 8,0 wodorotlenkiem sodu (NaOH). Przygotować 400 ml buforu, przygotować porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wszystkie poniższe procedury należy przeprowadzić w chłodni lub na lodzie. Przed rozpoczęciem należy schłodzić wszystkie roztwory, urządzenia, sprzęt i wirniki.</li>
	<li>Przygotować ciągły gradient gęstości, mieszając 13 ml Percollu, 13 ml buforu 2x CIB i 5 mg glutationu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirowując mieszaninę w temperaturze 43 000 × g przez 30 minut (hamowanie wyłączone) w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu należy obchodzić się z probówką ostrożnie, aby nie zakłócić gradientu i trzymać ją na lodzie do późniejszego użycia.</li>
	<li>Przenieść 100 ml 1x CIB na genotyp/warunek do zlewki o pojemności 1 l.
	<ol>
		<li>Usunąć sadzonki z płynnego podłoża, przerzucając je na sito, i przenieść je do innej zlewki zawierającej CIB; następnie przepłukać tkankę CIB, aby usunąć wszelkie pozostałości płynnego podłoża przed zastąpieniem jej 100 ml świeżego CIB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do homogenizacji należy użyć łącznie 100 ml 1x CIB na próbkę w pięciu kolejnych rundach homogenizacji, przy czym w każdej rundzie używa się 20 ml świeżego CIB przechowywanego w zlewce o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>W pierwszej rundzie homogenizacji przenieś ręcznie tkankę roślinną do zlewki o pojemności 50 ml, pozwalając poprzedniemu buforowi do przechowywania spłynąć przez palce. Spróbuj użyć większości tkanki w pierwszej rundzie, ale upewnij się, że jest ona zanurzona w buforze; Jeśli nie jest to możliwe, wprowadź pozostałą niewykorzystaną tkankę w drugiej rundzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić sondę homogenizatora tkankowego w tkance i homogenizować dwoma impulsami po 1 - 2 s każdy. Przefiltrować homogenat przez dwie warstwy tkaniny filtracyjnej do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml, delikatnie ściskając. Zachować filtrat i przenieść tkankę z powrotem do zlewki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umieścić drugą porcję CIB o pojemności 20 ml w zlewce o pojemności 50 ml, dodając pozostałą tkankę niewykorzystaną w pierwszej rundzie homogenizacji i powtórzyć etapy homogenizacji i filtracji. W ten sposób powtarzać kroki 3.5 i 3.6, aż do zużycia wszystkich 100 ml CIB (tj. 5 podwielokrotności po 20 ml) i połączyć otrzymane filtraty.</li>
	<li>Odwirować zebrany homogenat o stężeniu 1 000 × g przez 5 minut (hamulec włączony) w temperaturze 4 °C i wylać sklaczek natychmiast po zakończeniu wirowania, uważając, aby nie naruszyć osadu. Zawiesić osad w pozostałym supernatantze pozostawionym w probówce, delikatnie mieszając probówkę z lodem. Nie mieszać energicznie przez pipetowanie lub wirowanie.</li>
	<li>Delikatnie przenieść homogenat na wierzch wstępnie przygotowanego ciągłego gradientu gęstości, używając pipety Pasteura, aby nałożyć go przez ściankę rurki odbiorczej. Unikaj zakłócania gradientu. Wirować w wirniku z wahliwym kubełkiem o natężeniu 7 800 × g przez 10 minut (hamulec wyłączony) w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Po odwirowaniu w gradiencie widoczne są dwa zielone paski: dolny pas zawiera nienaruszone chloroplasty, a górny pas zawiera połamane chloroplasty.</li>
	<li>Odrzucić górne pasmo przez pipetowanie, a następnie przenieść dolne pasmo za pomocą pipety Pasteura do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, zachowując objętość do 8 ml na gradient.</li>
	<li>Dodaj ~ 25 ml buforu 1x HMS do probówki i dwukrotnie odwróć probówkę, aby zmyć Percoll z chloroplastów. Umieścić probówkę ponownie w wirniku kubełkowym i odwirować przy 1.000 × g przez 5 minut (hamulec włączony) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odlej supernatant i ostrożnie ponownie zawieś osad chloroplastowy w resztkach HMS pozostawionych w probówce, delikatnie mieszając probówkę na lodzie. W razie potrzeby dodać dodatkowe 100 - 300 μl HMS (w zależności od wielkości osadu i liczenia w sekcji 4), ale staraj się nie rozcieńczać próbki zbyt mocno.
	<ol>
		<li>Utrzymuj chloroplasty na lodzie. Za każdym razem, zanim chloroplasty zostaną użyte do dalszych zastosowań, należy wstrząsnąć rurką, aby je ponownie zawiesić. Zawsze używaj odciętej końcówki pipety (z rozszerzonymi porami) do przenoszenia chloroplastów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza wydajności i nienaruszoności chloroplastów
<ol>
	<li>Dodaj 5 μl wyizolowanych chloroplastów do 495 μl 1x buforu HMS w probówce o pojemności 1,5 ml, a następnie delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100.</li>
	<li>Umieść szklankę nakrywkową na górze komory zliczającej hemocytometru. Powoli odpipetować ~40 - 60 μL rozcieńczonej zawiesiny chloroplastowej do szczeliny między szkłem nakrywkowym a komorą liczącą. Używając mikroskopu z kontrastem fazowym z obiektywem 10X lub 20X, nienaruszone chloroplasty wyglądają na okrągłe i jasne i są otoczone aureolą światła. 
