Name: Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Poznaj metodę obrazowania komórek Dictyostelium discoideum w kontrolowanej temperaturze do badania agregacji białek i odpowiedzi na stres cieplny. Technika umożliwia precyzyjną obserwację dynamiki białek Q103-GFP w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Rosnące komórki
	<ol>
		<li>Hodować komórki D. discoideum w pożywce AX w temperaturze 23 °C pod światłem na płytkach do hodowli tkankowych. Unikaj utrzymywania komórek w dużej gęstości powyżej 75% konfluencji. 
		UWAGA: Aby uzyskać optymalną reakcję na stres cieplny, komórki muszą znajdować się w fazie wzrostu wykładniczego i nie powinny osiągnąć fazy stacjonarnej.</li>
		<li>Dzień przed obrazowaniem podziel komórki na pożywkę o niskiej fluorescencji (LFM) na 1 x 104 komórek/ml. 
		UWAGA: Ten krok jest konieczny do zmniejszenia fluorescencji tła spowodowanej przez medium AX. Czas inkubacji można skrócić do minimum 2 godzin. Jednak pęcherzyki wchłonięte przez pożywkę AX mogą nadal generować pewien sygnał tła po 2 godzinach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek do mikroskopii
	<ol>
		<li>Przed obrazowaniem należy pobrać komórki z płytki tkankowej w LFM i przenieść odpowiednią liczbę komórek do naczyń ze szklanym dnem. 
		UWAGA: Zwykle wystarczy 1 x 105 komórek/ml; jednakże, jeśli konfiguracja eksperymentalna wymaga długich okresów obrazowania (dłuższych niż 8 godzin), liczba komórek musi być starannie dostosowana, ponieważ komórki D. discoideum przejdą do cyklu rozwojowego i zaczną przepływać i agregować, jeśli liczba komórek jest wysoka, podczas gdy składniki odżywcze są niskie.</li>
		<li>Pozwól komórkom osiąść przez 20 minut. Usuń nieosadzone komórki, ostrożnie zastępując zużyte podłoże świeżym podłożem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie
UWAGA: Protokół może być używany w systemach o szerokim polu widzenia, jak również w konfokalnych ustawieniach mikroskopii. Użycie komory inkubacyjnej z kontrolowaną temperaturą, obejmującej obiektywy i stolik mikroskopu, jest pomocne, ale nie jest niezbędne do kontroli temperatury. Temperaturę w komorze inkubacyjnej ustawia się na najwyższą temperaturę zastosowaną w doświadczeniu, np. na 40 °C, jeżeli występuje stres cieplny. W przeciwnym razie temperaturę ustawia się na 25 °C. Zmiany temperatury należy dokonywać z wyprzedzeniem, aby system mógł się dostosować, ponieważ zmiany temperatury podczas obrazowania mogą wpływać na ostrość. 
UWAGA: Podczas obrazowania temperatura jest kontrolowana za pomocą komory chłodzącej. Domyślna temperatura do obrazowania komórek nieobciążonych wynosi 23 °C. W warunkach stresu cieplnego temperatura jest odpowiednio zwiększana do pożądanego poziomu. Element piezoelektryczny w komorze chłodzenia może bardzo szybko reagować na zmianę temperatury. Jednak ostrość obrazów zmieni się nieznacznie (może odchylić się do 20 μm w zależności od zmiany temperatury). W związku z tym konieczne jest ręczne ponowne ustawianie ostrości w ciągu pierwszych minut od uzyskania obrazu, chyba że używany mikroskop jest wyposażony w sprzętowy autofokus.
<ol>
	<li>Akwizycja obrazu w warunkach bezstresowych
	<ol>
		<li>Komórki obrazowe w warunkach bezstresowych w temperaturze 23 °C uzyskują co najmniej 6 pól widzenia (FOV). 
		UWAGA: Stan bezstresowy można zwizualizować, nagrywając krótki film poklatkowy (5-30 min) lub rejestrując reprezentatywne zdjęcia. Dla każdego warunku lub linii komórkowej uzyskaj co najmniej 6 pól widzenia (FOV). 
