Name: Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Poznaj metodę żywienia wysokotłuszczowego dla larw Danio rerio z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów lipidów. Technika ta umożliwia obrazowanie na żywo i kwantyfikację spożycia pokarmu w badaniach metabolizmu lipidów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Meng-Chieh Shen za zdjęcia, Jennifer Anderson za pomocne komentarze do manuskryptu, a także członkom laboratorium Farber za ich wkład w rozwój tych technik. Badanie to zostało sfinansowane przez NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F) i F32DK096786 (J.P.O.). Odpowiedzialność za te treści ponoszą wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH. Dodatkowe wsparcie zostało udzielone przez Fundację Charytatywną G. Harolda i Leili Y. Mathers dla laboratorium S.A.F oraz fundacji Carnegie Institution for Science.

Protokoły te zostały zatwierdzone przez Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care and Use Committee (protokół nr 139).
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Dorosłe osobniki i larwy należy utrzymywać w temperaturze 28 °C w cyklu 14 godzin: 10 godzin światło: ciemność. Karm dorosłe osobniki dwa razy dziennie Artemią bez skorupek (pozbawioną kapsuły, niewylęgającą, od 14 dpf) i dostępnymi w handlu mikrogranulkami.</li>
	<li>Protokoły te są zoptymalizowane pod kątem wykorzystania 6-7 larw dpf zebranych podczas naturalnego tarła na tle AB. Protokoły mogą być modyfikowane dla larw w innym wieku i o innym pochodzeniu. Nie podawaj żywności egzogennej przed 6 dpf.</li>
	<li>Znieczulić larwy trikainą w pożywce zarodkowej (EM) (4,2 ml 4 mg/ml trikainy na 100 ml EM) w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
2. Przygotowanie bogatej w lipidy paszy z żółtka jaja
<ol>
	<li>Przygotuj i przechowuj żółtka jaj kurzych. Oddziel żółtko i białko z 12 jaj kurzych. Połączyć żółtka, podaszkować 1 ml do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do 1 roku (12 żółtek da ~80 porcji). Zbierz białka, przechowuj i stosuj jako ubogą w lipidy, bogatą w białko karmę.</li>
	<li>Przygotować fluorescencyjny analog(-i) lipidów, który w razie potrzeby zostanie dodany do paszy z żółtka jaja.
	<ol>
		<li>Zakupiony, sproszkowany fluorescencyjny analog lipidowy zawiesić w 100% etanolu lub 100% chloroformie w stężeniu 0,1 μg/μl (patrz następna uwaga dotycząca rozpuszczalników), podwielokrotność w nieprzezroczystych szklanych probówkach, uszczelnić parafilmem i przechowywać zgodnie z instrukcjami producenta. Ze względu na szybkie odparowywanie rozpuszczalników organicznych nie należy używać podwielokrotnych objętości mniejszych niż ~400 μl do długotrwałego przechowywania. 
		Uwaga: Jeśli analog lipidowy jest zawieszony w etanolu, zostaną użyte duże objętości analogu lipidowego, ponieważ wysycha on szybciej wN2 niż chloroform. Jeśli analog lipidowy jest zawieszony w etanolu, nie musi być suszony i ponownie zawieszany przed dodaniem go do paszy liposomowej w kroku 2.2.4, ale całkowite stężenie etanolu nie powinno przekraczać 0,1% w paszy liposomowej, aby uniknąć potencjalnie mylących skutków fizjologicznych etanolu.</li>
		<li>Dla fluorescencyjnych analogów kwasów tłuszczowych: Przygotować całkowitą objętość 20 ml 5% emulsji z żółtka jaja w EM. Z tego należy przygotować 5 ml podwielokrotności o końcowym stężeniu 6,4 μM 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen (BODIPY C16) do obrazowania konfokalnego na żywo i oznaczania spożycia pokarmu lub 1 μg/ml BODIPY C12 do obrazowania stereomikroskopowego. Przenieś żądaną ilość fluorescencyjnego analogu lipidów do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć lipid pod strumieniemN2, uważając, aby nie wydmuchać lipidu z probówki.</li>
		<li>Natychmiast ponownie zamieszać w 5 μl 100% etanolu, pipetując strumień po bokach probówki, dodać 95 μl EM i dobrze wymieszać. 
		Uwaga: Mieszanina powinna wydawać się jednorodna; Jeśli na bokach probówki pozostaje kolorowy lipid lub płyn wydaje się grudkowaty, lipid nie jest w pełni rozpuszczony i wymaga więcej etanolu. Chroń probówkę przed światłem i przechowuj na lodzie.</li>
		<li>Dla fluorescencyjnego analogu cholesterolu: przygotować końcowe stężenie 2,4 μg/ml cholesterolu w 5 ml 0,5-5% emulsji z żółtka jaja do badań obrazowych na żywo. Przenieś żądaną ilość cholesterolu do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć lipid pod strumieniemN2, uważając, aby nie wydmuchać lipidu z probówki.</li>
		<li>Natychmiast ponownie zawiesić 15 μl RT 100% etanolu, pipetując strumień po bokach probówki i wymieszać z 85 μl RT 1% wolnego od kwasów tłuszczowych BSA w oczyszczonymH2O. Chronić probówkę przed światłem i przechowywać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj paszę liposomową z żółtka jaja.
	<ol>
		<li>Dodać rozmrożoną porcję żółtka jaja do EM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wiruj rozcieńczoną mieszankę żółtek jaja przez 1-2 minuty; Mieszanina powinna sprawiać wrażenie jednorodnej emulsji.</li>
		<li>Przelej mieszaninę przez sitko o drobnych oczkach, aby usunąć konglomeraty białkowe i zebrać w nowej, świeżej stożkowej tubie o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Pulsacyjnie sonikuj mieszaninę jaj za pomocą zwężającej się mikrokońcówki o średnicy 1/4 cala (5 razy (5 x 1 sekunda wł., 1 sekunda wyłączona), zatrzymując się na 5-10 sekund między każdą serią; intensywność wyjściowa: 6 W) przy RT, aby utworzyć liposomy. Ustawienia mocy sonikatora są zależne od instrumentu i dlatego wymagają optymalizacji dla każdego instrumentu i mikrokońcówki. 
		Uwaga: Mieszaninę liposomów należy stale skalać w temperaturze pokojowej, aby zachować jednorodność aż do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby dodaj fluorescencyjny analog lipidów do liposomów żółtka jaja. Natychmiast po sonikacji odpipetuj przygotowane lipidy do mieszaniny liposomów i wiruj z dużą prędkością przez 30 sekund, aby włączyć się do liposomów. Chroń mieszaninę przed światłem, owijając rurkę folią i kontynuuj kołysanie przy RT.</li>
</ol>
3. Paradygmat karmienia
<ol>
	<li>Przygotuj larwy do karmienia.
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem karmienia należy przesiać larwy pod kątem oczywistych wad morfologicznych, które mogą utrudniać karmienie. Przenieść larwy na szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm lub płytki 6- lub 12-dołkowe, zredukować EM do minimum i zastąpić 5 ml przygotowanego roztworu liposomowego.</li>
