Badania przesiewowe pod kątem aktywności hormonalnej w wodzie przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych transaktywacji in vitro

Ogólnym celem tej ustandaryzowanej procedury jest badanie próbek wody pod kątem substancji chemicznych aktywnych endokrynologicznie przy użyciu dostępnych na rynku testów komórkowych opartych na receptorach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie monitorowania jakości wody, takie jak: czy w próbce rzeczywiście obecne są substancje chemiczne czynne układu hormonalnego? Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona analizować grupę endokrynologicznych związków czynnych znacznie szybciej niż obecne metody chemiczne.

Ta technika może pomóc w diagnozowaniu problemów z jakością wody, które wynikają z obecności substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego. Metoda ta zapewnia wgląd w zanieczyszczenia w wodzie, ale może być również stosowana do innych matryc środowiskowych, takich jak osady i tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą techniką, mogą mieć trudności, ponieważ wymaga ona dużej precyzji podczas korzystania z technik pipetowania.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować próbkę wody w roztworach podstawowych pożywki specyficznej dla testu i referencyjnej substancji chemicznej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pożywkę specyficzną dla testu należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania. Następnie dodać 15 mikrolitrów odpowiedniego referencyjnego chemicznego podłoża do 285 mikrolitrów podłoża testowego w sterylnej probówce.

Wymieszać próbkę, pipetując w górę i w dół. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 5% DMSO w pożywce testowej do ośmiu dodatkowych probówek. Przenieść 100-mikrolitrową porcję z probówki pierwszej do probówki drugiej, aby rozpocząć serię trzykrotnego rozcieńczenia.

Rozcieńczoną próbkę w probówce drugiej dokładnie wymieszać pipetą. Następnie przenieś 100-mikrolitrową porcję z probówki drugiej do probówki trzeciej. Kontynuuj ten proces dla każdej probówki.

Następnie należy przygotować próbkę kontrolną rozpuszczalnika, mieszając 10 mikrolitrów DMSO w 190 mikrolitrach pożywki do oznaczania. Następnie zbierz i oznacz cztery nowe tuby. Dodać 95 mikrolitrów pożywki testowej do pierwszej probówki.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów ekstraktu wodnego i dokładnie wymieszaj. Dodaj 50 mikrolitrów 5% DMSO w pożywce testowej do pozostałych trzech probówek. Następnie wykonaj dwukrotne rozcieńczenie, przenosząc 50 mikrolitrów roztworu z jednej probówki do drugiej.

Zacznij od wyjęcia fiolki z komórkami zatrzymanymi przez podział ER lub GR z zamrażarki kriogenicznej. Szybko rozmrozić komórki, umieszczając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając przez dwie minuty. Następnie odkazić fiolkę 70% etanolem.

Umieść go w szafie bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej. Otwórz fiolkę przy użyciu technik aseptycznych i przenieś komórki do 10 mililitrów pożywki testowej. Wirować 200 razy g przez pięć minut.

Po zakończeniu wirowania należy użyć sterylnej szklanej pipety do zasysania supernatantu. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w sześciu mililetach pożywki testowej. Wymieszaj pięć mikrolitrów zawiesiny komórkowej z pięcioma mikrolitrami roztworu barwienia przyżyciowego.

Następnie dodaj podwielokrotność do komory liczącej. Policz liczbę żywych komórek za pomocą mikroskopu świetlnego lub automatycznego licznika komórek. Następnie oszacuj gęstość żywych komórek w zawiesinie komórek.

Rozcieńczyć w razie potrzeby, aby uzyskać końcową gęstość 550 000 żywych komórek na mililitr podłoża do oznaczania. Zacznij od stworzenia układu płytki, który zawiera dziewięciopunktową krzywą kalibracyjną specyficzną dla testu, próbki QA/QC i wiele rozcieńczeń dla każdego ekstraktu wodnego. Dodać 90 mikrolitrów pożywki testowej do studzienek kontrolnych wolnych od powtórzonych komórek.

Wlać zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika do pipetowania. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, dodaj 90 mikrolitrów zawiesiny komórek do pozostałych studzienek. Dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonych próbek do odpowiednich studzienek.

Przykryj talerz pokrywką. Następnie umieść płytkę w inkubatorze 5%C02 w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 16 godzin. Po zakończeniu inkubacji pozwól płytce zrównoważyć się do temperatury pokojowej.

Następnie kolejne kroki należy wykonywać przy braku bezpośredniego światła. Przygotuj roztwór sześciokrotny nasycający zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu ładującego do każdej studzienki.

Dodaj 10 mikrolitrów odczynnika żywotności komórek do każdej studzienki, aby ocenić cytotoksyczność rozcieńczonego ekstraktu wodnego. Uszczelnij płytkę aluminiową folią samoprzylepną. Następnie inkubuj płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Po zakończeniu inkubacji dodaj płytkę do czytnika mikropłytek z możliwością odczytu od dołu. Zmierz fluorescencję i przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu przeanalizowano cztery 24-godzinne próbki złożone oczyszczonych ścieków komunalnych, sześć próbek wody powierzchniowej z systemów słodkowodnych w południowej Kalifornii oraz ślepą próbę polową składającą się z ultra czystej wody.

Aktywność ER wykryto w siedmiu z 10 reprezentatywnych próbek wody, podczas gdy aktywność GR wykryto w czterech. Wytyczne dotyczące wydajności QA/QC dla testów receptora estrogenowego i receptora glikokortykosteroidowego można zobaczyć tutaj. Wyniki badań nad cytotoksycznością i precyzją próbki mieściły się w kryteriach akceptacji, potwierdzając pomiary próbki wody.

Najwyższe równoważne stężenia w teście biologicznym stwierdzono w ściekach wtórnych, podczas gdy aktywność GR ścieków trzeciorzędowych okazała się poniżej granicy wykrywalności testu biologicznego. Podobnie, większość próbek wód powierzchniowych nie wykazywała aktywności GR powyżej granicy wykrywalności i miała znacznie niższy poziom aktywności ER niż ścieki wtórne. Większość próbek ścieków z oczyszczalni ścieków wykazała reakcję na dawkę powyżej granicy wykrywalności zarówno dla testów biologicznych ER, jak i GR.

Reprezentatywne wyniki dla średniego stosunku fluorescencji niebieskiej do zielonej tych próbek, wykreślone w stosunku do względnego współczynnika wzbogacenia, można zobaczyć tutaj. Tę technikę można wykonać w ciągu 24 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby ważne jest, aby przestrzegać wszystkich wytycznych dotyczących zapewniania jakości/kontroli jakości.

Technika ta utorowała menedżerom drogę do zbadania alternatywnych podejść do monitorowania substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego w wodzie. Nie zapominaj, że praca z azydkiem sodu może być niebezpieczna. Należy podjąć środki ostrożności, takie jak praca w prawidłowo działającym dygestorium.