Zastosowanie wkładu filtracyjnego do filtracji próbek wody i ekstrakcji środowiskowego DNA
25 listopada 2016
Opisujemy protokół filtracji próbek wody za pomocą wkładu filtrującego i ekstrakcji środowiskowego DNA (eDNA) bez konieczności rozcinania obudowy w celu wyjęcia filtra. Protokół ten został opracowany do metabarkodowania eDNA ryb, ale ma również zastosowanie do eDNA z innych organizmów.
Ogólnym celem tego protokołu jest filtrowanie próbek wody za pomocą wkładu filtrującego i ekstrakcja środowiskowego DNA bez konieczności rozcinania obudowy w celu usunięcia filtra z metabarcodingu eDNA z różnych organizmów wodnych. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ekologii, takie jak monitorowanie różnorodności biologicznej i ekologia społeczności. Główną zaletą tej techniki jest to, że wkłady filtracyjne mogą pomieścić większe objętości wody, a filtracja i ekstrakcja DNA mogą być przeprowadzane w sterylny sposób.
Aby rozpocząć tę procedurę, podłącz rurkę o wysokiej próżni do złącza wejściowego pompy aspiratora. Podłącz drugi koniec rurki do kolektora. Upewnij się, że trzy czerwone zawory T na kolektorze są w pozycji wyłączonej.
Następnie załóż czysty zestaw rękawiczek. Włóż żeńską złączkę luer na górnym końcu gumowej rurki próżniowej. Następnie włóż złącze próżniowe na dolnym końcu.
Ostrożnie przymocuj żeńską złączkę luer do portu wylotowego wkładu filtra. Następnie przymocuj złącze próżniowe do silikonowego korka. Wlej jeden litr pobranej próbki wody do przygotowanej plastikowej torby.
Dołącz nakrętkę do męskiego złącza luer-lock. Następnie ostrożnie połącz port wlotowy zmontowanego wkładu filtrującego z męskim złączem luer-lock. Upewnij się, że wszystkie połączenia są bezpieczne.
Następnie zawieś plastikową torbę na dwóch zębach na panelu z siatki. Włóż silikonowy korek do portu wlotowego kolektora. Następnie włącz aspirator.
Otwórz czerwone zawory T w celu filtracji. Uruchom kolektor, aż wkład filtra wyschnie. Następnie zamknij czerwone zawory T.
Powtórz cały proces, aby przefiltrować żądaną ilość wody. Po przefiltrowaniu całej pobranej próbki wody ostrożnie wyjmij wkład filtra z plastikowej torby i pojemnika próżniowego. Zakryj oba końce wkładu odpowiednimi nasadkami typu luer.
Następnie, za pomocą długopisu odpornego na działanie rozpuszczalników, oznacz wkład i wlotową nasadkę luer. Przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do przeprowadzenia ekstrakcji DNA. W przypadku próbek większych niż cztery litry przygotuj dziesięciolitrową butelkę książkową, jak opisano w protokole tekstowym.
Dodać próbkę wody, która ma być przefiltrowana. Następnie szczelnie włóż dziesięciomililitrową końcówkę pipety do zaworu butelki z książką. Szczelnie włóż otwór wlotowy wkładu filtra do końcówki pipety.
Następnie włóż silikonowy korek do portu wlotowego kolektora. Włącz aspirator. Następnie otwórz czerwone zawory T w celu filtracji.
Uruchom kolektor, aż wkład filtra wyschnie. Po zakończeniu filtracji zamknij czerwone zawory T. Ostrożnie wyjmij wkład z plastikowej torby i złącza próżniowego.
Następnie zakryj oba końce wkładu odpowiednimi nasadkami typu luer. Użyj pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby oznaczyć wkład i nasadkę luer wlotową. Przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do przeprowadzenia ekstrakcji DNA.
