Name: Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Poznaj metodę izolacji neutrofili z krwi psów i ilościowego oznaczania uwalniania NETs za pomocą testu fluorescencyjnego. Technika umożliwia szybki przesiew agonistów i inhibitorów formowania pułapek neutrofili.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują doktorom Jamesowi Rothowi, Williamowi Nauseefowi i Kayoko Kimurze oraz panu Tomowi Skadowowi za pomoc w opracowaniu protokołów dotyczących neutrofili u psów. RDG jest wspierany przez Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za etycznym pozwoleniem Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Iowa.
1. Pobieranie krwi
<ol>
	<li>Pobrać 9 ml krwi z żyły odpiszczelowej, głowowej lub szyjnej bezpośrednio do leków przeciwzakrzepowych (np. kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 1,8 mgK2EDTA/ml krwi) lub do strzykawki z natychmiastowym przeniesieniem do probówek zawierających EDTA. Delikatnie zwiń lub odwróć probówki krwi, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie krwi i antykoagulantu.</li>
</ol>
2. Izolacja neutrofili
<ol>
	<li>W stożkowej probówce o pojemności 50 ml wymieszaj krew z równą objętością sterylnego 3% dekstranu-500 o temperaturze pokojowej (złożonego z 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej) przez delikatne odwrócenie. Pozostaw w pozycji pionowej na 18-20 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną warstwę w kolorze słomy do świeżej tuby, aż nie będzie można jej już zebrać bez zanieczyszczenia dolną czerwoną warstwą. Erytrocyty w oryginalnej probówce można wyrzucić.</li>
	<li>Odwirować supernatant przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odsączyć i wyrzucić supernatant. Ręcznie ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że wirowanie nie powinno być stosowane do ponownego zawieszania neutrofili na żadnym etapie tego protokołu. Ręczne ściąganie, a nie wylewanie supernatantów, jest również zalecane w całym protokole, aby zmaksymalizować wydajność komórek.</li>
	<li>Dodać 10 ml roztworu do separacji komórek polisacharozy i diatrizoinu sodu o temperaturze pokojowej (np. Histopaque 1077) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Ostrożnie nałożyć roztwór zawierający komórki na roztwór do separacji komórek. Należy pamiętać, że użycie roztworu do separacji komórek, który nie osiągnął równowagi z temperaturą pokojową, może zmniejszyć wydajność komórek.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonym hamulcu.</li>
	<li>Ponieważ neutrofile znajdują się w najniższej warstwie gradientu, należy odciągnąć i odrzucić 3 górne warstwy, składające się z górnej warstwy osocza i płytek krwi, wąskiego białego pasma komórek jednojądrzastych i przezroczystej warstwy ośrodka gradientu gęstości.</li>
	<li>Aby zlizować pozostałe erytrocyty, ponownie zawiesić osad neutrofili w 10 ml wody o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 30 sekundach przywrócić toniczność, dodając 10 ml sterylnego 1,8% chlorku sodu o temperaturze pokojowej i wymieszać przez delikatne odwrócenie.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odciągnąć sklarowany osad i odrzucić.</li>
	<li>Jeśli osad jest nadal czerwony, powtórz etap lizy. Jeśli osad jest biały (lub jeśli liza została już przeprowadzona dwukrotnie), delikatnie ponownie zawiesić komórki w 10 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika lub hemocytometru. Typowa wydajność to co najmniej 106 komórek na ml krwi.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odciągnąć sklarowany osad i odrzucić.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki do pożądanego stężenia w sterylnym PBS o temperaturze pokojowej. W przypadku testu uwalniania DNA opisanego w punkcie 2 zawiesić ponownie w stężeniu 5 x 106 komórek na ml.</li>
	<li>W razie potrzeby przenieś niewielką objętość komórek bezpośrednio lub za pomocą cytowirówki na szklane szkiełko. Pozostaw komórki do wyschnięcia i zabarwienia za pomocą zestawu do szybkiego utrwalania i barwienia zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli izolacja neutrofili zakończyła się sukcesem, podczas badania pod mikroskopem co najmniej 95% komórek jądrzastych powinno być granulocytami (neutrofile, bazofile, eozynofile) o minimalnym zanieczyszczeniu erytrocytów.</li>
</ol>
3. Test uwalniania DNA
<ol>
	<li>Ustaw test uwalniania DNA natychmiast po izolacji neutrofili</li>.
	<li>Jeśli podczas badania roztworu podstawowego za pomocą mikroskopii świetlnej występuje zlepianie się komórek, należy przepuścić zawiesinę komórek przez sterylny filtr o sterylnej mocy 70 μm bezpośrednio przed rozpoczęciem testu.</li>
	<li>Do każdej studzienki testowej sterylnej 96-dołkowej płytki dodać 5 x 104 komórek/basenik; agonistę i pożywkę Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI) bez czerwieni fenolowej i uzupełnioną 0,5% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu do końcowej objętości 100-200 μl. Włączyć co najmniej dwie ślepe studzienki na agonistę, w których podstawowy roztwór neutrofili jest zastąpiony równą objętością PBS. Należy pamiętać, że ustawienie ślepych studzienek dla każdego agonisty jest ważne w celu wykluczenia zanieczyszczenia DNA agonisty lub interferencji agonisty z testem fluorescencji.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 39 °C przez 30 minut w inkubatorze z użyciem dwutlenku węgla (4%).</li>
	<li>Dodaj agonistów w pożądanych stężeniach i nieprzepuszczalny dla komórek barwnik kwasu nukleinowego. Należy pamiętać, że optymalne stężenie barwnika nieprzepuszczalnego dla komórek będzie się różnić w zależności od różnych barwników kwasów nukleinowych. Niestymulowane kontrole, w których agoniści są zastępowani przez równą objętość pożywki, powinny być włączone do każdego doświadczenia. 
	UWAGA: Pożądane jest rozcieńczenie agonistów w podobnych objętościach pożywki hodowlanej w celu utrzymania stałych warunków między studzienkami. Końcowe objętości studzienek wynoszące 200 μl zostały pomyślnie wykorzystane, a w przypadku ich zmiany objętości studzienek powinny pozostać identyczne we wszystkich warunkach. Jako kontrole pozytywne można stosować octan forbolu-12-mirystynianu 13 (PMA) (stężenie końcowe ≥0,1 μM) lub czynnik aktywujący płytki krwi (PAF) (stężenie końcowe ≥31 μM). Agoniści powinni być mierzeni co najmniej dwukrotnie.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 39 °C. Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek po 2 godzinach lub w żądanych odstępach czasu. Należy pamiętać, że optymalne przedziały czasowe będą się różnić w zależności od zastosowanych agonistów. 
	UWAGA: Długość fali będzie zależeć od zastosowanego barwnika.</li>
	<li>Odejmij fluorescencję ślepej próby przed obliczeniem średniej fluorescencji.</li>
	<li>Aby umożliwić porównanie między osobnikami i między płytkami, oblicz krotną zmianę fluorescencji, dzieląc średnią fluorescencję studzienek stymulowanych przez średnią fluorescencję studzienek niestymulowanych.</li>
</ol>