	UWAGA: Pod mikroskopem znajduje się obszar zliczania o wielkości 1 mm2 z 25 dużymi kwadratami, z których każdy zawiera 16 małych kwadratów pośrodku komory liczącej.</li>
	<li>Policz liczbę chloroplastów w 10 dużych kwadratach. Liczba chloroplastów na duży kwadrat powinna wynosić średnio od 10 do 30. Jeśli obecnych jest zbyt mało lub zbyt wiele chloroplastów, należy odpowiednio dostosować współczynnik rozcieńczenia (krok 4.1 powyżej) i powtórzyć procedurę.</li>
	<li>Obliczyć liczbę chloroplastów na ml (stężenie) w następujący sposób: n (średnia liczba chloroplastów na duży kwadrat obliczona w kroku 4.3) × 25 (całkowita liczba dużych kwadratów) × 100 (współczynnik rozcieńczenia) ×10 4 (współczynnik skalowania do wyrażenia danych na 1 ml, ponieważ objętość powyżej 25 kwadratów wynosi 0,1 mm3).</li>
	<li>Obliczyć rzeczywistą wydajność chloroplastów, mnożąc stężenie przez objętość zawiesiny chloroplastów otrzymaną w kroku 3.12. Zwykle można uzyskać ponad 50 × 106 chloroplastów.</li>
</ol>
5. Import białka chloroplastowego
<ol>
	<li>Przygotuj następujące roztwory podstawowe:
	<ol>
		<li>Przygotuj 10x bufor HMS: 500 mM HEPES, 30 mMMgSO4 i 3,0 M sorbitolu; dostosuj do pH 8,0 za pomocą NaOH. Przygotować 50 ml tego buforu, podwielokrotność, i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania i w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Przygotuj bufor zatrzymujący import: 50 mM EDTA rozpuszczony w 1x buforze HMS. Przygotować 50 ml tego buforu, podwielokrotność, i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotuj 2x Bufor ładujący białko: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v/v) glicerol, 2% (w/v) SDS, 0,005% (w/v) błękit bromofenolowy. Przygotować 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. Tuż przed użyciem dodać 100 μl 1 M 1,4-ditiotreitolu (DTT) do 900 μl buforu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeprowadzić kurs czasowy z 3 punktami czasowymi, przygotuj 3 probówki, z których każda zawiera 130 μl podwielokrotności buforu zatrzymującego przywóz i pozostaw je na lodzie. Przygotować 450 μl reakcji importu w probówce o pojemności 2 ml (według genotypu/warunku). Rozmrozić wszystkie składniki tuż przed użyciem.
	<ol>
		<li>Dla jednej reakcji importu zwykle stosuje się 10 × 106 chloroplastów w objętości A μl; na przykład, jeśli stężenie chloroplastów wynosi 2,5 × 108 / ml, należy użyć 40 μl zawiesiny chloroplastów. Trzy punkty czasowe będą wymagały 3 × μL (tj. 120 μL w naszym przykładzie).</li>
		<li>Wymieszać składniki reakcji na lodzie w następującej kolejności: woda destylowana (aby uzyskać całkowitą objętość 600 μL), B μL 10x bufor HMS (gdzie B = [600-3×A]/10; tj. 48 w naszym przykładzie), 12 μL 1 M kwasu glukonowego (sól potasowa), 6 μL 1 M NaHCO3, 6 μL 20% (w/v) BSA, 30 μL 100 mM adenozyno-5′-trifosforanu soli magnezowej (MgATP), 24 μL 250 mM metioniny (nieznakowanej radioaktywnie) i 30 μL białka prekursorowego. Bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji importowej dodać 3 × μl chloroplastów i wymieszać, delikatnie stukając w probówkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 25 °C w łaźni wodnej pod światłem 100 μmol·m−2·s−1. Od czasu do czasu przesuwaj rurki, aby ponownie zawiesić chloroplasty.</li>
	<li>Aby przeprowadzić przebieg w czasie, należy pobrać 130 μL podwielokrotności z reakcji w wymaganych punktach czasowych w liniowym zakresie importu, który dla pPsaD wynosi do ~12 min (w tym przypadku odpowiednie są 4-, 8- i 12-minutowe punkty czasowe). Okres zakresu liniowego może być różny dla różnych białek 14. Dlatego sugeruje się wcześniejsze przetestowanie każdego pojedynczego prebiałka w celu optymalizacji punktów czasowych.</li>
	<li>Natychmiast po pobraniu przenieść każdą 130 μl podwielokrotności do probówki z lodowatym buforem zatrzymującym import, wymieszać, delikatnie stukając w probówkę i pozostawić wszystkie probówki na lodzie aż do zakończenia upływu czasu.</li>
	<li>Odwirować wszystkie próbki przez 30 s przy 12 000 × g w mikrofuge, wyrzucić supernatanty przez pipetowanie i ponownie zawiesić granulki w 15 μl buforu ładującego 2x białko przez wirowanie.</li>
	<li>Przeanalizować wszystkie próbki oraz kontrolną metodę wejściową pPsaD (zawierającą pPsaD odpowiadającą 10% ilości dodanej do każdej reakcji importu, począwszy od kroku 2.7) za pomocą standardowej SDS-PAGE i autoradiografii, fluorografii lub obrazowania luminoforowego 15. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić ilościowo i przeanalizować wyniki. Aby zapewnić wskazanie efektywności przywozu, ilość importowanego białka w różnych genotypach/warunkach można ocenić, mierząc radioaktywność związaną z każdym dojrzałym prążkiem.</li>
</ol>