Rozgrzej inkubator do 56 stopni Celsjusza. Następnie odetnij nakrętkę na zawiasach z rurki o pojemności 2,0 mililitra i wyrzuć nakrętkę. Zdejmij nasadkę luer wlotową z wkładu filtra.
Następnie włóż port wlotowy do rurki o pojemności 2.0 mililitra. Za pomocą folii samouszczelniającej szczelnie uszczelnij połączenie między wkładem a rurką zbiorczą. Następnie włóż połączoną jednostkę do adaptera wirówki do 15-mililitrowej stożkowej probówki.
Wirować wkład przez jedną minutę z prędkością 5000 razy g, aby usunąć pozostałą ciecz z filtra. Po zakończeniu wirowania wyjmij probówkę zbiorczą z wkładu filtra i wyrzuć probówkę. Następnie ponownie zamknij port wlotowy.
Następnie wymieszaj 20 mikrolitrów roztworu białka A-Case, 220 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i 200 mikrolitrów buforu AL. Zdejmij nasadkę wlotową i dodaj mieszaninę do wkładu za pomocą pipety, wkładając pipetę całkowicie do portu wlotowego. Zamknij port wlotowy. Następnie umieść wkład filtra na wytrząsarce obrotowej.
Umieść wytrząsarkę obrotową w nagrzanym inkubatorze i ustaw wytrząsarkę na 20 obr./min na 20 minut. Podczas inkubacji oznacz nową probówkę o pojemności 2,0 mililitra pisakiem odpornym na rozpuszczalnik. Następnie umieść go w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów.
Po zakończeniu inkubacji zdjąć nasadkę wlotową. Następnie włóż port wlotowy do nowej rurki o pojemności 2.0 mililitra. Zakryj stożkową rurkę zakrętką.
Wirować przez jedną minutę w temperaturze 5000 razy g, aby zebrać wyekstrahowane DNA. Następnie wyjmij wkład z rurki o pojemności 2,0 mililitra za pomocą wysterylizowanych kleszczy. Zakryj probówkę i oczyść wyekstrahowane DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
W tej procedurze cztery różne objętości wody morskiej są filtrowane na tym samym kolektorze za pomocą dwóch unikalnych filtrów, a następnie ekstrahowane jest eDNA. Wkład filtrujący wykrył średnio o 50% więcej gatunków niż filtry z włókna szklanego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak filtrować próbki wody za pomocą wkładu filtrującego i jak ekstrahować eDNA bez konieczności rozcinania obudowy w celu wyjęcia filtra z metabarcodingu eDNA z różnych organizmów wodnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę filtrowania próbek wody przy użyciu wkładu filtrującego w celu ekstrakcji środowiskowego DNA (eDNA) bez konieczności rozcinania obudowy. Metoda ta została opracowana przede wszystkim do metabarkodowania eDNA ryb, lecz może być zastosowana również w odniesieniu do innych organizmów wodnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Analiza środowiskowego DNA (eDNA)
- Techniki metabarkodowania
- Monitoring ekologiczny
Wstęp
- eDNA dostarcza informacji na temat bioróżnorodności i ekologii społeczności.
- Tradycyjne metody często wymagają inwazyjnych technik w celu uzyskania dostępu do filtrów.
- Niniejsza metoda pozwala na przetworzenie większych objętości wody.
- Filtrację i ekstrakcję DNA można przeprowadzić w środowisku sterylnym.
Cel badania
- Opracowanie nieinwazyjnej metody ekstrakcji eDNA.
- Ułatwienie monitorowania różnorodności biologicznej w ekosystemach wodnych.
- Poprawa wydajności metabarkodowania eDNA.
Zastosowane metody
- Podłączenie przewodów wysokiej próżni do pompy aspiracyjnej.
- Połączenie przewodów z kolektorem wyposażonym w zawory regulacyjne.
- Filtracja próbek wody przez wkład filtrujący.
- Ekstrakcja eDNA z filtra bez otwierania obudowy.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na skuteczną ekstrakcję eDNA z większych objętości wody.
