Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej
28 września 2016
Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.
Ogólnym celem tej metody jest ilościowe określenie ekspresji białek błonowych na powierzchni komórki za pomocą fluorescencyjnego testu w odstępach. Główną zaletą tej techniki jest to, że testy cytometrii przepływowej dostarczają wymiernych punktów końcowych na dużych objętościach żywych komórek w jednym eksperymencie. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy i terapii arytmii komorowych serca, ponieważ patologie te są często związane z mutacjami genetycznymi, które powodują defekty w transporcie kanałów jonowych serca.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mają trudności ze znalezieniem odpowiedniego miejsca insercji zewnątrzgrzbietowej dla epitopu, które nie szkodzi funkcji białka i generuje silny sygnał fluorescencyjny w obecności sprzężonego przeciwciała. Tę procedurę zademonstruje Benoite Bourdin, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Na początek podwójnie znakowane DNA konstruuje się z mCherry na wewnątrzkomórkowym C-końcu.
Ekspresja epitopu hemmaglutyniny skierowanego w stronę dodatkowej komórki, który można zmierzyć za pomocą przeciwciała fluorescencyjnego w celu oszacowania ekspresji białek błonowych na powierzchni komórki. Następnie hoduj płytkę komórek TSA201 przy użyciu standardowych technik, aż osiągną 90% konfluencji. Dla każdej próbki należy przygotować odczynniki do transfekcji w dwóch probówkach.
Przygotuj jedną 1,5-mililitrową probówkę z czterema mikrogramami DNA i 250 mikrolitrami zredukowanej pożywki surowicy oraz drugą probówkę z 10 mikrolitrami odczynnika do transfekcji za pośrednictwem liposomów i 250 mikrolitrów zredukowanej pożywki hodowlanej surowicy. Delikatnie wymieszaj dwie probówki i inkubuj je przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie połącz zawartość probówki pierwszej i probówki drugiej i inkubuj kompleksy liposomowego DNA przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Dodaj kompleksy do hodowanych komórek i delikatnie kołysz szalką hodowlaną. Umieść naczynie z powrotem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i w atmosferze 5% dwutlenku węgla na 24 godziny. 24 godziny po dodaniu odczynnika do transfekcji wyjąć pożywkę z naczynia hodowlanego i ostrożnie umyć komórki 400 mikrolitrami wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA.
Następnie dodaj 400 mikrolitrów Trypsyny-EDTA i inkubuj naczynie przez pięć minut, aby komórki odłączyły się od naczynia. Po odłączeniu zatrzymaj trawienie enzymu, dodając do komórek jeden mililitr zimnej pożywki hodowlanej bez penicyliny lub streptomycyny. Delikatnie odpipetuj pożywkę na płytce cztery do pięciu razy, aby zmyć wszystkie komórki z powierzchni.
Następnie zbierz komórki w sterylnych probówkach o pojemności 1,5 mililitra i natychmiast umieść je na lodzie. W kolejnych krokach użyj lodowatego roztworu i utrzymuj komórki w temperaturze czterech stopni, aby zapobiec internalizacji epitopu powierzchniowego. Zmniejsz również ekspozycję komórek na światło, aby ograniczyć fotowybielanie sygnału fluorescencyjnego.
Następnie odwiruj probówki, aby osadzać komórki. Następnie ostrożnie odessać i wyrzucić powstały supernatant. Ponownie zawiesić osad, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową przy użyciu jednego mililitra PBS.
Następnie krótko odwirować probówki. Osadzać i ponownie zawiesić komórki w celu całkowitego usunięcia pożywki hodowlanej. Następnie ponownie zawieś osad komórek w 600 mikrolitrach PBS.
Zmierz stężenie komórek i dostosuj je do co najmniej trzech milionów komórek na mililitr. Następnie podziel komórki na nowe rurki o pojemności 1,5 mililitra. Należy pamiętać o dołączeniu odpowiednich kontrolek, aby odróżnić barwienie specyficzne od barwienia niespecyficznego oraz barwienie pozakomórkowe, a także barwienie wewnątrzkomórkowe.
Przeciwciało kontrolne izotopowe pomoże ocenić poziom zabarwienia tła i powinno być zgodne z przeciwciałem pierwszorzędowym, izotopem pomyślnym i fluoroforem. Ważne jest, aby stosować przeciwciało izotopowe kontrolne i przeciwciało fluorescencyjne w tym samym stężeniu. Aby oszacować ekspresję białek błonowych na powierzchni komórki, najpierw oznacz tylko epitop HA skierowany w stronę innej komórki za pomocą przeciwciała sprzężonego ze światłem fluorescencyjnym.
Następnie dodać do probówki monoklonalne przeciwciało anty-HA sprzężone z FITC w stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr. Krótko zawiruj komórki, a następnie inkubuj je na platformie kołyskowej w ciemności. Usuń komórki z ciemności i dodaj 900 mikrolitrów PBS.