		UWAGA: W przypadku, gdy interesujące są pojedyncze komórki, umieść odpowiednie komórki w środku pola widzenia i nagraj serię kafelków 3 x 3 z polem widzenia zawierającym interesujące komórki pośrodku. Komórki D. discoideum są ruchliwe i mogą migrować poza pole widzenia. Jednak seria kafelków 3 x 3 zwiększa obszar potencjalnie eksplorowany przez komórkę zainteresowania i pozostaje on możliwy do prześledzenia przez okresy poklatkowe ~6 godzin.</li>
		<li>Uzyskaj stosy z o maksymalnej wielkości 7 μm w krokach co 1-0,25 μm, aby uchwycić całą objętość komórki.</li>
		<li>Uzyskaj referencyjny obraz w jasnym polu, aby ocenić całkowitą liczbę komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu pod kątem stresu cieplnego
	<ol>
		<li>Ustaw temperaturę komory chłodzącej na 30 °C zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Gdy wyświetlacz temperatury osiągnie żądaną wartość, ponownie ustaw ostrość ręcznie w jasnym kanale pola i sprawdź wszystkie zarejestrowane pola widzenia przed rozpoczęciem filmu poklatkowego.</li>
		<li>Rozpocznij film poklatkowy przez 4 godziny stresu cieplnego w odstępie 5-10 minut między punktami czasowymi. Sprawdź, czy ustawienie ostrości jest prawidłowe podczas uzyskiwania pierwszych dwóch punktów czasowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu podczas odzyskiwania
	<ol>
		<li>Po stresie cieplnym zmniejsz temperaturę z powrotem do 23 °C, poczekaj, aż wyświetlacz temperatury dostosuje się i ręcznie ponownie ustaw ostrość.</li>
		<li>Nagrywaj filmy poklatkowe w fazie odzyskiwania przez 8-10 godzin w odstępach 10-20 minut. Sprawdź, czy ustawienie ostrości jest prawidłowe podczas uzyskiwania pierwszego punktu czasowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza obrazu
UWAGA: Aby określić ilościowo liczbę komórek zawierających ogniska cytozolowe, oceń całkowitą liczbę komórek i liczbę komórek z ogniskami cytozolowymi w każdym przedziale czasowym. Ze względu na trudność w segmentacji komórek na podstawie obrazów w jasnym polu, kwantyfikacja musi być wykonana ręcznie. Poniżej opisano analizę danych dla bezpłatnego pakietu do przetwarzania obrazu ((http://fiji.sc/Fiji). Wymaga wtyczki "Cell Counter" (http://fiji.sc/Cell_Counter).
<ol>
	<li>Ocena całkowitej liczby komórek
	<ol>
		<li>Załaduj stos obrazów jasnego pola (XYT), klikając "Plik" i "Otwórz".</li>
		<li>Otwórz wtyczkę "Licznik komórek" ("Wtyczki" -"Licznik komórek"). Załaduj stos obrazów, klikając "Zainicjuj".</li>
		<li>Wybierz odpowiedni typ liczników, zaznaczając odpowiednie pole. 
		UWAGA: użyj typu 1 jako licznika całkowitej liczby komórek i typu 2 jako licznika dla komórek z ogniskami cytozolowymi. Policz wszystkie komórki.</li>
		<li>Zapisz znaczniki, klikając "Zapisz znaczniki".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena liczby komórek z ogniskami cytozolowymi
	<ol>
		<li>Załaduj hiperstos obrazu fluorescencyjnego (XZYT) ("Plik" - "Otwórz") i wykonaj projekcję o maksymalnej intensywności za pomocą "Projektora Z" (Obraz/Stosy).</li>
		<li>Otwórz wtyczkę "Licznik komórek". Załaduj wynikowy stos obrazów (XYT), klikając "Zainicjuj".</li>
		<li>Załaduj znaczniki, klikając "Załaduj znaczniki". 
		UWAGA: Nazwy plików obrazu referencyjnego i stosu fluorescencji muszą być identyczne. W razie potrzeby zmień odpowiednio nazwę przed zainicjowaniem stosu obrazów.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni typ markera (patrz 3.1.3) i policz komórki z ogniskami cytozolowymi. Istniejące znaczniki mogą być wykorzystane jako wskazówki dotyczące położenia poszczególnych komórek.</li>
		<li>Pobierz liczbę zliczeń na wycinek, klikając "Wyniki" i zapisz liczby w innym miejscu do dalszych obliczeń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).</li>
<li>Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+a+model+organism%3A+progress+with+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).</li>
<li>Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+finds+new+roles+to+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium finds new roles to model.</a> Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).</li>
<li>Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+system+-+substantial+share%3A+The+use+of+Dictyostelium+in+cell+biology+and+molecular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine.</a> European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).</li>
<li>Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum+has+a+highly+Q%2FN-rich+proteome+and+shows+an+unusual+resilience+to+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).</li>
<li>Malinovska, L., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+in+Dictyostelium%3A+Using+a+freak+of+nature+to+gain+insight+into+a+universal+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem.</a> Prion. 9 (5), 339-346 (2015).</li>
<li>Schneider, K., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+protein+quality+control+catastrophes+-+from+cells+to+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms.</a> Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).</li>
<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+spinning+disk+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Techniques%22%5BJournal%5D)">Live cell spinning disk microscopy.</a> Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).</li>
<li>Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell-Imaging+Techniques+for+Analyses+of+Microtubules+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium.</a> Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).</li>
<li>Herman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in yeast.</a> Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).</li>
<li>Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+response+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heat shock response of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 79 (2), 399-408 (1980).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do badania zachowania określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania w odpowiedzi na stres wywołany ciepłem. Doniesiono, że wzrost temperatury do 30 °C wywołuje reakcję na stres cieplny i w tych warunkach żywotność D. discoideum jest znacznie zmniejszona.