- Zapewnia utrzymanie sterylności podczas procesu filtracji i ekstrakcji.
- Jest stosowalny w odniesieniu do różnych organizmów wodnych, poza rybami.
- Zwiększa niezawodność badań z zakresu metabarcodingu eDNA.
Wnioski
- Ta metoda upraszcza ekstrakcję eDNA z próbek wody.
- Wspiera ona badania ekologiczne, dostarczając solidne narzędzie do oceny różnorodności biologicznej.
- Przyszłe zastosowania mogą zostać rozszerzone na inne dziedziny monitoringu środowiska.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna ekstrakcja środowiskowego DNA (eDNA) z próbek wody o dużej objętości przy użyciu wkładów filtrujących umożliwia nieinwazyjne, wysokoprzepustowe monitorowanie różnorodności biologicznej w systemach wodnych. Podejście to wspiera wczesne odkrycia i walidację celów, dostarczając wiarygodnych, ilościowych danych o obecności gatunków bez zakłócania siedlisk. Skalowalność i sterylność tej metody mają bezpośrednie zastosowanie w zespołach biofarmaceutycznych opracowujących lub walidujących biomarkery środowiskowe oraz testy ekologiczne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących różnorodności biologicznej środowisk wodnych z wykorzystaniem eDNA jako molekularnego odczytu.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów ekologicznych poprzez pozyskiwanie kompleksowych danych o gatunkach z dużych objętości wody.
- Zwiększa wiarygodność predykcyjną w opracowywaniu biomarkerów środowiskowych dzięki standaryzowanemu, nieinwazyjnemu pobieraniu próbek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane próbki eDNA do dalszych etapów metabarcodingu oraz analiz molekularnych.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację testów poprzez zachowanie sterylności i minimalizację ryzyka kontaminacji.
- Umożliwia skalowalne, wysokoprzepustowe badanie próbek środowiskowych w celu detekcji i kwantyfikacji gatunków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami markerów translacyjnych, umożliwiając nieinwazyjne monitorowanie stanu zdrowia ekosystemu.
- Zapewnia ciągłość od pobierania próbek środowiskowych do analizy molekularnej, wspierając dostosowany do ryzyka rozwój testów ekologicznych.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w przedklinicznych badaniach środowiskowych poprzez dostarczanie ilościowych i powtarzalnych danych eDNA.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół filtracji i ekstrakcji integruje etapy pobierania próbek środowiskowych z opracowywaniem testów molekularnych, wspierając przepływy pracy od wczesnego etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie ścieżek w badaniach nad różnorodnością biologiczną organizmów wodnych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, zminimalizowane pod kątem zanieczyszczeń próbki eDNA, zapewniając wiarygodność dalszych analiz.
- Analityka: Dostarcza ilościowe wyniki detekcji gatunków do analiz porównawczych i statystycznych.
- Badania translacyjne: Umożliwia dostosowanie do biomarkerów stanu zdrowia ekosystemu oraz strategii monitorowania nieinwazyjnego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku, skalowalny protokół dla różnorodnych zastosowań eDNA w środowiskach wodnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celów ekologicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, sterylność i skalowalność procesów eDNA.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz efektywne kapitałowo opracowywanie testów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów biomarkerów środowiskowych i testów w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach sterylnych oraz w procedurach ekologii molekularnej.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury do filtracji próżniowej, inkubatorów oraz wirówek.
- Konieczna jest standaryzacja obsługi i etykietowania próbek pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych środowisk wodnych i objętości próbek.
- Skuteczność zależy od zwalidowanych protokołów oczyszczania i analizy DNA na dalszych etapach.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Assembly of the Filtration System
1:37
Filtration of Water Samples ≤4 L Using the Filter Cartridge
3:05
Filtration of Water Samples >4 L Using the Filter Cartridge
4:23
Extraction of eDNA from the Filter
6:57
Results: MiFish Metabarcoding of eDNA
7:23
Conclusion
