Name: Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę generowania antygenowo-specyficznych limfocytów T regulatorowych z iPSC do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów. Technika zapewnia jednorodną populację komórek o potencjale supresyjnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został częściowo sfinansowany z grantów od National Institutes of Health (R01AI121180, R21AI109239 i K18CA151798), American Diabetes Association (1-16-IBS-281) oraz Pennsylvania Department of Health (Tobacco Settlement Funds) dla J.S.

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+concepts+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolving concepts of rheumatoid arthritis.</a> Nature. 423, 356-361 (2003).</li>
<li>Ferraro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interindividual+variation+in+human+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interindividual variation in human T regulatory cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>van Herwijnen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+that+recognize+a+ubiquitous+stress-inducible+self-antigen+are+long-lived+suppressors+of+autoimmune+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).</li>
<li>Wright, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+therapy+with+redirected+primary+regulatory+T+cells+results+in+antigen-specific+suppression+of+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).</li>
<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).</li>
<li>La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+development+from+human+cord+blood+hematopoietic+stem+cells+by+Delta-like+1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro.</a> Blood. 105, 1431-1439 (2005).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lineage+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells.</a> Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> J Vis Exp. , e3986(2012).</li>
<li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).</li>
<li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).</li>
<li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%3A+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+all-trans+retinoic+acid+in+stabilizing+human+natural+regulatory+T+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-9-CD44+interaction+enhances+stability+and+function+of+adaptive+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells.</a> Immunity. 41, 270-282 (2014).</li>
<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).</li>
<li>Ramos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+caspase+9+suicide+gene+to+improve+the+safety+of+mesenchymal+stromal+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies.</a> Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).</li>
<li>Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3+and+Bcl-xL+cooperatively+promote+regulatory+T+cell+persistence+and+prevention+of+arthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development.</a> Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat Med. 16, 475-482 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole krytycznym etapem jest różnicowanie in vitro iPSC transdukowanych genem TCR/FoxP3. Metody in vitro Sygnalizacja Notch indukuje rozwój w kierunku linii limfocytów T. Aby zróżnicować iPSC w limfocyty Treg CD4 + FoxP3 + , użyliśmy limfocytówb OP9-DL1 / DL4 / I-A, które wykazują wysoką ekspresję cząsteczek MHC II (I-Ab). Większość iPSC różnicuje się w komórki CD4+ . Jednak po powierzchniowej ekspresji TCR wiele zróżnicowanych komórek pre...

