Name: Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj protokół syntezy miceli usieciowanych dwusiarczkowym do celowanego dostarczania leków w terapii nowotworowej. Metoda wykorzystuje utlenianie nadtlenkiem wodoru, umożliwiając skalowalną produkcję stabilnych nanoformulacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Pani Alishy Knudson za pomoc redakcyjną. Pragną również podziękować za wsparcie finansowe ze strony NIH/NCI (3R01CA115483, dla K.S.L.), DoD PRMRP Award (W81XWH-13-1-0490, dla K.S.L.), NIH/NCI (1R01CA199668, dla Y.L.) oraz NIH/NICHD (1R01HD086195, dla Y.L.).

Oświadczenie etyczne: Samice nagich myszy atymicznych (szczep Nu/Nu), w wieku 6-8 tygodni, zostały zakupione, a następnie trzymane w warunkach wolnych od patogenów zgodnie z wytycznymi AAALAC i pozwolono im na aklimatyzację przez co najmniej 4 dni przed jakimikolwiek eksperymentami. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zgodnie z protokołem nr 07-13119 i nr 09-15584, zatwierdzonym przez Administracyjny Komitet Doradczy ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis.
1. Synteza TD PEG5K-Cys 4-Ebes 8-CA 8
<ol>
	<li>W kolbie okrągłodennej rozpuścić MeO-PEG5K-NH 2 (2 g, 0,4 mmol) w 10-20 ml bezwodnego dimetyloformamidu (DMF) i schłodzić na lodzie.</li>
	<li>W szklanej zlewce rozpuścić 3 równoważniki 1-hydroksy-6-chloro-benzotriazolu (HOBt), 3 równoważniki N,N'-diizopropylokarbodimidu (DIC) i 3 równoważniki (Fmoc)2Lys-OH w bezwodnym DMF (10-15 ml). Mieszaj przez 15-20 minut na magnetycznej płytce mieszającej.</li>
	<li>Dodać mieszaninę do kolby reakcyjnej zawierającej MeO-PEG5K-NH 2. Usunąć łaźnię lodową i mieszać mieszaninę reakcyjną przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)16 i testu Kaisera17 (żółty kolor oznacza brak wolnegoNH2). Wytrącić produkt polimerowy 1 (MeO-PEG5K-Lys(NH-Fmoc)2) przez dodanie około 200 ml lodowatego eteru do kolby reakcyjnej. Oddzielić wytrącony polimer przez odwirowanie (6 min w temperaturze 6 000 x g i temperaturze 4 °C).
	<ol>
		<li>Aby wykonać TLC, należy umieścić próbki na płytkach TLC pokrytych żelem krzemionkowym. Jako fazę ruchomą należy użyć dichlorometanu/metanolu (9:1). Obserwuj plamy pod lampą UV po wywołaniu płytek TLC. Można również użyć odczynnika barwiącego ninhydrynę, aby uwidocznić plamy aminowe na gorącej płycie.</li>
		<li>W teście Kaisera umieść niewielką część próbki w szklanej probówce zawierającej odczynnik Kaisera. Podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 5 minut i szukać zmiany koloru (jeśli kolor roztworu pozostaje żółty, oznacza to, że reakcja jest zakończona).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie rozpuścić produkt w bezwodnym DMF (10-20 ml) i powtórzyć wytrącanie i odwirowywanie (patrz krok 1.4).</li>
	<li>Powtórz krok 1,5, a następnie przemyj osad polimerowy trzykrotnie lodowatym eterem.</li>
	<li>Przenieść osad polimerowy 1 do czystej kolby reakcyjnej i podłączyć kolbę do źródła wysokiej próżni w celu usunięcia pozostałości eteru.</li>
	<li>Przygotować i dodać około 20-30 ml 20% (v/v) 4-metylopiperirydyny w DMF do polimeru pośredniego 1. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Uruchom reakcję na 3 godziny.</li>
	<li>Wykonaj TLC16 i test Kaisera (kolor niebieski potwierdza obecność wolnego NH2)17 (patrz krok 1.4), aby potwierdzić zakończenie reakcji. Jeśli reakcja jest zakończona, należy przejść do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6).</li>
	<li>Wysuszyć produkt polimerowy 2 (MeO-PEG5K-Lys(NH2)2) w próżni.</li>
	<li>Przeprowadzić jeszcze jedną rundę sprzężenia (Fmoc)2Lys-OH na pośrodku 2 (kroki 1.1-1.7), aby wytworzyć produkt 3 (MeO-PEG5K-Lys(Lys(NH-Fmoc)2)2). Odchroń (kroki 1.8-1.10) grupy Fmoc (4, MeO-PEG5K-Lys(Lys(NH2)2)2) i sprzęgnij (kroki 1.1-1.7) (Fmoc)Lys(Boc)-OH w celu wygenerowania dendrytycznej polilizyny trzeciej generacji (5, MeO-PEG 5k-Lys-Lys2-((Fmoc)Lys(Boc))4) zakończonej czterema grupami Boc i Fmoc na jednym końcu łańcucha PEG.</li>
	<li>Przenieść otrzymany polimer pośredni 5 do kolby reakcyjnej. W oddzielnej kolbie reakcyjnej przygotować kwas trifluorooctowy (TFA) w stosunku 1:1 (v/v) w dichlorometanie (DCM). Dodać 15-20 ml mieszaniny 1:1 TFA/DCM (v/v) do polimeru pośredniego 5. Mieszaj mieszaninę, aż polimer całkowicie się rozpuści. Mieszaj przez dodatkowe 3 godziny.</li>
	<li>Wykonaj TLC16 i test Kaisera (kolor niebieski potwierdza obecność wolnego NH2)17 (patrz krok 1.4), aby potwierdzić zakończenie reakcji. Jeśli reakcja jest zakończona, odparować mieszaninę polimeru w TFA/DCM z powietrzem aż do uzyskania lepkiego roztworu. Przejdź do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6). Wysuszyć produkt polimerowy 6 (MeO-PEG 5k-Lys-Lys2-((Fmoc)Lys(NH2))4) w próżni</li>.