Modyfikacje Protokół można modyfikować w celu porównania zachowania różnych białek w tych samych warunkach stresu. W tym celu komórki wyrażające różne białka o tym samym znaczniku fluorescencyjnym są przenoszone do szalek wielodołkowych, takich jak szalki czterokomorowe (sekcja 1.3.1). Protokół może być również stosowany w komórkach wykazujących współekspresję białek z różnymi markerami, takimi jak GFP lub RFP. Można to wykorzystać na przykład do monitorowania zachowania różnych elementów systemu kontroli jakości białek (PQC). Komórki wykazujące ekspresję markera agregacji znakowanego GFP i różnych składników PCQ oznaczonych RFP można obserwować za pomocą wielodołkowego wypukłości do obrazowania. Zapewnia to te same warunki naprężeń (szybkość wzrostu/spadku temperatury, czas trwania wzrostu/spadku temperatury) i pozwala na badania porównawcze.
Co więcej, protokół może być wykorzystany do badania wpływu systemu PQC na reakcję na stres cieplny. Aktywność składników może być modulowana poprzez zmianę poziomów ekspresji za pomocą narzędzi genetycznych, takich jak nokaut lub nadekspresja, lub poprzez stosowanie dostępnych na rynku specyficznych inhibitorów6. Proteasom można zahamować, dodając MG132 (100 μM) lub laktakystynę (10 μM) do pożywki wzrostowej. Białka opiekuńcze Hsp90 można hamować za pomocą geldanamycyny (6 μM) lub radicykolu (10 μM). Białko opiekuńcze Hsp70 można hamować za pomocą VER-155088, chociaż do tej pory nie udało nam się potwierdzić skuteczności hamowania w naszych warunkach eksperymentalnych. Inhibitory należy dodać dzień przed obrazowaniem, a komórki inkubować przez 14 godzin.
Kluczowe kroki w ramach protokołu Krytycznym etapem oceny perturbacji wywołanej ciepłem jest stan komórek przed eksperymentem obrazowania. Badania na drożdżach wykazały, że komórki nabywają odporność na różne stresy środowiskowe podczas stacjonarnej fazy13. Zaobserwowaliśmy również minimalną reakcję na zastosowany stres cieplny, jeśli komórki D. discoideum osiągnęły fazę stacjonarną przed obrazowaniem. Dlatego utrzymanie stałej liczby komórek <5 x 105 komórek/ml ma kluczowe znaczenie.
Co więcej, wysoka liczba komórek może indukować przejście z cyklu wegetatywnego D. discoideum do cyklu rozwojowego, uruchamiając w ten sposób szlaki głodu, które mogą prowadzić do innej reakcji na stres cieplny. Jeśli w fazie regeneracji po stresie cieplnym zostanie osiągnięta wysoka liczba komórek, strumieniowanie i agregacja komórek może zakłócać analizę danych, gdy komórki przestają być ostre (patrz rysunek 4).
Ograniczenie techniki Utrata koncentracji jest wąskim gardłem protokołu. Podczas zmian temperatury płaszczyzna ogniskowej może się drastycznie przesunąć, co wymaga ręcznego ponownego ustawiania ostrości w okresie bezpośrednio po zmianie temperatury. Skok ostrości może być czasami zbyt ekstremalny, aby można go było zniwelować za pomocą programowego autofokusa, zwłaszcza jeśli czas między punktami czasowymi jest duży. Jeśli jednak używany mikroskop jest wyposażony w sprzętowy autofokus, to wąskie gardło można obejść.
Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących metod W porównaniu z istniejącymi konfiguracjami, takimi jak korzystanie z klimatyzowanych pomieszczeń, kabiny inkubacyjne z kontrolowaną temperaturą zakrywające obiektywy i stolik mikroskopu lub stoliki z kontrolowaną temperaturą i kołnierze obiektywów, zastosowanie komory chłodzącej zapewnia bardziej precyzyjną kontrolę temperatury otoczenia. Element Peltiera w komorze chłodzącej może utrzymywać stałą i jednolitą temperaturę przez cały czas trwania eksperymentu. W klasycznych konfiguracjach lokalne różnice temperatur mogą prowadzić do różnych wyników obserwacji. Co więcej, może szybko i szybko reagować na indukowane zmiany temperatury, podczas gdy klasyczne konfiguracje bardzo wolno dostosowują się do indukowanych zmian temperatury, zwłaszcza obniżając temperaturę. Element Peltiera w komorze chłodzenia może również pokrywać szerszy zakres temperatur (15-40 °C) niż klasyczne konfiguracje, w których osiągnięcie temperatur takich jak 15 °C lub 40 °C jest bardzo trudne.
Dictyostelium discoideum jest szczególnie wrażliwe na fototoksyczność. W poprzednich badaniach stosowano askorbinian jako środek zmiatający w celu zmniejszenia fototoksyczności. Jednak długie okresy obrazowania wymagają dodatkowej suplementacji. Co więcej, stosowanie askorbinianu jest ograniczone do badań, w których suplement przeciwutleniający nie ma wpływu na mechanizm będący przedmiotem zainteresowania. Proponujemy, aby obrazowanie w kontrolowanej temperaturze mogło być stosowane jako alternatywne podejście w celu zminimalizowania fototoksyczności i może być połączone z dodatkiem askorbinianu w celu dalszego zmniejszenia toksyczności.
Skutki fototoksyczne można zminimalizować, zapewniając stałą i jednolitą temperaturę 23 °C za pomocą komory chłodzącej. Komórki zobrazowane za pomocą kontroli temperatury wykazują mniej oznak fototoksyczności, takich jak zaokrąglanie komórek, przez dłuższy czas. Umożliwia to również obrazowanie z większą intensywnością, krótszymi odstępami czasu lub większą liczbą pól widzenia (FOV).
Ogólne zastosowanie Wykazano, że stres cieplny w wyższych temperaturach wyzwala inną reakcję na stres cieplny14. W związku z tym zwiększenie temperatury do 34 °C lub 37 °C może wywołać inną reakcję. Oprócz zastosowanego stresu temperaturowego, czas trwania określonej sytuacji stresowej może być modyfikowany w celu zbadania natychmiastowej reakcji lub długoterminowej adaptacji do stresu cieplnego.
Ogólnie rzecz biorąc, opisany protokół można rozszerzyć na szeroki zestaw zastosowań. Ponieważ precyzyjna kontrola temperatury znacznie zmniejsza efekty fototoksyczne, protokół może być stosowany w warunkach, które wymagają długich czasów ekspozycji i/lub większego natężenia światła wzbudzającego, np. do wizualizacji białek o niskim poziomie ekspresji lub w połączeniu z krótkimi odstępami czasu między obrazowaniem, np. podczas obrazowania poklatkowego. Może to być również korzystne w przypadku obrazowania obiektów obejmujących całą komórkę, np. mikrotubul, ponieważ te ustawienia wymagają dużej liczby optycznych przekrojów z.

Dictyostelium discoideum to samotne ameby żyjące w glebie, które żywią się bakteriami i innymi mikroorganizmami, które są pobierane przez fagocytozę. Ma unikalny i niezwykły cykl życia, który jest głównym obszarem badań od czasu jego odkrycia1. Wczesne zainteresowanie rozwojem wielokomórkowym2 i molekularnymi podstawami chemotaksji3 zostało wkrótce uzupełnione badaniami skupiającymi się na ruchliwości komórek, polarności komórek i odporności wrodzonej. Ponadto wprowadzono D. discoideum jako system modelowy dla badań biomedycznych4,5.
Niedawno założyliśmy D. discoideum jako nowy system do badania systemu kontroli jakości białek (PQC)6,7. Jego proteom jest wzbogacony w podatne na agregację białka podobne do prionów, co stanowi wyzwanie dla kontroli jakości białek8. Aby zbadać, czy D. discoideum rozwinęła specjalne mechanizmy molekularne do kontrolowania swojego wysoce podatnego na agregację proteomu, zbadaliśmy zachowanie podatnych na agregację białek markerowych zarówno w normalnych warunkach wzrostu, jak i podczas stresu. Warunki stresowe, takie jak stres cieplny, mogą być wykorzystane do zwiększenia tempa nieprawidłowego fałdowania białek9. W związku z tym poszukiwaliśmy systemu, w którym moglibyśmy indukować zmiany temperatury i jednocześnie śledzić zachowanie białek markerowych. W tym celu połączyliśmy obrazowanie żywych komórek z ogrzewaniem sterowanym przez Peltiera za pomocą wkładki termicznej (komory chłodzącej). Metoda ta pozwoliła nam utrzymać stałą i jednolitą temperaturę, a także wywołać szybką, ale precyzyjną zmianę temperatury.
