Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym
23 grudnia 2016
Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.
Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie prostego i skutecznego protokołu syntezy usieciowanych miceli dwusiarczkowych obciążonych lekiem w celu ukierunkowanego dostarczania leków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie nanomedycyny. Na przykład, jak skutecznie wytwarzać stabilne nanopreparaty.
Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona na łatwą syntezę miceli usieciowanych dwusiarczkowymi na dużą skalę, co jest niezwykle pożądane w badaniach klinicznych na pacjentach. Aby rozpocząć tę procedurę, dodać dwa gramy monoaminy glikolu polietylenowego zakończonego monometylem do kolby okrągłodennej. Dodaj dziesięć mililitrów bezwodnego DMF, aby go rozpuścić.
Schłodzić na lodzie. Dodać trzy odpowiedniki hydroksybenzotriazolu, trzy odpowiedniki DIC i trzy odpowiedniki lizyny chronionej di-eth-mocem do kolby okrągłodennej. Następnie dodaj dziesięć mililitrów bezwodnego DMF.
Mieszaj mieszaninę przez 20 minut na magnetycznej płytce mieszającej. Następnie dodać mieszaninę do kolby okrągłodennej zawierającej glikol polietylenowy zakończony monometylem. Wyjąć kolbę okrągłodenną z łaźni lodowej, a następnie mieszać przez noc w temperaturze pokojowej.
Po zakończeniu mieszania potwierdź zakończenie reakcji, jak wyszczególniono w protokole tekstowym. Dodać 200 mililitrów lodowatego eteru do kolby reakcyjnej. Wirować przy 6 000 x g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza W celu oddzielenia wytrąconego polimeru.
Powtórzyć proces wytrącania i wirowania dwukrotnie, ponownie rozpuszczając produkt w 10 mililitrach DMF za każdym razem przed wytrącaniem. Następnie umyj polimer trzykrotnie lodowatym eterem. Podłącz rurkę do źródła wysokiej próżni, aby usunąć resztki eteru.
Następnie dodaj 20 mililitrów 20% 4-metylopipryrydyny w DMF do polimeru. Mieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia. Pozwól reakcji na zabawę przez trzy godziny.
Po potwierdzeniu zakończenia reakcji wysuszyć produkt polimerowy. Teraz półprodukt polimerowy numer dwa w próżni, a następnie wykonaj dodatkowe etapy syntezy polimeru, jak opisano w protokole tekstowym. Po wytworzeniu polimeru o liczbie pośredniej 10 należy go przenieść do kolby reakcyjnej.
Dodaj 30 mililitrów bezwodnego DMF. W nowej kolbie rozpuść 24 równoważniki aktywowanego kwasu cholowego w 20 mililitrach DMF. Następnie dodaj 48 odpowiedników N, N-diizopropyloetyloaminy.
Mieszaj przez 10 minut. Po zakończeniu mieszania przenieść mieszaninę do kolby reakcyjnej zawierającej polimer o pośredniej liczbie 10. Pozwól, aby reakcja przebiegła przez noc.
Następnego dnia potwierdzić zakończenie reakcji i wytrącić polimer o numerze pośrednim 11, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dializuj półprodukt polimerowy w wodzie dejonizowanej. Liofilizować próbkę, uzyskując biały proszek.
Po przygotowaniu miceli rozpuść 20 miligramów telodendrymeru i pięć miligramów PTX w jednym mililitrze chloroformu. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać jednorodną suchą warstwę polimerową. Rozpuść folię za pomocą jednego mililitra PBS przez wirowanie.
Następnie sonikuj przez 30 minut w 40 kilohercach. Dodaj 3% nadtlenku wodoru, aby utlenić grupy tiolowe na telodendrimmerze. Wykonaj dodatkowe kroki przygotowawcze i weryfikacyjne zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Po zakończeniu przygotowania miceli zmierz rozmiar i rozkład wielkości miceli za pomocą dynamicznego przyrządu do rozpraszania światła. Wykonaj pomiary w temperaturze pokojowej i utrzymuj stężenie miceli na poziomie jednego miligrama na mililitr. Następnie przygotuj 7,5 miligrama na mililitr roztworu podstawowego dodecylosiarczanu sodu w PBS.
Następnie przygotuj 1,5 miligrama na mililitr roztworu podstawowego usieciowanych mikomórek dwusiarczkowych w PBS. Korzystając z tych roztworów podstawowych, stwórz mieszaninę, w której końcowe stężenie SDS wynosi 2,5 miligrama na mililitr. A stężenie miceli wynosi 1,0 miligrama na mililitr.