Następnie odwirować probówkę, aby osadzać komórki i odessać supernatant. Następnie umyj komórki, ponownie zawieszając granulkę w jednym mililitrze PBS i krótko wirując komórki. Następnie powtórz krok wirówki, aby ponownie zagnieździć komórki.
Powtórz ten etap płukania w sumie trzy razy, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach PBS i przenieś zawiesinę pojedynczej komórki do pięciomililitrowej rurki cytometrii przepływowej. Utrzymuj komórki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż próbka zostanie uruchomiona.
Aby oszacować wewnątrzkomórkową ekspresję białka całkowitego, należy następnie oznaczyć przepuszczalne komórki. Osiąga się to przy użyciu podobnego protokołu do znakowania zewnątrzkomórkowego, ale z dodatkiem bufora przepuszczalności komórek na bazie saponin. Zwinąć komórki, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach roztworu przepuszczalnego do utrwalania bezpośrednio z przygotowanego wywaru.
Inkubuj komórki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu do płukania przepuszczalności i krótko zawiruj komórki. Następnie opelajuj komórki i umyj je jeszcze dwa razy za pomocą bufora do płukania permeabilizacji.
Następnie dodać sprzężone z FITC monoklonalne przeciwciało anty HA w stężeniu 5 mikrogramów na mililitr i 100 mikrolitrów buforu do przemywania permeabilizacji. Krótko zawiruj komórki i inkubuj komórki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do płukania przepuszczalności.
Osadzać komórki i myć je trzykrotnie w 100 mikrolitrach tego samego buforu, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach PBS i przenieś zawiesinę pojedynczej komórki do pięciomililitrowej rurki cytometrii przepływowej. Tego samego dnia przepuść nieprzepuszczalne i przepuszczalne komórki przez cytometr przepływowy.
Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i zaimportuj pliki fcs utworzone podczas cytometrii przepływowej. Kliknij pierwszą próbkę i rozpocznij proces bramkowania na wykresie rozproszenia bocznego i rozproszenia do przodu. Następnie narysuj bramkę P1 za pomocą ikony elipsy wokół żywych komórek, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczenia, martwe komórki lub agregaty.
Następnie narysuj wykres konturu parametru rurki mCherry w funkcji intensywności fluorescencji FITC. Ustaw bramkę P2 wokół komórek FITC i mCherry dodatnich, a bramkę P3 wokół populacji komórek ujemnych fluorescencyjnie. Następnie wybierz bramki P2 i P3 i kliknij ikonę dodawania statystyk w oryginalnym oknie obszaru roboczego.
Kliknij liczbę, a następnie kliknij średnią. Na koniec zastosuj parametry bramek i statystyki do wszystkich próbek badanych przez cytometr. Protokół ten wykorzystano do scharakteryzowania roli N-glikozylacji w całkowitej i powierzchniowej ekspresji CaV Alpha 2 Delta 1 w komórkach TSA201.
Aby uzyskać dostęp do powierzchni komórki, ekspresję białka HA mierzono na nieprzepuszczalnych komórkach, które miały zakłócone miejsca N-glikozylacji w czterech miejscach, 16 miejscach lub w żadnym miejscu. Poziomy FITC były silne w typie dzikim, a komórki z komórkami N-glikozylacyjnymi zostały zakłócone w czterech lokalizacjach, ale tylko poziomy tła stwierdzono w komórkach z 16 zakłóconymi lokalizacjami. W przypadku komórek przepuszczalnych fluorescencja FITC wzrosła we wszystkich warunkach, co wskazuje, że wszystkie transfekowane, znakowane HA białka CaV Alpha 2 Delta 1 zostały wybarwione i wykryte przez przeciwciało anty HA FITC.
Ponadto poziomy fluorescencji mCherry były podobne dla komórek przepuszczalnych i nieprzepuszczalnych, co oznacza, że przepuszczalność nie zmienia względnego sygnału mCherry. Testy przeprowadzone po przenikaniu komórek wykazały, że całkowita ekspresja białka dla komórek z zakłóconymi 16 lokalizacjami była również znacznie zmniejszona, niezależnie od tego, czy wywnioskowano ją z fluorescencji FITC w komórkach przepuszczalnych, czy z konstytutywnej fluorescencji mCherry mierzonej w komórkach nieprzepuszczalnych i przepuszczalnych. Oprócz tej procedury można wykonać dodatkowe zapisy fizjologiczne w celu skorelowania ekspresji i funkcji kanałów jonowych.
