Prosta i wydajna produkcja i oczyszczanie glikoproteiny oligodendrocytów mieliny myszy do eksperymentalnych badań nad autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego
27 października 2016
Opisujemy prosty protokół wykorzystujący tylko podstawowy sprzęt laboratoryjny do generowania i oczyszczania dużych ilości białka fuzyjnego, które zawiera glikoproteinę oligodendrocytów mieliny myszy. Białko to może być wykorzystane do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia wywołanego zarówno przez limfocyty T, jak i B.
Ogólnym celem tego protokołu jest wytworzenie białka opartego na zewnątrzkomórkowej domenie glikoproteiny oligodendrocytów mieliny lub MOG, które można wykorzystać do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego lub EAE. Protokół ten umożliwia każdemu laboratorium wytworzenie białka MOG w celu wykorzystania go jako antygenu do indukcji EAE. Główną zaletą tego protokołu jest to, że nie opiera się on na specjalistycznym sprzęcie do obsługi białek, ale zamiast tego można użyć standardowego sprzętu, który można znaleźć w prawie każdym laboratorium immunologicznym.
Cóż, ten protokół został zoptymalizowany pod kątem białka znacznika MOG w oparciu o wersję myszą, powinien działać dla innych systemów ekspresji białek MOG, które zawierają hestate do oczyszczania. Zaszczepić pięć mililitrów wysterylizowanego bulionu z glicerolem BL 21 MOG i inkubować go przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Dodać 500 mikrolitrów ampicyliny po 100 miligramów na mililitr do każdej z 500 mililitrowych kolb zawierających 500 mililitrów sterylnego LB. Przenieś jeden mililitr nocnej kultury do każdej z dwóch kolb bulionu LB.
Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez pięć godzin lub do gęstości optycznej 0,6. Po osiągnięciu pożądanej gęstości komórek dodaj 0,5 mililitra jednego molowego IPTG do każdej kolby hodowlanej. Inkubować kolbę, ustawić 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez cztery godziny, a następnie przez noc w temperaturze pokojowej i 75 obr./min.
Rozprowadź kultury równomiernie w 250-mililitrowych butelkach kompatybilnych z wirowaniem z dużą prędkością i od tego momentu utrzymuj butelki na lodzie. Osadzaj komórki bakteryjne w temperaturze 22 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawieś i połącz wszystkie granulki bakteryjne w sumie 30 mililitrów buforu lizatu.
Przenieś tę objętość do około dolnej 50-mililitrowej rurki zdolnej do szybkiego centrowania. Umieść tę rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 30 stopni Celsjusza na 30 minut. W czasie inkubacji należy dwukrotnie wstrząsnąć probówką, aby ponownie zawiesić komórki.
Po inkubacji przetransportować probówkę na lód i sonikować roztwór przy 20 kilohercach i amplitudzie 70%, pulsując przez trzy sekundy i wyłączając na trzy sekundy przez pięć impulsów, sonikować roztwór przez sześć rund po pięć impulsów, pozwalając roztworowi ostygnąć w lodzie pomiędzy rundami. Następnie odwirować roztwór o sile 24 000 razy g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie ponownie zawiesić osad w 30 mililitrach buforu A i inkubować roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po inkubacji poddać sonikacji roztwór na lodzie jak poprzednio, a następnie dodać 17,2 grama HCl guanidyny do roztworu.
Inkubować próbkę na lodzie przez jedną godzinę w celu rozpuszczenia białka znacznika MOG. Aby naładować i zrównoważyć żywicę niklową, najpierw umyj żywicę, dodając 40 mililitrów wody do każdej probówki zawierającej żywicę. Połóż rurki poziomo na bujaku i pozwól im mieszać przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po zakończeniu odwirować probówki w temperaturze 4500 razy g przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant przez pipetowanie, aby uniknąć uszkodzenia osadu. Następnie dodaj 40 mililitrów buforu ładunku do każdej probówki.
Przenieś probówki na kołyskę i pozwól im mieszać przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie ponownie odwiruj, jak poprzednio. Odrzucić supernatant i dodać 40 mililitrów buforu B do probówek. Przenieś probówki na kołyskę i pozwól im mieszać przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie ponownie odwiruj probówki z żywicą.
