Name: Badania przesiewowe pod kątem aktywności hormonalnej w wodzie przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych transaktywacji in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę przesiewowego wykrywania chemikaliów endokrynnie aktywnych w próbkach wody przy użyciu komórkowych testów biologicznych opartych na receptorach. Ta technika umożliwia szybszą analizę niż tradycyjne metody chemiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez Państwowy Zarząd Kontroli Zasobów Wodnych (umowy nr 10-096-250 i 14-090-270). Dziękujemy S. Abbasiemu, M. Connorowi, S. Engelage'owi, K. Northowi, J. Armstrongowi, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenkowi, S. Snyderowi, S. Westerheide, B. Escherowi, F. Leuschowi, G. Pelankowi, K. Bi i J. Printenowi. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów, a odniesienie do nazw handlowych nie oznacza poparcia.

1. Pobranie i opracowanie próbki wody (zmodyfikowane na podstawie Escher et al.9)
<ol>
	<li>Napełnić do pełna czystą, 1 L bursztynową szklaną butelkę zawierającą 1 g azotku sodu i 50 mg kwasu askorbinowego badaną próbką wody. Próbkę przechowywać w temperaturze 4 °C i przetworzyć w ciągu 72 hr. 
	UWAGA: Azotek sodu jest silnie toksyczny i należy z nim obchodzić się ostrożnie. Należy stosować środki ochrony osobistej (ochrona oczu/twarzy, rękawice, odzież) i odważać go w sprawnie działającej dygestorii. Do odważania nie używać szpatułki metalowej.</li>
	<li>Przepuścić próbkę przez filtr z włókna szklanego 1.6 µM, a następnie przez uprzednio przygotowany wkład do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) z szybkością przepływu 5-10 ml/min. Ciśnienie pompy próżniowej należy dostosować w celu kontrolowania szybkości przepływu.</li>
	<li>Osuszyć wkład pod próżnią przez 15 min.</li>
	<li>Eluować wkład 10 ml metanolu, a następnie 10 mL mieszaniny aceton:heksan (1:1, v/v).</li>
	<li>Skoncentrować eluat do objętości ~1 ml pod delikatnym strumieniem azotu o wysokiej czystości. Przeprowadzić wymianę rozpuszczalnika poprzez dodanie 500 µl dimetylosulfotlenku (DMSO) i odparowanie ekstraktu do objętości 500 µl.</li>
	<li>Przenieść ekstrakt do bursztynowej szklanej fiolki do autosamplera. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie rozcieńczeń substancji odniesienia specyficznej dla testu oraz ekstraktu wodnego
<ol>
	<li>Przygotuj 9 rozcieńczeń do krzywej kalibracyjnej.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór zapasowy substancji referencyjnej specyficznej dla danego testu w 100% DMSO. Stężenie końcowe musi wynosić 2 µM 17β-estradiol dla testu ER oraz 100 µM dexamethasone dla testu GR. Roztwory zapasowe przechowuj w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Do sterylnej probówki (probówka nr 1) dodaj 15 µl odpowiedniego roztworu zapasowego substancji referencyjnej do 285 µl medium testowego. Wymieszaj próbkę, pipetując ją w górę i w dół.</li>
		<li>Do 8 dodatkowych probówek (probówki nr 2-9) dodaj po 200 µl roztworu 5% DMSO w medium testowym.</li>
		<li>Przenieś alikwot 100 µl z probówki nr 1 do probówki nr 2, a następnie kolejno do probówki nr 9, aby wykonać 3-krotny szereg rozcieńczeń. Każda rozcieńczona próbka musi zostać dokładnie wymieszana pipetą przed pobraniem alikwotu i dodaniem go do następnej probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj próbkę kontrolną rozpuszczalnika, mieszając 10 µl DMSO w 190 µl medium testowego.</li>
	<li>Przygotuj cztery rozcieńczenia dla każdego ekstraktu wodnego.
	<ol>
		<li>Do pierwszej probówki dodaj 5 µL ekstraktu wodnego do 95 µL medium testowego i dokładnie wymieszaj. Do trzech pozostałych probówek dodaj po 50 µl 5% DMSO w medium testowym.</li>
		<li>Wykonaj 2-krotne rozcieńczenie, przenosząc 50 µl roztworu z jednej probówki do następnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny komórkowej do przeprowadzenia bioanalizy FRET
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę specyficzną dla testu zgodnie z instrukcjami producenta. Pożywkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C i ogrzać do 37 °C w łaźni wodnej przed użyciem.</li>
	<li>Wyjąć fiolkę z komórkami ER lub GR z zatrzymanym podziałem z zamrażarki kriogenicznej i szybko rozmrozić komórki, umieszczając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 2 min przy delikatnym mieszaniu. Zdezynfekować fiolkę 70% etanolem i umieścić ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.</li>
	<li>Otworzyć fiolkę, stosując techniki aseptyczne, i przenieść komórki do 10 ml pożywki do testu.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odssać nadsącz za pomocą sterylnej pipety szklanej i zawiesić osad komórkowy w 6 ml pożywki do testu.</li>
	<li>Zmieszać 5 µl zawiesiny komórkowej z 5 µl roztworu barwnika żywotności i nanieść alikwot do komory licznikowej.</li>
	<li>Policzyć liczbę żywych komórek za pomocą mikroskopu świetlnego lub automatycznego licznika komórek i oszacować gęstość żywych komórek w zawiesinie. Jeśli to konieczne, rozcieńczyć, aby uzyskać końcową gęstość 550 000 żywych komórek na ml pożywki do testu.</li>
</ol>