Obrazowanie żywych komórek służy do badania różnych procesów biologicznych w D. discoideum. Podejście to napotyka jednak na dwa zasadnicze ograniczenia. Po pierwsze, komórki wykazują dużą ruchliwość i mają tendencję do migracji poza pole widzenia, dlatego śledzenie pojedynczych komórek często wymaga obrazowania dużego obszaru. Ruchomość komórek można zmniejszyć za pomocą nakładki agarowej10, jednak warunki te nie są odpowiednie do długotrwałego obrazowania ze względu na spadek żywotności. Po drugie, komórki D. discoideum wykazują szczególnie wysoką wrażliwość na fototoksyczność, co skutkuje zaokrągleniem komórek i zatrzymaniem mitozy11. Poprzednie protokoły rozwiązywały ten problem poprzez dodanie askorbinianu jako wymiatacza rodników i skrócenie czasu ekspozycji12. To ostatnie może być krytyczne, jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji na niskich poziomach i wykazuje słaby sygnał fluorescencyjny. Autorzy sugerują również zapewnienie stałej temperatury 21 °C poprzez obrazowanie w klimatyzowanym pomieszczeniu lub za pomocą komór inkubacyjnych o kontrolowanej temperaturze, które obejmują obiektyw i mikroskop stage12.
Tutaj opisujemy metodę z ulepszoną kontrolą temperatury za pomocą komory chłodzącej ustawionej na 23 °C. Podczas obrazowania nasz zestaw znacznie zwiększa odporność na fototoksyczność. Pozwala to na zastosowanie dłuższych czasów naświetlania i wyższych natężeń światła wzbudzenia. Ma to szczególne znaczenie w przypadku zdjęć poklatkowych, ponieważ odstępy czasowe muszą być starannie zbalansowane w stosunku do liczby obrazowanych pozycji i zastosowanego czasu naświetlania. Możliwość zwiększenia liczby obrazowanych pozycji pozwala również na pokrycie szerszego obszaru obrazowania i ułatwia śledzenie poszczególnych komórek w dłuższym okresie czasu.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Naczynie do obrazowania ze szklanym dnem</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych CellViell</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-komorowa miska do obrazowania ze szklanym dnem</td></tr><tr><td>Termiczna nagrzewnica / chłodnica sceniczna Wkładka</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolarny regulator temperatury</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>System chłodzenia cieczą</td><td>Warner Instrumenty</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie systemu kontroli jakości białek d. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Złożony styl życia ameba społecznego Dictyostelium discoideum czyni go cennym modelem do badania różnych procesów biologicznych. Niedawno wykazaliśmy, że D. discoideum jest niezwykle odporny na agregację białek i może być wykorzystany do uzyskania wglądu w system kontroli jakości białek komórkowych. Jednak wykorzystanie D. discoideum jako systemu modelowego stwarza kilka wyzwań dla podejść eksperymentalnych opartych na mikroskopii, takich jak wysoka ruchliwość komórek i ich podatność na fototoksyczność. To ostatnie okazuje się szczególnie trudne podczas badania homeostazy białek, ponieważ efekty fototoksyczne mogą indukować komórkową reakcję na stres, a tym samym wpływać na zachowanie systemu kontroli jakości białek. 
Wzrost temperatury jest powszechnie stosowanym sposobem wywoływania stresu komórkowego. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania z kontrolowaną temperaturą, który pozwala na obserwację zaburzeń wywołanych temperaturą w D. discoideum. Co więcej, po zastosowaniu w normalnej temperaturze wzrostu, ten protokół obrazowania może również zauważalnie zmniejszyć fototoksyczność, umożliwiając w ten sposób obrazowanie z większą intensywnością. Może to być szczególnie przydatne podczas obrazowania białek o bardzo niskim poziomie ekspresji. Co więcej, wysoka ruchliwość komórek często wymaga nabycia wielu pól widzenia, aby podążać za poszczególnymi komórkami, a liczba pól musi być zrównoważona z pożądanym przedziałem czasowym i czasem ekspozycji.