	<li>Przenieść pośredni polimer 6 do kolby reakcyjnej. Użyć około 40 ml bezwodnego DMF zawierającego 8 równoważników N,N-diizopropyloetyloaminy (DIEA) do rozpuszczenia polimeru pośredniego 6. W szklanej zlewce rozpuścić 12 ekwiwalentów HOBt, 12 ekwiwalentów DIC i 12 ekwiwalentów (Fmoc)Cys(Trt)-OH w 20-25 ml bezwodnego DMF. Wstrząsać przez 10-15 minut, a następnie dodać mieszaninę reakcyjną do kolby reakcyjnej zawierającej 6 składników. Uruchom reakcję przez noc.</li>
	<li>Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą TLC16 i testu Kaisera (patrz krok 1.4; żółty kolor oznacza brak wolnego NH2)17. Jeśli reakcja jest zakończona, przystąpić do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (etap 1.4-1.6), w celu wyizolowania produktu 7 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys2-((Fmoc)Lys-((Fmoc)Cys(Trt)))4.</li>
	<li>Wykonaj de-protection Fmoc na 7, jak opisano w kroku 1.8, aby uzyskać produkt 8 (PEG 5K-Lys-Lys2-(Lys(NH2)-(Cys(NH2)(Trt)))4). Para (Fmoc)-PEG 2-Suc-OH (łącznik "Ebes", odpowiednik 24) na półprodukcie polimerowym przy użyciu procedury opisanej powyżej dla sprzężenia za pośrednictwem HOBt/DIC w celu otrzymania produktu pośredniego 9 (MeO-PEG5K-Lys-Lys 2-Lys 4-(Cys(Trt))4(Ebes(NH-Fmoc))8).</li>
	<li>Wykonaj jeszcze jedną rundę de-protection Fmoc (kroki 1.6-1.8), aby uzyskać pośrednie 10 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys2-Lys 4-(Cys(Trt))4(Ebes(NH2))8).</li>
	<li>Przenieść półprodukt polimerowy 10 do kolby reakcyjnej i dodać bezwodny DMF (około 30-40 ml) w celu jego rozpuszczenia. W innej kolbie reakcyjnej rozpuścić 24 równoważniki CAOSu (przygotowanego zgodnie z poprzednio opublikowaną procedurą) w bezwodnym DMF (20-30 ml)18. Dodać 48 ekwiwalentów N,N-diizopropyloetyloaminy i mieszać przez 10-15 minut. Przenieść zawartość do kolby reakcyjnej zawierającej 10 roztworów i pozostawić reakcję na noc.</li>
	<li>Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą TLC16 i testu Kaisera (patrz krok 1.4; żółty kolor oznacza brak wolnego NH2)17. Jeśli reakcja jest zakończona, należy przystąpić do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6) w celu wyizolowania produktu 11 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys2-Lys 4-(Cys(Trt))4-Ebes 8-CA 8). Dializuj go w wodzie dejonizowanej i liofilizuj próbkę, aby uzyskać biały proszek.</li>
	<li>Umieścić półprodukt polimeru 11 w kolbie reakcyjnej. Przygotować i dodać 20 ml mieszaniny TFA/1,2-etaneditiol (EDT)/trietylosilan (TIS)/H2O (94/2,5/1/2,5, v/v) do roztworu polimeru. Mieszaj mieszaninę aż do całkowitego rozpuszczenia. Uruchom reakcję na 4 godziny. Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą TLC16.</li>
	<li>Pod wyciągiem wdmuchiwać powietrze do mieszaniny polimerów TFA/EDT/TIS/H2O, aż roztwór stanie się lepki. Przystąpić do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6), w celu wyizolowania produktu końcowego 12 (PEG5K-Cys 4-Ebes 8-CA 8). Rozpuść go w acetonitrylu i liofilizuj, aby uzyskać biały proszek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie miceli z PTX
<ol>
	<li>Przygotuj micelę PEG5K-Cys 4-Ebes 8-CA 8 obciążoną PTX, stosując standardową metodę odparowywania.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 20 mg TD z inną ilością PTX (1-9 mg) w 1 ml chloroformu (CHCl 3). Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać jednorodny, suchy film polimerowy. Ponownie rozpuścić film w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą wiru, a następnie sonikować przez 30 minut przy 40 kHz, jeśli to konieczne, aby umożliwić utworzenie miceli obciążonych lekiem.</li>
		<li>Dodać 6 μl 3% (w/w)H2O2 (1 ekwiwalent w celu uwolnienia grup tiolowych) w celu utlenienia grup tiolowych na TD. Roztwór miceli należy wykorzystać do dalszej charakterystyki, gdy poziom wolnych grup tiolowych utrzymuje się na stałych, niskich wartościach, jak wskazano w teście Ellmana19.</li>
		<li>Przefiltruj roztwór za pomocą filtra 0,22 μm, aby wysterylizować próbkę. Przeanalizuj ilość leku załadowanego do miceli w systemie HPLC20 po uwolnieniu leków z miceli poprzez dodanie 9 razy acetonitrylu i wykonanie 10 minut sonikacji. Użyć kolumny C18 do HPLC z acetonitrylem/wodą jako fazą ruchomą.</li>
		<li>Obliczyć obciążenie lekiem zgodnie z krzywą kalibracyjną między wartościami powierzchni HPLC a stężeniami wzorca leku11. 
		UWAGA: Wydajność ładowania definiuje się jako stosunek leku załadowanego do miceli do początkowej zawartości leku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka miceli
<ol>