<ol><li>Schiffman, J. D., Breen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+oncology%3A+what+dogs+and+other+species+can+teach+us+about+humans+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+Rl+Soc+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer.</a> Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673(2015).</li>
<li>Williams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+canine+leucocyte+antigens%3A+a+significant+advance+in+canine+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+J%22%5BJournal%5D)">Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology.</a> Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).</li>
<li>Eckhart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplication+of+the+caspase-12+prodomain+and+inactivation+of+NLRC4%2FIPAF+in+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog.</a> Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).</li>
<li>Eckhart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+mammalian+caspases+reveals+an+important+role+of+gene+loss+in+shaping+the+human+caspase+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire.</a> Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li>
<li>Chuammitri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+heterophil+extracellular+traps+%28HETs%29%3A+novel+defense+mechanism+of+chicken+heterophils%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils.</a> Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).</li>
<li>Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+cast+NETs%3A+neutrophil+extracellular+traps+are+released+from+fish+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils.</a> Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).</li>
<li>Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+histones+and+DNA+traps+in+invertebrate+immunity%3A+evidences+in+Crassostrea+gigas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas.</a> J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).</li>
<li>Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invertebrate+extracellular+phagocyte+traps+show+that+chromatin+is+an+ancient+defense+weapon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon.</a> Nat Commun. 5, 4627(2014).</li>
<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
<li>Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+by+neutrophil+extracellular+traps%3A+fact+or+folklore%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore?</a> Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).</li>
<li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).</li>
<li>Martinod, K., Wagner, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis%3A+tangled+up+in+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombosis: tangled up in NETs.</a> Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).</li>
<li>Pratesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+target+citrullinated+histone+4+contained+in+neutrophils+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps.</a> Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).</li>
<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).</li>
<li>Gray, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+conventional+protein+kinase+C+%28PKC%29+is+critical+in+the+generation+of+human+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inflamm+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps.</a> J Inflamm (Lond). 10 (1), 12(2013).</li>
<li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+cast+NETs+too%3A+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li>
<li>McCracken, J. M., Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neutrophil+apoptosis+and+lifespan+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease.</a> J Cell Death. 7, 15-23 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony test uwalniania DNA jest łatwo mierzalnym testem dla zewnątrzkomórkowego DNA. Metoda została zaadaptowana z podobnych technik stosowanych do oceny tworzenia NET u innych gatunków, ale prędkości wirowania, stężenia agonistów i czasy inkubacji zostały zmienione w celu optymalizacji metody do stosowania z neutrofilami u psów8,17,18. Podobne dostosowania można by wprowadzić w celu dostosowania metody do innych gatunków. Test jest prosty i niedrogi w porównaniu z innymi metodami pomiaru NETozy, takimi...