Opisany protokół obrazowania może być wykorzystany do analizy zachowania białek prionopodobnych podatnych na agregację w amebie D. discoideum podczas stresu termicznego. Rysunek 1 przedstawia rozkład białka poliglutaminowego Q103 znakowanego GFP w komórkach w normalnych warunkach wzrostu (Rysunek 1A), po 2 godzinach stresu termicznego w 30 °C (Rysunek 1B) oraz po 6 godzinach regeneracji po stresie i wzrostu w normalnych warunkach (Rysunek 1C). Po zwiększeniu temperatury z 23 °C do 30 °C marker Q103-GFP zmienia rozkład z rozproszonego w struktury punktowe. Po ustąpieniu stresu i wzroście w normalnej temperaturze struktury te ulegają rozpuszczeniu. Redystrybucję Q103-GFP oraz tworzenie się indukowanych stresem termicznym ognisk cytozolowych można ilościowo ocenić za pomocą analizy obrazu. Rysunek 2A przedstawia analizę poszczególnych pól widzenia (FOV) przy użyciu programu Fiji i wtyczki „Cell counter”. Rysunek 2B przedstawia analizę ilościową odpowiedzi na stres termiczny. Wykazuje ona, że liczba cytozolowych ognisk Q103-GFP wzrasta wraz z przedłużającym się stresem termicznym. Podczas stresu termicznego system kontroli jakości białek (PQC) zostaje przeciążony, przez co białka podatne na agregację, takie jak prionopodobne białko Q103, nie mogą być utrzymywane w stanie rozpuszczalnym i coraz bardziej agregują w ogniskach cytozolowych. Komórki wykazują również charakterystyczne zaokrąglenie, co przedstawiono na Rysunku 1B. Redukcja ognisk cytozolowych po usunięciu stresu sugeruje, że zagregowane białka uległy rozpuszczeniu.
Jakość obrazowania jest zależna od początkowej gęstości komórek. Rysunek 3 przedstawia przykład komórek po regeneracji po stresie, porównując odpowiednią początkową gęstość komórek (Rysunek 3A) oraz wysoką początkową gęstość komórek (Rysunek 3B). Jeśli początkowa gęstość komórek była zbyt wysoka, komórki zaczęły tworzyć strumienie, jak pokazano na Rysunku 3b. Powoduje to trudności w późniejszej kwantyfikacji, ponieważ komórki przesunęły się poza płaszczyznę ogniskowania.
Opisana metoda może być wykorzystana do monitorowania zmian wywołanych temperaturą, zgodnie z powyższym opisem. Można jej również użyć w celu ograniczenia fototoksyczności podczas obrazowania w fizjologicznej temperaturze wzrostu. Rycina 4 przedstawia porównanie komórek obrazowanych w 23 °C w komorze chłodzącej (Rycina 4A) oraz komórek obrazowanych bez kontroli temperatury w klimatyzowanym pomieszczeniu o temperaturze 25 °C (Rycina 4B). Przy stałej ekspozycji na światło wzbudzenia komórki zaokrąglają się, gdy nie są obrazowane w warunkach kontrolowanej temperatury. Ta zmiana kształtu komórek świadczy o wystąpieniu stresu.
<img alt="Odpowiedź komórkowa na stres; obraz mikroskopowy; warunki przed stresem, w trakcie stresu i po stresie; skala 10 μm." src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Białka prionopodobne wykazujące tendencję do agregacji zmieniają swoją dystrybucję komórkową podczas stresu cieplnego. Konstytutywnie ekspresowany w AX2-214 GFP-tagowany egzon 1 huntingtiny o wysokiej zawartości poliglutaminy (Q103) D. discoideum komórki (sygnał GFP przedstawiony w odwróconej skali szarości). (A) W normalnych warunkach wzrostu przy 23 °C, Q103-GFP jest rozproszony w cytoplazmie. (B) Po 2 godz. stresu cieplnego w temperaturze 30 °C, Q103-GFP łączy się w cytoplazmatyczne ogniska (czerwone strzałki). Komórki wykazują charakterystyczną zmianę kształtu i zaokrąglają się. (C) Po zwolnieniu naprężeń i wzroście w 23 °Cogniska cytozolowe ulegają rozpuszczeniu. Po 6 godzinach nie obserwuje się żadnych ognisk cytozolowych. Pasek skali = 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Proces liczenia komórek wraz z analizą danych dotyczącą ognisk cytozolowych; schemat i wykres w temperaturach 30°C i 23°C." src="/files/ftp_upload/54730/54730fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ilościowe oznaczenie tworzenia się indukowanych ciepłem ognisk cytozolicznych. (AAnaliza komórek z wykorzystaniem bezpłatnego pakietu do przetwarzania obrazów Fiji oraz wtyczki „Cell Counter”. Całkowitą liczbę komórek (typ 1, niebieskie znaczniki licznika) określa się na obrazie w jasnym polu. Następnie ładuje się znaczniki w kanale GFP i określa liczbę komórek z ogniskami cytozolowymi (typ 2, czerwone znaczniki licznika).B) Ilościowe oznaczenie ognisk po 3 godzinach stresu cieplnego w 30 °C oraz 3 godziny regeneracji po stresie w 23 °C (n = 4 pola widzenia, słupek błędu = SD). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe porównujące gęstość komórek w temperaturze 23°C w ciągu 6 godzin, przedstawiające gęstość optymalną w stosunku do wysokiej." src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Wpływ gęstości komórek na długotrwałe obrazowanie time-lapse. (A) Komórki obrazowane przy początkowych gęstościach komórek &lt;105 komórek/ml. Po 3 godzinach stresu cieplnego w temperaturze 30 °C oraz 6 godzin regeneracji po stresie w 23 °Ckomórki nadal pozostają w cyklu wegetatywnym i dzielą się. Tylko nieliczne komórki opuszczają płaszczyznę ogniskowania. (B) Komórki obrazowane przy początkowych gęstościach komórkowych &gt;106 komórek/ml. Po 9 godzinach obrazowania (ustawienia jak w A) komórki weszły w cykl rozwojowy i rozpoczęły proces tworzenia strumieni oraz agregacji. Komórek w agregatach nie można wyraźnie rozróżnić. Znaczna część komórek opuszcza płaszczyznę ogniskowania i nie może zostać poddana analizie. Pasek skali = 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie zachowania komórek z kontrolą temperatury i bez niej w czasie 10 min; obrazy mikroskopowe, skala 10 μm." src="/files/ftp_upload/54730/54730fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wpływ kontroli temperatury na efekty fototoksyczne. (A) komórki obrazowano przez 10 min z kontrolą temperatury przy 23 °C6 pól widzenia, stos z (odstępy 0.5 µM, grubość próbki 8 µM), time-lapse (całkowity czas 10 min, odstęp 1 min), kanał GFP (czas ekspozycji 0,07 ms, intensywność lasera 10%), kanał RFP (czas ekspozycji 0,1 ms, intensywność lasera 10%). Komórki nie wykazują oznak charakterystycznych zmian morfologicznych związanych ze stresem fototoksycznym. (B) Komórki obrazowane przez 10 min bez kontroli temperatury (te same warunki, co w A). Komórki wykazują oznaki zaokrąglenia indukowanego fototoksycznością, co wskazuje na stres. Pasek skali = 10 µmObrazy komórek wykonano w systemie opartym na mikroskopie z obiektywem 10x o aperturze numerycznej (N.A.) 1,4. Obrazy rejestrowano za pomocą kamery CCD w formie plików o rozdzielczości 1024 x 1024 piksele, stosując binning 1 x 1. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Społeczny ameba Dictyostelium discoideum został niedawno założony jako system do badania nieprawidłowego fałdowania białek i proteostazy. W tym miejscu opisujemy nową metodologię opartą na obrazowaniu do badania agregacji białek wywołanej temperaturą i odpowiedzi na stres komórkowy u D. discoideum.

Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Ogólnym celem tej techniki obrazowania jest obserwacja zaburzeń komórkowych indukowanych stresem cieplnym w komórkach Dictyostelium discoideum. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu mechanizmów odpowiedzi na stres cieplny oraz kontroli jakości białek u ameby Dictyostelium discoideum. Główną zaletą tej techniki jest ścisła i precyzyjna kontrola temperatury stosowanej podczas obrazowania komórek.Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować komórki Dictyostelium zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dzień przed obrazowaniem należy przenieść komórki do medium o niskiej fluorescencji (LFM) w zagęszczeniu 10 000 komórek na mililitr. Przed rozpoczęciem obrazowania należy zebrać komórki z płytki tkankowej w medium LFM, a następnie przenieść odpowiednią liczbę komórek do naczyń z szklanym dnem.Pozostawić komórki na 20 minut w celu ich osadzenia, a następnie ostrożnie wymienić zużyte medium na świeże, aby usunąć nieosadzone komórki. Wykonać obrazowanie komórek w warunkach bezstresowych w temperaturze 23 °C, obejmując minimum sześć pól widzenia. Należy zebrać stosy Z-stack o maksymalnej grubości 7 µm w krokach od 1 do 0,25 µm, aby uchwycić całą objętość komórki.Następnie wykonaj referencyjny obraz w jasnym polu, aby ocenić całkowitą liczbę komórek. Następnie dostosuj temperaturę komory chłodzącej do 30 °C. Po osiągnięciu przez wyświetlacz temperatury pożądanej wartości, ponownie ustaw ostrość ręcznie w kanale jasnego pola.Przed rozpoczęciem serii czasowej sprawdź wszystkie zarejestrowane pola widzenia (FOV), a następnie uruchom obrazowanie time-lapse dla czterogodzinnego stresu cieplnego z odstępem