	<li>Zmierz rozmiar i rozkład wielkości miceli za pomocą przyrządu do dynamicznego rozpraszania światła (DLS)29. Pomiary należy wykonywać w temperaturze pokojowej i utrzymywać stężenie miceli na poziomie 1 mg/ml. 
	UWAGA: Aby przeprowadzić analizę wielkości cząstek, użyj PBS jako ślepej próby, a następnie zapisz wielkość cząstek dla rzeczywistych próbek. Wykonaj odczyty w trzech egzemplarzach dla próbek, a następnie uśrednij odczyty.</li>
	<li>Użyj widm fluorescencyjnych do pomiaru krytycznego stężenia micelarnego (CMC) PEG5K-Cys 4-Ebes 8-CA 8 przed i po sieciowaniu z pirenem jako hydrofobową sondą fluorescencyjną, jak opisano wcześniej13,21. 
	UWAGA: Zazwyczaj stężenie miceli waha się od 5×10-7 do 5×10-4 M.</li>
</ol>
4. Stabilność miceli w SDS z lub bez środków redukujących
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS) (7,5 mg/ml) i miceli usieciowanych dwusiarczków (1,5 mg/ml) w PBS. Następnie, używając roztworów podstawowych, przygotować mieszaninę roztworów, w której końcowe stężenie SDS wynosi 2,5 mg/ml, a stężenie miceli wynosi 1,0 mg/ml.</li>
	<li>Zmierzyć wielkość i rozkład wielkości (jak wspomniano w kroku 3.1) roztworów miceli w określonych odstępach czasu, z obecnością 10 mM glutationu (GSH) lub bez niej.</li>
</ol>
5. Test hemolizy
<ol>
	<li>Oceń potencjał hemolityczny nieusieciowanych miceli (PTX-NCM) obciążonych PTX przygotowanych zgodnie z wcześniej opublikowaną procedurą11 i miceli usieciowanych ładowanych PTX (PTX-DCM) przy użyciu świeżej krwi cytrynianowej od nagich myszy pobranych z zasłony ogonowej.
	<ol>
		<li>Zebrać czerwone krwinki przez odwirowanie próbki krwi (1,0 ml) o sile 1,000 x g przez 10 minut, przemyć je trzykrotnie PBS, a następnie ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą PBS do końcowego stężenia 2%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieszać 200 μl zawiesiny erytrocytów o różnych stężeniach (0,2 i 1,0 mg/ml) odpowiednio PTX-NCM i PTX-DCM i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w wytrząsarce inkubatora.</li>
	<li>Odwirować mieszaniny micela i erytrocyty przy 3 000 x g przez 5 minut. Przenieść 100 μl supernatantu ze wszystkich próbek na płytkę 96-dołkową. Zmierzyć absorbancję wolnej hemoglobiny w supernatancie przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek. 
	UWAGA: Erytrocyty inkubowane z Tritonem-100 (2%) i PBS należy stosować odpowiednio jako kontrole dodatnie i ujemne. Procentową hemolizę krwinek czerwonych oblicza się według następującego wzoru: hemoliza krwinek czerwonych = (próbka OD -kontrola ujemna OD)/(kontrola pozytywna OD -kontrola ujemna OD) × 100%.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+in+medicine%3A+therapeutic+applications+and+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).</li>
<li>Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+Delivery+of+Cancer+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Med%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs.</a> Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).</li>
<li>Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+enhanced+permeability+and+retention+effect+for+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Disc.+Today+Targets%22%5BJournal%5D)">Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting.</a> Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).</li>
<li>Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+strategies+for+therapeutic+delivery+by+using+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles.</a> Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).</li>
<li>Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+polymeric+therapeutic+nanoparticles%3A+design%2C+development+and+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).</li>
<li>Li, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibly+stabilized+multifunctional+dextran+nanoparticles+efficiently+deliver+doxorubicin+into+the+nuclei+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).</li>
<li>Miyata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+catiomer+polyplexes+with+regulated+densities+of+charge+and+disulfide+cross-linking+directed+to+enhance+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).</li>
<li>Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-labile+core+cross-linked+micelles+for+pH-triggered+release+of+antitumor+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs.</a> Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).</li>
<li>Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolysable+core-crosslinked+thermosensitive+polymeric+micelles%3A+synthesis%2C+characterisation+and+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies.</a> Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).</li>
