Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Ogólnym celem tego eksperymentu jest opracowanie nowej metody wytwarzania komórek T regulatorowych związanych ze stanem zapalnym stawów pochodzących z komórek macierzystych do immunoterapii przeciwko autoimmunologicznemu zapaleniu stawów. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie autoimmunizacji dotyczące potencjalnych immunoterapeutyków w autoimmunologicznym zapaleniu stawów. Główną zaletą tej techniki jest to, że limfocyty T regulatorowe pochodzące z komórek macierzystych są nieguzowate i jednego typu.

Rozpocznij od rozcieńczenia interesujących komórek zasilających do minimalnej gęstości jeden razy 10 czwartych komórek na centymetr kwadratowy w pożywce OP9 i posiewu jeden razy 10 do szóstych komórek podających na 10-centymetrową szalkę. Gdy komórki staną się zlewające się w 80 do 90%, usuń pożywkę z kultur i wysiewaj od 0,5 do jednego razy 10 do piątego, retrowirusowo transdukowanych indukowalnych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPSC w pożywce OP9 w każdym naczyniu. Pięć dni później odessać pożywkę i umyć komórki 10 mililitrami PBS.

Następnie odłącz komórki czterema mililitrami trypsyny na naczynie, w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 10 minutach przerwij reakcje za pomocą ośmiu mililitrów pożywki IPSC i wyciągnij komórki do odwirowania. Ponownie zawiesić granulkę w 10 mililitrach świeżej pożywki IPSC i ponownie umieścić komórki na nowych 10-centymetrowych szalkach.

Pozwól komórkom zasilającym przylegać do płytki przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie zbierz pływające IPSC i przefiltruj transdukowane komórki przez sitko o średnicy 70 mikronów w celu zliczenia. Wysiewaj się pięć razy po 10 do piątych IPSC na świeżej 80 do 90% zlewającej się płytce komórek zasilających w pożywce OP9 uzupełnionej mysim ligandem Flt3 i wróć do inkubatora.

Po trzech dniach użyj 10-mililitrowej pipety, aby umyć naczynie pożywką hodowlaną. Następnie dodaj pięć mililitrów świeżej pożywki OP9 do naczynia i delikatnie zmyj wszelkie półprzylegające IPSC ostrożnym, mocnym pipetowaniem, które nie narusza warstwy komórek zasilających. Powtórz mycie z 10 mililitrami PBS, aby zebrać ostatnie z częściowo przylegających komórek, wciągając popłuczyny z każdego naczynia do jednej stożkowej probówki na kulturę.

Po odwirowaniu komórek ponownie zawieś granulki w 10 mililitrach pożywki OP9 uzupełnionej mysim ligandem Flt3-Ligand i IL-7 i przefiltruj komórki przez sitko o wielkości 70 mikronów. Wysiewać jedną kulturę IPSC na studzienkę na sześciodołkową płytkę hodowlaną zawierającą od 80 do 90% zlewających się monowarstw komórek zasilających i zwrócić kokultury do inkubatora. Co dwa dni zastępować połowę pożywki świeżą pożywką OP9 uzupełnioną mysim-Flt3-Ligandem i IL-7, a co cztery do sześciu dni ponownie wysiewać różnicujące IPSC na nowe płytki ze świeżą warstwą komórek zasilających, jeśli to konieczne.

Zacznij od odłączenia interesujących kultur komórkowych za pomocą trypsyny i ponownego zawieszenia każdego typu komórek w 10 mililitrach świeżej pożywki. Umieść każdą hodowlę komórkową w nowym 10-centymetrowym naczyniu i pozwól komórkom zasilającym przylegać do inkubatora do hodowli komórkowych. Po 30 minutach zbierz pływające IPSC i przepuść kultury przez indywidualne sitka do komórek o wielkości 70 mikronów, aby usunąć skupiska komórek do zliczenia.

Ponownie zawiesić każdą kulturę w stężeniu 1,5 razy 10 do siódmych komórek na mililitr w zimnym PBS, ponownie filtrując w razie potrzeby. Następnie umieść cztery do sześciotygodniowe samice myszy C57BL/6 pojedynczo w unieruchomieniu dla małych zwierząt i adoptuj przenieś 200 mikrolitrów jednego rodzaju komórek na mysz do żyły ogonowej każdego zwierzęcia. Użyj suwmiarki zegarowej, aby zmierzyć obrzęk obu kolan, aby ustalić pomiar podstawowy.