Aby oczyścić białko znacznika MOG, przenieś całą objętość rozpuszczonego białka do pierwszej probówki zawierającej żywicę niklową. Po wymieszaniu umieść rurkę poziomo na bujaku w temperaturze czterech stopni Celsjusza na godzinę. Po centralnym stopieniu probówki pod ciśnieniem 4500 razy g przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przenieść ten supernatant do drugiej probówki z żywicą niklową i inkubować jak poprzednio.
W międzyczasie ponownie zawieś żywicę niklową w pierwszej probówce w buforze ewolucyjnym o pojemności 40 mililitrów i umieść probówkę poziomo na kołysce w temperaturze czterech stopni Celsjusza na pięć minut przed odwirowaniem jak poprzednio. Przenieść supernatant zawierający białko znacznika MOG do 250-mililitrowej butelki oznaczonej oczyszczonym białkiem znakowanym MOG. Trzymaj tę butelkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Na każdym etapie elucji należy zebrać powstały supernatant w tej butelce. Dodaj 40 mililitrów bufora paskowego do niklu obecnego w pierwszej probówce i umieść poziomo na kołysce na pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować probówkę, wyrzucić supernatant i ponownie naładować podniesiony nikiel jak poprzednio.
Po zakończeniu przejdź do przodu z drugą rurką, tak jak to zostało zrobione w przypadku pierwszej rurki. W sumie cztery rundy absorpcji rozpuszczonego białka na naładowaną żywicę niklową i elucja pozwolą odzyskać większość białka. Wytnij około 30 centymetrów rurki do dializy ze skóry węża.
Zabezpiecz jeden koniec hemostatykiem blokującym, składając koniec skóry węża ponad trzy razy i zaciskając złożony koniec hemostatem. Wypełnij skórę węża rozcieńczonym białkiem znacznika MOG. Następnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza ze skóry węża, wypychając je z otwartego końca.
Na koniec uszczelnij drugi koniec rurki za pomocą drugiego hemostatu blokującego. Następnie napełnij duże wiadro jednym litrem jednego buforu octanowego z czterema molowymi guanidynami. Umieścić w wiadrze maksymalnie dwa odcinki rurki dializacyjnej zawierające białko znacznika MOG.
Za pomocą taśmy przymocuj hemostatyki do boku wiadra, aby pozostawić miejsce na magnetyczne mieszadło, które może bez przeszkód obracać się na dnie. Umieść wiadro w pomieszczeniu o temperaturze czterech stopni Celsjusza na magnetycznej płycie osłonowej i włącz je na wolne obroty. Dializa trwa co najmniej trzy dni, aby stopniowo zmniejszać ilość guanidyny w buforze.
Regularnie sprawdzaj, czy rurka zaczyna się nienaruszona, a końce są bezpiecznie zamknięte. Po czterech do pięciu godzinach dodaj jeden litr jednego buforu octanowego do wiadra do dializy. Powtarzaj ten proces co cztery do pięciu godzin, w sumie trzy razy, aby uzyskać w sumie cztery litry w wiadrze.
Po wyrzuceniu połowy buforu do wiadra, napełnij jednym litrem jednego buforu octanowego i ustaw rurkę i mieszadło. Na koniec zastąp całą czterolitrową objętość w wiadrze czterema litrami świeżego buforu octanowego i mieszaj przez cztery do pięciu godzin. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wykonaj ten krok w dniu koncentracji białka.
Aby zagęścić białko znacznika MOG, wyłóż długopis folią aluminiową i przykryj folię aluminiową PEG 3350 i PEG 1000 w stosunku jeden do jednego. PEG 3350 może pomóc w zapobieganiu agregacji białek podczas koncentracji i jest skutecznym kriokonserwantem. Umieść białko MOG tag zawierające rurkę z wężowej skóry na wierzchu folii aluminiowej i przykryj PEG 8000.
Pozostaw to w temperaturze pokojowej i regularnie sprawdzaj objętość, aż objętość będzie równa lub mniejsza od szacowanej objętości końcowej. Jeśli wstrzykiwacz zostanie nadmiernie nasycony wodą podczas procesu zagęszczania, ustaw świeżą patelnię z folią aluminiową i PEG. Próbki białka pobrane podczas protokołu oczyszczania lub uruchamiane na stronie SDS żel w celu potwierdzenia czystości.