<li>Talelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core-crosslinked+polymeric+micelles+with+controlled+release+of+covalently+entrapped+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin.</a> Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).</li>
<li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-assembling+nanoparticle+for+paclitaxel+delivery+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer.</a> Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+size-tunable+nanocarrier+system+for+targeted+anticancer+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery.</a> J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-defined%2C+reversible+disulfide+cross-linked+micelles+for+on-demand+paclitaxel+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery.</a> Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-defined%2C+reversible+boronate+crosslinked+nanocarriers+for+targeted+drug+delivery+in+response+to+acidic+pH+values+and+cis-diols%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+smart+and+versatile+theranostic+nanomedicine+platform+based+on+nanoporphyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li>
<li>Belenki, B. G., Gankina, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-Layer+chromatography+of+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Thin-Layer chromatography of polymers.</a> J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).</li>
<li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li>
<li>Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cholic+acid-based+molecular+receptors%3A+head-to-head+cholaphanes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Soc.%2C+Perkin+Trans+1%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).</li>
<li>Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+Ellman%27s+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reassessment of Ellman's reagent.</a> Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).</li>
<li>Ahuja, S., Rasmussen, H. Overview of HPLC method development for pharmaceuticals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhuja%2C+S+%22HPLC+Method+Development+for+Pharmaceuticals%22">HPLC Method Development for Pharmaceuticals</a>. , Separation Science and Technology; 8. Elsevier Academic Press Inc. 1-11 (2007).</li>
<li>Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+thermo-sensitive+core-shell+nanoparticles+for+targeted+paclitaxel+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery.</a> Nanotechnology. 20 (6), 065104(2009).</li>
<li>Kato, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+cross-linked+micelles+for+the+targeted+delivery+of+vincristine+to+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma.</a> Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).</li>
<li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glutathione+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of glutathione synthesis.</a> Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).</li>
<li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22OA02%22+peptide+facilitates+the+precise+targeting+of+paclitaxel-loaded+micellar+nanoparticles+to+ovarian+cancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">"OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo.</a> Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).</li>
<li>Koo, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide-cross-linked+PEG-poly%28amino+acid%29s+copolymer+micelles+for+glutathione-mediated+intracellular+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery.</a> Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).</li>
<li>McLellan, L. I., Wolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+and+glutathione-dependent+enzymes+in+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Resist.+Update%22%5BJournal%5D)">Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance.</a> Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).</li>
<li>Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+peroxide-mediated+oxidative+refolding+of+a+protein+at+physiological+pH+and+implications+for+oxidative+folding+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum.</a> Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).</li>
<li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanomedicines%3A+closing+the+translational+gap%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cancer nanomedicines: closing the translational gap.</a> Lancet. 384, 2175-2176 (2014).</li>
<li>Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf">http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf</a> (2006).</li>
</ol>