<ol><li>Jarvis, P., Lòpez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+regulation+of+photosynthetic+and+related+metabolism+under+environmental+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses.</a> Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Chua, N. H., Schmidt, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis%2C+transport%2C+and+assembly+of+ribulose+1%2C5-bisphosphate+carboxylase+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits.</a> Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).</li>
<li>Highfield, P. E., Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+transport+of+the+small+subunit+of+chloroplast+ribulose+bisphosphate+carboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase.</a> Nature. 271, 420-424 (1978).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Froehlich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Arabidopsis+envelope+protein+localization+and+topology+using+thermolysin+and+trypsin+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases.</a> Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).</li>
<li>Flores-Pérez, Ú, Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+suborganellar+fractionation+of+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts.</a> Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).</li>
<li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+ppi1+mutant+is+specifically+defective+in+the+expression+chloroplast+import%2C+and+accumulation+of+photosynthetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins.</a> Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).</li>
<li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+amongst+the+Arabidopsis+Toc159+family+of+chloroplast+protein+import+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors.</a> Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).</li>
<li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+binding+and+dimerization+at+the+chloroplast+pre-protein+import+receptor%2C+atToc33%2C+are+not+essential+in+vivo+but+do+increase+import+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency.</a> Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).</li>
<li>Huang, W., Ling, Q., Bédard, J., Lilley, K., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analyses+of+the+roles+of+essential+Omp85-related+proteins+in+the+chloroplast+outer+envelope+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane.</a> Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual.+Second+edn%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn</a>. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monogalactosyldiacylglycerol+deficiency+in+Arabidopsis+thaliana+affects+pigment+composition+in+the+prolamellar+body+and+impairs+thylakoid+membrane+energization+and+photoprotection+in+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves.</a> Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+Arabidopsis+chloroplasts+and+their+use+for+in+vitro+protein+import+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays.</a> Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).</li>
<li>Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+plants+lacking+the+PSI-D+subunit+of+photosystem+I+suffer+severe+photoinhibition%2C+have+unstable+photosystem+I+complexes%2C+and+altered+redox+homeostasis+in+the+chloroplast+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma.</a> J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).</li>
<li>Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preparation+of+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants.</a> Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).</li>
<li>Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+the+role+of+atTic20+in+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts.</a> Plant Cell. 14, 641-654 (2002).</li>
<li>Miras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+transit+peptide+for+import+into+the+chloroplast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast.</a> J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).</li>
<li>Nada, A., Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+envelope+protein+32+is+imported+into+chloroplasts+by+a+novel+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway.</a> J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niedawno wykazaliśmy, że import białka chloroplastowego może być aktywnie regulowany przez stres, który ma kluczowe znaczenie dla funkcji chloroplastów i przetrwania roślin 3. W tym badaniu, aby monitorować takie regulacje, zmodyfikowaliśmy nasze procedury izolacji chloroplastów i testów importowych in vitro , aby umożliwić ocenę zdolności importowej roślin uprawianych w warunkach stresowych. Wyniki wskazują na ważną rolę SP1 w regulacji importu białek chloroplastowych.
W konwencjonalnych testach importowych in vitro wykorzystuje się rośliny uprawiane na standardowym podłożu agarowym MS6,17,18. W przypadku opisywanego tutaj mutanta sp1 takie konwencjonalne testy nie wykazały żadnych różnic w imporcie białka w stosunku do WT3. Jednak rola SP1 w regulacji importu białka jest wyraźnie widoczna, gdy import białka jest oceniany w warunkach stresu przy użyciu metod opisanych w niniejszym dokumencie (ryc. 1). Chociaż bezpośrednie porównanie danych przywozowych z testu warunków stresowych z danymi uzyskanymi z testów konwencjonalnych może nie być możliwe (ponieważ metody te wykorzystują rośliny uprawiane odpowiednio w kulturze płynnej i na podłożu agarowym), porównanie między warunkami stresowymi i niestresowymi jest wykonalne, pod warunkiem że wszystkie rośliny są uprawiane na tym samym płynnym podłożu hodowlanym, ze stresorami lub bez.
W porównaniu z leczeniem stresu na podłożu agarowym, kultura płynna jest wygodniejsza do leczenia dużej liczby roślin potrzebnych do testów importu in vitro . Ponadto ułatwia równomierne zastosowanie stresora we wszystkich roślinach, co jest szczególnie ważne w przypadku krótkotrwałych zabiegów stresowych. Przedstawiona tutaj metoda została zastosowana do badania stresu osmotycznego za pomocą leczenia mannitolem, ale może być łatwo dostosowana do szerokiego zakresu innych naprężeń; na przykład krótkotrwały stres solny i stres oksydacyjny, dla których odpowiednie czynniki stresogenne mogą być podobnie zastosowane za pomocą ciekłego podłoża MS. W przypadku innych rodzajów naprężeń sugerujemy, aby najpierw zoptymalizować stopień naprężenia; Zbyt surowe zabiegi mogą mieć niekorzystny wpływ na wydajność i/lub kompetencje importowe wyizolowanych organelli.
W protokole jest kilka ważnych kroków, na które należy zwrócić szczególną uwagę, jak opisano poniżej.
Optymalne stężenie agaru dla podłoża MS może się różnić (0,6 - 0,9%, w/v) w zależności od producenta. Dlatego zaleca się empiryczną optymalizację stężenia agaru przed rozpoczęciem eksperymentów. Pożywka nie powinna być tak miękka, aby przyklejała się do tkanki na etapie zbioru (krok 1.9), ani nie powinna być tak twarda, aby hamować rozwój korzeni roślin. Stężenie sacharozy można również dostosować w zależności od wykorzystywanych roślin. Podczas pracy ze szczególnie chorymi mutantami, pożywka MS uzupełniona o 2 - 3% (w/v) sacharozy może pomóc roślinom w lepszym wzroście. Podczas stosowania leczenia stresu nie jest dobrze przenosić bardzo stare rośliny na płynne podłoże (np. >14 dni). Dzieje się tak, ponieważ bardziej rozwinięte korzenie starszych roślin łatwiej ulegają uszkodzeniu podczas przenoszenia.
Jeśli chodzi o system transkrypcji/translacji, istnieją 2 główne systemy: te oparte na kiełkach pszenicy i te oparte na retikulocytach królika. Zestawy te mogą wykorzystywać różne szablony, takie jak zlinearyzowane plazmidy, nielinearyzowane plazmidy lub produkty PCR. Zestawy są również specyficzne dla promotorów T3, T7 i SP6. Należy pamiętać, że polecany przez nas zestaw nadaje się wyłącznie do stosowania z produktami PCR i promotorem T7. Jednak z nieznanych przyczyn niektóre znakowane radioaktywnie preproteiny wytworzone za pomocą tego systemu mogą nie działać skutecznie w teście importowym; W takich przypadkach można rozważyć wypróbowanie systemu ekstraktu z kiełków pszenicy lub systemu lizatu retikulocytów przeznaczonego do matryc plazmidowych. Można również poprawić wynik reakcji transkrypcji/translacji, modyfikując warunki reakcji zgodnie z instrukcją producenta.
Ważne jest, aby rozpocząć izolację chloroplastów wcześnie rano (lub wcześnie w cyklu świetlnym komory wzrostu), aby uniknąć gromadzenia się skrobi wewnątrz chloroplastów w wyniku fotosyntezy, co może utrudniać izolację nienaruszonych organelli. Procedura izolacji chloroplastów musi być wykonana szybko, bez zbędnych opóźnień, a wyizolowane chloroplasty muszą być zawsze przechowywane w niskiej temperaturze. Ma to na celu złagodzenie obserwacji, że izolowane chloroplasty będą stopniowo tracić swoją żywotność, co nie jest dobre. W przypadku korzystania z nowo rozmrożonego buforu CIB lub HMS, należy dobrze wymieszać bufor przed użyciem, aby uzyskać jednorodny roztwór. Optymalne warunki homogenizacji materiału roślinnego zostały ustalone empirycznie i mogą się zmieniać, jeśli stosuje się inny homogenizator tkankowy.
Jeśli różne genotypy roślin zawierają podobne poziomy chlorofilu, oznaczanie ilościowe chlorofilu może być stosowane jako alternatywny sposób normalizacji próbek przed przeprowadzeniem testów importowych. Chlorofil można oznaczyć spektrofotometrycznie po ekstrakcji próbki wyizolowanych chloroplastów w 80% (v/v) wodnym roztworze acetonu 19,20. Jednakże, jeżeli mają być porównane wielkości przywozu roślin wykazujących różną zawartość chlorofilu (np. mutanty o fenotypach chlorotycznych), należy zastosować liczenie liczby chloroplastów w celu normalizacji próbek chloroplastów w testach przywozu. Szczególnie ważne jest dokładne ponowne zawieszenie chloroplastów w kroku 3.11. Niewystarczająca ilość ponownego zawieszenia może pozostawić agregaty chloroplastów, co utrudni dokładne zliczenie liczb, a tym samym utrudni prawidłowe ładowanie w reakcjach przywozu. Jeżeli pod mikroskopem zaobserwuje się silną agregację (np. agregaty z >10 chloroplastami połączonymi ze sobą), należy kontynuować wytrząsanie próbki chloroplastu na lodzie, aż agregaty zostaną usunięte. Łatwiej jest ponownie zawiesić chloroplasty w mniejszej objętości buforu.
Ważne jest, aby mieć świadomość, że reakcje przywozu białek (sekcja 5) muszą być przeprowadzane z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności ze względu na ich radioaktywny charakter. Niezbędne środki ostrożności obejmują: noszenie rękawiczek jednorazowych, odzieży laboratoryjnej i okularów ochronnych, monitorowanie i odkażanie powierzchni roboczej i sprzętu oraz usuwanie wszystkich odpadów promieniotwórczych w zatwierdzonym pojemniku na odpady. Należy również pamiętać, że prawidłowe ciśnienie osmotyczne ma kluczowe znaczenie dla utrzymania nienaruszonego stanu chloroplastów podczas reakcji importu, a jest to głównie utrzymywane przez bufor HMS. Ponieważ 10x HMS jest lepki, należy go najpierw podgrzać do temperatury pokojowej, a następnie dokładnie wymieszać i nałożyć za pomocą wyciętej końcówki pipety, aby zapewnić dokładny pomiar objętości. W reakcji importu zimna metionina jest dodawana w celu zahamowania włączania wolnej metioniny znakowanej radioaktywnie do niepowiązanych białek chloroplastowych poprzez translację organellarów na etapie inkubacji, podczas gdy BSA jest stosowana w celu zminimalizowania proteolizy, działając jako substrat dla proteaz.