		<li>W razie potrzeby przenieść niekarmione larwy kontrolne do 5 ml EM i/lub 5 ml 5% białka jaja w EM i traktować równolegle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie kołysz larwy w inkubowanym kołysku (29-31 °C przy 30 obr./min) przez cały czas trwania paszy, aby zachęcić do przyjmowania pokarmu, jednocześnie kontynuując ochronę przed światłem, jeśli obecne są fluorescencyjne analogi lipidów. Jeśli larwy muszą być wystawione na działanie światła, zminimalizuj narażenie za pomocą przyciemnianej szklanej pokrywy inkubatora.</li>
	<li>Pod koniec okresu karmienia przepłukać swobodnie pływające larwy w EM 3 razy. 
	Uwaga: Larwy mogą zacząć spożywać liposomy w dowolnym momencie karmienia. Jeżeli bardzo ważne jest, aby larwy rozpoczęły żerowanie w tym samym czasie, po 1 godzinie karmienia należy przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem pobierania pokarmu (patrz ppkt 3.4) i zwrócić tylko larwy, które rozpoczęły żerowanie, do emulsji z żółtka jaja w celu uzupełnienia paszy.</li>
	<li>W tym momencie przesiewaj larwy pod kątem przyjmowania pokarmu, ponieważ niewielka liczba może nie jeść (zwykle ~0-5%). Zbadaj jelita larw, które zostały znieczulone lub lekko schłodzone na metalowym bloku na lodzie, aby ustalić, czy się żywiły: larwy, które spożyły liposomy, będą miały ciemne jelito (ryc. 1).</li>
	<li>Natychmiast zobrazuj lub przetwórz larwy w celu pobrania pokarmu. Alternatywnie, umieścić larwy w świeżym EM i inkubować w temperaturze 28 °C, aby umożliwić zajście przemiany metabolicznej.</li>
</ol>
4. Montaż larw do obrazowania na żywo
<ol>
	<li>Przygotuj nośnik montażowy.
	<ol>
		<li>Dla 3% metylocelulozy: dodać 0,75 g metylocelulozy do 25 ml prawie wrzącego EM, odwirować, rozdrabniać w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni aż do całkowitego rozpuszczenia i przechowywać w temperaturze 4 °C przez lata w temperaturze -20 °C. Powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania w temperaturze 4 °C usuną pęcherzyki powietrza. Przechowuj 3% metylocelulozy na lodzie podczas montowania larw.</li>
		<li>Dla 1,2% agarozy o niskiej mocowaniu: dodać 0,3 g niskotopliwej agarozy do 25 ml EM i rozpuścić przez doprowadzenie do wrzenia, podwielokrotność porcjować do probówek o pojemności 2 ml i utrzymywać w temperaturze 26-28 °C na bloku grzewczym. Niewykorzystane podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej lub -20 °C i ponownie gotowane w momencie użycia. Upewnij się, że agaroza jest wystarczająco chłodna, aby można ją było obchodzić przed wystawieniem na działanie larw, w przeciwnym razie mogą być przegrzane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku obrazowania na żywo w małym powiększeniu i średniej przepustowości, umieść szklane szkiełko na chusteczce na metalowym bloku na lodzie i poczekaj, aż szkiełko ostygnie. Nanieść dużą ilość 3% metylocelulozy (która była utrzymywana w temperaturze 4 °C na lodzie) na szkiełko, przenieść larwę na 3% metylocelulozy, używając pogrzebacza z żyłki rybackiej (żyłka o średnicy 0,41 mm przyklejona do końca szklanej rurki kapilarnej), stworzyć troth do odprowadzenia nadmiaru EM (tak, aby metyloceluloza nie została rozcieńczona) i ustawić larwy zgodnie z życzeniem.</li>
	<li>W przypadku krótkotrwałego (<20 min) obrazowania na żywo w dużym powiększeniu z pionowym obiektywem do emersji olejowej, należy zamontować larwy metodą nakrywki lean-to.
	<ol>
		<li>Użyj kleju na bazie cyjanoakrylanu (Superglue), aby przymocować szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 30 mm do jednego końca szkiełka podstawowego. Za pomocą pogrzebacza umieść cienką linię 3% metylocelulozy na szkiełku przylegającym do szkiełka nakrywkowego i przenieś larwy na szkiełko za pomocą pipety Pasteura o szerokim otworze. Usuń nadmiar EM, aby nie rozcieńczył metylocelulozy.</li>
		<li>Za pomocą pogrzebacza delikatnie ułóż larwy w metylocelulozie na boku (lewą stroną do góry, aby zobrazować więcej wątroby, prawą stroną do góry, aby zobrazować woreczek żółciowy) z głowami obok szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Umieść klej superglu w rogach drugiego szkiełka nakrywkowego i delikatnie umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na zamontowanym szkiełku nakrywkowym, a drugą na szkiełku, mostkując larwy. Należy uważać, aby nie wywierać nadmiernego nacisku podczas tego etapu lub obiektywu podczas obrazowania, aby larwy pozostały nieuszkodzone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu długotrwałego obrazowania w dużym powiększeniu za pomocą pionowego obiektywu zanurzeniowego, larwy należy zamontować w agarozie. Dodać larwę do małej porcji 1,2% niskotopliwej agarozy, a następnie przenieść larwę w małej objętości agarozy na szalkę Petriego.
	<ol>
		<li>Szybko ustaw larwy za pomocą pogrzebacza, zanim agaroza zastygnie. Pozostaw agarozę do wyschnięcia na 2-3 minuty i całkowicie przykryj agarozę świeżym EM, aby zapobiec jej wyschnięciu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu długotrwałego obrazowania w dużym powiększeniu za pomocą odwróconego obiektywu, larwy należy umieścić na naczyniu ze szklanym dnem w agarozie.
	<ol>
		<li>Ostudzić metalowy blok na lodzie. Umieść naczynie na metalowym bloku oddzielonym chusteczką, aby zapobiec nadmiernemu wychłodzeniu i zamarznięciu larw. Przenieś larwę do naczynia i usuń EM, odprowadzając wilgoć chusteczką.</li>
		<li>Umieścić kroplę niskotopliwej agarozy o temperaturze 28 °C (1,2%) na wierzchu larwy i natychmiast ustawić za pomocą pogrzebacza (lewą stroną do dołu, aby najlepiej zobrazować wątrobę, prawą stroną do dołu, aby zobrazować woreczek żółciowy). Wyjmij naczynie z zimnego bloku, pozostaw do wyschnięcia na 2-3 minuty i dodaj wystarczającą ilość świeżego EM, aby przykryć agarozę (~2-5 ml).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Test spożycia pokarmu
<ol>
	<li>Na końcu paszy liposomowej z żółtka jaja zawierającej 6,4 μM BODIPY C16 należy zebrać co najmniej 10 umytych larw w plastikowej probówce o pojemności 1,5 lub 2 ml, usunąć EM i zamknąć błyskawicznie. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C, chronione przed światłem przez kilka miesięcy. 
	Uwaga: Jeśli to możliwe, zbierz wiele powtórzeń. Ważne jest, aby na tym etapie zebrać niekarmione larwy, aby znormalizować fluorescencję lipidów w tle (najlepiej użyć larw z tego samego lęgu).</li>
	<li>Wykonać zmodyfikowaną ekstrakcję lipidów metodą Bligh-Dyera3,21.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl buforu homogenizacyjnego (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) do próbki na lodzie (alternatywnie można użyć oczyszczonegoH2O). Homogenizuj na lodzie za pomocą sonografu z mikrokońcówką (łącznie 5 sekund: 1 sekunda włączona 1 sekunda wyłączona). Sprawdź, czy larwy są całkowicie homogenizowane; Jeśli nie, powtórz czynność. Przenieść do jednorazowej szklanej probówki hodowlanej o pojemności 13 ml (można użyć innych szklanych probówek). 
		Uwaga: Chloroform jest niebezpieczny; wykonać wszystkie kolejne etapy ekstrakcji lipidów w temperaturze pokojowej w okapie chemicznym.</li>