Y. Li i K.S.L. są wynalazcami oczekującego patentu na odwracalnie usieciowane systemy micelowe (amerykańskie zgłoszenie patentowe 61/485,774). K.S.L. jest naukowcem-założycielem firmy LamnoTherapeutics Inc., która planuje rozwój nanoterapeutyków opisanych w manuskrypcie. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Zbadano kilka nanocząstek pod kątem ich potencjalnego zastosowania w dostarczaniu leków. Liposomalne nanoagregaty albuminy surowicy ludzkiej obciążone doksorubicyną i paklitakselem (PTX) należą do nanoterapeutyków zatwierdzonych przez FDA do leczenia raka. Jednak, chociaż klinicznie skuteczne, obie te nanoterapie mają stosunkowo "duże" rozmiary i mają tendencję do gromadzenia się w wątrobie i płucach. Polimerowe micele o stosunkowo mniejszych rozmiarach cząstek i większej zdolności ładowania leków stają się nowymi nośnik...

Nanotechnologia to szybko rozwijająca się dziedzina, która przyniosła korzyści wielu dziedzinom biomedycznym1. Nanocząstki dają możliwości projektowania i dostrajania właściwości, które nie są możliwe do uzyskania w przypadku innych rodzajów konwencjonalnych terapii. Nanonośniki zwiększają stabilność leków przed biodegradacją, wydłużają czas obiegu leków, rozwiązują problemy z rozpuszczalnością leków i mogą być precyzyjnie dostrojone do celowanego dostarczania leków i do współdostarczania środków obrazowania1,2. Systemy dostarczania oparte na nanocząstkach są obiecujące w obrazowaniu i leczeniu nowotworów. Naczynia krwionośne guza są nieszczelne dla makrocząsteczek i mogą prowadzić do preferencyjnej akumulacji krążących nanocząstek w miejscach guza poprzez efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR)3. Spośród kilku nanonośników (np. liposomów, hydrożeli i miceli polimerowych), które są aktywnie poszukiwane jako nośniki leków przeciwnowotworowych, micele polimerowe zyskały dużą popularność w ciągu ostatniej dekady4,5.
Micele polimerowe to system termodynamiczny, który po podaniu dożylnym może potencjalnie zostać rozcieńczony poniżej krytycznego stężenia miceli (CMC), co prowadzi do ich dysocjacji na unimery. Zastosowano strategie sieciowania w celu zminimalizowania dysocjacji micelarnej na unimery. Jednak nadmiernie ustabilizowane micele mogą zapobiegać uwalnianiu leku w miejscach docelowych, zmniejszając w ten sposób ogólną skuteczność terapeutyczną. Zbadano kilka podejść chemicznych w celu urozdzielenia sieciowania w odpowiedzi na redoks lub bodźce zewnętrzne, takie jak redukowalne wiązania dwusiarczkowe6,7 i rozszczepialne pH8 lub hydrolizowalne wiązania estrowe9,10.
Wcześniej informowaliśmy o projektowaniu i syntezie nanocząsteczek micelarnych składających się z bloków dendrytycznego kwasu cholowego (CA) i liniowych kopolimerów glikolu polietylenowego (PEG), określanych jako telodendrimery (TD)11-15. Te TD są reprezentowane jako PEGnK-CAy (gdzie n = masa cząsteczkowa w kilodaltonach (K), y = liczba jednostek kwasu cholowego (CA)). Charakteryzują się niewielkimi rozmiarami, długim okresem trwałości i wysoką skutecznością w kapsułkowaniu leków takich jak paklitaksel (PTX) i doksorubicyna (DOX) w rdzeniu hydrofobowym. Elementy budulcowe TD, takie jak PEG, lizyna i CA, są biokompatybilne, a obecność korony PEG może nadać charakter nanocząstek "stealth", zapobiegając niespecyficznemu wychwytowi nanocząstek micelarnych przez układy siateczkowo-śródbłonkowe.
Tiolowane liniowo-dendrytyczne polimery mogą być łatwo generowane przez wprowadzenie cystein do dendrytycznego szkieletu oligolizynowego naszych standardowych TD. W artykule przedstawiono prosty protokół wytwarzania odwracalnie usieciowanego systemu dostarczania leków micelarnych poprzez wprowadzenie usieciowania dwusiarczkowego do hydrofobowego rdzenia TD (ryc. 1).