4. Wysianie komórek na 96-dołkową płytkę z czarnymi ściankami i przezroczystym dnem oraz dodanie rozcieńczonego ekstraktu wodnego
<ol>
	<li>Przygotuj układ płytki zawierający 9-punktową krzywą kalibracyjną specyficzną dla analizy, próbki QA/QC oraz wielokrotne rozcieńczenia dla każdego ekstraktu wodnego. Przykład układu płytki 96-dołkowej przedstawiono na Rysunku 1.</li>
	<li>Dodaj 90 µl medium do analizy do powtórzeń kontroli bezkomórkowej.</li>
	<li>Przelej zawiesinę komórkową do sterylnego zbiornika do pipetowania i dodaj 90 µl zawiesiny komórkowej do pozostałych dołków za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Dodaj 10 µl rozcieńczonych próbek przygotowanych w kroku 2 do odpowiednich dołków. Końcowe stężenie DMSO w każdym dołku nie może przekraczać 0,5%.</li>
	<li>Przykryj płytkę pokrywką i umieść ją w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C na 16 hr.</li>
</ol>
<img alt="Układ rozcieńczeń chemicznych w teście, 9 rozcieńczeń, kontrola DMSO w płytce 96-dołkowej do analizy porównawczej." src="/files/ftp_upload/54725/54725fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przykład układu płytki 96-dołkowej. Płytka wielodołkowa została zaprojektowana tak, aby obejmowała specyficzną dla testu krzywą kalibracyjną, 3 rodzaje kontroli QA/QC (sama pożywka, komórki w czystej pożywce oraz komórki w pożywce z dodatkiem DMSO) i 4 rozcieńczenia na każdy ekstrakt wodny. Każda kontrola oraz każde rozcieńczenie ekstraktu wodnego są analizowane w trzech powtórzeniach. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54725/54725fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
5. Przygotowanie roztworu obciążającego i dodanie go do każdego dołka
<ol>
	<li>Po inkubacji pozwolić płytce osiągnąć temperaturę pokojową (RT). W przypadku tego bioanalizy FRET kroki od 5.2 do 5.6 należy przeprowadzać bez dostępu bezpośredniego światła.</li>
	<li>Przygotować 6-krotny roztwór obciążający zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 20 µl 6-krotnego roztworu obciążającego.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 10 µl odczynnika do oceny żywotności komórek w celu zbadania cytotoksyczności rozcieńczonego ekstraktu wodnego.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę aluminiową folią samoprzylepną.</li>
	<li>Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 hr.</li>
</ol>
6. Pomiar cytotoksyczności i odpowiedzi aktywności endokrynnej
<ol>
	<li>Przygotować czytnik mikropłytek z funkcją odczytu od dołu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>W przypadku bioanalizy transaktywacji FRET, zmierzyć fluorescencję w kanałach niebieskim (409/460 nm, długość fali wzbudzenia (Ex)/emisji (Em)) i zielonym (409 Ex/530 Em nm).</li>
	<li>W przypadku testu cytotoksyczności, zmierzyć fluorescencję przy 560 Ex/590 Em nm.</li>
</ol>
7. Ocena kontroli QA/QC w celu określenia jakości danych
<ol>
	<li>Porównaj średnią surową fluorescencję kontroli bezkomórkowej (samego medium) oraz kontroli zawierającej tylko komórki (komórki w czystym medium do testu). Fluorescencja tła dla samego medium powinna być co najmniej o 25% niższa niż odpowiedź kontroli zawierającej tylko komórki.</li>
	<li>Przetwórz surowe dane FRET. Dla obu zbiorów danych, „niebieskiego” i „zielonego”, odejmij średnią fluorescencję studni kontroli bezkomórkowej od wszystkich studni zawierających komórki. Oblicz stosunek niebieski/zielony dla każdej studni eksperymentalnej.</li>
	<li>Porównaj stosunek niebieski/zielony w kontrolach zawierających tylko komórki oraz komórki z DMSO. Wartości fluorescencji tych kontroli powinny mieścić się w granicach 15% względnego odchylenia standardowego (RSD).</li>
	<li>Wykreśl specyficzną dla testu krzywą kalibracyjną, przedstawiając stosunek niebieski/zielony w funkcji stężenia próbki wyrażonego jako logarytm masy cząsteczkowej (log M). Oblicz nachylenie, R2 oraz log EC50 (stężenie wywołujące 50% efektu). Parametry kalibracyjne powinny mieścić się w oczekiwanym zakresie wymienionym w Tabeli 1.</li>
	<li>Oblicz RSD dla wszystkich studni wykonanych w trzech powtórzeniach. Zmienność między powtórzeniami powinna być mniejsza niż 20%.</li>
	<li>W przypadku danych dotyczących cytotoksyczności (560 Ex/590 Em nm), odejmij średnią wartość kontroli bezkomórkowej (tj. tło medium) od wszystkich studni zawierających komórki.</li>
	<li>Oblicz średnią fluorescencję po odjęciu tła dla każdej próbki. Przedstaw otrzymane dane fluorescencyjne jako procent kontroli DMSO. Rozcieńczenia próbek nie powinny wykazywać śmiertelności komórek większej niż 20% w porównaniu do kontroli zawierającej tylko komórki oraz kontroli DMSO.</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz granicę wykrywalności (LOD) testu jako minimalną odpowiedź kalibracyjną plus dwa odchylenia standardowe średniej tej odpowiedzi.</li>
	<li>W przypadku próbek wykazujących odpowiedź na dawkę, wyznacz EC50 wyciągu wodnego, wykorzystując nachylenie regresji liniowej krzywej kalibracyjnej w zakresie stężeń efektowych od 10 do 50% substancji odniesienia.</li>
	<li>Oblicz bioanalityczne stężenie ekwiwalentne (BEQ), korzystając ze wzoru: BEQ = EC50 substancji odniesienia/EC50 próbki wody.</li>
</ol>

<ol><li>Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ToxCast+program+for+prioritizing+toxicity+testing+of+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals.</a> Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).</li>
<li>Reif, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+profiling+and+prioritization+of+environmental+chemicals+using+ToxCast+data%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data.</a> Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).</li>
<li>Maruya, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tiered%2C+integrated+biological+and+chemical+monitoring+framework+for+contaminants+of+emerging+concern+%28CECs%29+in+aquatic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Environ.+Assess.+Manag%22%5BJournal%5D)">A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems.</a> Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).</li>
<li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+multiple+hormonal+activities+in+wastewater+effluents%2C+surface+water%2C+using+a+panel+of+steroid+receptor+CALUX+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+in+vitro+bioassays+to+measure+estrogenic+activity+in+environmental+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters.</a> Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).</li>
<li>Jarosova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Europe-wide+survey+of+estrogenicity+in+wastewater+treatment+plant+effluents%3A+the+need+for+effect-based+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).</li>
<li>Sonneveld, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+screening+models+for+androgenic+and+estrogenic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities.</a> Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).</li>
<li>Piersma, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+alternative+in+vitro+test+battery+for+detecting+reproductive+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants.</a> Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).</li>
<li>Escher, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+organic+micropollutants+in+wastewater%2C+recycled+water+and+drinking+water+with+in+vitro+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Prioritization+of+the+endocrine+disruptor+screening+program+universe+of+chemicals+for+an+estrogen+receptor+adverse+outcome+pathway+using+computational+toxicology+tools%22">Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools</a>. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+wastewater+and+recycled+water+quality%3A+a+comparison+of+lines+of+evidence+from+in+vitro%2C+in+vivo+and+chemical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses.</a> Water Res. 50, 420-431 (2014).</li>
<li>Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+budget%3A+accounting+for+glucocorticoid+bioactivity+and+fate+during+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).</li>
<li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genomics+profiling+of+environmental+chemical+modulation+of+human+nuclear+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors.</a> Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).</li>
<li>Mehinto, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+in+vitro+bioassays+for+screening+of+endocrine+active+chemicals+in+recycled+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water.</a> Water Res. 83, 303-309 (2015).</li>
<li>Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrutinizing+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+wastewater+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).</li>
<li>Tang, J. Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+characterization+of+urban+stormwater+with+bioanalytical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools.</a> Water Res. 47, 5594-5606 (2013).</li>
<li>Scott, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+endocrine+activity+in+Australian+rivers+using+chemical+and+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).</li>
<li>Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminants+of+emerging+concern+in+municipal+wastewater+effluents+and+marine+receiving+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water.</a> Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).</li>
<li>WateReuse Research Foundation (WRRF). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Direct+potable+reuse%3A+a+path+forward%22">Direct potable reuse: a path forward</a>. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+application+of+bioanalytical+tools+as+surrogate+measure+of+chemical+contaminants+in+recycled+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water.</a> Water Res. 49, 300-315 (2014).</li>
<li>Schriks, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+glucocorticoid+activity+in+various+surface+waters+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands.</a> Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).</li>
<li>Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+glucocorticoid+receptor+agonist+in+effluents+from+sewage+treatment+plants+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tot.+Environ%22%5BJournal%5D)">Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan.</a> Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).</li>
<li>Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+effects+of+effluents+from+sewage+treatment+works%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works.</a> Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).</li>
<li>Kidd, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+a+fish+population+after+exposure+to+a+synthetic+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).</li>
<li>Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+estrogen+and+androgen+receptor+activities+in+200+pesticides+by+in+vitro+reporter+gene+assays+using+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells.</a> Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).</li>
<li>Kugathas, S., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+glucocorticoids+in+the+environment%3A+First+results+on+their+potential+impacts+on+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish.</a> Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).</li>
<li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+panel+of+high-throughput+reporter-gene+assays+to+detect+genotoxicity+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Genet.+Toxicol.+Environ.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).</li>
<li>Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+designer+drugs%3A+when+transformation+may+not+eliminate+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk.</a> Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dobrze udokumentowana siła działania estrogenów środowiskowych, takich jak 17β-estradiol (E2), uzasadnia badania przesiewowe pod kątem tych substancji chemicznych w stężeniach ng / L23,24. W tym badaniu reakcja ER dla ścieków (zakres BEQ: 2,3 do 17 ng E2/L) była nieco wyższa niż w przypadku ścieków wtórnych z australijskich oczyszczalni ścieków20, podczas gdy BEQ dla wód powierzchniowych (<0,5 do 4 ng E2/L) mieściły się w zakresie zgłaszanym dla wód powierzchniowych i burzowych w innych miejscach (<...

Obecne monitorowanie jakości wody opiera się na możliwości dokładnego i precyzyjnego pomiaru występowania zanieczyszczeń chemicznych jako wskaźnika narażenia na kontakt z dziką przyrodą i ludźmi. Jednak ten paradygmat monitorowania i oceny chemicznej po substancji nie jest w stanie nadążyć za ciągle zmieniającym się wszechświatem chemicznym, z którym mamy do czynienia. W miarę jak dowiadujemy się więcej o losie i skutkach syntetycznych i naturalnych chemikaliów, kontynuujemy poszukiwanie narzędzi pomiarowych, które uwzględniają oczekiwane skutki biologiczne, a jednocześnie są odporne na zmiany w produkcji chemicznej, zastosowaniu i wpływie środowiska. Takie narzędzia są szczególnie istotne dla zrozumienia, czy nieznane lub nowe substancje chemiczne i produkty przemian zasługują na naszą uwagę. Co więcej, złożone mieszaniny substancji chemicznych obecnych w wodzie są słabo eliminowane przez indywidualne monitorowanie chemiczne. W związku z tym stoimy przed wyzwaniem modernizacji istniejącego zestawu narzędzi do monitorowania, aby lepiej rozwiązać te problemy w wodach powierzchniowych, które są odprowadzane z oczyszczonych ścieków i spływów wód miejskich/burzowych.
W ostatnich latach techniki bioanalityczne okazały się obiecujące jako narzędzia przesiewowe do oceny jakości wody. W szczególności testy biologiczne in vitro, które reagują na substancje chemiczne działające za pośrednictwem znanych, specyficznych sposobów działania1,2, cieszą się dużym zainteresowaniem społeczności zajmującej się monitorowaniem środowiska3. W licznych badaniach wykorzystano testy biologiczne in vitro w celu ilościowego określenia aktywności hormonalnej wód pitnych, powierzchniowych i ścieków4 -6. Co więcej, szereg testów biologicznych jest ukierunkowanych na molekularne zdarzenia inicjujące (np. aktywację receptora), które można potencjalnie powiązać ze szkodliwymi skutkami poprzez analizy szlaków niekorzystnychskutków 7,8.
Ewolucja badań biologicznych do oceny jakości wody była stosunkowo szybka, z setkami różnych punktów końcowych testów biologicznych in vitro, które zostały ocenione pod kątem ich użyteczności9,10. Obecnie wykazano, że tylko kilka testów biologicznych osiąga dobrą precyzję pomiaru (w laboratoriach), wykazując jednocześnie zdolność do różnicowania jakości wody5,6. W szczególności w przypadku ścieków oczyszczonych występowanie estrogenów i steroidów glikokortykosteroidowych udało się wyjaśnić za pomocą testów transaktywacji in vitro 11,12. Jednak w większości dotychczasowych badań stosowano testy biologiczne, których linie komórkowe są zastrzeżone (a zatem nie są powszechnie dostępne), wymagają ciągłej opieki i manipulacji lub obu. W rezultacie, zdolność do standaryzacji protokołów, wykonywania ćwiczeń kalibracji międzylaboratoryjnej, a ostatecznie do przeniesienia tej technologii badań przesiewowych do społeczności zajmującej się zasobami wodnymi, pozostaje utrudniona.
Co najmniej jeden dostawca testów biologicznych in vitro sprawdzonych przez amerykański program ToxCast jest dostępny na rynku13 w łatwych w użyciu formatach "zamrażania i rozmrażania". Wykazano, że te "zestawy" komórek zatrzymanych przez podział są solidne w pomiarze aktywności substancji chemicznych ekstrahowanych z wody, reprezentujących różne poziomy uzdatniania14. Chociaż dostępne są protokoły dostawców do badania bioaktywności poszczególnych substancji chemicznych lub mieszanin, niektóre z nich wymagają modyfikacji, zanim będzie można je zastosować do próbek wody. Oczyszczone ścieki15, odpływ wód opadowych16, wody odbiorcze17,18, a ostatnio woda z recyklingu19,20 to doskonałe przykłady środowisk wodnych, które są przedmiotem zainteresowania społeczności zajmującej się jakością wody.
To badanie przedstawia pojedynczy, ustandaryzowany protokół do pomiaru aktywności endokrynologicznej w próbkach wody za pomocą dostępnych na rynku, zatrzymanych podziałowo testów biologicznych transaktywacji in vitro. Wykazaliśmy solidność protokołu poprzez kompleksową ocenę tła, reakcji na dawkę i powtarzalności odpowiedzi dla dwóch punktów końcowych o szczególnym znaczeniu: transaktywacji receptora estrogenowego i glikokortykosteroidowego (odpowiednio ER i GR). Protokół został zastosowany do badania próbek oczyszczonych ścieków, ścieków i wód powierzchniowych z systemów słodkowodnych w Kalifornii.