		<li>Na każde 100 μl użytego buforu homogenizacyjnego dodać 375 μl roztworu 1:2 (chloroform:metanol). Wirować 30-60 sekund, inkubować 10 min, dodać 125 μl chloroformu na 100 μl użytego buforu homogenizacyjnego i wirować 30 sek.</li>
		<li>Dodać 125 μl 200 mM Tris pH 7,5 na 100 μl użytego buforu homogenizacyjnego, wirować przez 30 sekund i odwirować (2 000 x g, 5 min, RT, chronić przed światłem). Ostrożnie wyjmij próbki z wirówki. Zostaną one podzielone na dwie fazy: górna faza jest wodna, granica resztek larwalnych, a dolna faza organiczna (zawiera lipidy).</li>
		<li>Za pomocą pipety z czystego szkła zebrać dolną, organiczną fazę i przenieść ją do czystej szklanej probówki o pojemności 13 ml. 
		Uwaga: Należy uważać, aby uniknąć fazy wodnej i resztek larwalnych na granicy faz; Jeśli dojdzie do zanieczyszczenia, powtórz etap wirowania i przypomnij sobie. Odrzuć górną, wodną fazę; Pomocne może być usunięcie i odrzucenie tej fazy przed zebraniem fazy organicznej. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
		<li>Wysuszyć fazę organiczną w próżni (0,12 atm), chroniąc ją przed światłem. Nie należy kontynuować suszenia próbek po odparowaniu cieczy, ponieważ zmniejszy to rozpuszczalność w tłuszczach. Zawiesić lipidy w stosunku 2:1 (chloroform:metanol) i przechowywać na lodzie. Optymalna objętość roztworu chloroformu: metanolu zależy od zastosowanej metody wykrywania; Zacznij od niskiego poziomu i kontynuuj rozcieńczanie w razie potrzeby. Ogólną wskazówką jest użycie 10 μl na 10 larw w puli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść całe objętości próbki w równych odstępach czasu na kanałowej płytce TLC i zeskanuj płytkę za pomocą skanera laserowego rutynowo używanego do obrazowania biomolekularnego (np. czytnika płytek fluorescencyjnych). W przypadku fluorescencyjnych analogów lipidów znajdujących się w wykazie materiałów, które mają maksima wzbudzenia od 500-650 nm i maksima emisji od 510-665 nm, należy użyć lasera o długości fali 488 nm i przy odbiorze emisji przy 520 nm.
	<ol>
		<li>Określ ilościowo całkowitą fluorescencję każdej plamki za pomocą oprogramowania do obrazowania. 
		Uwaga: Skorygować naturalnie występującą fluorescencję lipidów tła, odejmując fluorescencję sparowanych, niekarmionych próbek larw.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carten, J. D., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+system+swims+into+focus%3A+using+the+zebrafish+to+visualize+intestinal+metabolism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo.</a> Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).</li>
<li>Babin, P. J., Vernier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+lipoproteins+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma lipoproteins in fish.</a> J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).</li>
<li>Marza, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+and+nutritional+regulation+of+a+zebrafish+gene+homologous+to+mammalian+microsomal+triglyceride+transfer+protein+large+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit.</a> Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).</li>
<li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+lipid+accumulation%2C+lipoprotein+oxidation%2C+and+macrophage+lipid+uptake+in+hypercholesterolemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish.</a> Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+effects+of+high-carbohydrate+feeding+of+larvae+on+adult+glucose+metabolism+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio.</a> Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+a+combined+high+cholesterol+diet+and+high+glucose+environment+on+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature.</a> PLoS One. 8 (12), 81485(2013).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+and+attenuation+of+oxidized+lipid+accumulation+in+hypercholesterolemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish.</a> J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li>
<li>Matthews, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFalpha-dependent+hepatic+steatosis+and+liver+degeneration+caused+by+mutation+of+zebrafish+S-adenosylhomocysteine+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase.</a> Development. 136 (5), 865-875 (2009).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC Physiol. 10, 21(2010).</li>
<li>Chu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Akt1+enhances+adipogenesis+and+leads+to+lipoma+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (5), 36474(2012).</li>
<li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).</li>
<li>Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+approaches+to+the+study+of+zebrafish+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition.</a> ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).</li>
<li>Farber, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+digestive+physiology+using+fluorescent+phospholipid+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters.</a> Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).</li>
<li>Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+yolk+lipid+processing%3A+a+tractable+tool+for+the+study+of+vertebrate+lipid+transport+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).</li>
<li>Otis, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+apolipoprotein+biology%3A+comprehensive+expression+analysis+and+a+role+for+ApoA-IV+in+regulating+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).</li>
<li>Bligh, E., Dyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).</li>
<li>Otis, J. P., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+vertebrate+digestive+function+and+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism.</a> Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).</li>
<li>Andre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fatty+acid+binding+protein+gene+expression+reveals+the+cephalocaudal+patterning+during+zebrafish+gut+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis.</a> Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PLoS One. 7 (12), 52549(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj techniki pozwalają naukowcom leczyć larwy danio pręgowanego paszą bogatą w lipidy, wizualizować przetwarzanie lipidów w diecie u żywych larw i określać ilościowo spożycie pokarmu przez larwy. Aby zapewnić sukces, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka kluczowych kroków. Komercyjne jaja kurze różnią się; Aby zminimalizować potencjalną zmienność, przeprowadzamy wszystkie testy na ekologicznych jajach od kur z chowu bezklatkowego, które nie zostały wzbogacone w kwasy tłuszczowe omega-3. Niższe wskaźniki karm...

