Szybkie i wydajne wytwarzanie rekombinowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinazy w locus AAVS1

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie szybkiej i wydajnej celowanej edycji genomu w AAVS1 ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych lub ludzkich PSC, przy użyciu flippazy, podejścia do wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy lub RMCE. RMCE poprawia docelową insercję sekwencji do locus AAVS1, co ma ogromne znaczenie dla biologii komórek macierzystych, ponieważ umożliwia szybkie testowanie funkcji cząsteczki poprzez nadekspresję lub knockdown. Główną zaletą tej techniki jest to, że ludzkie linie PSC są wolne od losowych zdarzeń integracyjnych, nadal pluripotencjalne i przy normalnych kariotypach mogą zostać wytworzone w ciągu zaledwie 15 dni.

Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do transgenezy w locus AAVS1, ale może być również stosowana do innych ludzkich loci permisywnych. Na początek należy przeprowadzić hodowlę ludzkich macierzystych linii komórkowych PSC zgodnie ze standardowymi procedurami na inaktywowanych mysich zarodkowych fybroblastach lub iMEF-ach lub poza nimi, na sześciodołkowych płytkach. Gdy komórki osiągną 60% do 70% konfluencji, płytki oporne na leki iMEF, najpierw używając 0,1% roztworu żelatyny do pokrycia niezbędnych studzienek 12-dołkowej płytki i inkubacji płytki w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie należy umieścić na płytce 125 000 iDR4 na studzience i inkubować kultury przez noc na pożywce iMEF. Następnego dnia należy przeprowadzić preinkubację ludzkich kultur PSC ze świeżą pożywką, w tym 10 mikromolowym inhibitorem ROCK w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. W międzyczasie doprowadzić ludzki roztwór do transfekcji ESC i czynnik dysocjujący komórki do temperatury pokojowej.

Przygotować jeden mililitr pożywki do powlekania nukleofekcji na każdy warunek nukleofekcji. Następnie wyjmij pożywkę iDR4 z dołków, użyj jednego mililitra PBS o temperaturze pokojowej do umycia komórek i dodaj pożywkę do powlekania nukleofekcji. Przenieś 500 mikrolitrów na próbkę podłoża galwanicznego do sterylnych probówek o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza do momentu posiewu.

Aby odłączyć ludzkie PSC w zawiesinie pojedynczej komórki, usuń pożywkę, użyj PBS o temperaturze pokojowej do umycia komórek i dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny lub Accutase odpowiednio na hodowle hPSC z karmnikiem lub bez karmienia. Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie wyjmij płytkę z inkubatora i nie dopuszczając do odłączenia komórek, odessać środek dysocjacyjny i dodać 1 mililitr ludzkiej pożywki PSC.

Oddziel luźne komórki, delikatnie spłukując podłoże na powierzchni płytki, unikając tworzenia się piany. Zbierz komórki w zawiesinie pojedynczej komórki w czystej i sterylnej probówce o pojemności 15 lub 50 mililitrów. Następnie użyj 1 mililitra pożywki hESC do umycia komórek i zbierz je do tej samej probówki.

Weź 50 mikrolitrów podwielokrotności zawiesiny komórek do liczenia i odwiruj pozostałe komórki w temperaturze pokojowej 300 razy g przez pięć minut. Policzyć komórki za pomocą urządzenia do liczenia komórek, podczas gdy zawiesina jest w trakcie wirowania. Usuń supernatent i użyj PBS w temperaturze pokojowej, aby delikatnie zawiesić kolor komórki do 10 do szóstej komórki na mililitr.

Następnie przenieś dwa mililitry na warunki eksperymentalne, aby oczyścić sterylne 15-mililitrowe probówki i powtórzyć wirowanie. Podczas wirowania próbek przygotuj mieszanki plazmidowe w trzech czystych 1,5-mililitrowych probówkach ze stosunkami molekularnymi flippazy dawcy 0:1, 2:1 i 2:0 przy użyciu 2,5 mikrograma plazmidu flippazy. Aby kontynuować nukleofekcję, wyjmij z inkubatora płytkę iDR4 i 1,5-mililitrową rurkę z podłożem galwanicznym.

Jedna probówka po drugiej, nie naruszając osadu, ostrożnie odpipetować PBS, usuwając jak najwięcej buforu. Użyj 100 mikrolitrów roztworu do transfekcji, aby ponownie zawiesić osad przez delikatne pipetowanie. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 1,5 mililitrowej probówki zawierającej mieszaniny plazmidów i delikatnie wymieszaj.