Chloroplasty to bardzo obfite organelle, które istnieją w zielonych tkankach roślin. Są dobrze znane ze swojej kluczowej roli w fotosyntezie, procesie, który wykorzystuje energię świetlną do przekształcania dwutlenku węgla w cukier, a tym samym podtrzymuje prawie całe życie na Ziemi 1. Ponadto chloroplasty (i szersza rodzina pokrewnych organelli zwanych plastydami) odgrywają wiele innych istotnych ról w roślinach, w tym biosyntezę aminokwasów, lipidów, pigmentów i wykrywanie sygnałów środowiskowych, takich jak grawitacja i prowokacja patogenów. Fotosynteza generuje reaktywne formy tlenu (ROS) jako produkty uboczne, które w pewnych okolicznościach pełnią użyteczną rolę, ale w przypadku nadprodukcji mogą powodować szkodliwe lub nawet śmiertelne skutki. Nadprodukcji ROS sprzyjają szczególnie niekorzystne warunki środowiskowe, a zatem chloroplasty są ściśle związane z reakcjami na stresy abiotyczne, takie jak zasolenie i stresy osmotyczne 2.
Chloroplasty mają złożoną strukturę. Każdy chloroplast jest otoczony zewnętrzną warstwą z podwójną błoną zwaną otoczką, która składa się z błony zewnętrznej i wewnętrznej. Wewnątrz znajduje się inny system błonowy zwany tylakoidami, w którym zachodzą reakcje świetlne fotosyntezy. Pomiędzy tymi dwoma systemami membranowymi znajduje się przedział wodny zwany zrębem, który bierze udział w wiązaniu węgla. Chloroplast może zawierać do ~ 3,000 różnych białek, a zdecydowana większość tych białek jest syntetyzowana w cytozolu w postaci prekursora i musi być importowana do organelli przez dedykowane translokony białkowe w błonach otoczki 1. Co ciekawe, ostatnie prace wykazały, że import białek chloroplastowych jest aktywnie regulowany, a zatem jest w stanie wywierać istotny poziom kontroli nad proteomem chloroplastowym. Na przykład w 2015 r. doniesiono, że import białek może reagować na stres abiotyczny poprzez bezpośrednią regulację obfitości translokonu na zewnętrznej błonie otoczki chloroplastów (TOC) przez układ ubikwityna-proteasom 3.
Używając oczyszczonych chloroplastów i syntetyzowanych in vitro białek prekursorowych, import białek może być odtworzony in vitro 4,5. W związku z tym metody in vitro mogą być stosowane do oceny wskaźników importu w różnych zmutowanych roślinach 6, co było kluczowym podejściem do analizy przypuszczalnych składników maszynerii importu białek oraz do odkrywania mechanizmów leżących u podstaw importu białka i jego regulacji. Ponadto chloroplasty mogą być przetwarzane z dalszym frakcjonowaniem lub trawieniem proteazy, po imporcie in vitro, co może ułatwić badania nad lokalizacją i topologią suborganellarów białek chloroplastowych 7,8.
Aby zbadać regulację importu białek przez stres, zmodyfikowaliśmy naszą rutynową metodę izolacji chloroplastów, jak to opiszemy tutaj. Co ważne, chloroplasty wyizolowano z roślin, które były uprawiane na standardowym podłożu agarowym Murashige and Skoog (MS) przez 8 dni, a następnie przeniesiono do płynnej pożywki MS uzupełnionej stresorem, zapewniając stosunkowo krótkie, kontrolowane leczenie stresu. Wydajność i kompetencje chloroplastów wyizolowanych z takich roślin poddanych działaniu stresu są zgodne z późniejszym testem importu białka in vitro 3. Oprócz protokołu izolacji chloroplastów przedstawiamy naszą rutynową metodę importu białka in vitro, która okazała się solidna i jest szeroko stosowana 3,9-12.