Mechanizmy, za pomocą których jelito reguluje przetwarzanie lipidów w diecie, wątroba kontroluje złożoną syntezę lipidów i metabolizm lipoprotein, oraz jak te organy współpracują z ośrodkowym układem nerwowym w celu kontrolowania przyjmowania pokarmu, nie są w pełni zrozumiałe. Wyjaśnienie tej biologii w świetle obecnych epidemii otyłości, chorób układu krążenia, cukrzycy i niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby ma znaczenie biomedyczne. Badania na hodowli komórkowej i myszach dostarczyły nam większości wiedzy na temat mechanistycznych związków między lipidami w diecie a chorobami, a danio pręgowany (Danio rerio) wyłania się jako idealny model uzupełniający tę pracę.
Danio pręgowany mają podobne narządy przewodu pokarmowego (GI), metabolizm lipidów i transport lipoprotein jak wyższe kręgowce 1,2, rozwijają się szybko i są genetycznie podatne. Przejrzystość optyczna larw danio pręgowanego ułatwia badania in vivo, co jest szczególnie korzystne w przypadku badania układu pokarmowego, ponieważ jego środowisko zewnątrzkomórkowe (tj. żółć, mikrobiota, sygnalizacja hormonalna) jest praktycznie niemożliwe do modelowania ex vivo. W związku z tym, pojawiają się badania łączące genetyczną wykonalność i skłonność do obrazowania na żywo larw danio pręgowanego z różnymi manipulacjami dietetycznymi (dieta wysokotłuszczowa3,4, -cholesterolowa5 i -węglowodanowa6,7) oraz modelami chorób sercowo-naczyniowych8, cukrzycy9,10, stłuszczenia wątroby11-13 i otyłości14-16, które dostarczają wielu wglądów metabolicznych.
Zasadniczym aspektem przejścia larw danio pręgowanego do badań metabolicznych jest optymalizacja technik opracowanych u innych zwierząt modelowych do danio pręgowanego oraz opracowanie nowych testów, które wykorzystują unikalne mocne strony danio pręgowanego. Protokół ten przedstawia techniki opracowane i zoptymalizowane w celu karmienia larw danio pręgowanego posiłkiem bogatym w lipidy, wizualizacji przetwarzania lipidów w diecie od całego ciała do rozdzielczości subkomórkowej oraz pomiaru spożycia pokarmu. Żółtko jaja kurzego zostało wybrane do skomponowania bogatego w lipidy posiłku, ponieważ zawiera wysoki poziom tłuszczów i cholesterolu (lipidy stanowią ~58% żółtka jaja kurzego, z czego ~5% to cholesterol, 60% to trójglicerydy, a 35% to fosfolipidy). Żółtko jaja kurzego dostarcza więcej tłuszczu niż typowe komercyjne pokarmy mikrogranulowane danio pręgowanego (~ 15% lipidów) i zaletą jest to, że jest to standaryzowana pasza ze znaną zawartością procentową określonych gatunków kwasów tłuszczowych, ponieważ diety danio pręgowanego i reżimy żywieniowe nie zostały ustandaryzowane w laboratoriach17. Co więcej, fluorescencyjne analogi lipidów zawarte w żółtku jaja wizualizują transport i akumulację lipidów w diecie18, obrazują składniki komórkowe, w tym kropelki lipidów, działając zarówno jako niezbędnebarwniki3, jak i poprzez kowalencyjne włączenie do złożonych lipidów, badają metabolizm za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)19 i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (dane niepublikowane SAF) i zapewniają test ilościowy dla całkowitego spożycia pokarmu20.

