Name: Zastosowanie wkładu filtracyjnego do filtracji próbek wody i ekstrakcji środowiskowego DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę filtracji próbek wody z wykorzystaniem wkładu filtracyjnego do ekstrakcji środowiskowego DNA bez otwierania obudowy. Ta technika umożliwia przetwarzanie większych objętości wody w warunkach sterylnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane jako badania podstawowe przez CREST z Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JST) oraz przez granty od JSPS/MEXT KAKENHI (Numer 26291083) i Fundacji Canon dla M.M. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, zbieraniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

UWAGA: Ten protokół nie zajmuje się próbkowaniem wody i metodami metabarkodowania. Próbki wody mogą być pobierane w różny sposób w zależności od celów badania16 i zob. Miya i wsp.12 dla szczegółowych informacji na temat metod metabarcodingu z wykorzystaniem starterów MiFish. Należy pamiętać, że próbka wody powinna być przechowywana w bardzo niskiej temperaturze i przefiltrowana w ciągu kilku godzin, aby uniknąć degradacji eDNA. Należy również pamiętać, że protokół ten obejmuje użycie wytrząsarki obrotowej i inkubatora, przy czym ten ostatni musi być wystarczająco duży, aby pomieścić ten pierwszy. Ponadto wirówka, która może pomieścić zarówno stożkowe probówki o pojemności 15 ml, jak i 50 ml, jest niezbędna do usunięcia pozostałej cieczy z filtra końcowego i zebrania wyekstrahowanego DNA we wkładzie odpowiednio.
1. Przetwarzanie nakrętki i plastikowej torby o pojemności 1 l
UWAGA: Pomiń ten krok, jeśli objętość filtracji wynosi >4 L.
<ol>
	<li>Wywierć otwór przez środek nakrętki (przymocowanej do jednorazowej plastikowej torby o pojemności 1 l) o tej samej średnicy (4.8 mm) co rurka wystająca z męskiego złącza luer-lock. Za pomocą szczypiec ukośnych skróć rurkę męskiego złącza luer-lock do odpowiedniej długości (ok. 3 mm), aby uniknąć zatkania niewielkiej ilości wody wewnątrz nasadki po filtracji.</li>
	<li>Nałóż klej klejowy przeznaczony do polietylenu (PE) i polipropylenu (PP) zarówno na spód, jak i powierzchnię męskiego złącza luer-lock i nakrętki. Odczekaj kilka minut, aby klej był dobrze wiążący (patrz instrukcje producenta).</li>
	<li>Włóż męskie złącze luer-lock do otworu w nakrętce. Poczekaj, aż obie części zostaną całkowicie połączone klejem (zwykle >24 godziny). Przed użyciem wysterylizuj nakrętkę z męskim złączem luer-lock z 10% dostępnym w handlu wybielaczem (ok. 0,6% podchlorynu sodu).</li>
	<li>Zrób dwa otwory w dwóch dolnych rogach plastikowej torby o pojemności 1 l, aby zawiesić ją na panelu z siatki (krok 3). Upewnij się, że średnica otworów jest większa niż średnica zębów na panelu z siatki.</li>
</ol>
2. Montaż systemu filtracji
<ol>
	<li>Podłącz rurkę wysokiego podciśnienia do złącza wejściowego pompy aspiratora, a drugi koniec rurki podłącz do kolektora. Upewnij się, że trzy czerwone zawory teowe kolektora są w pozycji "wyłączonej" (tj. poziomej).</li>
	<li>Zakładając czysty zestaw rękawiczek, włóż żeńską złączkę luer i złącze próżniowe odpowiednio na górnym i dolnym końcu gumowej rurki próżniowej w celu filtracji.</li>
	<li>Ostrożnie przymocuj żeńską złączkę luer do portu wylotowego wkładu filtra i przymocuj złącze próżniowe do silikonowego korka.</li>
</ol>
3. Filtracja próbek wody (≤4 L) za pomocą wkładu filtrującego
UWAGA: Pomiń ten krok, jeśli objętość filtracji wynosi >4 L. Ten system filtracji wymaga wolnostojącego panelu do zawieszenia plastikowej torby wypełnionej 1 litrem wody. Do montażu tego urządzenia przydałby się panel siatkowy, wiele zębów i stojak na panel, wszystkie dostępne w sklepach internetowych. Przed użyciem należy w autoklawie wlotowe i wylotowe nasadki luer wkładu filtra.
<ol>
	<li>Wlej 1 l próbki wody do plastikowej torebki i zamknij nakrętkę za pomocą męskiego złącza luer-lock.</li>
	<li>Ostrożnie połącz port wlotowy zmontowanego wkładu filtrującego z męskim złączem luer-lock plastikowej torby. Nie dokręcaj zbyt mocno złącza luer-lock; W przeciwnym razie urządzenie będzie przeciekać po rozpoczęciu pompowania. Upewnij się, że wszystkie połączenia są bezpieczne przed powieszeniem plastikowej torby na panelu z siatki.</li>
	<li>Ostrożnie zawieś plastikową torbę z wkładem filtra na dwóch bolcach na panelu siatkowym i włóż silikonowy korek do portu wlotowego kolektora.</li>
	<li>Włącz aspirator. Otwórz czerwone zawory T w celu filtracji. Uruchom kolektor, aż wkład filtra wyschnie, a następnie przekręć czerwony zawór T do pozycji wyłączonej.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.1-3.4, aż żądana ilość wody zostanie przefiltrowana. 
	UWAGA: Na 1 l wody pobranej z subtropikalnych raf koralowych filtracja trwa około trzech minut.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij wkład filtra z plastikowej torby i złącza próżniowego.</li>
	<li>Zakryj oba końce wkładu nasadkami luer wlotowymi i wylotowymi.</li>
	<li>Odpowiednio oznacz wkład i nasadkę luer wlotową za pomocą pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby uzyskać szybkoschnące i nierozmazujące się etykiety.</li>
	<li>Przechowywać wkład filtra w temperaturze -20 °C przed ekstrakcją DNA.</li>
</ol>
4. Filtracja próbek wody (>4 L) za pomocą wkładu filtrującego
Uwaga: Pomiń ten krok, jeśli objętość filtracji wody wynosi ≤4 L. Ten system filtracji wymaga 10-litrowej butelki książkowej wyposażonej w zawór i jednorazową końcówkę do pipety o pojemności 10 ml. Średnica wewnętrzna końcówki pipety o pojemności 10 ml (15,0 mm) i stożek końcówki powinny pasować odpowiednio do średnicy zewnętrznej zaworu (15,0 mm) i króćca wlotowego wkładu filtrującego. Oba połączenia są bezpiecznie utrzymywane podczas filtracji w pasowaniu ciernym. Wysterylizuj końcówkę pipety 10% dostępnym w handlu wybielaczem (ok. 0,6% podchlorynu sodu) przed użyciem.
<ol>
	<li>Przygotuj odpowiednią ilość próbki wody w butelce z książką. Szczelnie włóż końcówkę pipety o pojemności 10 ml do zaworu 10-litrowej butelki książkowej.</li>
	<li>Szczelnie włóż port wylotowy wkładu filtra do końcówki pipety i włóż silikonowy korek do portu wlotowego kolektora. Włącz aspirator. Otwórz czerwone zawory T w celu filtracji. Uruchom kolektor, aż wkład filtra wyschnie, a następnie przekręć czerwony zawór T do pozycji wyłączone. 
	UWAGA: W przypadku 10 l wody morskiej pobranej z subtropikalnych zewnętrznych raf koralowych filtracja zajmuje około 30-40 minut.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij wkład filtra z plastikowej torby i złącza próżniowego. Zakryj oba końce wkładu nasadkami luer wlotowymi i wylotowymi. Odpowiednio oznacz wkład i nasadkę luer wlotową za pomocą pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby uzyskać szybkoschnące i nierozmazujące się etykiety. Przechowywać wkład filtra w temperaturze -20 °C przed ekstrakcją DNA.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja eDNA z filtra