<table><tbody><tr><td>MeO-PEG5K-NH2</td><td>Rapp Polymere</td><td>125000-2</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Fmoc)-OH</td><td>Aaptec</td><td>AFK107</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Anaspec</td><td>AS-20132</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Aapptec</td><td>AAC105</td><td></td></tr><tr><td>Dimetyloformamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>Eter etylowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>E134-20</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropyloetyloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>, obchodź się z</td></tr><tr><td>4-metylopierydyną</td><td>Alfa-Aesar</td><td>L-02709</td><td></td></tr><tr><td>Łącznik Ebes</td><td>Anaspec</td><td>AS-61924</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cholowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1129</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02390</td><td>Uchwyt wewnątrz dygestorio. Rękawice wybielające po użyciu.</td></tr><tr><td>Triizopropylosilan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (bezwodny)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru 30%</td><td>Aaron Industries</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HoBt-Cl</td><td>Aaptec</td><td>CXZ096</td><td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125407</td><td></td></tr><tr><td>Samice atymicznych nagich myszy (szczep Nu/Nu), 6&ndash; 8 tygodni</td><td>Harlan (Livermore, Kalifornia)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedycyna to nowa forma terapii, która wykorzystuje unikalne właściwości cząsteczek o skali nanometrów do zastosowań biomedycznych. Poprawa dostarczania leków w celu maksymalizacji wyników terapeutycznych i zmniejszenia skutków ubocznych związanych z lekami to tylko niektóre z kamieni węgielnych współczesnej nanomedycyny. W szczególności nanocząstki znalazły szerokie zastosowanie w leczeniu raka. Przewiduje się, że nanocząstki, które oferują wysoki stopień elastyczności w projektowaniu, stosowaniu i produkcji w oparciu o mikrośrodowisko guza, będą bardziej skuteczne dzięki szybkiemu przełożeniu na praktykę kliniczną. Polimerowy nanonośnik micelarny jest popularnym wyborem do zastosowań związanych z dostarczaniem leków.
W tym artykule opisujemy prosty i skuteczny protokół syntezy naładowanych lekami, usieciowanych dwusiarczków w oparciu o samoorganizację dobrze zdefiniowanego amfifilowego kopolimeru liniowo-dendrytycznego (telodendrymer, TD). TD składa się z glikolu polietylenowego (PEG) jako segmentu hydrofilowego i tiolowanego klastra kwasu cholowego jako hydrofobowego ugrupowania tworzącego rdzeń, przyłączonego stopniowo do PEG zakończonego aminami przy użyciu chemii peptydów na bazie roztworu. Leki stosowane w chemioterapii, takie jak paklitaksel (PTX), mogą być ładowane przy użyciu standardowej metody odparowywania rozpuszczalnika. Utlenianie za pośrednictwemO2 było wcześniej wykorzystywane do tworzenia wewnątrzmicelarnych wiązań krzyżowych dwusiarczku z wolnych grup tiolowych na TD. Reakcja była jednak powolna i niemożliwa do zrealizowania przy produkcji na dużą skalę. Niedawno zbadano metodę utleniania za pośrednictwemH2O2jako bardziej wykonalne i wydajne podejście, która była 96 razy szybsza niż poprzednio opisana metoda. Dzięki temu podejściu udało się wyprodukować 50 g nanocząstek usieciowanych dwusiarczkiem obciążonych PTX o wąskim rozkładzie wielkości cząstek i wysokiej wydajności ładowania leku. Stabilność otrzymanego roztworu miceli jest analizowana przy użyciu warunków zakłócających, takich jak jednoczesna inkubacja z detergentem, dodecylosiarczanem sodu, z lub bez środka redukującego. Naładowane lekiem, usieciowane dwusiarczkowe micele wykazywały mniejszą aktywność hemolityczną w porównaniu z ich nieusieciowanymi odpowiednikami.

