Analiza importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych

Ogólnym celem tej metodologii jest zbadanie importu białek kodowanych w jądrze do chloroplastów, ze szczególnym uwzględnieniem skutków stresu. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chloroplastów, takie jak sposób regulowania importu białek chloroplastowych. Szczególną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na ocenę wpływu stresu na import białka chloroplastowego.

Chociaż metoda ta została opracowana do stosowania z rośliną modelową Arabidopsis thaliana, może być modyfikowana i dostosowywana do stosowania z innymi systemami, takimi jak rośliny uprawne. Procedurę zademonstruje Qihua Ling, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, najpierw wyhoduj rośliny Arabidopsis, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym.

Następnie, gdy rośliny osiągną wiek ośmiu dni, wykonaj zabieg stresu. Delikatnie ręcznie zeskrobać rośliny z płytki agarowej i umieścić je w wysterylizowanej kolbie z płynnym podłożem MS zawierającym stresor. Umieszczenie dodatkowych roślin w podobnej kolbie bez stresora jako kontroli może być również konieczne, w zależności od charakteru eksperymentu.

Przykryj wylot kolb wysterylizowaną folią i pozwól roślinom rosnąć przez dodatkowe dwa dni na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym potrząsaniem. Przygotuj ciągły gradient gęstości, najpierw mieszając 13 mililitrów Percollu, 13 mililitrów dwóch x buforu izolacyjnego chloroplastów i pięć miligramów glutationu w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Następnie odwirować mieszaninę.

Po odwirowaniu należy obchodzić się z probówką ostrożnie, aby nie zakłócić gradientu, i przechowywać ją na lodzie do późniejszego wykorzystania. Następnie przenieś 100 mililitrów buforu izolacyjnego chloroplastów na warunek do jednolitrowej zlewki. Usuń sadzonki z płynnego podłoża, wrzucając je do sita.

Następnie przenieś je do zlewki zawierającej bufor izolacyjny chloroplastów. Przepłukać tkankę buforem, aby usunąć wszelkie pozostałości pożywki, a następnie zastąpić bufor 100 mililitrami świeżego buforu izolacyjnego. W pierwszej rundzie homogenizacji przenieś ręcznie tkankę roślinną do 50-mililitrowej zlewki, pozwalając poprzedniemu buforowi spłynąć przez palce.

Następnie umieść sondę homogenizatora tkankowego w tkance i homogenizuj dwoma impulsami po jednej do dwóch sekund każdy. Przefiltrować homogenat przez dwie warstwy tkaniny filtracyjnej do 250-mililitrowej probówki wirówkowej. Na koniec delikatnie ściskaj szmatkę.

Zachować filtrat i przenieść tkankę roślinną z powrotem do zlewki o pojemności 50 mililitrów. Następnie umieść drugie 20 mililitrów buforu izolacyjnego chloroplastów w 50-mililitrowej zlewce i dodaj pozostałą tkankę, która nie została użyta w pierwszej rundzie homogenizacji. Powtórz etapy homogenizacji i filtracji jeszcze cztery razy.

Odwirować zebrany homogenat o stężeniu 1 000 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odlać sklarowany osad natychmiast po odwirowaniu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Umieścić probówkę na lodzie i ponownie zawiesić osad w pozostałym supernatantze, delikatnie mieszając probówkę.

Następnie za pomocą pipety Pasteura delikatnie przenieś homogenat na wierzch wstępnie przygotowanego ciągłego gradientu gęstości przez ściankę rurki odbiorczej. Następnie odwirować próbkę i dokonać gradientu w obracającym się wirniku kubełkowym o sile 7 800 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy wyłączonym hamulcu. Po zakończeniu obserwuj dwa zielone pasy, które można zobaczyć na gradiencie.

Wyrzuć górną prążek, która zawiera połamane chloroplasty, i użyj pipety Pasteura, aby przenieść dolną prążek zawierającą nienaruszone chloroplasty do świeżej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj 25 mililitrów buforu HMS do probówki i dwukrotnie odwróć rurkę, aby zmyć Percoll z chloroplastów. Następnie umieść rurkę z powrotem w wahadłowym wirniku wiadra i ponownie zasyp chloroplasty.

Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad w pozostałym buforze, delikatnie mieszając probówkę na lodzie. W razie potrzeby dodać dodatkowe 100 do 300 mikrolitrów buforu HMS, ale staraj się nie rozcieńczać próbki zbyt mocno. Zawieszone chloroplasty należy przechowywać na lodzie.