UWAGA: W krokach 4 i 5 używamy komercyjnego zestawu, w dużej mierze przestrzegając protokołu dla "krwi jądrowej" dostarczonego przez zestaw. Dla uproszczenia opisujemy procedurę przetwarzania pojedynczego wkładu. W praktyce zalecamy przetwarzanie 8 (lub maksymalnej liczby wirówek) lub mniej filtrów na raz.
<ol>
	<li>Rozgrzej inkubator do temperatury 56 °C.</li>
	<li>Przygotuj probówkę o pojemności 2,0 ml, odcinając nakrętkę na zawiasach z tuby. Wyrzuć nasadkę. 
	UWAGA: Ta rurka służy jako rurka zbiorcza dla pozostałej cieczy w filtrze.</li>
	<li>Zdejmij wlotową (NIE wylotową) nasadkę luer z wkładu filtra i włóż port wlotowy do rurki zbiorczej. Szczelnie uszczelnić połączenie między wkładem a rurką zbiorczą za pomocą folii samouszczelniającej.</li>
	<li>Włóż kombinowaną jednostkę do adaptera wirówki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować wkład o stężeniu 5 000 x g przez 1 minutę, aby usunąć pozostałą ciecz z filtra.</li>
	<li>Wyjmij rurkę zbiorczą z wkładu filtra i wyrzuć rurkę. Ponownie zamknij otwór wlotowy wkładu.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę 20 μl roztworu proteinazy-K, 220 μl PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami; brak w zestawie) i 200 μl buforu AL. 
	UWAGA: Wkład filtrujący mieści do czterech razy większą objętość mieszanki (ok. 1,8 ml).</li>
	<li>Zdjąć nasadkę wlotową i dodać mieszaninę (440 μl) do wkładu filtra za pomocą końcówki pipety. Włóż pipetę całkowicie do portu wlotowego tak, aby końcówka pipety była widoczna wewnątrz wkładu tuż nad membraną.</li>
	<li>Ponownie zakryj otwór wlotowy i umieść wkład filtra na wytrząsarce obrotowej.</li>
	<li>Umieścić wytrząsarkę obrotową w nagrzanym inkubatorze w temperaturze 56 °C i włączyć wytrząsarkę z prędkością 20 obr./min na 20 minut.</li>
	<li>Podczas inkubacji należy przygotować nową probówkę o pojemności 2,0 ml, odpowiednio oznaczyć probówkę za pomocą pisaka odpornego na działanie rozpuszczalników i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Pierwsza (2,0 ml) i druga probówka (50 ml) są używane odpowiednio do pobierania wyekstrahowanego DNA i do przechowywania probówki o pojemności 2,0 ml.</li>
	<li>Po inkubacji zdjąć nasadkę wlotową i włożyć otwór wlotowy (NIE wylotowy) wkładu do probówki o pojemności 2,0 ml w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zamknąć stożkową probówkę o pojemności 50 ml nakrętką.</li>
	<li>Odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml o pojemności 5 000 x g przez 1 minutę w celu zebrania wyekstrahowanego DNA z wkładu. Wyjmij wkład filtra i probówkę o pojemności 2,0 ml za pomocą wysterylizowanych kleszczyków i zakryj probówkę. Wyrzuć wkład filtra.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie wyekstrahowanego DNA
UWAGA: Eluujemy eDNA za pomocą buforu AE o pojemności 100 μl zamiast 200 μl podanych w instrukcji zestawu komercyjnego.
<ol>
	<li>Dodać 200 μl etanolu (96-100%) do wyekstrahowanego DNA w probówce o pojemności 2,0 ml z powyższego etapu (ok. 440 μl) i dokładnie wymieszać przez wirowanie.</li>
	<li>Odpipetować mieszaninę do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Wirować przy 5 000 x g przez 1 min. Wyrzucić przelew i probówkę zbiorczą.</li>
	<li>Umieścić kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml, dodać 500 μl buforu AW1 i wirować przez 1 minutę przy 5 000 x g. Wyrzucić przepływowy przepływ i probówkę zbiorczą.</li>
	<li>Umieścić kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml, dodać 500 μl buforu AW2 i wirować przez 3 minuty przy 20 000 x g. Wyrzucić przepływowy i probówkę zbiorczą.</li>
	<li>Przygotuj nową tubkę o pojemności 1,5 ml (brak w zestawie) i odpowiednio oznacz probówkę za pomocą wodoodpornego pisaka do szybkiego schnięcia i nierozmazywania etykietowania. Przenieść kolumnę wirową do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Eluuj DNA, dodając 100 μl buforu AE do środka błony kolumny spinowej. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować przy 6 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Wyrzuć kolumnę wirującą i zakryj rurkę. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+environmental+DNA+to+estimate+the+distribution+of+an+invasive+fish+species+in+ponds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds.</a> PLoS ONE. 8, e56584(2013).</li>
<li>Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+fish+biomass+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Estimation of fish biomass using environmental DNA.</a> PLoS ONE. 7, e35868(2012).</li>
<li>Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+near-extinct+European+weather+loach+in+Denmark+based+on+environmental+DNA+from+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples.</a> Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).</li>
<li>Jerde, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Asian+carp+DNA+as+part+of+a+Great+Lakes+basin-wide+surveillance+program%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Fish.+Aquat.+Sci%22%5BJournal%5D)">Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program.</a> Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).</li>
<li>Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BSight-unseen%26%2334%3B+detection+of+rare+aquatic+species+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Lett%22%5BJournal%5D)">&#34;Sight-unseen&#34; detection of rare aquatic species using environmental DNA.</a> Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).</li>
<li>Mahon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+eDNA+surveillance+sensitivity+for+detection+of+Asian+carps+in+controlled+and+field+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments.</a> PLoS ONE. 8, e58316(2013).</li>
<li>Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+fish+species+composition+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology%22%5BJournal%5D)">Surveillance of fish species composition using environmental DNA.</a> Limnology. 13, 193-197 (2012).</li>
<li>Keskin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+invasive+freshwater+fish+species+using+environmental+DNA+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Syst.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey.</a> Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).</li>
<li>Wilcox, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+rare+species+using+environmental+DNA%3A+the+importance+of+primer+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity.</a> PLoS ONE. 8, e59520(2013).</li>
<li>Thomsen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+a+diverse+marine+fish+fauna+using+environmental+DNA+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples.</a> PLoS ONE. 7, e41732(2012).</li>