Przygotowanie i charakterystyka miceli obciążonych lekiem, sieciowanych mostkami dwusiarczkowymi
Amfifilowy polimer PEG5K-Cys4-Ebes8-CA8 jest polimerem dendrytycznym zdolnym do tworzenia micelarnego układu sieciowanego mostkami disiarczkowymi do dostarczania leków przeciwnowotworowych. Strukturalnie jest on zdefiniowany jako oligomer dendrytyczny kwasów cholicznych (domena hydrofobowa) połączony z jed...

Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie prostego i skutecznego protokołu syntezy usieciowanych miceli dwusiarczkowych obciążonych lekiem w celu ukierunkowanego dostarczania leków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie nanomedycyny. Na przykład, jak skutecznie wytwarzać stabilne nanopreparaty.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona na łatwą syntezę miceli usieciowanych dwusiarczkowymi na dużą skalę, co jest niezwykle pożądane w badaniach klinicznych na pacjentach. Aby rozpocząć tę procedurę, dodać dwa gramy monoaminy glikolu polietylenowego zakończonego monometylem do kolby okrągłodennej. Dodaj dziesięć mililitrów bezwodnego DMF, aby go rozpuścić.Schłodzić na lodzie. Dodać trzy odpowiedniki hydroksybenzotriazolu, trzy odpowiedniki DIC i trzy odpowiedniki lizyny chronionej di-eth-mocem do kolby okrągłodennej. Następnie dodaj dziesięć mililitrów bezwodnego DMF.Mieszaj mieszaninę przez 20 minut na magnetycznej płytce mieszającej. Następnie dodać mieszaninę do kolby okrągłodennej zawierającej glikol polietylenowy zakończony monometylem. Wyjąć kolbę okrągłodenną z łaźni lodowej, a następnie mieszać przez noc w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu

a-facile-efficient-approach-for-production-reversible-disulfide-cross

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano metodę analizy dostępności rozpuszczalnika grupy tiolowej reszt cysteinowych wirusa Maize rayado fino virus (MRFV) - wirusopodobnych cząstek (VLP), po których następuje reakcja sieciowania peptydów. Metoda wykorzystuje dostępność kilku grup chemicznych na powierzchni VLP, które mogą być celami dla określonych reakcji.

