Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów
21 listopada 2016
Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to sieci DNA, histonów i białek neutrofilowych. Chociaż jest to składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, NET są zaangażowane w autoimmunizację i zakrzepicę. Protokół ten opisuje prostą metodę izolacji neutrofili u psów i ilościowego oznaczania NET za pomocą testu fluorescencji mikropłytek.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wyizolowanie uśpionych neutrofili i zmierzenie ich uwalniania DNA w odpowiedzi na agonistów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w immunologii i medycynie weterynaryjnej, takie jak: jaka jest odpowiedź neutrofili na różnych agonistów indukcji pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili lub śmierci komórki? Główną zaletą tej technologii jest to, że umożliwia szybkie badanie przesiewowe różnych agonistów i inhibitorów tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.
Zacznij od wkłucia igły motylkowej o rozmiarze 21 do żyły głowowej zdrowego psiego dawcy, a następnie podłącz trzymililitrową strzykawkę i uzyskaj trzy trzymililitrowe próbki krwi, natychmiast przenosząc próbki do niezakorkowanych probówek krwionośnych zawierających EDTA. Uważaj, aby wkłucie żyły było atraumatyczne i aby przepływ krwi był dobry, ponieważ złe pobranie krwi spowoduje słabą wydajność neutrofili. Po napełnieniu każdej probówki należy je odwrócić do tyłu, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie krwi i antykoagulantu.
Zgromadź krew w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Wymieszać próbki z równą objętością sterylnego 3%Dekstranu 500 o temperaturze pokojowej przez delikatne odwrócenie i pozostawić probówkę w pozycji pionowej na 18 do 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś górną warstwę w kolorze słomkowym do świeżej tuby, aż nie będzie można jej już zebrać bez zanieczyszczenia dolną czerwoną warstwą.
Odwirować górną warstwę. Wyrzucić supernatant, ręcznie ponownie zawieszając osad w 10 mililitrach sterylnego PBS o temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 10 mililitrów polisacharozy o temperaturze pokojowej w roztworze do separacji komórek dizatrizoanu sodu do 50-mililitrowej stożkowej probówki.
Ostrożnie ułóż komórki na roztworze do separacji. Oddziel komórki przez odwirowanie. Odrzuć trzy górne warstwy jednojądrzastych komórek plazmowych i płytkowych oraz gradientu gęstości.
Lizuj którykolwiek z pozostałych erytrocytów za pomocą 10 mililitrów wody o temperaturze pokojowej. Po 30 sekundach dodaj 10 mililitrów sterylnego 1,8% chlorku sodu o temperaturze pokojowej, aby przywrócić toniczność. Wymieszaj komórki przez delikatne odwrócenie.
Teraz zbierz komórki przez odwirowanie. Delikatnie ponownie zanurz biały granulat w 10 mililitrach sterylnego PBS. Po zliczeniu ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w stężeniu pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr w sterylnym PBS w temperaturze pokojowej.
W razie potrzeby wysuszyć na powietrzu niewielką objętość komórek na szkiełku podstawowym, a następnie wybarwić za pomocą zestawu do szybkiego utrwalania i barwienia zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli izolacja neutrofili zakończyła się sukcesem, co najmniej 95% komórek jądrzastych powinno być granulocytami o minimalnym zanieczyszczeniu erytrocytami, jak zaobserwowano pod mikroskopem świetlnym. Natychmiast po izolacji neutrofili przepuścić zawiesinę komórek przez sterylny sterylny filtr o średnicy 70 mikronów i dodać pięć razy 10 do czwartych komórek do studzienek testowych 96-dołkowej płytki zawierającej pożywkę hodowlaną na 30-minutową inkubację w temperaturze 39 stopni Celsjusza i 4% dwutlenku węgla.
Po przyłączeniu się komórek dodać do końcowej objętości 100-200 mikrolitrów agonisty będącego przedmiotem zainteresowania w RPMI bez czerwieni fenolowej i uzupełnionego inaktywowanym termicznie FCS do studzienek testowych, jak również do dwóch ślepych studzienek zawierających sam PBS. Następnie dodaj do komórek odpowiedni nieprzepuszczalny dla komórek barwnik kwasu nukleinowego i włóż płytkę z powrotem do inkubatora. Po odpowiednim okresie inkubacji zmierz fluorescencję na czytniku mikropłytek.
Jednogodzinna stymulacja neutrofili psów czynnikiem aktywującym płytki krwi powoduje średnio czterokrotny wzrost fluorescencji w porównaniu z kontrolnymi komórkami niestymulowanymi. PMA jest jednak wolniejszym agonistą, który nie wykazuje zwiększonej fluorescencji neutrofili przed dwiema godzinami aktywacji, ale ostatecznie powoduje podobny wzrost krotności w czasie. Fluorescencja barwnika kwasu nukleinowego nie jest specyficzna dla tworzenia zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, ponieważ wystąpi również w przypadku śmierci komórki przez inne mechanizmy lub jeśli odczynniki są zanieczyszczone DNA.
Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie komercyjny preparat LPS wytwarzał bardzo wysoką fluorescencję przy braku neutrofili, prawdopodobnie z powodu zanieczyszczenia bakteryjnym DNA. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu około sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z neutrofilami.
Nie należy wirować komórek i raczej odpipetować niż wylać supernatanty. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia immunofluorescencyjna, aby potwierdzić, że uwolnione DNA koreluje z NETosis. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie hematologii do zbadania interakcji DNA uwalnianego podczas krzepnięcia i wpływu nowych agonistów NET, w tym osocza pacjenta.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować neutrofile u psów i mierzyć ich odpowiedź na agonistów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji spoczywających neutrofili z krwi psiej oraz ilościowego oznaczania tworzenia przez nie pułapek zewnątrzkomórkowych. Neutrofilowe pułapki zewnątrzkomórkowe (NETs) odgrywają istotną rolę w nieswoistej odpowiedzi immunologicznej i są powiązane z różnymi jednostkami chorobowymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Medycyna weterynaryjna
Wstęp
- Neutrofile odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi odpornościowej.
- Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) składają się z DNA, histonów i białek uwalnianych przez neutrofile.
- NETs są zaangażowane w choroby autoimmunologiczne oraz zakrzepicę.
- Zrozumienie procesu powstawania NETs może dostarczyć cennych informacji na temat odpowiedzi odpornościowej.
Cel badania
- W celu wyizolowania neutrofili i pomiaru uwalniania przez nie DNA w odpowiedzi na różne agoniści.
- W celu zbadania odpowiedzi neutrofili na czynniki indukujące powstawanie NET.
- W celu umożliwienia szybkiego przesiewowego badania agonistów i inhibitorów wpływających na formowanie się NET.
Zastosowane metody
- Próbki krwi pobiera się od zdrowego psa dawcy za pomocą igły motylkowej o rozmiarze 21G.
- Próbki przenosi się do probówek zawierających EDTA w celu izolacji neutrofili.
- Należy zadbać o to, aby nakłucie żyły było nieurazowe, co zapewni optymalną wydajność uzyskania neutrofili.
- Odwracanie probówek zapewnia prawidłowe wymieszanie krwi z antykoagulantem.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia skuteczną izolację neutrofilów.
- Ilościowe oznaczenie NET można przeprowadzić za pomocą fluorescencyjnego testu na płytkach mikrotitracyjnych.
- Protokół ten wspiera badanie odpowiedzi neutrofilów na różne bodźce.
- Możliwe jest szybkie przesiewowe badanie tworzenia NET w odpowiedzi na różne agoniści.
Wnioski
- Niniejszy protokół zapewnia niezawodną metodę badania zachowania neutrofili.
- Uzyskane informacje mogą przyczynić się do zrozumienia odpowiedzi odpornościowych zarówno w stanie zdrowia, jak i choroby.
- Technika ta jest przydatna zarówno w badaniach, jak i w zastosowaniach klinicznych w medycynie weterynaryjnej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten test ilościowy NET oparty na fluorescencji umożliwia szybki screening agonistów i inhibitorów wpływających na tworzenie pozakomórkowych pułapek neutrofili w modelach psich. Metoda ta wspiera walidację celów w badaniach nad immunologią i chorobami zapalnymi, dostarczając ilościowych i powtarzalnych odczytów uwalniania DNA. Ułatwia ona ograniczanie ryzyka mechanistycznego w programach przedklinicznych badających szlaki zależne od NET w modelach autoimmunizacji, zakrzepicy i chorób zakaźnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie odpowiedzi neutrofili na agoniści, takie jak PMA i PAF, w celu wyjaśnienia docelowych szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera szybkie przesiewanie bibliotek związków w celu identyfikacji modulatorów NETozy.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Wykorzystanie nieprzenikającego przez błony komórkowe barwnika kwasów nukleinowych do ilościowego oznaczenia uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA jako wskaźnika tworzenia NET.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z czytnikami mikropłytek 96-dołkowych, umożliwiająca wysokoprzepustowe profilowanie agonistów i inhibitorów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia istotny dla przebiegu chorób model systemowy do badania roli NET w zakrzepicy i autoimmunizacji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia analizę zależności dawka-odpowiedź oraz analizę przebiegu czasowego, co zwiększa pewność prognostyczną podczas optymalizacji wiodących związków.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, wspierając ograniczanie ryzyka związanego z celem immunologicznym przed rozpoczęciem inwestycji przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Pomiar kinetyki uwalniania DNA w celu wyjaśnienia szlaków aktywacji neutrofili oraz specyficzności agonistów.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników fluorescencji, umożliwiając porównanie mocy agonistów i skuteczności inhibitorów.
- Analityka: Generuje dane o krotności zmian (np. 4-krotny wzrost w przypadku PAF) w celu uszeregowania aktywności związków i oceny istotności biologicznej.
- Badania translacyjne: Łączy kwantyfikację NET z procesami patofizjologicznymi, takimi jak krzepnięcie i zapalenie, w połączeniu z walidacją ortogonalną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zstandaryzowaną, wielokrotnego użytku platformę do walidacji celów w immunologii i chorobach zapalnych w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez oddzielenie sygnałów specyficznych dla NET od ogólnej cytotoksyczności, po potwierdzeniu wynikami mikroskopii.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje niedrogie, łatwo dostępne odczynniki oraz standardowy sprzęt laboratoryjny, co umożliwia skalowalne wdrożenie.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki możliwości wczesnej oceny wpływu związków na patologię napędzaną przez NET.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów w obszarze chorób zapalnych i autoimmunologicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w izolacji pierwotnych komórek oraz w sterylnych technikach hodowli tkankowej.
- Zależne od dostępu do czytników mikropłytek z możliwością detekcji fluorescencji.
- Wymaga standaryzacji gęstości siewu komórek oraz warunków inkubacji pomiędzy poszczególnymi seriami pomiarowymi.
- Należy łączyć z metodami ortogonalnymi (np. immunofluorescencją), aby odróżnić NETozę od innych mechanizmów śmierci komórkowej.
- Ograniczone przez specyficzność barwnika, ponieważ fluorescencja może wystąpić z powodu zewnątrzkomórkowego DNA pochodzącego z nekrozy lub zanieczyszczenia odczynników.