Załadować próbkę i zmierzyć wielkość i rozkład wielkości roztworu miceli w odstępach dwuminutowych. Po pobraniu świeżej cytrynianu krwi od nagich myszy odwiruj jednomililitrową próbkę krwi o sile 1 000 x g przez 10 minut, aby zebrać czerwone krwinki. Umyj je trzykrotnie PBS, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy z PBS do końcowego stężenia 2% Wymieszaj 200 mikrolitrów zawiesiny erytrocytów z 1,0 miligramem na mililitr roztworu PTX NCM.
Następnie wymieszać 200 mikrolitrów zawiesiny erytrocytów z roztworem PTX DCM w stężeniu 1,0 miligrama na mililitr. Inkubować te mieszaniny w wytrząsarce inkubatora przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji odwirować mieszaniny o stężeniu 3 000 x g przez pięć minut.
Przenieść 100 mikrolitrów supernatantu z każdej próbki na płytkę 96-dołkową. Następnie użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję wolnej hemoglobiny przy 540 nanometrach. Jak zmierzono za pomocą testu Ellmana, współczynnik konwersji z wolnych grup tiolowych do wiązań dwusiarczkowych osiągnął 85% po 48 godzinach utleniania za pośrednictwem tlenu.
W tym przypadku jako metodę alternatywną stosuje się metodę utleniania za pośrednictwem nadtlenku wodoru. Współczynnik konwersji osiąga 88% w ciągu 30 minut. Jest to 96 razy szybsze niż podejście za pośrednictwem tlenu.
Dzięki temu bardziej wydajnemu podejściu wyprodukowano ponad 50 gramów nanocząstek o zmierzonej wielkości cząstek 27 nanometrach i wąskim rozkładzie wielkości. Stabilność usieciowanych miceli disufidowych obciążonych PTX jest również badana w warunkach ciężkiego zaburzenia miceli. Wielkość cząstek miceli pozostawała stała w czasie, co wskazuje, że pozostały one nienaruszone.
Po wprowadzeniu GSH w stężeniu wewnątrzkomórkowym wielkość usieciowanych miceli dwusiarczkowych naładowanych lekiem pozostaje nienaruszona przez 30 minut, a następnie gwałtownie zmniejsza się do jednego nanometra. Oznacza to zmniejszenie krytycznej liczby wiązań dwusiarczkowych, co jest warunkiem wstępnym szybkiej dysocjacji miceli. Reprezentatywne wyniki aktywności hemolitycznej miceli obciążonych PTX przedstawiono tutaj.
NCM PTX mają zależną od dawki liczbę czerwonych krwinek. Jednak PTX DCM, które mają sieciowanie dwusiarczkowe, nie wykazują obserwowalnych działań hemolitycznych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w innej, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dodaniu równej ilości 3% nadtlenku wodoru w celu wytworzenia dwusiarczku. Po tej procedurze można przeprowadzić test hemolizy w celu oceny zgodności miceli usieciowanych dwusiarczkiem we krwi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie syntetyzować micele usieciowane dwusiarczkiem naładowane lekiem.
Nie zapominaj, że niektóre z tych chemikaliów mogą być bardzo niebezpieczne i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół syntezy obciążonych lekiem miceli sieciowanych wiązaniami disiarczkowymi, przeznaczonych do ukierunkowanego dostarczania leków w terapii nowotworów. Metoda ta wykorzystuje utlenianie indukowane nadtlenkiem wodoru do przygotowania miceli, które mogą ulegać dysocjacji w redukującym środowisku guza, uwalniając ładunek terapeutyczny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nanomedycyna
- Terapia nowotworów
- Systemy dostarczania leków
Wstęp
- Ukierunkowane dostarczanie leków jest kluczowe dla zminimalizowania działań niepożądanych w leczeniu nowotworów.
- Nanocząsteczki stanowią obiecujące podejście do dostarczania leków bezpośrednio do miejsc występowania guza.
- W celu zwiększenia stabilności i kontrolowanego uwalniania leków można syntetyzować micele sieciowane wiązaniami dwusiarczkowymi.
- Kluczowym etapem procesu syntezy jest utlenianie zapośredniczone przez nadtlenek wodoru.
Cel badania
- Opracowanie prostego i skutecznego protokołu syntezy miceli obciążonych lekiem.
- Rozwiązanie problemów związanych z wytwarzaniem stabilnych nanoformulacji do zastosowań klinicznych.
- Umożliwienie syntezy miceli na dużą skalę w celu przeprowadzenia potencjalnych badań z udziałem pacjentów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie polietylenoglikolu monoaminy zakończonego grupą monometylową w bezwodnym DMF.
- Utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru w celu tworzenia miceli.
- Charakteryzacja miceli pod kątem stabilności i właściwości uwalniania leku.
- Ocena wydajności miceli w środowisku redukującym.
Główne wyniki
- Skuteczna synteza miceli sieciowanych mostkami disiarczkowymi.
