Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów

Ogólnym celem tego eksperymentu jest izolacja spoczynkowych neutrofili oraz pomiar uwalniania przez nie DNA w odpowiedzi na agoniści. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii i medycyny weterynaryjnej, takie jak: jaka jest odpowiedź neutrofili na różne agoniści indukujących powstawanie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych lub śmierć komórki? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na szybki screening różnych agonistów i inhibitorów tworzenia zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych.

Zacznij od wprowadzenia igły motylkowej o rozmiarze 21 G do żyły cephalicznej zdrowego psa będącego dawcą, następnie podłącz strzykawkę o pojemności 3 ml i pobierz trzy próbki krwi po 3 ml, niezwłocznie przenosząc je do niezatykanych probówek z EDTA. Należy zadbać o to, aby wkłucie do żyły było nieurazowe, a przepływ krwi prawidłowy, ponieważ utrudniony pobór krwi spowoduje niską wydajność neutrofili. Po napełnieniu każdej probówki odwróć je kilka razy, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie krwi z antykoagulantem.

Przenieś krew do stożkowatej probówki o pojemności 50 ml. Połącz próbki z równą objętością sterylnego 3% Dextran 500 w temperaturze pokojowej poprzez delikatne odwracanie probówki, a następnie pozostaw ją w pozycji pionowej na 18 do 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś słomkową górną warstwę do nowej probówki, aż do momentu, gdy nie będzie można jej już pobierać bez zanieczyszczenia dolną czerwoną warstwą.

Odwirować górną warstwę. Odlać nadsącz, a osad ponownie zawiesić ręcznie w 10 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej. Następnie do 50-mililitrowej probówki stożkowej dodać 10 ml roztworu do separacji komórek na bazie polisukrozy i diatrizoanu sodu o temperaturze pokojowej.

Ostrożnie nałóż warstwę komórek na roztwór separacyjny. Rozdziel komórki poprzez wirowanie. Usuń górne trzy warstwy: plazmy, mononuklearnych komórek krwi obwodowej oraz gradientu gęstości.

Pozostałe erytrocyty poddać lizie, dodając 10 ml wody w temperaturze pokojowej. Po 30 sekundach dodać 10 ml sterylnego 1,8% roztworu chlorku sodu w temperaturze pokojowej w celu przywrócenia toniczności. Komórki wymieszać poprzez delikatne odwracanie probówki.

Następnie należy zebrać komórki poprzez wirowanie. Biały osad należy delikatnie zawiesić w 10 ml sterylnego PBS. Po dokonaniu odliczenia, komórki ponownie wirujemy, a osad zawieszamy w sterylnym PBS w temperaturze pokojowej, osiągając stężenie 5 × 10⁶ komórek/ml.

W razie potrzeby niewielką objętość komórek osusz na powietrzu na szkiełku przedmiotowym, a następnie przeprowadź barwienie za pomocą zestawu do szybkiej fiksacji i barwienia zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli izolacja neutrofili przebiegła pomyślnie, co należy potwierdzić w badaniu mikroskopowym w świetle przechodzącym, co najmniej 95% komórek jądrzastych powinno stanowić granulocyty przy minimalnym zanieczyszczeniu erytrocytami. Bezpośrednio po izolacji neutrofili przepuść zawiesinę komórkową przez sterylny filtr 70-micron i przenieś 5 × 10⁴ komórek do dołków testowych płytki 96-dołkowej zawierającej pożywkę hodowlaną w celu inkubacji przez 30 minut w temperaturze 39 °C i 4% CO2.

Po przytwierdzeniu komórek, do studzienek testowych, a także do dwóch studzienek kontrolnych zawierających sam PBS, dodaj agonistę w wybranym stężeniu do końcowej objętości 100-200 µL w pożywce RPMI bez czerwieni fenolowej, uzupełnionej nieaktywnym termicznie FCS. Następnie dodaj do komórek odpowiedni barwnik do kwasów nukleinowych nieprzenikający do wnętrza komórki i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze. Po odpowiednim czasie inkubacji zmierz fluorescencję przy użyciu czytnika mikropłytek.

Jednogodzinna stymulacja neutrofili psich czynnikiem aktywującym płytki krwi skutkuje średnio czterokrotnym wzrostem fluorescencji w porównaniu z kontrolnymi komórkami niestymulowanymi. PMA jest natomiast wolniej działającym agonistą, który nie wykazuje zwiększonej fluorescencji neutrofili przed upływem dwóch godzin aktywacji, lecz ostatecznie powoduje podobny wielokrotny wzrost w czasie. Fluorescencja barwnika kwasów nukleinowych nie jest specyficzna dla tworzenia pozakomórkowych pułapek neutrofilowych, ponieważ występuje ona również w przypadku śmierci komórek w wyniku innych mechanizmów lub gdy odczynniki są zanieczyszczone DNA.

Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie komercyjny preparat LPS wywołał bardzo wysoką fluorescencję w przypadku braku neutrofili, co prawdopodobnie wynikało z zanieczyszczenia bakteryjnym DNA. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje około sześciu godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z neutrofilami.

Nie należy mieszać komórek w wortexie, a znadfiltrów nie należy zlewać, lecz odprowadzać za pomocą pipety. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia immunofluorescencyjna, aby potwierdzić, że uwolniona DNA koreluje z procesem NETosis. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z zakresu hematologii do zgłębiania wpływu uwolnionej DNA na krzepnięcie oraz działania nowych agonistów NET, w tym osocza pacjentów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować neutrofile psie oraz mierzyć ich odpowiedź na agoniści.