Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze
2 grudnia 2016
Społeczny ameba Dictyostelium discoideum został niedawno założony jako system do badania nieprawidłowego fałdowania białek i proteostazy. W tym miejscu opisujemy nową metodologię opartą na obrazowaniu do badania agregacji białek wywołanej temperaturą i odpowiedzi na stres komórkowy u D. discoideum.
Ogólnym celem tej techniki obrazowania jest obserwacja zaburzeń komórkowych wywołanych stresem cieplnym w komórkach Dictyostelium discoideum. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu mechanizmów reakcji na stres cieplny i kontroli jakości białek w amebie Dictyostelium discoideum. Główną zaletą tej techniki jest ścisła i precyzyjna kontrola temperatury stosowanej do obrazowania plików komórek.
Aby rozpocząć procedurę, przygotuj komórki Dictyostelium zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dzień przed obrazowaniem podziel komórki na podłoże o niskiej fluorescencji do 10 000 komórek na mililitr. Przed obrazowaniem należy pobrać komórki z płytki tkankowej w LFM, a następnie przenieść odpowiednią liczbę komórek do naczyń ze szklanym dnem.
Pozwól komórkom osiąść przez 20 minut, a następnie ostrożnie zastąp zużyte podłoże świeżym podłożem, aby usunąć nieosadzone komórki. Komórki obrazowe w warunkach nieobciążonych w temperaturze 23 stopni Celsjusza uzyskują co najmniej sześć pól widzenia. Uzyskaj stosy Z o maksymalnej długości siedmiu mikrometrów w krokach od jednego do 0,25 mikrometra, aby uchwycić całą objętość komórki.
Następnie uzyskaj referencyjny obraz w jasnym polu, aby ocenić całkowitą liczbę komórek. Następnie dostosuj temperaturę komory chłodzącej do 30 stopni Celsjusza. Gdy wyświetlacz temperatury osiągnie żądaną wartość, ponownie ustaw ostrość ręcznie w kanale jasnego pola.
Sprawdź wszystkie zarejestrowane pola widzenia przed rozpoczęciem filmu poklatkowego, a następnie rozpocznij film poklatkowy przez cztery godziny stresu cieplnego w odstępie czasu od pięciu do 10 minut między punktami czasowymi. Sprawdź, czy ostrość jest prawidłowa podczas uzyskiwania pierwszych dwóch punktów czasowych. Po zakończeniu stresu cieplnego zmniejsz temperaturę z powrotem do 23 stopni Celsjusza.
Poczekaj, aż wyświetlacz temperatury dostosuje się i ręcznie ponownie ustawi ostrość. Następnie nagrywaj filmy poklatkowe w fazie odzyskiwania przez osiem do 10 godzin w odstępach od 10 do 20 minut. Sprawdź, czy ostrość jest prawidłowa podczas uzyskiwania pierwszego punktu czasowego.
Zacznij od otwarcia pakietu do przetwarzania obrazu wyposażonego we wtyczkę Cell Counter. Załaduj stos obrazów z jasnym polem, klikając Plik, a następnie Otwórz. Następnie otwórz wtyczkę Cell Counter, załaduj stos obrazów, klikając Inicjuj.
Wybierz typ liczników, klikając odpowiednie pole. Następnie policz całkowitą liczbę komórek, zapisz znaczniki, klikając Zapisz znaczniki. Po zapisaniu znaczników załaduj maksymalną projekcję hiperstosu obrazu fluorescencji.
Otwórz wtyczkę Cell Counter i załaduj znaczniki, klikając Załaduj znaczniki. Następnie wybierz typ markera dla ognisk cytozolowych i policz komórki. Istniejące znaczniki mogą być wykorzystane jako wskazówki dotyczące położenia poszczególnych komórek.
Pobierz liczbę zliczeń na wycinek, klikając Wyniki, a następnie zapisz liczby w innym miejscu w celu dalszych obliczeń. W tym badaniu zaobserwowano dystrybucję białka poliglutaminy Q103 znakowanego GFP w komórkach Dictyostelium. W normalnych warunkach wzrostu Q103-GFP jest rozprowadzany dyfuzyjnie w cytoplazmie.
Podczas stresu cieplnego marker Q103-GFP łączy się, aby napunktować struktury. Po uwolnieniu stresu i wzroście w normalnych warunkach wzrostu, struktury te rozpuszczają się. Redystrybucję Q103-GFP i powstawanie ognisk cytozolowych wywołanych stresem cieplnym określa się ilościowo za pomocą analizy obrazu.