<table><tbody><tr><td>Trikaina (sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Znieczulenie dla larw danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Jaja kurze</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Jaja ekologiczne, bezklatkowe, niewzbogacone o kwasy tłuszczowe omege-3</td></tr><tr><td>Procesor ultradźwiękowy 3000 sonikator</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>Do produkcji liposomów z żółtka jaja</td></tr><tr><td>Sonabox obudowa akustyczna</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>Do produkcji liposomów z żółtka jaja</td></tr><tr><td>1/8 "stożkowa mikrokońcówka</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>Do produkcji liposomów żółtka jaja</td></tr><tr><td>Bursztynowe fiolki (4 ml, szkło)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Magazynowanie lipidów; zawiera fiolki, kapsle otwarte i przegrody nasadki</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini&nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>1222U12</td><td>Wytrząsarka inkubowana do pasz</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaksen-3-heksadekanowy)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indakno-3-dodekanowy)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indakno-3-pentanowy)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Fluorescencyjny analog lipidów; (Kwas 4,4-difluoro-5,7-dimetylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indakno-3-propionowy)</td></tr><tr><td>Cholesterol TopFluor&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>810255</td><td>Fluorescencyjny analog lipidów; 23-(difluorek dipyrrometenboru)-24-norcholesterol</td></tr><tr><td>Bez kwasów tłuszczowych BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>Do solubilizacji cholesterolu TopFluor</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Pożywka montażowa do obrazowania żywych larw; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Podłoże montażowe dla żywych larw Obrazowania; Szkiełka mikroskopowe 22 x 30</td></tr><tr><td>VWR&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>16004-422</td><td>Mocowanie larw do obrazowania na żywo</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe&nbsp;</td><td>Szkło osłonowe</td><td>12-544A</td><td>Montaż larw do obrazowania na żywo</td></tr><tr><td>Super klej</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Montaż larw do obrazowania na żywo</td></tr><tr><td>FluoroDish (naczynie ze szklanym dnem)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>Montaż larw do obrazowania na żywo; czasza 35 mm, szkło 23 mm, grubość szkła 0,17 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>Mikroskop do obrazowania na żywo w dużym powiększeniu</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td><td>Mikroskop do obrazowania na żywo w małym powiększeniu</td></tr><tr><td>Szklane probówki hodowlane&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>Ekstrakcja lipidów; (13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>Odkurzacz Savant SpeedVac Plus&nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A Ekstrakcja lipidów</td><td></td></tr><tr><td>Kanałowe płytki TLC</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>Test przyjmowania pokarmu; LK5D Żel krzemionkowy 150 A, 20 x 20 cm, grubość 250 um; Wycofane z produkcji</td></tr><tr><td>kanałowe płytki TLC</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Test przyjmowania pokarmu; Bezpośredni zamiennik płyt TLC Whatman Scientific</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Czytnik płytek fluorescencyjnych do oznaczania spożycia żywności</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>ImageQuant GE Healthcare</td><td>29000605</td><td>Analiza testu spożycia żywności</td></tr><tr><td>5 3/4' Jednorazowe pipety borokrzemianowe Pasteura o szerokim otworze&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Przenoszenie larw</td></tr></tbody></table>

paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Danio pręgowany wyłania się jako model przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób karmić larwy danio pręgowanego mączką bogatą w lipidy, która składa się z emulsji liposomów żółtka jaja kurzego powstałych w wyniku sonikacji żółtka jaja w pożywce zarodkowej. Podano szczegółowe instrukcje dotyczące badania larw pod kątem spożycia żółtka jaja, tak aby larwy, które nie żerują, nie zafałszowały wyników eksperymentów. Liposomy żółtka jaja kurzego mogą być wzbogacane fluorescencyjnymi analogami lipidów, w tym kwasami tłuszczowymi i cholesterolem, umożliwiając zarówno ogólnoustrojową, jak i subkomórkową wizualizację przetwarzania lipidów w diecie. Opisano kilka metod montowania larw, które sprzyjają krótko- i długoterminowemu obrazowaniu na żywo zarówno z pionowymi, jak i odwróconymi obiektywami przy dużym i małym powiększeniu. Dodatkowo przedstawiono test do ilościowego określania spożycia pokarmu przez larwy poprzez ekstrakcję lipidów larw karmionych fluorescencyjnymi analogami lipidów, plamienie lipidów na płytce chromatografii cienkowarstwowej i ilościowe określanie fluorescencji. Na koniec omówiono krytyczne aspekty procedur, ważne kontrole, opcje modyfikacji protokołów w celu rozwiązania konkretnych pytań eksperymentalnych oraz potencjalne ograniczenia. Techniki te mogą być stosowane nie tylko do ukierunkowanych, opartych na hipotezach badań, ale także do różnych badań przesiewowych i technik obrazowania na żywo w celu badania metabolizmu lipidów w diecie i kontroli spożycia pokarmu.