<table><tbody><tr><td>Sól bazalna Murashige i Skoog&nbsp;</td><td>Melford</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>fitoagar</td><td>Melford</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BPE151-500</td><td></td></tr><tr><td>taśma chirurgiczna (e.g., Micropore, 3M)</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>bibuła filtracyjna</td><td>Fisher</td><td>FB59023</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fisher</td><td>10607095</td><td></td></tr><tr><td>Kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>D/0700/53</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (HEPES)</td><td>Tkanina</td> filtracyjna Melford <td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>(Miracloth)</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Fisher</td><td>CFT-595-040M</td><td></td></tr><tr><td>Butelka wirówkowa 250 ml</td><td>Fisher</td><td>CFT-891-V</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (e.g., Kinematica PT10-35)</td><td>Sonda Fisher</td><td>11010070</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (np. , Kinematica PTA20S)</td><td>Fisher</td><td>11030083</td><td></td></tr><tr><td>wirówka (np. , Beckman Coulter Avanti JXN-26, do probówek 50 i 250 ml)</td>Rotor stałokątowy <td>Beckman Coulter</td><td>B34182</td><td></td></tr><tr><td>do 250&nbsp; Butelki ml (np. , JLA-16.250)</td><td>Rotor stałokątowy Beckman Coulter</td><td>363930</td><td></td></tr><tr><td>do 50&nbsp; Probówki mL (np. , JA-25.50)</td>Rotor wahliwe <td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td></td></tr><tr><td>do probówek 50 mL (np. , JS-13.1)</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>znakowany radioizotopowo [35S] metionina</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG072002MC</td><td></td></tr><tr><td>bezkomórkowy system translacji oparty na lizacie retikulocytów królika (TNT T7 Szybki zestaw do PCR DNA)</td><td>Mikroskop z</td> kontrastem fazowym Promega <td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>(np. , Nikon Eclipse 80i)</td><td>Nikon</td><td>niedostępny</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometr (ulepszona komora Neubauer BS748)</td><td>Hawksley Technology</td><td>AC1000</td><td>0,1 mm głębokość, 1/400 mm2</td></tr><tr><td>okulary nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td>22 mm i razy; 22 mm, grubość 0,13-0,17 mm</td></tr><tr><td>1,5 ml rurki do mikrofuge</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL probówki do mikrofuge</td><td>Starlab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>microfuge (np. , Eppendorf 5415D)</td><td>Eppendorf</td><td>niedostępny</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop 2000 lub podobny</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPR-700-310L</td><td></td></tr><tr><td>kwas glukonowy (sól potasowa)</td><td>Fisher</td><td>22932-2500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>metionina</td><td>Sigma</td><td>M6039</td><td></td></tr><tr><td>błękit bromofenolowy</td><td>Fisher</td><td>B/P620/44</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Fisher</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>S/5200/53</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base&nbsp;</td><td>Melford</td><td>B2005</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>(np. , Aida Image Analyzer)</td><td>Raytest</td><td>niedostępny</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Chloroplasty to organelle pełniące wiele ważnych ról w roślinach, które obejmują nie tylko fotosyntezę, ale także wiele innych funkcji metabolicznych i sygnalizacyjnych. Ponadto chloroplasty mają kluczowe znaczenie dla reakcji roślin na różne stresy abiotyczne, takie jak zasolenie i stresy osmotyczne. Chloroplast może zawierać do ~ 3,000 różnych białek, z których niektóre są kodowane przez jego własny genom. Jednak większość białek chloroplastowych jest kodowana w jądrze i syntetyzowana w cytozolu, a białka te muszą być importowane do chloroplastu przez translokony na błonach otoczki chloroplastowej. Ostatnie badania wykazały, że import białka chloroplastowego może być aktywnie regulowany przez stres. Aby biochemicznie zbadać taką regulację importu białka w warunkach stresowych, opracowaliśmy opisaną tutaj metodę jako szybką i prostą procedurę, którą można łatwo osiągnąć w każdym laboratorium. W tej metodzie rośliny są uprawiane w normalnych warunkach, a następnie poddawane warunkom stresowym w płynnej kulturze. Zbierany jest materiał roślinny, a następnie uwalniane są chloroplasty w wyniku homogenizacji. Surowy homogenat jest oddzielany przez wirowanie w gradiencie gęstości, co umożliwia izolację nienaruszonych chloroplastów. Wydajność chloroplastów ocenia się przez liczenie, a nienaruszalność chloroplastów sprawdza się pod mikroskopem. W przypadku testów importu białek, oczyszczone chloroplasty inkubuje się z 35S znakowanymi radioizotopowo białkami prekursorowymi in vitro i przeprowadza się eksperymenty w czasie, aby umożliwić porównanie wskaźników importu między genotypami w warunkach stresu. Przedstawiamy dane wygenerowane tą metodą, które pokazują, że szybkość importu białka do chloroplastów z mutanta regulatorowego jest specyficznie zmieniona w warunkach stresu osmotycznego.

