Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej metody jest ilościowe określenie ekspresji białek błonowych na powierzchni komórek przy użyciu fluorescencyjnego testu przestrzennego. Główną zaletą tej techniki jest to, że analizy cytometryczne dostarczają mierzalnych wyników końcowych dla dużych objętości żywych komórek w ramach jednego eksperymentu. Zastosowania tej techniki obejmują diagnostykę i terapię arytmii komór systemu serca, ponieważ patologie te są często związane z mutacjami genetycznymi powodującymi defekty w transporcie kanałów jonowych serca.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z zidentyfikowaniem odpowiedniego miejsca insercji zewnątrzkomórkowej dla epitopu, które nie upośledzałoby funkcji białka i pozwalało na uzyskanie silnego sygnału fluorescencyjnego w obecności skoniugowanego przeciwciała. Procedurę tę zaprezentuje Benoite Bourdin, asystent badawczy z mojego laboratorium. Aby zacząć, należy dwukrotnie oznakować konstrukty DNA białkiem mCherry na wewnątrzkomórkowym C-końcu.

Ponadto wyekspresuj dodatkowy epitop hemaglutyniny skierowany na zewnątrz komórki, który można zmierzyć za pomocą przeciwciała fluorescencyjnego w celu oszacowania ekspresji białek błonowych na powierzchni komórki. Następnie hoduj płytkę komórek TSA201, stosując standardowe techniki, aż osiągną one 90% konfluencji. Dla każdej próbki przygotuj odczynniki do transfekcji w dwóch probówkach.

Przygotuj jedną probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 4 µg DNA i 250 µl medium z redukowaną zawartością surowicy oraz drugą probówkę z 10 µl odczynnika do transfekcji zapośredniczonej przez liposomy i 250 µl medium hodowlanego z redukowaną zawartością surowicy. Delikatnie wymieszaj zawartość obu probówek i inkubuj je przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie połącz zawartość pierwszej i drugiej probówki i inkubuj kompleksy liposomowo-DNA przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Dodaj kompleksy do hodowanych komórek i delikatnie zakolebiesz szalką hodowlaną. Umieść szalkę z powrotem w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2 na 24 godziny. Po 24 godzinach od dodania odczynnika do transfekcji usuń medium z szalki hodowlanej i ostrożnie przemyj komórki 400 µL uprzednio ogrzanej Trypsyny-EDTA.

Następnie należy dodać 400 µL Trypsyny-EDTA i inkubować szalkę przez pięć minut, aby komórki mogły oddzielić się od powierzchni. Po oddzieleniu komórek należy zatrzymać trawienie enzymatyczne, dodając do nich 1 mL zimnej pożywki hodowlanej bez penicyliny lub streptomycyny. Należy delikatnie pipetować pożywkę po powierzchni płytki od czterech do pięciu razy, aby wypłukać wszystkie komórki z powierzchni.

Następnie zebrać komórki do sterylnych probówek o pojemności 1.5 ml i niezwłocznie umieścić je w lodzie. W kolejnych etapach należy stosować schłodzone do temperatury 0°C roztwory oraz utrzymywać komórki w temperaturze 4°C, aby zapobiec internalizacji epitopu powierzchniowego. Należy również ograniczyć ekspozycję komórek na światło, aby zminimalizować fotowyblaknięcie sygnału fluorescencyjnego.

Następnie odwiruj probówki w wirówce, aby utworzyć pellet komórkowy. Potem ostrożnie odessij i odrzuć powstały nadsącz. Resuspenduj pellet w 1 ml PBS, aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek.

Następnie krótko odwiruj probówki. Ponownie scentryfuguj i resuspenduj komórki, aby całkowicie usunąć medium hodowlane. Następnie resuspenduj osad komórkowy w 600 µl PBS.

Zmierz stężenie komórek i dostosuj je do poziomu co najmniej trzech milionów komórek na mililitr. Następnie przenieś komórki do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Należy pamiętać o uwzględnieniu odpowiednich kontroli w celu odróżnienia barwienia swoistego od nieswoistego, a także w celu weryfikacji barwienia zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego.

Przeciwciało kontrolne izotypowe pomoże ocenić poziom barwienia tła i powinno być dopasowane do przeciwciała pierwszorzędowego pod kątem izotypu oraz fluoroforu. Ważne jest, aby stosować przeciwciało izotypowe kontrolne i przeciwciało fluorescencyjne w tym samym stężeniu. Aby oszacować ekspresję białek błonowych na powierzchni komórki, należy najpierw znakować wyłącznie epitop HA skierowany na zewnątrz komórki, używając przeciwciała sprzężonego z fluoroforem.

Następnie do probówki należy dodać przeciwciało monoklonalne przeciwko HA sprzężone z FITC w stężeniu 5 µg/mL. Komórki należy krótko wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie inkubować na platformie kołyszącej w ciemności. Po wyjęciu komórek z ciemności należy dodać 900 µl PBS.

Następnie odwiruj probówkę, aby otrzymać osad komórkowy, i odessij nadsącz. Dalej, przemyj komórki, resuspendując osad w 1 ml PBS i krótko mieszając je na wirówce typu vortex. Następnie powtórz etap wirowania, aby ponownie otrzymać osad komórkowy.