<table><tbody><tr><td>Zestaw testowy GeneBLAzer ER alpha DA</td><td>Zestaw ThermoFisher</td><td>K1393</td><td>zawiera komórki zatrzymane przez podział ER (DA) i zestaw do ładowania LiveBLAzer FRET.</td></tr><tr><td>Zestaw testowy GeneBLAzer GR DA</td><td>Zestaw ThermoFisher</td><td>K1391</td><td>zawiera komórki z zatrzymaniem podziału GR (DA) i zestaw do ładowania LiveBLAzer FRET.</td></tr><tr><td>Odczynnik do żywotności komórek PrestoBlue&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy, 0,4% w PBS</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8154</td><td>Dostępne również w ThermoFisher</td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowa ściana, przezroczysta płyta dolna</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Indywidualnie pakowane, sterylne z pokrywką</td></tr><tr><td>Filtry z włókna szklanego Whatman, GF/A, 1,6 i mikro; M</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>WHA1820025</tr><tr><td>Aluminiowa folia uszczelniająca z mikropłytką</td><td>E & K Scientific</td><td>T592100</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 6 cc kartusz, 200 mg sorbentu</td><td>Wody</td><td>WAT106202</td><td></td></tr><tr><td>17&beta; Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E2758</td><td>CAS #50-28-2</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A61-100</td><td>Dostępny również w Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Deksametazon&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D4902</td><td>CAS #50-02-2</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8418</td><td>Rozpuszczalniki klasy molekularnej</td></tr><tr><td>(aceton, heksan, metanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>HPLC klasy</td></tr><tr><td>azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td>Substancja chemiczna <td>S2002</td><td>jest wysoce toksyczna i należy się z nią obchodzić ostrożnie. Używać odzieży ochronnej i ważyć pod wyciągiem. Dostępne również w EMD Millipore.</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek lub hemocytometr</td><td>Różni*</td><td></td><td>Dostawcy to Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich i ThermoFisher.</td></tr><tr><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego klasy II</td><td>Różne*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Różne*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka kriogeniczna&nbsp;</td><td>Różne*</td><td></td><td>Zalecane jest przechowywanie ciekłego azotu dewara.&nbsp;</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych</td><td>Różne*</td><td></td><td>&nbsp; Czytnik musi mieć możliwość odczytu od dołu.</td></tr><tr><td>* Brak zalecanego źródła, wybór tego sprzętu zależy od budżetu, częstotliwości użytkowania i przestrzeni laboratoryjnej.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe pod kątem aktywności hormonalnej w wodzie przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych transaktywacji in vitro

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Testy biologiczne transaktywacji in vitro okazały się obiecujące jako narzędzia do monitorowania jakości wody, jednak ich przyjęcie i powszechne zastosowanie było utrudnione częściowo z powodu braku ustandaryzowanych metod i dostępności solidnej, przyjaznej dla użytkownika technologii. W tym badaniu, dostępnym na rynku, linie komórkowe z zatrzymanym podziałem wykorzystano do ilościowego badania przesiewowego pod kątem aktywności hormonalnej substancji chemicznych obecnych w próbkach wody, które są przedmiotem zainteresowania specjalistów ds. jakości środowiska. Opracowano pojedynczy, ustandaryzowany protokół, który obejmował kompleksowe kontrole zapewnienia jakości/kontroli jakości (QA/QC) dla aktywności receptorów estrogenowych i glikokortykosteroidowych (odpowiednio ER i GR) przy użyciu komórkowego testu transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET). Próbki oczyszczonych ścieków komunalnych i wód powierzchniowych z systemów słodkowodnych w Kalifornii (USA) zostały wyekstrahowane za pomocą ekstrakcji do fazy stałej i przeanalizowane pod kątem aktywności hormonalnej przy użyciu znormalizowanego protokołu. Kontekst i dawka-odpowiedź dla referencyjnych substancji chemicznych specyficznych dla punktu końcowego spełniły wytyczne QA/QC uznane za niezbędne do wiarygodnego pomiaru. Odpowiedź przesiewowa testu biologicznego dla próbek wód powierzchniowych była w dużej mierze niewykrywalna. Natomiast próbki ścieków z oczyszczalni wtórnych miały najwyższą mierzalną aktywność, z szacowanymi równoważnymi stężeniami testu biologicznego (BEQ) do 392 ng deksametazonu/L dla GR i 17 ng 17β-estradiolu/L dla ER. Odpowiedź testu biologicznego dla próbki ścieków trzeciorzędowych była niższa niż zmierzona dla ścieków wtórnych, co wskazuje na niższą pozostałość substancji chemicznych aktywnych endokrynologicznie po zaawansowanym leczeniu. Protokół ten wykazał, że testy biologiczne transaktywacji in vitro, które wykorzystują dostępne na rynku, "zestawy" komórek zatrzymanych przez podział, można dostosować do badań przesiewowych pod kątem aktywności endokrynologicznej w wodzie.

W niniejszym badaniu, w celu zilustrowania opisywanego protokołu, wybrano 4 próbki złożone z 24 h oczyszczonego ścieku komunalnego, 6 próbek punktowych wód powierzchniowych z systemów słodkowodnych w południowej Kalifornii oraz próbę ślepą terenową składającą się z wody ultrapurej. 3 z 4 próbek ścieków pochodziły z konwencjonalnych oczyszczalni ścieków z osadem czynnym („ścieki wtórne”), a czwarta z zaawansowanej oczyszczalni ścieków z dodatkową filtracją piaskową/węglową po oczyszczaniu ...

Protokół badania przesiewowego pod kątem aktywności endokrynologicznej w organicznych ekstraktach próbek wody, w tym ścieków oczyszczonych i wód powierzchniowych (odbierających), został dostosowany przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych in vitro transaktywacji z zatrzymaniem ("zamrożenie i rozmrożenie").

Badania przesiewowe pod kątem aktywności hormonalnej w wodzie przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych transaktywacji in vitro

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

Ogólnym celem tej zestandaryzowanej procedury jest badanie próbek wody w kierunku obecności substancji chemicznych aktywnych endokrynnie, z wykorzystaniem dostępnych komercyjnie testów komórkowych opartych na receptorach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie monitorowania jakości wody, takie jak: czy w próbce rzeczywiście znajdują się substancje chemiczne aktywne endokrynnie? Główną zaletą tej techniki jest możliwość znacznie szybszej analizy grupy związków aktywnych endokrynnie w porównaniu do obecnie stosowanych metod chemicznych.Technika ta może pomóc w diagnozowaniu problemów z jakością wody wynikających z obecności substancji zaburzających gospodarkę hormonalną. Metoda ta pozwala na analizę zanieczyszczeń w wodzie, ale może być również stosowana do innych matryc środowiskowych, takich jak osady i tkanki. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mogą napotkać trudności, ponieważ wymaga ona wysokiej precyzji podczas pipetowania.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować próbkę wody w roztworach zapasowych medium specyficznego dla analizy oraz odczynnika referencyjnego, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Medium spec

screening-for-endocrine-activity-water-using-commercially-available

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

W tym artykule, zarodki danio pręgowanego są wykorzystywane do badań przesiewowych toksyczności chemicznej. Toksyczność chemiczna jest skorelowana z odczytami fenotypu. W protokole próbki przedstawiono metodologiczne podejście do przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności chemicznej.

Badania przesiewowe toksyczności chemicznej na podstawie zarodków: ocena wpływu na rozwój zarodków danio pręgowanego

Ten film opisuje test reporterowy oparty na komórkach w celu określenia aktywności estrogenowej związków pochodzenia roślinnego. Związek o aktywności podobnej do estrogenu naśladuje jego wiązanie z receptorami estrogenowymi i napędza transkrypcję genów enzymu reporterowego. Enzym reporterowy generuje bioluminescencję w reakcji, co wskazuje na aktywność estrogenową związku.

Test aktywności reporterowej receptora estrogenowego w celu zbadania aktywności estrogenowej fitoestrogenów

Przedstawiono protokół ekstrakcji i wstępnego zatężania estradiolu z próbek wody za pomocą zautomatyzowanego i zminiaturyzowanego systemu.

Prosta metoda automatycznej ekstrakcji próbek wody do fazy stałej do analizy immunologicznej małych zanieczyszczeń

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować płynowe biochipy z komórkami nabłonkowymi skrzeli pstrąga tęczowego do użycia w przenośnym czujniku impedancji podłoża elektrycznego ogniwa.  Opisano również protokół przeprowadzania szybkiego testu toksyczności wody pitnej za pomocą czujnika.

Przygotowanie i testowanie opartych na impedancji biochipów fluidycznych z ogniwami RTgill-W1 do szybkiej oceny próbek wody pitnej pod kątem toksyczności

Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Przedstawiona w artykule metodologia pozwala na ocenę skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do usuwania EDC.

Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Ten artykuł przedstawia zoptymalizowany ekran estrogenów drożdżowych do ilościowego oznaczania ligandów w produktach higieny osobistej (PCP), które wiążą receptory estrogenowe alfa (ERα) i/lub beta (ERβ). Metoda obejmuje dwie opcje substratów kolorymetrycznych, sześciodniową inkubację w chłodzie do wykorzystania na studiach licencjackich oraz narzędzia statystyczne do analizy danych.

Wykrywanie ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej za pomocą drożdżowego ekranu estrogenowego zoptymalizowanego pod kątem laboratorium nauczania licencjackiego

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Ilościowe modelowanie zależności struktura-aktywność (QSAR) jest reprezentatywną metodą wspomaganą bioinformatyką w toksykologicznych badaniach przesiewowych. Protokół ten pokazuje, jak obliczeniowo oceniać ryzyko związane z substancjami zaburzającymi funkcjonowanie układu hormonalnego (ED) w środowisku wodnym. Wykorzystując zestaw narzędzi OECD QSAR Toolbox, protokół implementuje test in silico do analizy toksyczności substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego u ryb.

Metoda modelowania in silico w obliczeniowej toksykologii wodnej substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego: podejście oparte na oprogramowaniu z wykorzystaniem zestawu narzędzi QSAR

Obecny jest tutaj szczegółowy protokół użycia zarodków danio pręgowanego Tg(vtg1: mCherry) do wykrywania efektów estrogenowych. Protokół obejmuje rozmnażanie ryb i leczenie zarodków, a także kładzie nacisk na wykrywanie, dokumentowanie i ocenę sygnałów fluorescencyjnych indukowanych przez związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC).

Wykorzystanie zarodków zebry danio pręgowanego TG (Vtg1:mcherry) do testowania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną

Zoptymalizowaliśmy dostępny na rynku test reporterowy receptora estrogenowego β do badania pokarmów dla naczelnych u ludzi i innych zwierząt pod kątem aktywności estrogenowej. Potwierdziliśmy ten test, pokazując, że znana estrogenna soja z ludzkiej żywności rejestruje się na wysokim poziomie, podczas gdy inne pokarmy nie wykazują żadnej aktywności.

Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego

Mysi model wskaźnika działania hormonu tarczycy został opracowany, aby umożliwić specyficzną tkankowo kwantyfikację lokalnego działania hormonu tarczycy za pomocą jego endogennej maszynerii regulacyjnej. Ostatnio wykazano, że model ten nadaje się do charakteryzowania substancji chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną, oddziałujących z gospodarką hormonów tarczycy, zarówno za pomocą metodologii ex vivo, jak i in vivo.

Charakterystyka in vivo skutków chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną za pomocą myszy wskaźnika działania hormonów tarczycy

Poznaj metodę przesiewowego wykrywania chemikaliów endokrynnie aktywnych w próbkach wody przy użyciu komórkowych testów biologicznych opartych na receptorach. Ta technika umożliwia szybszą analizę niż tradycyjne metody chemiczne.

Badania przesiewowe pod kątem aktywności hormonalnej w wodzie przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych transaktywacji in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Badania przesiewowe pod kątem aktywności hormonalnej w wodzie przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych transaktywacji in vitro

Przeglądaj więcej filmów