W samych Stanach Zjednoczonych jest ponad 70 milionów psów domowych,1. Jako cenieni członkowie rodziny, zwierzęta te często otrzymują najnowocześniejszą opiekę medyczną. Również dlatego, że psy dzielą nasze środowisko, mogą dostarczać informacji na temat patogenezy i leczenia chorób u ludzi1. Jednak niezależnie od tego, czy przekłada się odkrycia w medycynie ludzkiej na leczenie weterynaryjne, czy odwrotnie, ważne jest, aby dokładnie scharakteryzować różnice gatunkowe nawet w wysoce konserwatywnych systemach, takich jak wrodzona odpowiedź immunologiczna. Przykłady różnic między wrodzonym układem odpornościowym psa i człowieka obejmują wysoką ekspresję CD4 na neutrofilach2 psów; brak funkcjonalnego homologu cytoplazmatycznego czujnika flageliny IPAF u psów3 i ekspresji hybrydy kaspazy 1/4 u mięsożerców4.
Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) są stosunkowo niedawno odkrytym składnikiem odporności wrodzonej5. NET to sieci DNA, białek jądrowych i ziarnistych uwalnianych w odpowiedzi na szeroki zakres bodźców zapalnych lub zakaźnych6. Struktury podobne do NET wykazano u wielu gatunków, w tym u kurcząt7, ryb8,9 i acoelomates10, ale istnieją różnice gatunkowe. Na przykład neutrofile mysie wolniej reagują na bodźce NETozy niż neutrofile ludzkie i tworzą mniej rozproszone NET11. Istnieje wiele dowodów pochodzących od wielu gatunków, że NET więzią drobnoustroje i, co bardziej kontrowersyjne, mogą być bezpośrednio zaangażowane w zabijanie patogenów12,13. Jednak składniki NET zwiększają również uszkodzenia tkanek, sprzyjają zakrzepicy i działają jako autoantygeny14,15. Równowaga między korzystnymi i szkodliwymi skutkami NET może być różna w zależności od różnych chorób i gatunków, co sugeruje, że ważne jest zbadanie NET zarówno pod względem gatunku, jak i stanu będącego przedmiotem zainteresowania.
Tutaj opisujemy prosty protokół indukowania i mierzenia uwalniania NET przez neutrofile u psów. Metoda ta jest podobna do metod stosowanych do izolowania neutrofili16 i indukowania NETozy u innych gatunków, ale warunki takie jak stężenie agonistów i czas inkubacji zostały zoptymalizowane dla neutrofili u psów. Podobny test ilościowy uwalniania DNA NET został również opisany u innych gatunków, ale przedstawiona tutaj metoda jest również zoptymalizowana dla psów8,17,18.