<li>Kelly, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+DNA+to+improve+environmental+management%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Harnessing DNA to improve environmental management.</a> Science. 344, 1455-1456 (2014).</li>
<li>Miya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mifish%2C+a+set+of+universal+PCR+primers+for+metabarcoding+environmental+DNA+from+fishes%3A+detection+of+more+than+230+subtropical+marine+species%5BTitle%5D)+AND+%22Roy.+Soc.+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species.</a> Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088(2015).</li>
<li>Port, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+vertebrate+biodiversity+in+a+kelp+forest+ecosystem+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA.</a> Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).</li>
<li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+provides+a+%27snapshot%27+of+fish+distribution%3A+a+case+study+of+Japanese+jack+mackerel+in+Maizuru+Bay%2C+Sea+of+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan.</a> PLoS ONE. 11, e0149786(2016).</li>
<li>Valentini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+monitoring+of+aquatic+biodiversity+using+environmental+DNA+metabarcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding.</a> Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).</li>
<li>Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+The+detection+of+aquatic+animal+species+using+environmental+DNA+-+a+review+of+eDNA+as+a+survey+tool+in+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology.</a> J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).</li>
<li>Stewart, F. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+FJ+%22Microbial+metagenomics%2C+Metatranscriptomics%2C+and+metaprotenomics+Vol.+531+Methods+in+Enzymology%22">Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology</a>. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. (28), e1161(2009).</li>
<li>Smalla, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmalla%2C+K+%22Molecular+Microbial+Ecology+Manual%22">Molecular Microbial Ecology Manual</a>. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).</li>
<li>Thomsen, P. F., Willerslev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+-+An+emerging+tool+in+conservation+for+monitoring+past+and+present+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity.</a> Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).</li>
<li>Pedersen, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+and+modern+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Ancient and modern environmental DNA.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383(2015).</li>
<li>Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+basin+scale+application+of+environmental+DNA+assessment+for+rare+endemic+species+and+closely+related+exotic+species+in+rivers%3A+a+case+study+of+giant+salamanders+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Ecol%22%5BJournal%5D)">A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan.</a> J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).</li>
<li>Yamanaka, H., Minamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+environmental+DNA+of+fishes+as+an+efficient+method+of+determining+habitat+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol.+Indicators%22%5BJournal%5D)">The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity.</a> Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).</li>
<li>Moss, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliated+protists+from+the+nepheloid+layer+and+water+column+of+sites+affected+by+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+in+the+Northeastern+Gulf+of+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Deep+Sea+Res.+Pt+I%22%5BJournal%5D)">Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico.</a> Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).</li>
<li>Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metatranscriptomics+of+N2-fixing+cyanobacteria+in+the+Amazon+River+plume%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume.</a> The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).</li>
<li>Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+capture+and+extraction+methods+affect+detection+of+freshwater+biodiversity+from+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA.</a> Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).</li>
<li>Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+techniques+to+capture+and+extract+environmental+DNA+for+detection+and+quantification+of+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol.+Res%22%5BJournal%5D)">Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish.</a> Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).</li>
<li>Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLemarchand%2C+K+%22Sample+Preparation+Techniques+for+Soil%2C+Plant%2C+and+Animal+Samples%27Springer+Protocols+Handbooks%22">Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks</a>. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).</li>
<li>Turner, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+distribution+and+optimal+capture+of+aqueous+macrobial+eDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA.</a> Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).</li>
<li>Barnes, M. A., Turner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecology+of+environmental+DNA+and+implications+for+conservation+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Genet%22%5BJournal%5D)">The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics.</a> Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).</li>
<li>Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolymers+for+sample+collection%2C+protection%2C+and+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biopolymers for sample collection, protection, and preservation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).</li>
<li>Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+room+temperature+preservation+of+filtered+environmental+DNA+samples+and+assimilation+into+a+Phenol-Chloroform-Isoamyl+alcohol+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol.+Res%22%5BJournal%5D)">The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction.</a> Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W wielu badaniach metabarcodingu wykorzystujących próbki środowiskowe, takie jak woda i gleba, obróbka pofiltracyjna wkładu filtracyjnego przebiega na ogół w następujący sposób24,25: 1) rozcięcie lub pęknięcie obudowy za pomocą narzędzi ręcznych (obcinak do rurek lub szczypce); 2) wyjęcie filtra z wkładu; oraz 3) pocięcie filtra na małe kawałki za pomocą żyletki w celu ekstrakcji DNA. Aby uniknąć takich kłopotliwych i czasochłonnych procedur, które są podatne na zanieczyszczenie w laboratorium, wypróbowaliśmy ...

Środowiskowe DNA (eDNA) w środowisku wodnym odnosi się do materiału genetycznego znajdującego się w słupie wody. Ostatnie badania wykazały przydatność eDNA do wykrywania ryb z różnych środowisk wodnych, w tym stawów1-3, rzek4-8, strumieni9 i wody morskiej10-14. Większość z tych badań koncentrowała się na wykrywaniu pojedynczego lub kilku inwazyjnychgatunków 1,4-6,8,14 oraz rzadkich lub zagrożonych3,9, podczas gdy niektóre ostatnie badania próbowały jednoczesnego wykrywania wielu gatunków w lokalnych zbiorowiskach ryb7,9,12,13,15 i mezokosmosach11,12.
Drugie podejście nazywa się "metabarcoding", a metabarcoding eDNA wykorzystuje jeden lub wiele zestawów starterów PCR do koamplifikacji regionu genu w taksonomicznie zróżnicowanych próbkach. Następnie następuje przygotowanie biblioteki z indeksowaniem i dodawaniem adapterów, a indeksowane biblioteki są analizowane przez platformę sekwencjonowania równoległego o wysokiej przepustowości. Ostatnio Miya i wsp.Firma 12 opracowała uniwersalne startery PCR do metabarkodowania eDNA ryb (zwane "MiFish"). Startery MiFish są ukierunkowane na hiperzmienny region mitochondrialnego genu 12S rRNA (163-185 pz), który zawiera wystarczające informacje do identyfikacji ryb do rodziny taksonomicznej, rodzaju i gatunku, z wyjątkiem niektórych blisko spokrewnionych kongenerów. Wykorzystując te startery w metakodowaniu eDNA, Miya i wsp.12 wykryło ponad 230 subtropikalnych gatunków morskich ze zbiorników akwariowych o znanym składzie gatunkowym i raf koralowych w pobliżu akwarium.
Optymalizując protokół metabarcodingu, aby dostosować się do naturalnej wody morskiej o różnych poziomach stężenia eDNA od ryb, zauważyliśmy, że startery MiFish czasami nie wzmacniały regionu docelowego do późniejszego przygotowania biblioteki. Jedną z bardziej prawdopodobnych przyczyn tej nieudanej amplifikacji PCR jest brak odpowiedniej ilości matrycowego DNA zawartego w małych objętościach przefiltrowanej wody (tj. 1-2 L). Chociaż stężenie eDNA z określonej grupy taksonomicznej jest nieznane przed amplifikacją, filtracja dużych objętości wody (>1-2 l) byłaby prostym i skutecznym sposobem na zebranie większej ilości eDNA ze środowisk wodnych o ograniczonej liczebności ryb i biomasie, takich jak ekosystemy otwarte oceany i ekosystemy głębinowe.
W porównaniu do konwencjonalnie używanych w wielu badaniach eDNA ryb16, wkłady filtrujące mają tę zaletę, że przyjmują większe objętości wody przed zatkaniem17. W rzeczywistości niedawne badanie wykazało dużą objętość (>20 l) filtracji przybrzeżnych próbek wody morskiej przy użyciu wkładów filtracyjnych18. Ponadto są one pakowane pojedynczo i sterylne, a w obudowie filtra można przeprowadzić kilka etapów eksperymentalnego przepływu pracy, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo zanieczyszczenia z laboratorium19. Ta ostatnia cecha ma kluczowe znaczenie dla metabarcodingu eDNA, w którym ryzyko zanieczyszczenia pozostaje jednym z największych wyzwań eksperymentalnych20,21. Pomimo tych technicznych zalet wkładów filtracyjnych, nie zostały one wykorzystane w badaniach eDNA ryb z dwoma wyjątkami8,15.
Tutaj udostępniamy protokół filtracji próbek wody za pomocą wkładu filtrującego i ekstrakcji eDNA z jego filtra bez konieczności otwierania obudowy. Oferujemy również dwa alternatywne systemy filtracji wody w zależności od objętości wody (≤4 L lub >4 L). Aby porównać wydajność nowo opracowanego protokołu z poprzednio używanym protokołem z wykorzystaniem filtra z włókna szklanego w naszej grupie badawczej12,14,22,23, przeprowadzamy analizę metabarkodowania eDNA wody morskiej z ogromnego zbiornika akwariowego (7,500 m3) o znanym składzie gatunkowym i pokazujemy liczbę wykrytych gatunków pochodzących z obu protokołów jako reprezentatywne wyniki. Protokół ten został opracowany do metabarkodowania eDNA ryb, ale ma również zastosowanie do eDNA z innych organizmów.

<table><tbody><tr><td>Panel siatkowy</td><td>Iris Ohyama</td><td>MPP-3060-BE</td><td></td></tr><tr><td>Metalowy bolec</td><td>Iris Ohyama</td><td>MR12F</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na panel siatkowy Nr</td><td>marki</td><td>4184-9507</td><td>dostępny w Amazon Japan</td></tr><tr><td>Plastikowa torba 1 L z zakrętką</td><td>Yanagi</td><td>DP16-TN1000</td><td></td></tr><tr><td>Męskie złącze luer-lock</td><td>ISIS</td><td>11620</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipety 10 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 000.765</td><td></td></tr><tr><td>Butelka na książki 10 l z zaworem</td><td>As One</td><td>1-2169-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtr Sterivex-HV</td><td>Millipore</td><td>SVHVL10RC</td><td>oznaczany jako "wkład filtrujący" w całym ms i stosowany w protokole</td></tr><tr><td>Męska złączka Luer</td><td>As One</td><td>1-7379-04</td><td></td></tr><tr><td>Żeńska złączka</td><td>Luer As One</td><td>5-1043-14&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka luer wlotowa</td><td>ISIS</td><td>VRMP6</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka luer wylotowa</td><td>ISIS</td><td>VRFP6</td><td></td></tr><tr><td>Rurka wysokopróżniowa</td><td>As One</td><td>6-590-01</td><td></td></tr><tr><td>Złącze próżniowe</td><td>As One</td><td>6-663-02</td><td></td></tr><tr><td>Korek silikonowy</td><td>As One</td><td>1-7650-07</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz</td><td>As One</td><td>2-258-01</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator-GAS-1</td><td>As One</td><td>1-7483-21</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestaw tkanek (250)</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji DNA PowerWater Sterivex</td><td>MO BIO</td><td>14600-50-NF</td><td>oznaczony jako "zestaw opcjonalny" w wirówce stołowej ms</td></tr><tr><td></td><td>Kubota</td><td>Model 4000</td><td>Maksymalna prędkość obrotowa 6 000 obr./min</td></tr><tr><td>Rotor o stałym kącie nachylenia</td><td>Kubota</td><td>AT-508C</td><td></td></tr><tr><td>Adapter do probówki stożkowej 15 ml</td><td>Kubota</td><td>055-1280</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór stabilizujący RNAlater</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>oznaczony jako "folia samouszczelniająca"</td></tr></tbody></table>

zastosowanie wkładu filtracyjnego do filtracji próbek wody i ekstrakcji środowiskowego dna

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Ostatnie badania wykazały, że wykorzystanie środowiskowego DNA (eDNA) od ryb jest odpowiednie jako nieinwazyjne narzędzie do monitorowania. W większości tych badań wykorzystano filtry z włókien dyskowych do zbierania eDNA z próbek wody, chociaż w wielu badaniach mikrobiologicznych w środowiskach wodnych wykorzystano wkłady filtracyjne, ponieważ wkład ma tę zaletę, że mieści duże ilości wody i jest ogólnie łatwy w użyciu. W tym miejscu udostępniamy protokół filtracji próbek wody za pomocą wkładu filtracyjnego i ekstrakcji eDNA z filtra bez konieczności rozcinania obudowy. Główne części tego protokołu obejmują: 1) filtrację próbek wody (objętości wody ≤4 l lub >4 l); (2) ekstrakcja DNA z filtra za pomocą wytrząsarki rolkowej umieszczonej we wstępnie podgrzanym inkubatorze; oraz (3) oczyszczanie DNA przy użyciu komercyjnego zestawu. Za pomocą tego i poprzednio stosowanych protokołów przeprowadzamy analizę metabarcodingową eDNA pobranego z ogromnego zbiornika akwariowego (7 500 m3) o znanym składzie gatunkowym i pokazujemy liczbę wykrytych gatunków w bibliotece z dwóch protokołów jako reprezentatywne wyniki. Protokół ten został opracowany do metabarkodowania eDNA ryb, ale ma również zastosowanie do eDNA z innych organizmów.

Wyizolowanie i ilościowe oznaczenie wyłącznie eDNA ryb z wyekstrahowanego całkowitego eDNA jest technicznie trudne, ponieważ startery MiFish współamplifikują region docelowy u niektórych kręgowców niebędących rybami, takich jak ptaki i ssaki, dając produkty PCR o tej samej wielkości (ca. 170 bp)12. Zamiast kwantyfikacji eDNA ryb, przeprowadzamy analizę metabarkodingu MiFish eDNA z akwarium o znanym składzie gatunkowym, stosując dwie różne metody filtracji i ekstrakcji ...

Opisujemy protokół filtracji próbek wody za pomocą wkładu filtrującego i ekstrakcji środowiskowego DNA (eDNA) bez konieczności rozcinania obudowy w celu wyjęcia filtra. Protokół ten został opracowany do metabarkodowania eDNA ryb, ale ma również zastosowanie do eDNA z innych organizmów.

Zastosowanie wkładu filtracyjnego do filtracji próbek wody i ekstrakcji środowiskowego DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest filtrowanie próbek wody przy użyciu wkładu filtrującego oraz ekstrakcja środowiskowego DNA bez konieczności rozcinania obudowy w celu wyjęcia filtra, co służy do metabarcodingu eDNA z różnych organizmów wodnych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekologii, takie jak monitorowanie różnorodności biologicznej oraz ekologia społeczności. Główną zaletą tej techniki jest to, że wkłady filtrujące mogą pomieścić większe objętości wody, a filtracja i ekstrakcja DNA mogą być przeprowadzone w sposób sterylny.Aby rozpocząć tę procedurę, podłącz wężyk do wysokiej próżni do złącza wlotowego pompy aspiracyjnej. Drugi koniec wężyka podłącz do kolektora. Upewnij się, że trzy czerwone zawory T na kolektorze znajdują się w pozycji wyłączonej.Następnie załóż czystą parę rękawiczek. W górnym końcu gumowego przewodu próżniowego zamontuj żemskie złącze luerowskie. Następnie w dolnym końcu zamontuj łącznik próżniowy.Ostrożnie przymocuj żeńską końcówkę luer do otworu wylotowego wkładu filtra. Następnie przymocuj złączy próżniowe do silikonowego stopra. Wlej jeden litr pobranej wody do przygotowanej plastikowej torby.Zakręć nakrętkę z męskim łącznikiem Luer-lock. Następnie ostrożnie połącz wlot włożonego wkładu filtra z męskim łącznikiem Luer-lock. Upewnij się, że wszystkie połączenia są szczelne.Następnie zawieś plastikowy worek na dwóch zaczepach panelu z siatki. Włóż silikonowy korek do otworu wlotowego kolektora. Następnie włącz aspirator.Otwórz czerwone zawory T w celu filtracji. Uruchom kolektor, aż wkład filtra całkowicie wyschnie. Następnie zamknij czerwone zawory T.Powtórz cały ten proces, aby przefiltrować pożądaną ilość wody. Po przefiltrowaniu całej pobranej próbki wody ostrożnie wyjmij wkład filtra z plastikowej torby oraz pojemnika próżniowego. Zakręć oba końce wkładu odpowiednimi korkami Luer.Następnie, używając pisaka odpornego na rozpuszczalniki, należy opisać kasetę oraz nakrętkę wlotową Luer. Przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza do momentu przeprowadzenia ekstrakcji DNA. W przypadku próbek o objętości większej niż cztery litry, przygotować butelkę typu book bottle o pojemności dziesięciu litrów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Dodaj próbkę wody do przefiltrowania. Następnie szczelnie włóż końcówkę pipety dziesięciomililitrowej do zaworu butelki. Szczelnie włóż wlot wkładu filtra do końcówki pipety.Następnie wstaw korek silikonowy do wlotu kolektora. Włącz aspirator. Następnie otwórz czerwone zawory T, aby rozpocząć filtrację.Uruchom kolektor aż wkład filtra całkowicie wyschnie. Po zakończeniu filtracji zamknij czerwone zawory T. Ostrożnie wyjmij wkład z plastikowej torebki oraz z przyłącza próżniowego.Następnie zakręć oba końce wkładu odpowiednimi nakrętkami Luer. Użyj wodoodpornego markera, aby opisać wkład oraz nakrętkę Luer wlotową. Przechowywać w temperaturze 20°C do momentu przeprowadzenia ekstrakcji DNA.Podgrzej inkubator do 56 °C. Następnie odetnij zawiasową zakrętkę z probówki o pojemności 2,0 ml i wyrzuć ją. Zdejmij zatyczkę luer z wlotu wkładu filtrującego.Następnie wsuń wlot do probówki o pojemności 2,0 ml. Za pomocą folii samoprzylepnej szczelnie zamknij połączenie między kartridżem a probówką do zbierania. Kolejno umieść połączony zestaw w adapterze wirówki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.Wiruj kasetę przez jedną minutę przy 5000 ×g, aby usunąć pozostałą ciecz z filtra. Po zakończeniu wirowania wyjmij probówkę zbiorczą z kasety filtrującej i wyrzuć ją. Następnie ponownie zakręć port wlotowy.Następnie zmieszaj 20 µL roztworu białka A-Case, 220 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym oraz 200 µL buforu AL. Zdejmij nasadkę wlotową i za pomocą pipety wprowadź mieszaninę do kartridża, wkładając końcówkę pipety całkowicie do otworu wlotowego. Ponownie zakryj otwór wlotowy. Następnie umieść kartridż filtrujący na wytrząsarce rotacyjnej.Umieść wytrząsarkę rotacyjną w wstępnie podgrzanym inkubatorze i ustaw prędkość wytrząsania na 20 rpm na 20 minut. Podczas inkubacji opisz nową probówkę o pojemności 2,0 ml za pomocą pisaka odpornego na rozpuszczalniki. Następnie umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.Po zakończeniu inkubacji należy zdjąć nasadkę wlotową. Następnie wprowadź port wlotowy do nowej probówki o pojemności 2.0 ml. Zakręć probówkę stożkową za pomocą zakrętki.Wiruj przez jedną minutę przy 5000 ×g, aby zebrać wyekstrahowane DNA. Następnie wyjmij wkład z probówki 2,0 ml, używając sterylnej pęsety. Zakręć probówkę i oczyść wyekstrahowane DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W tej procedurze cztery różne objętości wody morskiej są filtrowane na tym samym kolektorze przy użyciu dwóch różnych filtrów, a następnie ekstrahuje się eDNA. Wkład filtracyjny wykrył średnio o 50% więcej gatunków niż filtry z włókna szklanego. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym przeprowadzeniu, procedura ta może zająć dwie godziny.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, jak filtrować próbki wody za pomocą wkładu filtrującego oraz jak ekstrahować eDNA bez konieczności rozcinania obudowy w celu wyjęcia filtra, w celu przeprowadzenia metabarkodowania eDNA z różnych organizmów wodnych.

use-filter-cartridge-for-filtration-water-samples-extraction

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisujemy metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0.22 μm, a następnie oczyszczania go za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Ten protokół służy do ekstrakcji i koncentracji białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej zebranej z wody morskiej, a następnie do generowania peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas.

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Dwie uzupełniające analizy atmosferycznych cząstek biologicznych z filtrów próbek powietrza są opisane tutaj: ekstrakcja i wykrywanie endotoksyny oraz DNA.

Analiza filtra z próbką powietrza pod kątem endotoksyn i zawartości DNA

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę ekstrakcji DNA prowirusa HIV z pełnej krwi, wykrywaną metodą ilościowego PCR. Protokół ten może zostać rozszerzony do wykorzystania w wykrywaniu innych markerów genetycznych lub przy użyciu alternatywnych metod amplifikacji.

Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Tutaj prezentujemy protokół do zbadania wpływu szczelinowania hydraulicznego na pobliskie strumienie, analizując ich wodne i osadowe zbiorowiska mikroorganizmów.

Ocena wpływu szczelinowania hydraulicznego na strumienie przy użyciu mikrobiologicznych sygnatur molekularnych

Tutaj prezentujemy prostą technikę oceny środowiskowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) poprzez zwiększenie proporcji niskocząsteczkowego DNA zewnątrzkomórkowego. Wcześniejsze leczenie 20%-30% PEG i 1,2 M NaCl pozwala na wykrycie zarówno genomowych, jak i przenoszonych horyzontalnie genów AMR. Protokół nadaje się do procesu bez zestawów z dodatkową optymalizacją.

Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Tutaj prezentujemy nowatorski protokół odzyskiwania morskiego eDNA poprzez zbieranie i filtrację próbek wody morskiej z działających promów i innych statków handlowych.

Pływające laboratorium: Standardowa procedura operacyjna pobierania i filtrowania próbek wody morskiej z działających promów do analizy środowiskowej DNA

Niezawodne i dokładne formy analizy DNA w terenie są kluczowe dla wielu branż. Niniejszy artykuł oferuje dwie metody analizy mikroorganizmów środowiskowych w terenie: 1) izolację DNA mikroorganizmów z próbek środowiskowych za pomocą zestawu terenowego do ekstrakcji biologicznej oraz 2) analizę DNA za pomocą jednostki qPCR w terenie.

Analiza DNA mikroorganizmów w terenie z wykorzystaniem zestawu do ekstrakcji biologicznej oraz jednostki qPCR

Protokół ten opisuje ustandaryzowany sposób zbierania próbek DNA środowiskowego waleni (eDNA) z jednostek obserwatorów wielorybów. Priorytetem jest wykonalność dla badaczy i wykwalifikowanych naukowców-obywateli, natomiast warunki środowiskowe, czas filtracji, mętność oraz logistyka pokładowa wyznaczają praktyczne ograniczenia zastosowania.

Pobieranie próbek DNA środowiskowych z jednostek obserwatorskich wielorybów w celu monitorowania waleni

Poznaj metodę filtracji próbek wody z wykorzystaniem wkładu filtracyjnego do ekstrakcji środowiskowego DNA bez otwierania obudowy. Ta technika umożliwia przetwarzanie większych objętości wody w warunkach sterylnych.

Zastosowanie wkładu filtracyjnego do filtracji próbek wody i ekstrakcji środowiskowego DNA

Przeglądaj więcej filmów