Przykład eksperymentu dotyczącego importu białek do chloroplastów z 3 punktami czasowymi przedstawiono na Rysunku 1. PsaD jest komponentem fotosystemu I o masie ~18 kD, wystawionym na stromę, z formą prekursora o masie ~23 kD16. PsaD wybrano tutaj do testu importu białek in vitro, ponieważ jego poziomy w stanie stacjonarnym są podwyższone u mutanta sp1 w porównaniu z WT w warunkach stresu, co sugeruje zmianę wydajności jego importu u mutanta 3. Mutant sp1 posiada defekt w ważnym regulatorze aparatu importu białek do chloroplastów — białku SP1 3. W przypadku chloroplastów wyizolowanych z roślin hodowanych w normalnych warunkach nie stwierdzono wyraźnej różnicy w imporcie PsaD między sp1 a WT (dane nie przedstawiono)3. Jednakże, stosując opisane tutaj metody do oceny importu PsaD do chloroplastów wyizolowanych z roślin poddanych stresowi osmotycznemu, wykryto wyraźną różnicę. Choć u obu genotypów zaobserwowano akumulację dojrzałej formy białka w sposób zależny od czasu, szybkość importu była znacznie niższa dla chloroplastów WT niż dla chloroplastów sp1 (Rysunek 1), co jest zgodne z naszymi poprzednimi wynikami 3 i ujawnia istotną rolę białka SP1 w regulacji importu PsaD do chloroplastów w warunkach stresu.
<img alt="Analiza importu białek, prążki Western blot, wynik elektroforezy, porównanie czasu, WT vs sp1." src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Test importu białek przeprowadzony z użyciem chloroplastów wyizolowanych z roślin hodowanych w warunkach stresu osmotycznego. Chloroplasty wyizolowano z 10-dniowych roślin WT (Col-0) oraz mutantów sp1 Arabidopsis hodowanych w warunkach stresu (200 mM mannitolu) przez 2 d. (A) Import białek przeprowadzono z użyciem pPsaD znakowanego [35S]-metioniną; proces trwał 4, 8 i 12 min przed analizą metodą SDS-PAGE i obrazowaniem fosforowym. Równolegle przeanalizowano 10% kontrolę wejściową pPsaD, obejmującą białko przetłumaczone in vitro (IVT). Wskazano formy prekursorowe (pre) i dojrzałe (mat) pPsaD, natomiast pomiędzy nimi znajdują się dwa prążki, które prawdopodobnie odpowiadają produktom translacji skróconym lub proteolizowanym, ponieważ ich intensywność nie uległa zmianie w czasie trwania eksperymentu (*). (B) Aby porównać szybkość importu do chloroplastów z roślin WT i sp1 hodowanych w warunkach stresu, zmierzono intensywność każdego prążka odpowiadającego zaimportowanemu dojrzało białku w części A. Wszystkie dane wyrażono jako procenty ilości białka zaimportowanego do chloroplastów z roślin WT po 12 min. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Tutaj opisujemy nową metodę badania importu białek do izolowanych chloroplastów pod wpływem stresu. Metoda jest szybka i prosta i może być stosowana do badania konsekwencji różnych warunków stresowych dla importu białka chloroplastowego i odpowiednich mechanizmów regulacyjnych.