<table><tbody><tr><td>Plastikowa probówka z pełną krwią z powłoką natryskową K2EDTA</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-500</td><td>Dokładny korpus chemiczny i naukowy.</td><td></td><td></td>AN228410</tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>20012043</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla cieląt bydlęcych, inaktywowana termicznie</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10100139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media 1640, bez czerwieni fenolowej i L-glutaminy</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>32404-014</td><td>Powinien być wolny od czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>96-dołkowa sterylna płytka polistyrenowa z płaskim dnem</td><td>Sokół</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu Phorbol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik aktywujący płytki</td><td>krwi Sigma-Aldrich</td><td>P4904</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Zielona plama kwasu nukleinowego</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili to sieci DNA, histonów i białek neutrofilowych uwalnianych w odpowiedzi na bodźce zakaźne i zapalne. Chociaż są składnikiem wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, NET są zaangażowane w szereg procesów chorobowych, w tym autoimmunizację i zakrzepicę. Protokół ten opisuje prostą metodę izolacji neutrofili u psów i ilościowego oznaczania NET za pomocą testu fluorescencji mikropłytek. Krew pobierana jest przy użyciu konwencjonalnych technik nakłuwania żył. Neutrofile izoluje się za pomocą sedymentacji dekstranu i gradientu gęstości w warunkach zoptymalizowanych dla krwi psa. Po pozostawieniu czasu na przyłączenie się do studzienek 96-dołkowej płytki, neutrofile są traktowane agonistami indukującymi NET, takimi jak octan forbolu-12-mirystynianu 13 lub czynnik aktywujący płytki krwi. Uwalnianie DNA mierzy się fluorescencją nieprzepuszczalnego dla komórek barwnika kwasu nukleinowego. Ten test jest prostą i niedrogą metodą ilościowego określania uwalniania NET, ale powstawanie NET, a nie inne przyczyny śmierci komórki, musi zostać potwierdzone za pomocą alternatywnych metod.

Stosując ten protokół, po stymulacji neutrofilów kontrolami pozytywnymi (PMA i PAF) powinna nastąpić znaczna krotność zmiany fluorescencji. Jak pokazano na Ryc. 1B, stymulacja neutrofili psich 31 µM PAF przez 1 h skutkuje średnio 4,0-krotnym wzrostem fluorescencji w porównaniu z komórkami niestymulowanymi (zakres 2,0-5,8, n = 5 psów)18. PMA w stężeniu 0,1 µM (Ryc. 1A) jest wolniej działającym agonistą, który nie powoduje wzrostu fluorescencji a...

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to sieci DNA, histonów i białek neutrofilowych. Chociaż jest to składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, NET są zaangażowane w autoimmunizację i zakrzepicę. Protokół ten opisuje prostą metodę izolacji neutrofili u psów i ilościowego oznaczania NET za pomocą testu fluorescencji mikropłytek.

Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest izolacja spoczynkowych neutrofili oraz pomiar uwalniania przez nie DNA w odpowiedzi na agoniści. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii i medycyny weterynaryjnej, takie jak: jaka jest odpowiedź neutrofili na różne agoniści indukujących powstawanie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych lub śmierć komórki? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na szybki screening różnych agonistów i inhibitorów tworzenia zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych.Zacznij od wprowadzenia igły motylkowej o rozmiarze 21 G do żyły cephalicznej zdrowego psa będącego dawcą, następnie podłącz strzykawkę o pojemności 3 ml i pobierz trzy próbki krwi po 3 ml, niezwłocznie przenosząc je do niezatykanych probówek z EDTA. Należy zadbać o to, aby wkłucie do żyły było nieurazowe, a przepływ krwi prawidłowy, ponieważ utrudniony pobór krwi spowoduje niską wydajność neutrofili. Po napełnieniu każdej probówki odwróć je kilka razy, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie krwi z antykoagulantem.Przenieś krew do stożkowatej probówki o pojemności 50 ml. Połącz próbki z równą objętością sterylnego 3% Dextran 500 w temperaturze pokojowej poprzez delikatne odwracanie probówki, a następnie pozostaw ją w pozycji pionowej na 18 do 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś słomkową górną warstwę do nowej probówki, aż do momentu, gdy nie będzie można jej już pobierać bez zanieczyszczenia dolną czerwoną warstwą.Odwirować górną warstwę. Odlać nadsącz, a osad ponownie zawiesić ręcznie w 10 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej. Następnie do 50-mililitrowej probówki stożkowej dodać 10 ml roztworu do separacji komórek na bazie polisukrozy i diatrizoanu sodu o temperaturze pokojowej.Ostrożnie nałóż warstwę komórek na roztwór separacyjny. Rozdziel komórki poprzez wirowanie. Usuń górne trzy warstwy: plazmy, mononuklearnych komórek krwi obwodowej oraz gradientu gęstości.Pozostałe erytrocyty poddać lizie, dodając 10 ml wody w temperaturze pokojowej. Po 30 sekundach dodać 10 ml sterylnego 1,8% roztworu chlorku sodu w temperaturze pokojowej w celu przywrócenia toniczności. Komórki wymieszać poprzez delikatne odwracanie probówki.Następnie należy zebrać komórki poprzez wirowanie. Biały osad należy delikatnie zawiesić w 10 ml sterylnego PBS. Po dokonaniu odliczenia, komórki ponownie wirujemy, a osad zawieszamy w sterylnym PBS w temperaturze pokojowej, osiągając stężenie 5 × 10⁶ komórek/ml.W razie potrzeby niewielką objętość komórek osusz na powietrzu na szkiełku przedmiotowym, a następnie przeprowadź barwienie za pomocą zestawu do szybkiej fiksacji i barwienia zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli izolacja neutrofili przebiegła pomyślnie, co należy potwierdzić w badaniu mikroskopowym w świetle przechodzącym, co najmniej 95% komórek jądrzastych powinno stanowić granulocyty przy minimalnym zanieczyszczeniu erytrocytami. Bezpośrednio po izolacji neutrofili przepuść zawiesinę komórkową przez sterylny filtr 70-micron i przenieś 5 × 10⁴ komórek do dołków testowych płytki 96-dołkowej zawierającej pożywkę hodowlaną w celu inkubacji przez 30 minut w temperaturze 39 °C i 4% CO2.Po przytwierdzeniu komórek, do studzienek testowych, a także do dwóch studzienek kontrolnych zawierających sam PBS, dodaj agonistę w wybranym stężeniu do końcowej objętości 100-200 µL w pożywce RPMI bez czerwieni fenolowej, uzupełnionej nieaktywnym termicznie FCS. Następnie dodaj do komórek odpowiedni barwnik do kwasów nukleinowych nieprzenikający do wnętrza komórki i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze. Po odpowiednim czasie inkubacji zmierz fluorescencję przy użyciu czytnika mikropłytek.Jednogodzinna stymulacja neutrofili psich czynnikiem aktywującym płytki krwi skutkuje średnio czterokrotnym wzrostem fluorescencji w porównaniu z kontrolnymi komórkami niestymulowanymi. PMA jest natomiast wolniej działającym agonistą, który nie wykazuje zwiększonej fluorescencji neutrofili przed upływem dwóch godzin aktywacji, lecz ostatecznie powoduje podobny wielokrotny wzrost w czasie. Fluorescencja barwnika kwasów nukleinowych nie jest specyficzna dla tworzenia pozakomórkowych pułapek neutrofilowych, ponieważ występuje ona również w przypadku śmierci komórek w wyniku innych mechanizmów lub gdy odczynniki są zanieczyszczone DNA.Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie komercyjny preparat LPS wywołał bardzo wysoką fluorescencję w przypadku braku neutrofili, co prawdopodobnie wynikało z zanieczyszczenia bakteryjnym DNA. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje około sześciu godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z neutrofilami.Nie należy mieszać komórek w wortexie, a znadfiltrów nie należy zlewać, lecz odprowadzać za pomocą pipety. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia immunofluorescencyjna, aby potwierdzić, że uwolniona DNA koreluje z procesem NETosis. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z zakresu hematologii do zgłębiania wpływu uwolnionej DNA na krzepnięcie oraz działania nowych agonistów NET, w tym osocza pacjentów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować neutrofile psie oraz mierzyć ich odpowiedź na agoniści.

a-simple-fluorescence-assay-for-quantification-canine-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Opisujemy metody izolowania neutrofili u psów z krwi pełnej i wizualizacji powstawania NET w żywych neutrofilach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Opisano również protokoły ilościowego oznaczania powstawania NET i ekspresji cytrulinowanego histonu H3 (citH3) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Przedstawiamy protokół zmodyfikowanej techniki testu immunoenzymatycznego połączonego z enzymem kanapkowym do ilościowego pomiaru dwóch składników pozostałości po pułapkach zewnątrzkomórkowych neutrofili, kompleksów DNA sprzężonego z mieloperoksydazą i sprzężonego DNA elastazy neutrofilowej, pochodzących z aktywowanych neutrofili.

Kwantyfikacja kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili przy użyciu zmodyfikowanego testu ELISA typu kanapkowego

Ten protokół zawiera zestaw testów funkcjonalnych neutrofili, które mają być używane jako metoda przesiewowa w celu pokrycia funkcji z różnych ścieżek sygnałowych. Protokół zawiera wstępną i prostą ocenę żywotności komórek, czystości, produkcji reaktywnych form tlenu, migracji w czasie rzeczywistym, fagocytozy oraz wstępną sugestię pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Poznaj metodę izolacji neutrofili z krwi psów i ilościowego oznaczania uwalniania NETs za pomocą testu fluorescencyjnego. Technika umożliwia szybki przesiew agonistów i inhibitorów formowania pułapek neutrofili.

Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów

Przeglądaj więcej filmów