Powtórz ten etap płukania łącznie trzy razy, aby usunąć wszystkie niezwiązane przeciwciała. Po ostatnim płukaniu resuspenduj komórki w 500 µL PBS i przenieś zawiesinę pojedynczych komórek do probówki do cytometrii przepływowej o pojemności pięciu ml. Przechowuj komórki w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu analizy próbki.

Aby oszacować wewnątrzkomórkową ekspresję białka całkowitego, należy następnie przeprowadzić znakowanie permeabilizowanych komórek. Odbywa się to przy użyciu protokołu podobnego do znakowania zewnątrzkomórkowego, lecz z dodatkiem buforu do permeabilizacji komórek opartego na saponinie. Odwiruj komórki, odrzuć nadsącz i resuspenduj komórki w 100 µL roztworu do fiksacji i permeabilizacji bezpośrednio z przygotowanego zapasu.

Inkubować komórki w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Następnie dodać 100 µL świeżo przygotowanego buforu do przemywania i permeabilizacji oraz krótko wymieszać komórki na wirówce typu vortex. Następnie zcentrygować komórki i przemyć je dwukrotnie, używając buforu do przemywania i permeabilizacji.

Następnie dodać monoklonalne przeciwciało anty-HA sprzężone z FITC w stężeniu 5 µg/mL oraz 100 µL buforu do płukania i permeabilizacji. Krótko wymieszać komórki w wirówce typu vortex i inkubować je w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Następnie dodać 100 µL buforu do płukania i permeabilizacji.

Odwiruj komórki i wypłucz je trzykrotnie w 100 µL tego samego buforu, który został przedstawiony wcześniej. Po ostatnim płukaniu resuspenduj komórki w 500 µL PBS i przenieś zawiesinę pojedynczych komórek do probówki do cytometrii przepływowej o pojemności pięciu ml. Przeanalizuj komórki niepermeabilizowane oraz permeabilizowane za pomocą cytometru przepływowego tego samego dnia.

Na początek należy uruchomić oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i zaimportować pliki fcs utworzone podczas badania. Kliknij pierwszą próbkę i rozpocznij proces bramkowania na wykresie rozpraszania bocznego (side scatter) względem rozpraszania przedniego (forward scatter). Następnie, używając ikony elipsy, wyznacz bramkę P1 wokół żywych komórek, aby wyeliminować resztki komórkowe, martwe komórki lub agregaty.

Następnie narysuj wykres konturowy parametrów probówki dla intensywności fluorescencji mCherry względem FITC. Ustaw bramkę P2 wokół komórek pozytywnych pod względem FITC i mCherry, a bramkę P3 wokół populacji komórek negatywnych pod względem fluorescencji. Następnie zaznacz bramki P2 i P3 i kliknij ikonę dodawania statystyk w oryginalnym oknie obszaru roboczego.

Kliknij opcję count, a następnie kliknij mean. Na koniec zastosuj parametry bramkowania i statystyki do wszystkich próbek analizowanych przez cytometr. Niniejszy protokół został wykorzystany do scharakteryzowania roli N-glikozylacji w całkowitej i powierzchniowej ekspresji CaV Alpha 2 Delta 1 w komórkach TSA201.

Aby ocenić ekspresję białka na powierzchni komórki, zmierzono poziom HA w komórkach niepermeabilizowanych, w których miejsca N-glikozylacji zostały zablokowane w czterech miejscach, 16 miejscach lub w ogóle. Poziomy FITC były wysokie w typie dzikim oraz w komórkach z zablokowanymi czterema miejscami N-glikozylacji, natomiast w komórkach z zablokowanymi 16 miejscami odnotowano jedynie poziomy tła. W przypadku komórek permeabilizowanych fluorescencja FITC wzrosła we wszystkich wariantach, co wskazuje, że wszystkie transfekowane białka CaV Alpha 2 Delta 1 znakowane HA zostały zabarwione i wykryte przez przeciwciało anty-HA FITC.

Ponadto poziomy fluorescencji mCherry były podobne dla komórek permeabilizowanych i niepermeabilizowanych, co wskazuje, że permeabilizacja nie zmienia względnego sygnału mCherry. Analizy przeprowadzone po permeabilizacji komórek wykazały, że całkowita ekspresja białka w komórkach z zaburzoną strukturą w 16 lokalizacjach była również znacząco obniżona, niezależnie od tego, czy wywnioskowano to z fluorescencji FITC w komórkach permeabilizowanych, czy z konstytutywnej fluorescencji mCherry mierzonej w komórkach niepermeabilizowanych i permeabilizowanych. Dodatkowo do tej procedury można dołączyć pomiary fizjologiczne w celu skorelowania ekspresji i funkcji kanałów jonowych.

Technika ta otwiera również drogę badaczom z dziedziny medycyny do studiowania wpływu mutacji genetycznych, modyfikacji potranslacyjnych, mikroRNA, małych GTPaz oraz roli chaperonów w transporcie białek błonowych ekspresowanych w komórkach rekombinowanych lub natywnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić transfekcję DNA w komórkach rekombinowanych, barwić NTAC i komórki permeabilizowane, a także przeprowadzić analizę danych z próbek. Należy pamiętać, że praca z żywymi komórkami wymaga zachowania środków ostrożności, takich jak praca w przepływie laminarnym podczas transfekcji oraz noszenie rękawiczek podczas obchodzenia się z odczynnikami chemicznymi.