Zacznij od dodania pięciu mikrolitrów wyizolowanych chloroplastów do 495 mikrolitrów buforu HMS w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Odwróć probówkę, aby delikatnie wymieszać roztwór. Następnie umieść szklankę nakrywkową na górze komory liczącej hemacytometru.

Powoli odpipetować od 40 do 60 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny chloroplastowej do szczeliny między szkłem nakrywkowym a komorą liczącą. Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym zobrazuj chloroplasty za pomocą obiektywu 20x. Nienaruszone chloroplasty wyglądają na okrągłe i jasne i są otoczone aureolą światła.

Następnie użyj obiektywu 10x, aby określić liczbę chloroplastów w 10 dużych kwadratach. Liczba chloroplastów na duży kwadrat powinna wynosić średnio od 10 do 30. Jeśli obecnych jest zbyt mało lub zbyt wiele chloroplastów, dostosuj współczynnik rozcieńczenia i powtórz procedurę.

Gdy znajdzie się w odpowiednim zakresie, oblicz liczbę chloroplastów na mililitr, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Aby przeprowadzić kurs czasowy z trzema punktami czasowymi, przygotuj trzy probówki, z których każda zawiera 130 mikrolitrów podwielokrotności buforu przywozowego i pozostaw je na lodzie. W dwumililitrowej probówce przygotować reakcję importu zawierającą bufor reakcyjny i znakowane radioaktywnie białko prekursorowe.

Należy pamiętać, że dla każdego badanego stanu powinna wystąpić jedna reakcja. Użyj około 10 milionów chloroplastów na punkt czasowy. Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 25 stopni Celsjusza w łaźni wodnej pod ograniczoną ilością światła.

Od czasu do czasu przesuwaj probówki, aby ponownie zawiesić chloroplasty. Aby przeprowadzić przebieg czasowy, z 130 mililitrowymi porcjami z reakcji w wymaganych punktach czasowych w liniowym zakresie importu. Natychmiast po pobraniu przenieś każdą 130 mikrolitrową porcję do probówki z lodowatym buforem zatrzymującym import, zmieszanym przez delikatne stuknięcie w probówkę i umieść probówki na lodzie, aż czas trwania zostanie zakończony.

Po usunięciu ostatniej próbki należy odwirować wszystkie próbki przez 30 sekund w temperaturze 12 000 g w mikrofuzie. Następnie wyrzuć supernatanty i ponownie zawieś granulki w 15 mikrolitrach dwóch x buforu ładującego białko. Następnie wymieszaj próbki przez wirowanie.

Na koniec przeanalizuj wszystkie próbki, a także kontrolę wejściową prekursora, używając standardowej SDS-PAGE i autoradiografii, fluorografii lub fosforowania. PsiD jest 18-kilodaltonowym składnikiem fotosystemu I, który jest syntetyzowany jako większy prekursor 23 kilodaltonów. Przetwarzanie do dojrzałej formy 18 kilodaltonów wskazuje, że nastąpił import do chloroplastów.

Badane tutaj zmutowanie sp1 Arabidopsis niesie ze sobą defekt ważnego regulatora maszynerii importu białek chloroplastowych, białka sp1. W warunkach stresowych ilość importowanego białka PsaD do zmutowanych chloroplastów sp1 jest zwiększona w stosunku do typu dzikiego, ale nie w normalnych warunkach niestresowych. Podczas gdy dojrzała forma białkowa PsaD gromadziła się w sposób zależny od czasu z chloroplastami z obu genotypów roślin, szybkość importu była znacznie wyższa w przypadku zmutowanych chloroplastów sp1 niż w przypadku chloroplastów typu dzikiego.

Wyniki te wskazują na ważną rolę białka sp1 w regulacji importu białka chloroplastowego w warunkach stresowych. Po opanowaniu, ta metoda, od izolacji chloroplastów do zakończenia testu importowego, może zostać zakończona w ciągu pięciu do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby przeprowadzić wszystkie etapy izolacji chloroplastów w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby upewnić się, że chloroplasty zachowują maksymalną aktywność.

Test importu białek chloroplastowych in vitro, który został opracowany kilka dekad temu, utorował drogę naukowcom w tej dziedzinie do zbadania wielu różnych aspektów mechanizmu importu białek chloroplastowych. Przedstawione tu udoskonalenie umożliwia zbadanie wpływu warunków stresowych na import białka. Nie zapominaj, że praca z materiałem radioaktywnym wymaga szczególnej ostrożności.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych.