Zastosowanie wkładu filtracyjnego do filtracji próbek wody i ekstrakcji środowiskowego DNA
November 25th, 2016
Opisujemy protokół filtracji próbek wody za pomocą wkładu filtrującego i ekstrakcji środowiskowego DNA (eDNA) bez konieczności rozcinania obudowy w celu wyjęcia filtra. Protokół ten został opracowany do metabarkodowania eDNA ryb, ale ma również zastosowanie do eDNA z innych organizmów.
Ogólnym celem tego protokołu jest filtrowanie próbek wody za pomocą wkładu filtrującego i ekstrakcja środowiskowego DNA bez konieczności rozcinania obudowy w celu usunięcia filtra z metabarcodingu eDNA z różnych organizmów wodnych. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ekologii, takie jak monitorowanie różnorodności biologicznej i ekologia społeczności. Główną zaletą tej techniki jest to, że wkłady filtracyjne mogą pomieścić większe objętości wody, a filtracja i ekstrakcja DNA mogą być przeprowadzane w sterylny sposób.
Aby rozpocząć tę procedurę, podłącz rurkę o wysokiej próżni do złącza wejściowego pompy aspiratora. Podłącz drugi koniec rurki do kolektora. Upewnij się, że trzy czerwone zawory T na kolektorze są w pozycji wyłączonej.
Następnie załóż czysty zestaw rękawiczek. Włóż żeńską złączkę luer na górnym końcu gumowej rurki próżniowej. Następnie włóż złącze próżniowe na dolnym końcu.
Ostrożnie przymocuj żeńską złączkę luer do portu wylotowego wkładu filtra. Następnie przymocuj złącze próżniowe do silikonowego korka. Wlej jeden litr pobranej próbki wody do przygotowanej plastikowej torby.
Dołącz nakrętkę do męskiego złącza luer-lock. Następnie ostrożnie połącz port wlotowy zmontowanego wkładu filtrującego z męskim złączem luer-lock. Upewnij się, że wszystkie połączenia są bezpieczne.
Następnie zawieś plastikową torbę na dwóch zębach na panelu z siatki. Włóż silikonowy korek do portu wlotowego kolektora. Następnie włącz aspirator.
Otwórz czerwone zawory T w celu filtracji. Uruchom kolektor, aż wkład filtra wyschnie. Następnie zamknij czerwone zawory T.
Powtórz cały proces, aby przefiltrować żądaną ilość wody. Po przefiltrowaniu całej pobranej próbki wody ostrożnie wyjmij wkład filtra z plastikowej torby i pojemnika próżniowego. Zakryj oba końce wkładu odpowiednimi nasadkami typu luer.
Następnie, za pomocą długopisu odpornego na działanie rozpuszczalników, oznacz wkład i wlotową nasadkę luer. Przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do przeprowadzenia ekstrakcji DNA. W przypadku próbek większych niż cztery litry przygotuj dziesięciolitrową butelkę książkową, jak opisano w protokole tekstowym.
Dodać próbkę wody, która ma być przefiltrowana. Następnie szczelnie włóż dziesięciomililitrową końcówkę pipety do zaworu butelki z książką. Szczelnie włóż otwór wlotowy wkładu filtra do końcówki pipety.
Następnie włóż silikonowy korek do portu wlotowego kolektora. Włącz aspirator. Następnie otwórz czerwone zawory T w celu filtracji.
Uruchom kolektor, aż wkład filtra wyschnie. Po zakończeniu filtracji zamknij czerwone zawory T. Ostrożnie wyjmij wkład z plastikowej torby i złącza próżniowego.
Następnie zakryj oba końce wkładu odpowiednimi nasadkami typu luer. Użyj pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby oznaczyć wkład i nasadkę luer wlotową. Przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do przeprowadzenia ekstrakcji DNA.
Rozgrzej inkubator do 56 stopni Celsjusza. Następnie odetnij nakrętkę na zawiasach z rurki o pojemności 2,0 mililitra i wyrzuć nakrętkę. Zdejmij nasadkę luer wlotową z wkładu filtra.
Następnie włóż port wlotowy do rurki o pojemności 2.0 mililitra. Za pomocą folii samouszczelniającej szczelnie uszczelnij połączenie między wkładem a rurką zbiorczą. Następnie włóż połączoną jednostkę do adaptera wirówki do 15-mililitrowej stożkowej probówki.
Wirować wkład przez jedną minutę z prędkością 5000 razy g, aby usunąć pozostałą ciecz z filtra. Po zakończeniu wirowania wyjmij probówkę zbiorczą z wkładu filtra i wyrzuć probówkę. Następnie ponownie zamknij port wlotowy.
Następnie wymieszaj 20 mikrolitrów roztworu białka A-Case, 220 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i 200 mikrolitrów buforu AL. Zdejmij nasadkę wlotową i dodaj mieszaninę do wkładu za pomocą pipety, wkładając pipetę całkowicie do portu wlotowego. Zamknij port wlotowy. Następnie umieść wkład filtra na wytrząsarce obrotowej.
Umieść wytrząsarkę obrotową w nagrzanym inkubatorze i ustaw wytrząsarkę na 20 obr./min na 20 minut. Podczas inkubacji oznacz nową probówkę o pojemności 2,0 mililitra pisakiem odpornym na rozpuszczalnik. Następnie umieść go w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów.