10 dni po transferze komórek użyj jednomililitrowej strzykawki, aby wstrzyknąć myszom 100 mikrogramów metylowanego BSA zemulgowanego w kompletnym adiuwantzie Freunda u podstawy ogona każdego zwierzęcia doświadczalnego. 17 dni po transferze komórek wywołać zapalenie stawów przez dostawowe wstrzyknięcie 20 mikrogramów metylowanego BSA w 10 mikrolitrach PBS do lewego stawu kolanowego oraz 20 mikrogramów metylowanego BSA i 100 mikrogramów całej albuminy jaja kurzego w 10 mikrolitrach PBS do prawego stawu kolanowego każdego znieczulonego adoptyjnie przeniesionego zwierzęcia. Siedem dni po wywołaniu zapalenia stawów ponownie zmierz kolana, aby obliczyć procentowy wzrost średnicy kolana i chirurgicznie wyciąć rzepki.

Zamocuj stawy w formalinie. Następnie, po odwapnieniu w EDTA, zanurz kolana w parafinie i uzyskaj skrawki o długości czterech mikronów do barwienia i analizy histochemicznej. W 28 dniu komórki regulatorowe T specyficzne dla antygenu wyrażają znaczne poziomy CD3 i receptorów limfocytów T specyficznych dla antygenu.

Większość z tych komórek wykazuje również ekspresję CD25, CD127 i CTLA-4, z których wszystkie są zwykle wyrażane na podwyższonych poziomach w naturalnie występujących komórkach regulatorowych T. Rzeczywiście, FoxP3 utrzymuje się w komórkach regulatorowych T pochodzących z IPSC, nawet po długotrwałej stymulacji in vitro ligandem Notch, wykrytym przez barwienie wewnątrzkomórkowe. Ponadto te specyficzne dla antygenu komórki regulatorowe T IPSC wytwarzają cytokiny supresyjne po stymulacji splenocytami pulsacyjnymi antygenu in vitro, co wskazuje na potencjalny fenotyp supresyjny dla tych komórek.

Komórki FoxP3 dodatnie obserwuje się w kolanach leczonych OVA, przy czym brak komórek FoxP3-dodatnich widocznych w kolanach, które otrzymują IPSC transdukowane wektorem kontrolnym. Co więcej, znacznie więcej komórek CD4-dodatnich, FoxP3-dodatnich, TCR3 Beta 5 jest wizualizowanych w kolanach myszy, które otrzymują IPSC transdukowane wektorem TCR-FoxP3, niż z samym wektorem FoxP3, co sugeruje, że specyficzne dla antygenu komórki IPSC-Treg migrują do kolana z zapaleniem stawów wywołanym antygenem po ich adopcyjnym przeniesieniu do zwierząt biorców. Adoptywny transfer komórek pochodzący z IPSC wpływa również na znaczne zmniejszenie zapalnego obrzęku kolana, gdy OVA jest obecny, ale nie ma wpływu na kontrolne kolana z metylowanym BSA.

Pozytywne efekty zmniejszenia obrzęku są dodatkowo potwierdzone przez obrazowanie mikrotomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości zmniejszonej utraty kości obserwowanej w kolanach poddanych transferowi komórek w porównaniu ze zwierzętami, którym wstrzyknięto MBSA. Po zebraniu te dogłębne procedury mogą zostać zakończone w ciągu sześciu tygodni, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Próbując tej techniki, należy pamiętać o indukowaniu różnicowania IPSC transdukowanego antygenem TCR-FoxP3.

Po tej procedurze można również rozważyć różne związki cytokin supresyjnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące przeżycia i jakości limfocytów T reg IPSC specyficznych dla antygenu. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią komórkową do zbadania roli limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu w chorobie autoimmunologicznej. Nie zapominaj, że praca z bezpośrednimi baktorami z autobody może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania zabiegu należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca w podstawowym pomieszczeniu z dwoma urządzeniami.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.