Analiza importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest badanie importu białek kodowanych w jądrze do chloroplastów, ze szczególnym uwzględnieniem wpływu stresu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad chloroplastami, takie jak sposób regulacji importu białek do chloroplastów. Szczególną zaletą tej techniki jest możliwość oceny wpływu stresu na import białek do chloroplastów.Chociaż metoda ta została opracowana do zastosowania u rośliny modelowej Arabidopsis thaliana, można ją zmodyfikować i dostosować do innych układów, takich jak rośliny uprawne. Procedurę zaprezentuje Qihua Ling, postdoc z mojego laboratorium. Na początek należy wyhodować rośliny Arabidopsis zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.Następnie, gdy rośliny osiągną ośmiodniowy wiek, należy przeprowadzić zabieg stresowy. Ostrożnie zsunąć rośliny z płytki z agarem ręcznie i umieścić je w wysterylizowanej kolbie z płynnym podłożem MS zawierającym czynnik stresowy. W zależności od charakteru eksperymentu konieczne może być również umieszczenie dodatkowych roślin w podobnej kolbie bez czynnika stresowego w celu zapewnienia kontroli.Przykryć wyloty kolb wysterylizowaną folią i pozostawić rośliny do wzrostu przez kolejne dwa dni na wytrząsarce orbitalnej przy łagodnym mieszaniu. Przygotować ciągły gradient gęstości, najpierw mieszając 13 ml Percoll, 13 ml dwukrotnego buforu do izolacji chloroplastów oraz pięć mg glutationu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie odwirować mieszaninę.Po wirowaniu należy ostrożnie obchodzić się z probówką, aby nie zakłócić gradientu, i przechowywać ją w lodzie do późniejszego użycia. Następnie należy przelać 100 mililitrów buforu do izolacji chloroplastów dla każdego wariantu do zlewki o pojemności jednego litra. Siewki należy usunąć z pożywki płynnej, przesypując je na sito.Następnie przenieś je do zlewki zawierającej bufor do izolacji chloroplastów. Przepłucz tkankę buforem, aby usunąć pozostałości pożywki, a następnie wymień bufor na 100 ml świeżego buforu do izolacji. W pierwszej rundzie homogenizacji przenieś tkankę roślinną ręcznie do zlewki o pojemności 50 ml, pozwalając poprzedniemu buforowi spłynąć między palcami.Następnie wprowadź głowicę homogenizatora tkankowego do tkanki i przeprowadź homogenizację, stosując dwa impulsy trwające od jednej do dwóch sekund każdy. Przefiltruj homogenizat przez dwie warstwy tkaniny filtracyjnej do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml. Na koniec delikatnie wyciśnij tkaninę.Zatrzymaj filtrat, a tkankę roślinną przenieś z powrotem do zlewki o pojemności 50 ml. Następnie wlej do zlewki 50 ml kolejne 20 ml buforu do izolacji chloroplastów i dodaj pozostałą tkankę, która nie została wykorzystana w pierwszej rundzie homogenizacji. Powtórz etapy homogenizacji i filtracji jeszcze cztery razy.Odwiruj połączony homogenat z prędkością 1 000 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Bezpośrednio po wirowaniu zlej nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu. Umieść probówkę w lodzie i resuspenduj osad w pozostałym nadsączu, delikatnie wstrząsając probówką.Następnie, używając pipety Pasteura, ostrożnie przenieś homogenat na górną część przygotowanego gradientu gęstości, prowadząc ciecz po ściance probówki odbiorczej. Następnie odwiruj próbkę i gradient w wirówce z rotorem z koszykami odchylanymi przy 7 800 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, z wyłączonym hamulcem. Po zakończeniu procesu zaobserwuj dwa zielone pasma widoczne w gradiencie.Odrzuć górny prążek, który zawiera uszkodzone chloroplasty, i za pomocą pipety Pasteura przenieś dolny prążek zawierający nienaruszone chloroplasty do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj do probówki 25 mililitrów buforu HMS i odwróć probówkę dwukrotnie, aby wypłukać Percoll z chloroplastów. Następnie umieść probówkę z powrotem w rotorze z koszyczkami wahadłowymi i ponownie sypalizuj chloroplasty.Odlej supernatant i resuspenduj osad w pozostałym buforze, delikatnie wstrząsając probówką na lodzie. W razie potrzeby dodaj dodatkowe 100 do 300 µL buforu HMS, starając się jednak nie rozcieńczać próbki zbyt mocno. Przechowuj resuspendowane chloroplasty na lodzie.Zacznij od dodania 5 µL wyizolowanych chloroplastów do 495 µL buforu HMS w probówce o pojemności 1,5 ml. Odwróć probówkę, aby delikatnie wymieszać roztwór. Następnie umieść szkiełko nakrywkę na komorze liczbowej hemacytometru.Powoli pipetuj od 40 do 60 µL rozcieńczonej zawiesiny chloroplastów w szczelinę między szkiełkiem zakrywającym a komorą liczbową. Za pomocą mikroskopu fazowo-kontrastowego wykonaj obraz chloroplastów, używając obiektywu 20x. Nieuszkodzone chloroplasty mają okrągły kształt, są jasne i otoczone aureolą światła.Następnie, używając obiektywu 10x, należy policzyć chloroplasty w 10 dużych polach. Średnia liczba chloroplastów na duże pole powinna wynosić od 10 do 30. Jeśli obecnych chloroplastów jest zbyt mało lub zbyt wiele, należy skorygować stopień rozcieńczenia i powtórzyć procedurę.Po uzyskaniu odpowiedniego zakresu należy obliczyć liczbę chloroplastów na mililitr zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Aby przeprowadzić analizę kinetyczną w trzech punktach czasowych, należy przygotować trzy probówki, z których każda zawiera 130 µL buforu zatrzymującego import, i pozostawić je w lodzie. W probówce o pojemności 2 mL należy przygotować mieszaninę do reakcji importu zawierającą bufor reakcyjny oraz znakowane radioaktywnie białko prekursorowe.Należy pamiętać, że dla każdego testowanego warunku powinna zostać przeprowadzona jedna reakcja. Należy użyć około 10 milionów chloroplastów na każdy punkt czasowy. Probówkę z reakcją należy inkubować w temperaturze 25°C w łaźni wodnej przy ograniczonej ilości światła.Od czasu do czasu potrząśnij probówkami, aby resuspender chloroplasty. W celu przeprowadzenia analizy przebiegu czasowego pobieraj 130 mikrolitrowe aliquoty z reakcji w wymaganych punktach czasowych w obrębie liniowego zakresu importu. Natychmiast po pobraniu przenieś każdą 130 mikrolitrową alikwotę do probówki z lodowatym buforem zatrzymującym import, wymieszaj poprzez delikatne opukiwanie probówki i przechowuj probówki w lodzie do zakończenia analizy przebiegu czasowego.Po usunięciu ostatniej próbki należy odwirować wszystkie próbki przez 30 sekund przy 12 000 ×g w mikrowirówce. Następnie należy usunąć nadfiltraty i resuspender osady w 15 µL dwukrotnego buforu do ładowania białek. Próbki należy następnie wymieszać za pomocą wortexa.Na koniec przeanalizuj wszystkie próbki oraz kontrolę wejściową prekursora, stosując standardowe SDS-PAGE oraz autoradiografię, fluorografię lub obrazowanie fosforymetryczne. PsaD jest komponentem fotosystemu I o masie 18 kilodaltonów, który jest syntetyzowany jako większy prekursor o masie 23 kilodaltonów. Przetworzenie do dojrzałej formy o masie 18 kilodaltonów świadczy o tym, że nastąpił import do chloroplastów.Badany w niniejszej pracy mutant sp1 Arabidopsis posiada defekt w białku sp1, które jest istotnym regulatorem mechanizmu importu białek do chloroplastów. W warunkach stresowych ilość importowanego białka PsaD do chloroplastów mutanta sp1 jest zwiększona w stosunku do typu dzikiego, czego nie obserwuje się w normalnych warunkach bezystressowych. Chociaż dojrzała forma białka PsaD gromadziła się w sposób zależny od czasu w chloroplastach obu genotypów roślin, szybkość importu była znacznie wyższa w chloroplastach mutanta sp1 niż w chloroplastach typu dzikiego.Wyniki te wskazują na istotną rolę białka sp1 w regulacji importu białek do chloroplastów w warunkach stresowych. Po opanowaniu techniki, cały proces — od izolacji chloroplastów po zakończenie testu importu — może zostać przeprowadzony w ciągu pięciu do sześciu godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o przeprowadzaniu wszystkich etapów izolacji chloroplastów w temperaturze 4 °C, aby zapewnić maksymalną aktywność chloroplastów.Po opracowaniu przed kilkoma dekadami, test importu białek do chloroplastów in vitro utorował drogę badaczom w tej dziedzinie do zgłębiania wielu różnych aspektów mechanizmu importu białek do chloroplastów. Przedstawione tutaj udoskonalenie umożliwia badanie wpływu warunków stresowych na import białek. Należy pamiętać, że praca z materiałami promieniotwórczymi wymaga szczególnej ostrożności.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych.