Technika ta toruje również drogę naukowcom z dziedziny medycyny do badania wpływu mutacji genetycznych, modyfikacji potranslacyjnych, mikroRNA, małych GTPaz i roli białek opiekuńczych w transporcie białek błonowych ulegających ekspresji w komórkach rekombinowanych lub natywnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić transfekcję DNA w komórkach rekombinowanych, barwieć NTAC i komórki przepuszczalne, a także przeprowadzać analizę danych na próbkach. Nie zapominaj, że praca z żywymi komórkami wymaga środków ostrożności, takich jak praca w płynie helaminalnym do transfiksacji i noszenie rękawiczek podczas pracy z chemikaliami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę ilościowego określania ekspresji białek błonowych na powierzchni komórki za pomocą badań cytometrii przepływowej. Technika ta ma szczególne znaczenie dla badań nad zaburzeniami rytmu serca związanymi z mutacjami genetycznymi wpływającymi na transport kanałów jonowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Zaburzenia rytmu serca
- Biologia kanałów jonowych
- Techniki cytometrii przepływowej
Tło
- Odziedziczone zaburzenia rytmu serca często wynikają z mutacji w kanałach jonowych.
- Te mutacje mogą zakłócać transport kanałów jonowych na powierzchnię komórki.
- Cytometria przepływowa umożliwia analizę dużych objętości żywych komórek.
- Identyfikowanie odpowiednich miejsc wstawiania dla tagowania epitopu jest kluczowe dla powodzenia eksperymentów.
Cel badania
- Opracowanie metody ilościowego określania ekspresji białek błonowych.
- Ułatwienie diagnozy i terapii zaburzeń rytmu komór serca.
- Poprawa rozumienia defektów transportu kanałów jonowych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie badań cytometrii przepływowej do ilościowego określania.
- Podwójne tagowanie konstrukcji DNA za pomocą mCherry na wewnątrzkomórkowym C-końcu.
- Ocenianie ekspresji białek na powierzchni komórki w komórkach tsA-201.
- Demonstracja procedury przez asystenta badawczego.
Główne wyniki
- Udana ilościowa ocena ekspresji białek całkowitych i na powierzchni komórki.
- Identyfikacja skutecznych miejsc wstawiania epitopu.
- Demonstracja zastosowania metody do analizy żywych komórek.
- Wgląd w związek między mutacjami genetycznymi a funkcją kanałów jonowych.
Wnioski
- Metoda zapewnia niezawodne podejście do badania białek błonowych.
- Ma potencjalne zastosowanie w rozumieniu zaburzeń rytmu serca.
- Przyszłe zastosowania mogą poprawić strategie terapeutyczne dla osób dotkniętych tą chorobą.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of membrane protein expression is critical for de-risking ion channel targets in cardiac arrhythmia drug discovery. This flow cytometry method enables high-throughput, reproducible assessment of total and cell surface expression in live cells, supporting target validation and mechanistic de-risking. It provides quantitative endpoints that improve predictive confidence in early discovery by linking genetic variants to trafficking defects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying relative cell surface versus total expression of recombinant ion channels.
- Operational Value: Supports biological de-risking through objective, flow-based measurement of trafficking efficiency in tsA-201 cells.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying constructs with preserved surface expression despite genetic or posttranslational modifications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts (mCherry for total, HA-FITC for surface) suitable for assay optimization.
- Operational Value: Delivers reproducible, large-volume analysis (10⁴–10⁶ cells) with minimal variability, enabling robust compound or mutant screening.
- Assay Readiness: Establishes a scalable, two-color flow cytometry platform adaptable to ion pumps, transporters, and other multi-spanning transmembrane proteins.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase expression data to functional outcomes by correlating surface levels with electrophysiological recordings.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes trafficking defects from gating alterations, clarifying disease-relevant mechanisms in ion channelopathies.
- Preclinical Model Support: Provides a disease-relevant system for evaluating how mutations affect membrane residency of cardiac L-type calcium channels.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering quantitative expression data that informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the variable of membrane trafficking from channel function through dual-tag quantification.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility, critical for evaluating large libraries of ion channel variants or modulators.
- Analytics: Delivers mean fluorescence intensity and percentage-positive readouts that allow direct comparison of expression conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing expression data that can be linked to functional assays in native or disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable flow cytometry workflow for membrane protein quantification across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing ambiguity between expression and function.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across teams through a defined, antibody-based staining protocol.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of trafficking-defective variants, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying the proportion of expressed protein reaching the cell surface.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to design C-terminally tagged constructs with extracellular epitope insertion.
- Dependent on flow cytometry instrumentation capable of detecting mCherry and FITC fluorescence with appropriate compensation.
- Necessitates standardization of antibody titration and permeabilization protocols across users to ensure consistent surface versus total signal discrimination.
- Involves adaptation considerations when extending to other membrane proteins, particularly regarding epitope accessibility and transfection efficiency.
- Limited by the need to validate that epitope tagging does not disrupt protein folding or function, requiring functional controls.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Liposome Mediated Transient Transfection
2:35
Preparing Cell Samples for Staining
4:51
Extracellular Staining of Cell Samples
6:10
Intracellular Staining of Cell Samples
7:51
Data Analysis
8:55
Results: Simultaneaous Mutations of N-glycosylation Sites Disrupted Cell Surface Expression of CaVα2δ1
10:25
Conclusion