Reprezentatywne wyniki reakcji na stres cieplny można zobaczyć tutaj. Liczba komórek z cytozolowymi ogniskami Q103-GFP wzrasta wraz z utrzymującym się stresem cieplnym. Podczas stresu cieplnego system kontroli jakości białek jest przeciążony, przez co białka podatne na agregację nie mogą być utrzymywane w stanie rozpuszczalnym.
Po stresie cieplnym liczba komórek z ogniskami cytozolowymi zmniejsza się, co sugeruje, że zagregowane białka rozpuszczają się. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak monitorować perturbacje wywołane stresem cieplnym w amebie Dictyostelium discoideum. Podczas obrazowania należy pamiętać o prawidłowym ustawieniu ostrości, jeśli mikroskop nie jest wyposażony w sprzętowy autofokus.
Kontrola temperatury pokazana w tym protokole może być stosowana poza polem reakcji na stres cieplny. Obrazowanie w normalnych warunkach wzrostu z wykorzystaniem kontroli temperatury może znacznie zmniejszyć efekty fototoksyczne.
Przegląd
To badanie przedstawia nową metodę obrazowania do badania agregacji białek indukowanej temperaturą i reakcji stresu komórkowego w amebie społecznej Dictyostelium discoideum. Technika ta pozwala na precyzyjne sterowanie temperaturą, umożliwiając badaczom obserwowanie efektów stresu cieplnego na kontrolę jakości białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Agregacja białek
Tło
- Dictyostelium discoideum służy jako organizm modelowy do badania reakcji komórkowych na stres.
- Rozumienie błędnego fałdowania białek jest kluczowe dla wnikliwej analizy różnych chorób.
- Stres cieplny może prowadzić do agregacji białek, wpływając na funkcję komórkową.
- Techniki obrazowania są niezbędne do obserwacji procesów komórkowych w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Opracowanie metody obserwacji zaburzeń komórkowych indukowanych stresem cieplnym.
- Wyjaśnienie mechanizmów odpowiedzi na stres cieplny w D. discoideum.
- Ocena skuteczności kontroli jakości białek w warunkach stresu.
Zastosowane metody
- Przygotowanie komórek Dictyostelium w medium o niskiej fluorescencji.
- Obrazowanie w kontrolowanych temperaturach (23°C i 30°C).
- Obrazowanie time-lapse w celu monitorowania reakcji komórkowych przez kilka godzin.
- Analiza obrazów w celu ilościowej oceny agregacji i odzyskiwania białek.
Główne wyniki
- Białko Q103-GFP wykazywało rozproszoną dystrybucję w normalnych warunkach.
- Podczas stresu cieplnego Q103-GFP tworzyło kropkowe struktury wskazujące na agregację.
- Po zakończeniu stresu liczba komórek z agregatami zmniejszała się, sugerując odzyskiwanie.
- Metoda ta z powodzeniem wykazała dynamikę agregacji i rozpuszczania białek.
Wnioski
- Technika obrazowania zapewnia wgląd w reakcje komórkowe na stres.
- Kontrola temperatury jest kluczowa dla dokładnego obserwowania dynamiki białek.
- Ta metoda może być zastosowana w innych obszarach badań nad stresem komórkowym.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Temperature-controlled live cell imaging in Dictyostelium discoideum enables precise interrogation of protein quality control mechanisms under stress, supporting early-stage target validation for protein aggregation pathways. This approach enhances predictive confidence in mechanistic studies relevant to neurodegeneration and proteostasis. The method's ability to reduce phototoxicity and quantify dynamic protein aggregation provides actionable insights for portfolio triage in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein aggregation dynamics in a live, stress-responsive model.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cellular responses to heat-induced proteotoxic stress.
- Facilitates functional validation of protein quality control targets relevant to aggregation disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a validated imaging protocol for quantifying protein aggregation and dissolution events.
- Reduces phototoxicity, allowing higher imaging intensities for low-expression proteins.
- Supports reproducible, quantitative readouts suitable for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms of protein misfolding and aggregation.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for aggregation-targeted therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation of protein aggregation targets.
- Discovery Biology: Quantifies heat stress-induced protein aggregation, clarifying proteostasis pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation metrics for assay development.
- Analytics: Provides cell-level counts of aggregation events and recovery dynamics.
- Translational Research: Models disease-relevant stress responses for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse protein quality control studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation for protein aggregation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, mechanistic data on proteostasis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of aggregation-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging and quantitative image analysis.
- Demands temperature-controlled microscopy and compatible analytical software.
- Necessitates cross-team standardization for imaging parameters and data interpretation.
- Adaptable to other aggregation-prone protein models with protocol optimization.
- High cell motility and phototoxicity sensitivity require careful experimental design.