Po zakończeniu inkubacji zdjąć nasadkę wlotową. Następnie włóż port wlotowy do nowej rurki o pojemności 2.0 mililitra. Zakryj stożkową rurkę zakrętką.
Wirować przez jedną minutę w temperaturze 5000 razy g, aby zebrać wyekstrahowane DNA. Następnie wyjmij wkład z rurki o pojemności 2,0 mililitra za pomocą wysterylizowanych kleszczy. Zakryj probówkę i oczyść wyekstrahowane DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
W tej procedurze cztery różne objętości wody morskiej są filtrowane na tym samym kolektorze za pomocą dwóch unikalnych filtrów, a następnie ekstrahowane jest eDNA. Wkład filtrujący wykrył średnio o 50% więcej gatunków niż filtry z włókna szklanego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak filtrować próbki wody za pomocą wkładu filtrującego i jak ekstrahować eDNA bez konieczności rozcinania obudowy w celu wyjęcia filtra z metabarcodingu eDNA z różnych organizmów wodnych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę filtrowania próbek wody za pomocą wkładu filtracyjnego w celu ekstrakcji środowiskowego DNA (eDNA) bez konieczności otwierania obudowy. Jest on przede wszystkim przeznaczony do metakodowania eDNA z ryb, ale może być również zastosowany do innych organizmów wodnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Analiza środowiskowego DNA (eDNA)
- Techniki metakodowania
- Monitorowanie ekologiczne
Tło
- eDNA dostarcza informacji o bioróżnorodności i ekologii społeczności.
- Tradycyjne metody często wymagają inwazyjnych technik dostępu do filtrów.
- Ta metoda pozwala na przetwarzanie większych objętości wody.
- Filtracja i ekstrakcja DNA mogą być przeprowadzane w sterylnym środowisku.
Cel badania
- Rozwój nieinwazyjnej metody ekstrakcji eDNA.
- Ułatwienie monitorowania bioróżnorodności w ekosystemach wodnych.
- Poprawa efektywności metakodowania eDNA.
Stosowane metody
- Przymocowanie wysokiego próżniowego przewodu do pompy aspiracyjnej.
- Podłączenie przewodu do kolektora z kontrolowanymi zaworami.
- Filtracja próbek wody przez wkład filtracyjny.
- Ekstrakcja eDNA z filtra bez otwierania obudowy.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie ekstrahuje eDNA z większych objętości wody.
- Utrzymuje sterylność podczas procesu filtracji i ekstrakcji.
- Może być stosowany do różnych organizmów wodnych poza rybami.
- Poprawia niezawodność badań metakodowania eDNA.
Wnioski
- Ta metoda upraszcza ekstrakcję eDNA z próbek wody.
- Wspiera badania ekologiczne, dostarczając solidnego narzędzia do oceny bioróżnorodności.
- Przyszłe zastosowania mogą rozszerzyć się na inne dziedziny monitoringu środowiska.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient extraction of environmental DNA (eDNA) from large-volume water samples using filter cartridges enables non-invasive, high-throughput biodiversity monitoring in aquatic systems. This approach supports early discovery and target validation by providing robust, quantitative data on species presence without disrupting habitats. The method's scalability and sterility are directly relevant for biopharma teams developing or validating environmental biomarkers and ecological assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of aquatic biodiversity using eDNA as a molecular readout.
- Supports functional validation of ecological targets by capturing comprehensive species data from large water volumes.
- Facilitates predictive confidence in environmental biomarker development through standardized, non-invasive sampling.
Screening & Assay Development
- Prepares validated eDNA samples for downstream metabarcoding and molecular analysis workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by maintaining sterility and minimizing contamination risk.
- Enables scalable, high-throughput screening of environmental samples for species detection and quantification.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling non-invasive monitoring of ecosystem health.
- Provides continuity from environmental sampling to molecular analysis, supporting risk-adjusted advancement of ecological assays.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical environmental studies by delivering quantitative, reproducible eDNA data.
Pipeline & Workflow Integration
This filtration and extraction protocol integrates at the interface of environmental sampling and molecular assay development, supporting workflows from early discovery through preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in aquatic biodiversity studies.
- Screening: Delivers assay-ready, contamination-minimized eDNA samples for reliable downstream analysis.
- Analytics: Provides quantitative species detection outputs for comparative and statistical analysis.
- Translational Research: Enables alignment with ecosystem health biomarkers and non-invasive monitoring strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable protocol for diverse aquatic eDNA applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in ecological target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, sterility, and scalability of eDNA workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient assay development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of environmental biomarker and assay programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique and molecular ecology workflows.
- Needs access to vacuum filtration, incubators, and centrifugation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for sample handling and labeling.
- Adaptable to various aquatic environments and sample volumes.
- Dependent on validated downstream DNA purification and analysis protocols.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Assembly of the Filtration System
1:37
Filtration of Water Samples ≤4 L Using the Filter Cartridge
3:05
Filtration of Water Samples >4 L Using the Filter Cartridge
4:23
Extraction of eDNA from the Filter
6:57
Results: MiFish Metabarcoding of eDNA
7:23
Conclusion