Analiza dostępności rozpuszczalników reszt cysteiny na cząstkach wirusopodobnych wirusa rayado fino kukurydzy wytwarzanych w roślinach Nicotiana benthamiana i sieciowanie peptydów z VLP

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Prosta, solidna i skalowalna technika funkcjonalizacji i samodzielnego montażu makroskopowych warstw nanocząstek-ligandów na podłożach bez szablonów jest opisana w tym protokole.

Technika funkcjonalizacji i samoorganizacji makroskopowych warstw monowarstwowych nanocząstek-ligand na podłożach bez szablonów

Ten artykuł opisuje proces wytwarzania polimerowych, samoorganizujących się nanocząstek za pomocą polimeryzacji dyspersyjnej za pośrednictwem światła widzialnego. Wykorzystanie niskoenergetycznego światła widzialnego do kontrolowania polimeryzacji pozwala na powtarzalne tworzenie samoorganizujących się miceli przypominających robaki przy wysokiej zawartości części stałych.

Łatwa synteza robakopodobnych miceli za pomocą polimeryzacji dyspersyjnej za pośrednictwem światła widzialnego przy użyciu katalizatora fotoredoks

Niniejsza praca opisuje metodę wytwarzania nanokryształów micelarnych, wyłaniającej się głównej klasy nanobiomateriałów. Ta metoda łączy w sobie elektronatryskiwanie od góry do dołu, samoorganizację od dołu do góry i kontrolę struktury na bazie rozpuszczalnika. Metoda wytwarzania jest w dużej mierze ciągła, może wytwarzać produkty wysokiej jakości i posiada niedrogie środki kontroli struktury.

Wytwarzanie sferycznych i ślimakowatych nanokryształów micelarnych poprzez połączenie elektrorozpylania, samoorganizacji i kontroli struktury na bazie rozpuszczalnika

Tutaj prezentujemy dwa ultraszybkie protokoły do rekonstytucji białek błonowych w fuzogenne proteoliposomy oraz fuzji takich proteoliposomów z docelowymi dwuwarstwami lipidowymi w celu bezdetergentowego dostarczania tych białek błonowych do dwuwarstwy pofuzyjnej. Połączenie tych podejść umożliwia szybki i łatwy w obsłudze montaż złożonych, wieloskładnikowych systemów membranowych.

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Przedstawiamy protokół budowy spiralnych peptydów tioeterowych/siarczków winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiol-en/tiol-yne.

Konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny

Tutaj prezentujemy jednogarnkową, wolną od metali przejściowych syntezę tioli i tioestrów z halogenków aromatycznych i tiometlenku sodu, a następnie przygotowanie monokryształów sieci metal-ditiolen przy użyciu form tiolu generowanych in situ z bardziej stabilnego i podatnego na działanie tioestru.

Synteza tiolowego bloku budulcowego do krystalizacji półprzewodnikowego żyroidalnego szkieletu metal-siarka

Od dawna wiadomo, że wiązania dwusiarczkowe stabilizują strukturę wielu białek. Prostą metodą analizy kompleksów multimerycznych stabilizowanych przez te wiązania jest nieredukcyjna analiza SDS-PAGE. Tutaj metoda ta jest zilustrowana poprzez analizę izoformy jądrowej dUTPazy z ludzkiej linii komórkowej kostniakomięsaka U-2 OS.

Połączenie nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Poznaj protokół syntezy miceli usieciowanych dwusiarczkowym do celowanego dostarczania leków w terapii nowotworowej. Metoda wykorzystuje utlenianie nadtlenkiem wodoru, umożliwiając skalowalną produkcję stabilnych nanoformulacji.

Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

Przeglądaj więcej filmów