Na wyświetlaczu znajduje się reprezentatywny żel pokazujący wysoce oczyszczoną etykietę MOG o mocy 31,86 kilodaltonów. Aby sprawdzić, czy białko znacznika MOG złożyło się prawidłowo, za pomocą cytometrii przepływowej oceniono wiązanie białka znacznika MOG z CD19-dodatnim, CD4-ujemnym, dziewięcioma komórkami B z węzłów chłonnych od dzikich czarnych sześciu myszy C57 lub myszy IgH MOG, które wyrażają łańcuch ciężki immunoglobuliny specyficzny dla białka MOG. Ten protokół wymaga co najmniej 10 dni od początku do końca.
Przez cały czas trwania procedury izolacji ważne jest, aby śledzić białko i pamiętać, co należy zachować, a co wyrzucić. Nie zapominaj, że podczas używania sześciowodnego siarczanu niklu używanego do ładowania żywicy niklowej jest to niezwykle niebezpieczne i należy podjąć środki ostrożności, aby zapobiec wdychaniu lub kontaktowi ze skórą lub oczami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak produkować i oczyszczać własne białko znacznika MOG.
Po oczyszczeniu białko znacznika MOG może być emulgowane w kompletnym adiuwantzie Freunda i stosowane jako immunizacja w celu indukcji EAE. EAE indukowany przez znacznik MOG może być wykorzystany do badania udziału wielu typów komórek, takich jak komórki CD4 lub CDAT lub komórki B w autoimmunizacji ośrodkowego układu nerwowego. W przeciwieństwie do krótkiego peptydu, który jest ograniczony przez MHC, antygen białkowy może być stosowany w dowolnym szczepie myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje prostą metodę generowania i oczyszczania białka fuzyjnego zawierającego mysie glikoproteinę mieliny oligodendrocytów (MOG). Uzyskane białko może być wykorzystane do indukcji eksperymentalnego autoprzewodzenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) indukowanego przez limfocyty T i B.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Oczyszczanie białek
Wprowadzenie
- Glikoproteina mieliny oligodendrocytów (MOG) ma kluczowe znaczenie dla badania chorób autoimmunologicznych.
- Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest modelem stwardnienia rozsianego.
- Do produkcji białka można wykorzystać standardowy sprzęt laboratoryjny, co czyni tę metodę dostępną.
- Protokół został zoptymalizowany dla mysiej MOG, ale można go dostosować do innych systemów.
Cel badania
- Dostarczenie niezawodnej metody produkcji białka MOG.
- Ułatwienie badań nad EAE oraz powiązanymi chorobami autoimmunologicznymi.
- Umożliwienie prowadzenia tych badań laboratoriom nieposiadającym specjalistycznego sprzętu.
Zastosowane metody
- Zaszczepienie sterylnej pożywki płynnej z glycerolowego stożka szczepu BL 21 MOG tag.
- Inkubacja w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
- Przygotowanie pożywki LB z ampicyliną w celu selekcji.
- Przeniesienie nocnej kultury do pożywki LB w celu ekspresji białka.
Główne wyniki
- Skuteczna generacja białka MOG przy użyciu standardowych technik laboratoryjnych.
- Białko może być wykorzystane jako antygen do indukowania EAE.
- Protokół umożliwia wielkoskalową produkcję białka fuzyjnego.
- Dostępna metoda dla różnych laboratoriów badawczych.
Wnioski
- Protokół ten upraszcza produkcję białka MOG.
- Wspiera on badania nad chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak stwardnienie rozsiane.
- Można wykorzystać standardowy sprzęt, co zwiększa dostępność metody dla badaczy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym z sektora biofarmaceutycznego otrzymywanie natywnej glikoproteiny mielinowej oligodendrocytów (MOG) do modeli przedklinicznych, które angażują zarówno szlaki limfocytów T, jak i B w autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia. Dzięki generowaniu pełnowymiarowego zewnątrzkomórkowego białka MOG przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego, metoda ta wspiera mechanistyczną weryfikację hipotez terapeutycznych ukierunkowanych na limfocyty B w badaniach nad stwardnieniem rozsianym. Skalowalna konstrukcja z możliwością odszczepienia znacznika ułatwia powtarzalną produkcję antygenu w celu zapewnienia spójnej indukcji modelu choroby w procesach odkrywczych i translacyjnych.