czasu od 5 do 10 minut między punktami pomiarowymi. Upewnij się, że ostrość jest prawidłowa podczas akwizycji dwóch pierwszych punktów czasowych. Po zakończeniu stresu cieplnego obniż temperaturę z powrotem do 23 stopni Celsjusza.Należy odczekać, aż wyświetlacz temperatury dostosuje się do warunków, a następnie ponownie ustawić ostrość ręcznie. Następnie należy rejestrować filmy poklatkowe w fazie regeneracji przez od 8 do 10 godzin w odstępach czasowych od 10 do 20 minut. Należy sprawdzić, czy ostrość jest prawidłowa podczas akwizycji pierwszego punktu czasowego.Zacznij od uruchomienia pakietu do przetwarzania obrazów z zainstalowaną wtyczką Cell Counter. Załaduj stos obrazów w jasnym polu, klikając Plik, a następnie Otwórz. Następnie otwórz wtyczkę Cell Counter i załaduj stos obrazów, klikając Initialize.Wybierz typ liczników, klikając w odpowiednie pole. Następnie policz całkowitą liczbę komórek i zapisz znaczniki, klikając Save Markers. Po zapisaniu znaczników wczytaj maksymalną projekcję hiperstosu obrazu fluorescencyjnego.Otwórz wtyczkę Cell Counter i załaduj markery, klikając Load Markers. Następnie wybierz typ markera dla ognisk cytozolowych i policz komórki. Istniejące markery mogą służyć jako wskazówka przy określaniu położenia poszczególnych komórek.Pobierz liczbę zliczeń na przekrój, klikając w zakładkę Results, a następnie zapisz te dane w innym miejscu w celu wykonania dalszych obliczeń. W niniejszym badaniu obserwowano rozkład białka poliglutaminowego Q103 znakowanego GFP w komórkach Dictyostelium. W normalnych warunkach wzrostu Q103-GFP jest rozproszony w cytoplazmie.Podczas stresu termicznego marker Q103-GFP zlega się w struktury punktowe. Po ustąpieniu stresu i wzroście w normalnych warunkach hodowli struktury te rozpuszczają się. Redystrybucję Q103-GFP oraz tworzenie indukowanych stresem termicznym ognisk cytozolowych ilościowo ocenia się za pomocą analizy obrazu.Reprezentatywne wyniki odpowiedzi na stres cieplny przedstawiono tutaj. Liczba komórek z cytozylowymi ogniskami Q103-GFP zwiększa się wraz z trwaniem stresu cieplnego. Podczas stresu cieplnego system kontroli jakości białek zostaje przeciążony, w związku z czym białka podatne na agregację nie mogą być utrzymywane w stanie rozpuszczalnym.Po stresie termicznym liczba komórek z ogniskami cytozolowymi maleje, co sugeruje rozpuszczanie się zagregowanych białek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak monitorować zaburzenia wywołane stresem termicznym u ameby Dictyostelium discoideum. Podczas obrazowania ważne jest, aby pamiętać o prawidłowej regulacji ostrości, jeśli Twój mikroskop nie posiada sprzętowego autofokusa.Kontrola temperatury przedstawiona w niniejszym protokole może być stosowana również poza zakresem odpowiedzi na stres cieplny. Obrazowanie w normalnych warunkach wzrostu z zastosowaniem kontroli temperatury może znacząco zredukować efekty fototoksyczne.

studying-protein-quality-control-system-d-discoideum-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Makowski, Ł., i in. Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życia bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej poklatkowej. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne Bdellovibrio bacteriovorus polującego na unieruchomionej E. coli pod agarozową poduszką, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym replikacji wewnątrzkomórkowej i uwalniania potomstwa do badania drapieżnictwa bakteryjnego i interakcji...

Obrazowanie czasowe z żywymi komórkami drapieżnictwa bakterioworu Bdellovibrio na E. coli

Źródło: Wagner, K.  i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL...

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Ten protokół opisuje metodę określania okresu półtrwania białek w pojedynczych żywych komórkach przylegających, przy użyciu znakowania impulsowego i fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego białek fuzyjnych znaczników SNAP.

Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Poznaj metodę obrazowania komórek Dictyostelium discoideum w kontrolowanej temperaturze do badania agregacji białek i odpowiedzi na stres cieplny. Technika umożliwia precyzyjną obserwację dynamiki białek Q103-GFP w czasie rzeczywistym.

Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze

Przeglądaj więcej filmów