Przenieś mieszankę DNA komórkowego do kuwety transfektorowej, uważając, aby nie wprowadzać pęcherzyków. Włożyć kuwetę do urządzenia nukleofektorowego i uruchomić program A13 dla komórek hodowanych na podajnikach lub F16 dla transfekcji bez podajnika. Wyjmij kuwetę i użyj jednorazowych pipet transferowych znajdujących się w zestawie, aby delikatnie, ale szybko i jednym ruchem dodać 0,5 mililitra podłoża galwanicznego do kuwety.

Następnie odzyskaj objętość w ten sam sposób i umieść ją kroplami w 12-dołkowej płytce zawierającej iDR4 i podłoże galwaniczne. Umieść naczynie hodowlane na półce w inkubatorze i przesuwaj je powoli do przodu i do tyłu oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić zawiesinę komórek. Inkubuj naczynie przez 24 godziny przed zmianą podłoża.

Dwa do trzech dni po transfekcji rozpocznij selekcję. Odessać pożywkę, użyć 1 mililitra PBS do umycia komórek, a następnie dodać ludzką pożywkę ESC ze 100 nanogramami na mililitr puromycyny. Obserwuj wzrost komórek i odpowiednio zwiększ stężenie puromycyny do maksymalnie 250 nanogramów na mililitr, kontynuując selekcję puromycyny przez siedem dni.

Po trzech do czterech dniach selekcji puromycyny rozpocznij selekcję od 0,5 mikromolowej fialurydyny lub FIAU. Zmieniaj pożywkę codziennie i utrzymuj FIAU nie dłużej niż siedem kolejnych dni. Po zakończeniu selekcji, około 14 do 15 dni, pojawią się odporne kolonie RMCE, które utworzą nową linię RMCE.

Podziel komórki w stosunku 1:2 zgodnie ze standardowymi procedurami. Gdy studzienki z Klucza 1 są gotowe do podziału, rozdziel studzienkę w celu scharakteryzowania na zawiesinę pojedynczej komórki, jak opisano wcześniej w filmie, i zbierz komórki w 15-mililitrowej probówce. Wiruj komórki 300 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie użyj jednego mililitra PBS do ponownego zawieszenia komórek i podziel próbkę na dwie części. Jeden filtrowany za pomocą sitka komórkowego w celu przeprowadzenia cytometrii przepływowej, a drugi do analizy DNA zgodnie z protokołem tekstowym. Po transfekcji z rekombinazą flippazy i donorem tdT RMCE, hPSC utworzyły małe grupy komórek równomiernie rozmieszczonych w warstwie iDR4 MEF i ulegały ekspresji konstytutywnego GFP i przejściowego tdT.

Selekcja pozytywna przy użyciu puromycyny sprzyja insercji dawcy RMCE, a następnie selekcja negatywna przy użyciu FIAU selekcjonuje tylko zdarzenia rekombinacji za pośrednictwem FRT, w których brakuje TK. Około szóstego dnia po transfekcji można zidentyfikować małe skupiska komórek RMCE GFP-ujemnych, tdT-dodatnich. Jak wykazano tutaj, GFP-ujemne, tdT-dodatnie kolonie RMCE są obecne tylko wtedy, gdy stosuje się zarówno dawcę RMCE, jak i flippazę, podczas gdy RMCE nie występuje przy braku flippazy. Charakterystyka cytometrii przepływowej nowo wygenerowanych linii RMCE, które są koloniami RMCE opornymi na puromycynę i FIAU, połączonych w nieklonalną populację komórek, potwierdza, że 100% komórek reprezentuje fenotyp RMCE GFP-ujemny, tdT-dodatni.

Gdy wykorzystuje się dawców RMCE bez aktywności rejestratora w hPSC, 100% komórek jest GFP-ujemnych. Pokazana tutaj charakterystyka PCR nieklonalnej linii RMCE pokazuje pełną wymianę kasety i to, że zastosowany program selekcyjny generuje losowe linie wolne od integracji, zarówno dawcy RMCE, jak i wektora ekspresji flippazy. Podsumowując, ta metoda RMCE znacznie upraszcza edycję genów w hPSC dla zdefiniowanego locus w porównaniu z docelowymi nukleazami.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w 15 dni. Dlatego RMCE jest bardzo szybkim narzędziem do edycji genów, które pozwoli na badania porównawcze w warunkach izogenicznych. Podczas korzystania z tej procedury ważne jest, aby wydajność transfekcji była wyższa niż 30% i aby przygotować odpowiedni środek do wyboru pamięci rdzeniowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać RMCE w locus AAVS1 ludzkich PSC i jak scharakteryzować linię rekombinowaną.