Autoimmunologiczne zapalenie stawów jest chorobą ogólnoustrojową charakteryzującą się przerostem tkanki maziowej i postępującym niszczeniem chrząstki stawowej, kości i więzadeł1. Wadliwe wytwarzanie lub funkcja limfocytów Treg w autoimmunologicznym zapaleniu stawów przyczynia się do przewlekłego stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek, ponieważ limfocyty Treg odgrywają kluczową rolę w zapobieganiu rozwojowi autoreaktywnych komórek odpornościowych. 
Manipulacja limfocytami Treg jest idealną strategią dla rozwoju terapii tłumiących stan zapalny w sposób zależny od Ag. W przypadku immunoterapii opartej na limfocytach Treg swoistość przenoszonych limfocytów Treg jest ważna w leczeniu trwającej choroby autoimmunologicznej2. Aby wykazywać aktywność supresyjną, limfocyty Treg muszą migrować i być zatrzymywane w dotkniętym regionie, co może być kierowane przez specyfikę TCR dla Ag w tej lokalizacji3. Chociaż poliklonalne Treg mogą zawierać niewielką populację zawierającą tę specyficzność Ag z ich TCR, liczba tych Treg specyficznych dla Ag jest zwykle niska. W związku z tym terapie komórkowe z wykorzystaniem poliklonalnych limfocytów Treg przeciwko chorobom autoimmunologicznym wymagają adoptywnych transferów dużej liczby limfocytów Treg4,5. Ponieważ pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) mają zdolność przekształcania się w dowolny typ komórek, specyficzne dla Ag PSC-Treg mogą okazać się dobrymi kandydatami do immunoterapii opartej na Treg. Wcześniejsze badania wykazały pomyślny rozwój limfocytów T pochodzących z PSC, w tym Tregs6-8. 
Tutaj opisujemy protokół do tworzenia specyficznych dla Ag iPSC-Tregs. Dalej opisujemy terapię komórkową autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim przy użyciu takich limfocytów Treg. Metoda ta opiera się na genetycznie modyfikowanych mysich iPSC za pomocą TCR specyficznych dla Ag i czynnika transkrypcyjnego FoxP3. Zmodyfikowane iPSC następnie różnicują się w specyficzne dla Ag Treg na komórkach zrębu OP9 eksprymujących ligandy Notch DL1, DL4 i cząsteczki MHC-II (I-A b) w obecności cytokin mFlt3L i mIL-7. Te specyficzne dla Ag iPSC-Treg mogą wytwarzać cytokiny supresyjne, takie jak TGF-β i IL-10, gdy są stymulowane przez Ag, a adoptywny transfer takich Treg ma zdolność tłumienia rozwoju AIA w modelu mysim. Opisany protokół może być wykorzystany do opracowania limfocytów Treg specyficznych dla Ag pochodzących z komórek macierzystych do potencjalnych interwencji terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Myszy C57BL/6j</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD3 (2C11)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD28 (37.51)</td><td>Przeciwciało Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD8 ( 53&ndash; 6.7) przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CD25 (3C7)</td><td>Biolegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR-&beta; (H57597) przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Zintegrowana nauka</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>ACK Bufor do lizy</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Uwaga: Alergenne, rakotwórcze, toksyczne</td></tr><tr><td>Bufor permeabilizacji</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Ova</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik Tailveiner</td><td>Braintree scientific</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwój limfocytów t regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Choroby autoimmunologiczne powstają z powodu utraty samotolerancji immunologicznej. Limfocyty T regulatorowe (Treg) są ważnymi mediatorami samotolerancji immunologicznej. Tregi reprezentują około 5-10% subpopulacji dojrzałych limfocytów T CD4 + u myszy i ludzi, przy czym około 1 - 2% tych limfocytów Treg krąży we krwi obwodowej. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być różnicowane w funkcjonalne limfocyty Treg, które mogą być stosowane w terapiach komórkowych chorób autoimmunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę wytwarzania limfocytów Treg specyficznych dla antygenu (Ag) z iPSC (tj. iPSC-Treg). Metoda opiera się na włączeniu czynnika transkrypcyjnego FoxP3 i receptora limfocytów T specyficznego dla Ag (TCR) do iPSC, a następnie różnicowaniu się na komórkach zrębu OP9 wykazujących ekspresję ligandów Notch delta-podobnych (DL) 1 i DL4. Po różnicowaniu in vitro iPSC-Treg wykazują ekspresję CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 i TCR specyficznego dla Ag i są w stanie reagować na stymulację Ag. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w terapii komórkowej autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim. Adoptywne przeniesienie tych specyficznych dla Ag iPSC-Treg do myszy z zapaleniem stawów wywołanym przez Ag (AIA) ma zdolność zmniejszania stanu zapalnego i obrzęku stawów oraz zapobiegania utracie masy kostnej.

Jak pokazano tutaj, w 28. dniu Ag-specyficzne Tregs wykazywały znaczną ekspresję CD3 oraz Ag-specyficznego TCR, czyli dwóch markerów limfocytów T. Populacja CD3+TCRVβ5+ wykazywała ekspresję CD4. Większość komórek CD3+TCRVβ5+CD4+ wykazywała również ekspresję CD25, CD127 oraz CTLA-4, które są zazwyczaj wyrażane na podwyższonym poziomie w naturalnie występujących Tregs (nTregs) oraz w limfocytach T ektopowo ekspresyjnych dla F...

Prezentujemy tutaj metodę rozwoju funkcjonalnych limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu (Ag) (Treg) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim.

Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest opracowanie nowej metody generowania regulatorowych limfocytów T związanych ze stanem zapalnym stawów, pochodzących z komórek macierzystych, do immunoterapii przeciwreumatycznej w autoimmunologicznym zapaleniu stawów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie autoimmunologii dotyczące potencjalnych środków immunoterapeutycznych w leczeniu autoimmunologicznego zapalenia stawów. Główną zaletą tej techniki jest to, że regulatorowe limfocyty T pochodzące z komórek macierzystych są nyped i należą do jednego typu.Zacznij od rozcieńczenia odpowiednich komórek zasilających do minimalnej gęstości 1 × 10⁴ komórek na centymetr kwadratowy w pożywce OP9, a następnie wysiej 1 × 10⁶ komórek zasilających na szalkę o średnicy 10 cm. Gdy komórki osiągną 80–90% konfluencji, usuń pożywkę z kultur i wysiej w każdej szalce od 0,5 do 1 × 10⁵ indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) transdukowanych retroviralnie w pożywce OP9. Po pięciu dniach odessij pożywkę i przemyj komórki 10 ml PBS.Następnie odklej komórki, stosując cztery mililitry trypsyny na każdą płytkę, w temperaturze 37 °C. Po 10 minutach zatrzymaj reakcję, dodając osiem mililitrów pożywki IPSC, a następnie pobierz komórki do wirowania. Zawieszenie z osadu resuspenduj w 10 mililitrach świeżej pożywki IPSC i ponownie wysiej komórki na nowe płytki o średnicy 10 cm.Pozostaw komórki karmidła na płytce na 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych, aby mogły przylegać. Następnie zbierz pływające iPSC i przefiltruj przetransdukowane komórki przez sito o rozmiarze 70 $\mu$m w celu ich przeliczenia. Wysiej $5 \times 10^5$ iPSC na nową płytkę z komórkami karmidła o stopniu konfluencji 80–90% w pożywce OP9 uzupełnionej o Murine-Flt3-Ligand, a następnie przenieś hodowle z powrotem do inkubatora.Po trzech dniach, używając pipety 10 mililitrów, należy przemyć płytkę pożywką hodowlaną. Następnie do płytki należy dodać pięć mililitrów świeżej pożywki OP9 i delikatnie wypłukać wszelkie półprzylegające iPSC, stosując ostrożne, ale zdecydowane pipetowanie, które nie naruszy warstwy komórek karmicieli. Czynność płukania należy powtórzyć, używając 10 mililitrów PBS, aby zebrać pozostałe półprzyległe komórki, przenosząc płukanki z każdej płytki do jednej probówki stożkowej na każdą kulturę.Po odwirowaniu komórek, ponownie zawiesić osady w 10 mililitrach pożywki OP9 uzupełnionej o Murine-Flt3-Ligand i IL-7, a następnie przefiltrować komórki przez sitko o oczkach 70 µm. Wysiać jedną kulturę IPSC na każdą studienkę w sześciostudzienkowej płytce hodowlanej zawierającej monowarstwy komórek pokarmowych o stopniu konfluencji od 80 do 90%, a następnie przenieść kokultury do inkubatora. Co dwa dni wymieniać połowę pożywki na świeżą pożywkę OP9 uzupełnioną o Murine-Flt3-Ligand i IL-7, a co cztery do sześciu dni, w razie potrzeby, ponownie wysiewać różnicujące się IPSC na nowe płytki z nową warstwą komórek pokarmowych.Zacznij od ododerwania interesujących kultur komórkowych za pomocą trypsyny i resuspensji każdego typu komórek w 10 mililitrach świeżej pożywki. Przeniesienie każdą kulturę komórkową do nowej szalki o średnicy 10 centymetrów i pozwól komórkom dokarmiającym przywrzeć w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 30 minutach zbierz pływające iPSC i przepuść kultury przez poszczególne sita komórkowe o oczkach 70 mikronów, aby usunąć skupiska komórek przed odliczeniem.Każdą kulturę resuspenduj do stężenia 1,5 × 10⁷ komórek na ml w zimnym PBS, ponownie filtrując w razie potrzeby. Następnie umieszczaj pojedynczo samice myszy C57BL/6 w wieku od czterech do sześciu tygodni w stabilizatorze dla małych zwierząt i wykonaj transfer adopcyjny 200 µl jednego typu komórek na mysz do żyły ogonowej każdego zwierzęcia. Użyj suwmiarki zegarowej do pomiaru obrzęku obu kolan w celu ustalenia pomiaru wyjściowego.10 dni po transferze komórek, za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra, wstrzyknąć myszom 100 µg zmetylowanego BSA zemulgowanego w pełnym adjuwancie Freunda w podstawę ogona każdego zwierzęcia doświadczalnego. 