Strategiczne Zastosowania w Badań i Rozwoju Biofarmaceutyków
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych dotyczących rozpoznawania natywnego MOG przez patogenne limfocyty B w modelach autoimmunizacyjnych chorób OUN.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane źródło antygenu do walidacji MOG jako celu w zapaleniu układu nerwowego indukowanym przez limfocyty B, bez konieczności posiadania specjalistycznej infrastruktury do oczyszczania białek.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia otrzymanie oczyszczonego białka MOGtag lub MOG1-125, odpowiedniego do zastosowania w testach immunoologicznych w celu wykrywania odpowiedzi przeciwciał anty-MOG w próbkach przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne wydajności (>200 mg na cykl) białka kompatybilnego z endotoksynami, co umożliwia skalowalny rozwój testów i kwalifikację odczynników.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla przebiegu choroby poprzez indukowanie EAE za pomocą natywnego MOG, co pozwala uchwycić zależne od limfocytów B mechanizmy patogeniczne istotne dla patologii SM u ludzi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki powtarzalnemu, niezależnemu od konkretnego sprzętu procesowi produkcji, który można dostosować do różnych szczepów myszy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do fazy przedklinicznej, zapewniając niezawodne źródło antygenów do generowania modeli opartych na hipotezach, standaryzacji odczytów testowych oraz podejmowania decyzji o dalszym rozwoju programów badawczych w chorobach autoimmunologicznych z uwzględnieniem ryzyka.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga walidację celu, umożliwiając funkcjonalną ocenę odpowiedzi limfocytów B i T swoistych dla MOG in vivo.
- Przesiewanie: Pozwala na wytwarzanie standaryzowanych partii antygenu w celu powtarzalnego przesiewania związków immunomodulujących w modelach EAE.
- Analityka: Dostarcza mierzalną, czystą białkową formę produktu, odpowiednią do testów ELISA, cytometrii przepływowej oraz innych odczytów immunoanalitycznych służących do pomiaru swoistych odpowiedzi immunologicznych na antygen.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez produkcję antygenu odzwierciedlającego natywny cel rozpoznawany w klinicznych terapiach deplecji limfocytów B w stwardnieniu rozsianym (MS).
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalną platformę produkcji antygenu MOG, która może być współdzielona przez zespoły zajmujące się immunologią i neuronauką bez zależności od specjalistycznych placówek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez umożliwienie badania mechanizmów autoimmunologicznych obejmujących rozpoznawanie natywnych antygenów, co redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji i powtarzalności dzięki dobrze zdefiniowanemu, skalowalnemu procesowi oczyszczania z wykorzystaniem dostępnych odczynników i sprzętu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wczesne ograniczanie ryzyka związanego z mechanizmami angażującymi limfocyty B w procesie rozwoju, co potencjalnie zmniejsza odsetek niepowodzeń na późnych etapach programów neuroimmunologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapeutyków skierowanych przeciwko MOG z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o modele odzwierciedlające istotną dla ludzi prezentację antygenu i angażowanie limfocytów B.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu biologii molekularnej, bakteryjnej ekspresji białek oraz chromatografii powinowactwa do niklu.
- Metoda opiera się na standardowym wyposażeniu laboratoryjnym, w tym inkubatorach, wirówkach, sonikatorach i zestawach do dializy; nie są wymagane specjalistyczne systemy oczyszczania białek.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja ilościowego oznaczania białka, testów na obecność endotoksyn oraz warunków przechowywania w celu zapewnienia powtarzalności wyników w różnych ośrodkach.
- Proces obejmuje pracę z chlorkiem guanidyny oraz sześcio wodnikiem siarczanu niklu(II), co wymaga stosowania odpowiednich protokołów bezpieczeństwa chemicznego i procedur utylizacji odpadów.
- Adaptacja do alternatywnych systemów ekspresji może wymagać optymalizacji warunków indukcji oraz kompatybilności buforów, przy jednoczesnym zachowaniu projektu znacznika z miejscem cięcia TEV.