Przy karmieniu na kołysarce w temperaturze 29-31 °C większość zdrowych larw (≥95%) przyjmie pokarm w ciągu 1 h. Po spożyciu emulsji z żółtka jaja jelito larwy ciemnieje. Bardzo ciemne jelita można zaobserwować po 2 h (Rysunek 1). W przypadku larw niekarmionych lub tych, które nie przyjęły pokarmu, jelito pozostaje przeźroczyste. Larwy karmione białkiem jaja wykazują rozszerzone światło jelita, które nie ciemnieje.
<img alt="Jelita danio pręgowa...

Danio pręgowany staje się cennym modelem przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Opisano protokoły żywienia larw bogatych w lipidy, obrazowanie na żywo fluorescencyjnych analogów lipidów w diecie oraz ilościowe oznaczanie spożycia pokarmu. Techniki te można zastosować do różnych technik badań przesiewowych, obrazowania i dociekań opartych na hipotezach.

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu eksperymentalnego jest podanie larwom Danio pręgowanego posiłku bogatego w lipidy, który może zostać wzbogacony fluorescencyjnym analogiem lipidów, aby umożliwić wizualizację dynamiki poboru lipidów przez larwy oraz ilościowe określenie spożycia lipidów z pożywieniem. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu metabolizmu i biologii przewodu pokarmowego, takie jak sposób metabolizowania lipidów z pożywienia oraz mechanizmy regulacji spożycia pokarmu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość efektywnego dostarczenia fluorescencyjnych analogów lipidów w liposomach pokarmowych.Przezroczystość optyczna larw Zebrafish umożliwia wykorzystanie mikroskopii do badania subkomórkowego przetwarzania lipidów. Aby rozpocząć, zawiesić 1 mg sproszkowanego fluorescencyjnego analogu lipidów w 2 mL 100% chloroformu, aby uzyskać stężenie końcowe 0,5 µg/µL. Analog należy rozdzielić na aalikwoty do szklanych probówek z ciemnego szkła z nakrętkami kompatybilnymi z rozpuszczalnikiem, wyposażonymi w uszczelkę teflonową.Przechowywać te roztwory zapasowe w zamrażarce. Do probówki o pojemności 1.5 mililitr dodać 10.4 µL roztworu zapasowego fluorescencyjnego analogu lipidów o stężeniu 0.5 µg/µL i osuszyć strumieniem azotu, uważając, aby nie wydmuchać lipidów z probówki. Natychmiast zawiesić osuszony lipid w pięciu µL 100% etanolu, pipetując strumień wzdłuż ścianek probówki.Następnie należy dodać 95 µL pożywki dla embrionów i dokładnie wymieszać, pipetując roztwór w górę i w dół, aż mieszanina stanie się jednorodna. Probówkę należy chronić przed światłem i przechowywać w lodzie do momentu użycia. Aby przygotować fluorescencyjny roztwór liposomów cholesterolowych, do probówki o pojemności 1,5 ml należy dodać taką ilość roztwoku fluorescencyjnego analogu cholesterolu, aby po dodaniu do emulsji żółtka jaja osiągnąć stężenie końcowe 2,5 µg/ml.Osusz zapas cholesterolu w strumieniu azotu, tak jak wcześniej. Natychmiast resuspenduj fluorescencyjny analog cholesterolu w 15 µL 100% etanolu o temperaturze pokojowej, wprowadzając ciecz pipetą po ściance probówki. Następnie wymieszaj z 85 µL 1% BSA wolnej od kwasów tłuszczowych i wody.Przed dodaniem fluorescencyjnego analogu lipidów do emulsji z żółtka jaja konieczne jest jego całkowite rozpuszczenie w etanolu i pożywce embrionalnej, aby zapewnić jednorodne rozprzestrzenienie lipidów w paszy i równą dostępność dla wszystkich larw. Należy zabezpieczyć probówkę przed światłem za pomocą folii i przechowywać ją w lodzie. Aby przygotować roztwór do karmienia, należy dodać 19 mililitrów pożywki embrionalnej do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, a następnie dodać jedną mililitrową porcję żółtka jaja.Mieszaninę należy wstrząsnąć w wirówce (vortex) przez jedną do dwóch minut, aby uzyskać jednorodną emulsję. Przecedzić mieszaninę przez gęste sito w celu usunięcia konglomeratów białkowych i zebrać ją do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie poddać mieszaninę jajeczną sonikacji impulsowej pięć razy (sekunda działania, sekunda przerwy), używając stożkowej mikrokońcówki o średnicy 1/4 cala przy mocy sześciu watów.Powtórz program sonikacji jeszcze cztery razy. W ten sposób powstają liposomy, które od tego momentu należy stale kołysać aż do momentu użycia, aby zachować ich jednorodność. Bezpośrednio po sonikacji dodaj odpowiednią ilość fluorescencyjnych analogów lipidów do pięciu mililitrów mieszaniny liposomów.Mieszaj w wibratorze laboratoryjnym (vortex) z dużą prędkością przez 30 sekund, aby włączyć fluorescencyjne analogi lipidów do liposomów. Chroń mieszaninę przed światłem, owijając probówkę folią, a następnie umieść ją z powrotem na kołysce. Przenieś pięćdziesiąt larw do naczynia do karmienia, usuń pożywkę dla embrionów i dodaj 5 ml pożywki.Aby zachęcić larwy do żerowania, delikatnie kołysz je w inkubowanym kołysarce, osłaniając przed światłem, jeśli stosowane są fluorescencyjne analogi lipidów. Po zakończeniu okresu karmienia przemyj larwy trzy razy w pięciu mililitrach pożywki do embrionów. Aby unieruchomić larwy, umieść metalowy blok na lodzie, przykryj go chusteczką, aby zapobiec nadmiernemu schłodzeniu, a następnie postaw na nim naczynie z larwami w pożywce do embrionów w celu ich ochłodzenia.Obserwuj larwy przy powiększeniu 10x pod mikroskopem stereoskopowym i określ, które z nich spożyły paszę liposomalną. Larwy, które spożyły liposomy, będą miały ciemniejszy jelito. Kluczowe jest określenie, czy larwy się pożywiły, poprzez sprawdzenie, czy jelito jest ciemne.Zazwyczaj od jednego do pięciu procent larw nie przyjmuje pokarmu, co może zakłócić wyniki eksperymentalne, jeśli nie zostaną one zidentyfikowane i usunięte. W przypadku długoterminowego obrazowania przy dużym powiększeniu z użyciem obiektywu odwróconego, należy najpierw schłodzić larwy na metalowym bloku umieszczonym na lodzie. Następnie należy przenieść larwę do szalki z szklanym dnem i usunąć medium do embrionów, odsączając je chusteczką.Nanieś kroplę 1,2% agarozy low melt o temperaturze 42 °C na wierzch larwy i natychmiast ustaw ją za pomocą zgłębnika. Wyjmij szalkę z bloku chłodzącego i pozostaw agarozę na dwie do trzech minut. Na koniec dodaj odpowiednią objętość świeżej pożywki do embrionów, aby przykryć agarozę i zapobiec wysychaniu.Próbki są teraz gotowe do obrazowania. Po zakończeniu podawania liposomów, przenieś co najmniej 10 wypłukanych larw do probówki o pojemności 1,5 ml. Usuń medium do embrionów, a następnie gwałtownie zamroź larwy.Powtórz procedurę w osobnej probówce z 10 nienakarmionymi larwami jako kontrolą. Trzymając próbkę w lodzie, dodaj 100 µl buforu do homogenizacji do każdej probówki, a następnie homogenizuj za pomocą sonikatora z mikrokońcówką. Przenieś tkankę do probówki hodowlanej o pojemności 13 ml.Do każdej zawiesiny w buforze do homogenizacji dodaj 375 µL mieszaniny chloroformu z metanolem w stosunku od 1:1 do 2:1. Mieszaj w wstrząsarku typu vortex przez 30 do 60 sekund, a następnie inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj kolejne 125 µL chloroformu i mieszaj w wstrząsarku typu vortex przez 30 sekund.Następnie należy dodać 125 µL 200 mM TRIS pH 7,5, mieszać w vortexie przez 30 sekund, a następnie wirować przy 2000 ×g przez pięć minut w warunkach chroniących przed światłem. Próbki należy ostrożnie wyjąć z wirówki, aby nie zakłócić rozdzielenia faz. Za pomocą czystej pipety szklanej należy zebrać dolną fazę organiczną i przenieść ją do czystej szklanej probówki o pojemności 13 ml.Należy ostrożnie uniknąć przeniesienia górnej fazy wodnej oraz środkowej fazy z osadem larwalnym i je usunąć. Fazę organiczną należy wysuszyć pod próżnią przy ciśnieniu 0,12 atm, chroniąc ją przed światłem i dbając o to, aby przerwać proces natychmiast po odparowaniu cieczy. Pojedynczą próbkę należy zawiesić w 10 µL mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku 2:1, a następnie nanieść całą objętość próbki na płytkę do cienkowarstwowej chromatografii z nacięciem.Powtórz procedurę z pozostałymi próbkami, nanosząc je w równych odstępach. Na koniec przeskanuj płytkę za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek. Badanie larw karmionych na kołysce w warunkach eksperymentalnych wykazuje ściemnienie jelit, co jest typowe dla ryb, które spożyły emulsję żółtka jaja.Niekarmione larwy zazwyczaj mają przejrzyste jelita, dzięki czemu można łatwo odróżnić osobniki, które nie spożyły formuły pokarmowej w okresie karmienia. Larwa karmiona fluorescencyjnym analogiem lipidów pozwala na wizualizację transportu i akumulacji tego lipidu dietetycznego. W tym przypadku sygnał fluorescencyjny jest widoczny w całych narządach trawiennych po ośmiu godzinach karmienia.Różne analogi lipidów są włączane do unikalnych zestawów struktur komórkowych i w ten sposób je wizualizują, ponieważ są one w różny sposób metabolizowane do złożonych lipidów. W tym przypadku analogi Fluorescent-C16 i C12 znakują krople lipidowe. Fluorescent-C5 znakuje przewody wątrobowe i trzustkowe, krople lipidowe, błony komórkowe oraz sieci tętnicze.Analog Fluorescent-C2 znakuje przewodowe wątrobowe i trzustkowe oraz błony komórkowe. Do badania karmienia larw typu dzikiego w porównaniu z larwami transgenicznymi nadekspresującymi apolipoproteinę A4B1 wykorzystano testy poboru pokarmu przez larwy; wykazały one, że podczas czterogodzinnego karmienia larwy transgeniczne zjadły mniej niż larwy typu dzikiego. Wyniki hodowli zostały znormalizowane przy użyciu sparowanych, niekarmionych larw kontrolnych.Ilościowe oznaczenie fluorescencji larw typu dzikiego oraz larw transgenicznych, które po karmieniu wykazują nadekspresję Apo A4, wskazuje na znacząco zmniejszone spożycie pokarmu przez larwy transgeniczne w porównaniu z typem dzikim. Po opanowaniu procedury, pasza w postaci fluorescencyjnego analogu lipidów żółtka jaja może zostać przygotowana w około 15 minut. Spożycie pokarmu można określić ilościowo z 10 do 12 połączonych próbek w czasie około czterech godzin.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przesiewowo badać larwy pod kątem wad rozwojowych, które mogą upośledzać przyjmowanie pokarmu, takich jak źle uformowana żuchwa, niedorozwinięte jelito lub zmniejszona mobilność. Do niniejszego protokołu eksperymentalnego można włączyć metody takie jak leczenie farmakologiczne lub inżynieria genomu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, w jaki sposób specyficzne białka i szlaki sygnalizacji komórkowej regulują przyjmowanie pokarmu i metabolizm lipidów. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu fizjologii układu pokarmowego i biologii komórki do wizualizacji transportu i akumulacji lipidów dietetycznych u larw Zebrafish.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat przygotowania bogatej w lipidy karmy dla larw Zebrafish, przesiewania larw pod kątem przyjmowania pokarmu, montowania larw do obrazowania krótkoterminowego i długoterminowego oraz ilościowego oznaczania przyjmowania pokarmu. Należy pamiętać, że praca z sonikatorem może być niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy stosować ochronniki słuchu.

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy nowatorską metodę mikrozgavage u larw danio pręgowanego, wykorzystującą standardowy sprzęt do mikroiniekcji embrionów oraz stereomikroskopię. Wykazujemy, że mikrozgavage jest bezpieczną i wydajną techniką, przydatną do dostarczania kontrolowanych ilości różnorodnych materiałów bezpośrednio do światła jelita larw danio pręgowanego.

Mikrogaważ larw danio pręgowanego

Film opisuje unikanie i testowanie metodą thigmotaxis larw danio pręgowanego. Film bada zachowanie larw danio pręgowanego w odpowiedzi na wizualny bodziec awersyjny.

Test unikania danio pręgowanego i thigmotaxsji: wysokoprzepustowa metoda badania zachowania larw w odpowiedzi na awersyjny bodziec wzrokowy

Nasze laboratorium opracowało nowatorski system automatycznego obrazowania o wysokiej przepustowości, który jest przydatny do wykrywania kilku różnych zachowań u 7-dniowych larw danio pręgowanego. System może być używany do wykrywania subtelnych zmian w zachowaniu po wystawieniu larw na działanie toksyn środowiskowych lub farmaceutyków.

Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe analizy behawioralne larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.

Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

Celem tego protokołu jest zmierzenie czasu przejścia fluorescencyjnie znakowanego pokarmu przez jelita larw danio pręgowanego w sposób wysokoprzepustowy.

Wysokoprzepustowy pomiar czasu pasażu jelitowego przy użyciu larw danio pręgowanego

Danio rerio) stają się powszechnie używanym modelem zwierzęcym kręgowców do kolonizacji i patogenezy mikrobiologicznej. Protokół ten opisuje zastosowanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego. P. caudatum łatwo internalizuje bakterie i jest wchłaniany przez larwy danio pręgowanego poprzez naturalne zachowania żerowania.

Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego

Tutaj demonstrujemy metodę ilościowego określania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego, umożliwiając ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby.

Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

Tutaj prezentujemy, jak wygenerować model danio pręgowanego związanego z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD) w celu zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych.

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Poznaj metodę żywienia wysokotłuszczowego dla larw Danio rerio z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów lipidów. Technika ta umożliwia obrazowanie na żywo i kwantyfikację spożycia pokarmu w badaniach metabolizmu lipidów.

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu (Wideo) | JoVE Journal

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

Przeglądaj więcej filmów