17 dni po transferze komórek wywołać zapalenie stawów poprzez dostawowy zastrzyk 20 µg zmetylowanego BSA w 10 µL PBS do lewego stawu kolanowego oraz 20 µg zmetylowanego BSA i 100 µg całej owalbuminy w 10 µL PBS do prawego stawu kolanowego każdego znieczulonego zwierzęcia poddanego transferowi adopcyjnemu. Siedem dni po wywołaniu zapalenia stawów ponownie zmierzyć kolana w celu obliczenia procentowego wzrostu średnicy stawu kolanowego, a następnie chirurgicznie usunąć rzepki.Utrwalić stawy w formalinie. Następnie, po dekalcyfikacji w EDTA, zablokować kolana w parafinie i wykonać przekroje o grubości czterech mikronów do barwienia histochemicznego i analizy. W 28. dniu antygenowo swoiste limfocyty T regulatorowe wykazują znaczne poziomy ekspresji CD3 oraz antygenowo swoistych receptorów limfocytów T.Większość tych komórek wykazuje również ekspresję CD25, CD127 oraz CTLA-4, które wszystkie są zazwyczaj wyrażane na podwyższonym poziomie w naturalnie występujących limfocytach T regulatorowych. Rzeczywiście, FoxP3 utrzymuje się w limfocytach T regulatorowych pochodzących z iPSC, nawet po długotrwałej stymulacji in vitro ligandem Notch, co stwierdzono za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego. Ponadto te antygenowo swoiste limfocyty T regulatorowe pochodzące z iPSC produkują cytokiny supresyjne po stymulacji in vitro splenocytami obciążonymi antygenem, co wskazuje na potencjalny fenotyp supresyjny tych komórek.W kolanach traktowanych OVA obserwuje się komórki wykazujące ekspresję FoxP3, podczas gdy w kolanach, w których zastosowano iPSC transdukowane wektorem kontrolnym, nie stwierdzono obecności komórek FoxP3-dodatnich. Ponadto w kolanach myszy, które otrzymały iPSC transdukowane wektorem TCR-FoxP3, wizualizuje się znacznie więcej komórek CD4-dodatnich, FoxP3-dodatnich i TCR3 Beta 5-dodatnich niż w przypadku zastosowania samego wektora FoxP3, co sugeruje, że antygenowo swoiste komórki iPSC-Treg migrują do stawu kolanowego z zapaleniem indukowanym antygenem po ich adoptywnej transferze do zwierząt biorców. Adoptywne transfer komórek pochodnych z iPSC powoduje również znaczny spadek zapalnego obrzęku kolana w obecności OVA, jednak nie wpływa na kolana wstrzyknięte kontrolnym zmetylowanym BSA.Pozytywne efekty zmniejszenia obrzęku są dodatkowo potwierdzone za pomocą obrazowania Micro-CT o wysokiej rozdzielczości, wykazującego mniejszą utratę masy kostnej w kolanach leczonych metodą transferu komórek w porównaniu z zwierzętami kontrolnymi, którym wstrzyknięto wyłącznie MBSA. Po opanowaniu tych szczegółowych procedur można je w pełni zrealizować w ciągu sześciu tygodni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas stosowania tej techniki ważne jest pamiętanie o indukowaniu ukierunkowanego różnicowania iPSCs transdukowanych antygenem TCR-FoxP3.Po zastosowaniu tej procedury można również rozważyć użycie różnych związków cytokin supresyjnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące przeżywalności i jakości specyficznych dla antygenu komórek T reg pochodzących z iPSC. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie terapii komórkowych do zgłębienia roli specyficznych dla antygenu regulatorowych komórek T w chorobach autoimmunologicznych. Należy pamiętać, że praca z bezpośrednimi wektorami autoprzeciwciał może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak praca w podstawowym obiekcie dwustrefowym.Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

development-stem-cell-derived-antigen-specific-regulatory-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Limfocyty T regulatorowe: potencjał terapeutyczny w leczeniu odrzutów przeszczepów i cukrzycy typu I

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Ten film prezentuje terapię komórkową autoimmunologicznego zapalenia stawów u myszy. Komórkom regulatorowym T pochodzącym z iPSC, wyrażającym receptory specyficzne dla albuminy jaja kurzego, wstrzykuje się metylowaną albuminę surowicy bydlęcej (mBSA) emulgowaną w adiuwancie. Mysie komórki prezentujące antygen (APC) przetwarzają i prezentują mBSA limfocytom T, wywołując aktywację limfocytów T i migrację do błony maziowej stawu kolanowego. Kolejne wstrzyknięcia obejmują samo mBSA w lewym kolanie...

Terapia komórkowa autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Poznaj metodę generowania antygenowo-specyficznych limfocytów T regulatorowych z iPSC do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów. Technika zapewnia jednorodną populację komórek o potencjale supresyjnym.

Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Przeglądaj więcej filmów