- stwierdzono efektywną dysocjację miceli w środowiskach redukujących.
- Potencjał w zakresie ukierunkowanego dostarczania terapeutyków przeciwnowotworowych.
- Skalowalna metoda produkcji odpowiednia do badań klinicznych.
Wnioski
- Opracowany protokół zapewnia skuteczną metodę tworzenia miceli obciążonych lekiem.
- Micele mogą zwiększyć swoistość dostarczania leków do guzów.
- Podejście to może zmniejszyć efekty uboczne związane z konwencjonalnymi terapiami nowotworowymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia skalowalną produkcję miceli sieciowanych mostkami dwusiarczkowymi do celowanego dostarczania leków przeciwnowotworowych, rozwiązując kluczowy problem w translacji nanomedycyny. Dzięki zastosowaniu utleniania pośredniczonego przez H₂O₂, metoda ta pozwala na 96-krotnie szybsze sieciowanie w porównaniu do wcześniejszych podejść, co wspiera możliwości produkcyjne na potrzeby badań przedklinicznych i klinicznych. Otrzymane nanocząsteczki wykazują stabilność w krwiobiegu oraz uwalnianie indukowane w redukujących mikrośrodowiskach nowotworowych, co zwiększa indeks terapeutyczny i zmniejsza toksyczność pozaortogenną.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia opracowanie formulacji cytotoksycznych ładunków, takich jak paclitaxel, w formie stabilnych nanonośników do badań mechanistycznych nad dostarczaniem celowanym do guza.
- Wartość operacyjna: Wspiera szybkie generowanie wariantów formulacji w celu oceny zależności struktura-aktywność w kinetyce uwalniania leku.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia powtarzalną platformę nanocząsteczkową do badania profilu uwalniania leków w symulowanych redukcyjnych warunkach guza.
- Wartość operacyjna: Umożliwia uzyskanie wąskiego rozkładu wielkości (27 nm), co jest krytyczne dla spójnych wyników analiz oraz porównywalności regulacyjnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje zmniejszoną aktywność hemolityczną w porównaniu z micelami nieusieciowanymi, co poprawia profil bezpieczeństwa w zakresie kompatybilności z krwią.
- Wartość operacyjna: Umożliwia produkcję partii o masie >50 g, co wspiera badania toksykologiczne i farmakokinetyczne niezbędne do złożenia wniosku IND.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć w dziedzinie nanomedycyny, od wczesnego przesiewu formulacji po walidację przedkliniczną, umożliwiając iteracyjne projektowanie systemów dostarczania reagujących na warunki redoks.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotezy dotyczącej tego, czy sieciowanie dwusiarczkowe poprawia specyficzną dla guza akumulację leku w porównaniu z wolnym lekiem.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane micelle z wysoką wydajnością załadunku leku w celu wiarygodnej oceny związków w testach cytotoksyczności.
- Analityka: Generuje ilościowe dane dotyczące rozmiaru i stabilności za pomocą DLS oraz testów hemolizy w celu porównania wydajności formulacji.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość od etapu odkrywania do badań przedklinicznych poprzez walidację uwalniania wyzwalanego w wewnątrzkomórkowych środowiskach redukcyjnych (spadek rozmiaru do 1 nm indukowany przez GSH).
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy modułową platformę opartą na telodendrymerach, którą można dostosować do różnych ładunków i ligandów celujących.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w zakresie selektywnego uwalniania leku w guzie dzięki zwalidowanemu rozpadowi indukowanemu reakcjami redox.
- Wartość operacyjna: Zstandaryzowana, skalowalna synteza z rygorystyczną kontrolą wielkości cząstek i wysokim stopniem załadowania leku.
- Wartość strategiczna: Zmniejszenie ryzyka niepowodzenia w późnych fazach badań poprzez poprawę indeksu terapeutycznego dzięki zminimalizowanej hemolizie i wzmocnionym celowaniu w guz.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie dostosowanego do ryzyka rozwoju kandydatów nanoleków poprzez skalowalną produkcję zgodną z GMP.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu chemii peptydów, nanoprecypitacji oraz obchodzenia się z polimerami wrażliwymi na utlenianie i redukcję.
- Do syntezy polimerów niezbędny jest bezwodny DMF, nadtlenek wodoru oraz infrastruktura do dializy i liofilizacji.
- W celu zapewnienia powtarzalności partii wymagana jest standaryzacja przygotowania miceli i kontroli jakości (DLS, test hemolizy) pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do alternatywnych ładunków może wymagać optymalizacji parametrów odparowywania rozpuszczalnika i stopnia załadowania leku.
- Ograniczenie praktyczne: Pozostałości nadtlenku muszą zostać usunięte po utlenianiu, aby zapobiec degradacji ładunku lub toksyczności.