analysis-protein-import-into-chloroplasts-isolated-from-stressed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Prezentujemy tutaj protokoły do wysokowydajnej izolacji fizjologicznie aktywnych tylakoidów i testów transportu białek dla szlaków translokacji bliźniaczej argininy chloroplastów (cpTat), wydzielniczej (cpSec1) i rozpoznawania sygnałów cząstek (cpSRP).

Izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii

Tutaj opisujemy protokół ekspresji białek do protoplastów za pomocą metody transformacji za pośrednictwem PEG. Metoda ta zapewnia łatwą ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania oraz efektywne badanie lokalizacji białek i procesu importu dla różnych warunków eksperymentalnych in vivo.

Badanie importu białek do chloroplastów przy użyciu protoplastów

Prezentujemy tutaj sprawdzony i przetestowany protokół oczyszczania kompleksów importujących białka chloroplastowe (kompleks TOC-TIC) za pomocą znacznika TAP. Jednoetapowy protokół izolacji powinowactwa może być potencjalnie zastosowany do dowolnego białka i może być wykorzystany do identyfikacji nowych partnerów interakcji za pomocą spektrometrii mas.

Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania nienaruszonych chloroplastów z liści Arabidopsis i ich trzech głównych podkomór (otoczka, zrąb i tylakoidy), używając kombinacji wirowania różnicowego, ciągłych gradientów Percoll i nieciągłych gradientów sacharozy. Metoda ta jest cenna dla subplastydialnej i subkomórkowej lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu i proteomiki.

Przygotowanie podkompartmentów chloroplastowych z Arabidopsis do analizy lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu lub proteomiki

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje profilowanie polisomalne w celu wyizolowania translatomów, mRNA związanych z rybosomami, do niepolisomalnych i polisomalnych RNA z Arabidopsis poprzez wirowanie w gradicynacji gęstości sacharozy. Metoda ta demonstruje wydajność translacji Arabidopsis poddanego stresowi cieplnemu.

Test wydajności translacji przy użyciu profili polisomowych pod wpływem stresu cieplnego

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Dołączony film opisuje sposób wykorzystania systemu frakcjonowania GELFREE 8100, który rozdziela złożone próbki białek na podstawie masy cząsteczkowej i odzyskuje frakcje w fazie ciekłej. Film wyjaśnia zasadę działania tej technologii, sposób jej zastosowania oraz przedstawia uzyskane dane z analizy frakcjonowanego homogenatu wątroby bydlęcej za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.

Wykorzystanie systemu frakcjonowania GELFREE 8100 do frakcjonowania w oparciu o masę cząsteczkową z odzyskiem w fazie ciekłej

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Poznaj metodę analizy importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych Arabidopsis thaliana. Technika ta pozwala badać mechanizmy regulacyjne importu białek pod wpływem stresu.

Analiza importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych

Przeglądaj więcej filmów