Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie monomerów typu lizyny i argininy do tej samej sekwencji peptamoidalnej oraz ocena aktywności tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytom wywołującym zaniedbaną chorobę tropikalną, jaką jest leiszmanioza. Pilnie potrzebne są nowe terapie w leczeniu leiszmaniozy skórnej, a ta procedura może pomóc w identyfikacji i opracowaniu peptoidów jako nowej klasy potencjalnych środków przeciwinfekcyjnych dla tej zaniedbanej choroby tropikalnej. Główną zaletą tego protokołu jest to, że można syntetyzować peptoidy, które zawierają mieszaną funkcjonalność kationową.

Jest to bardzo pożądane, ponieważ może pomóc w modulowaniu aktywności biologicznej sekwencji. Chociaż testuje się go przeciwko ssaczej formie pasożyta, może być również stosowany przeciwko stadiom owadów Leishmania mexicana lub stosowany do linii komórkowych ssaków. Wizualna demonstracja tej metody jest naprawdę przydatna, ponieważ pokazuje stopniową naturę syntezy, a także kulturę pasożytów w różnych momentach cyklu życiowego Leishmania mexicana.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować roztwory dimetyloformamidu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj 0,1 milimola żywicy amidowej chronionej przed Fmoc do zakrytego 20-mililitrowym polipropylenowym naczyniem reakcyjnym z dwoma frytkami. Dodać pięć mililitrów dimetyloformamidu i odstawić naczynie na 60 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie opróżnij DKZ za pomocą platformy próżniowej do ekstrakcji do fazy stałej. Następnie dodaj dwa mililitry przygotowanego roztworu piperydyny. Umieść naczynie na platformie wytrząsającej z prędkością 450 obr./min w temperaturze pokojowej i potrząsaj przez pięć minut.

Spuść roztwór za pomocą stacji próżniowej. Następnie dodaj dwa mililitry roztworu piperydyny i wstrząsaj w tych samych warunkach przez 15 minut. Po zakończeniu wstrząsania spuść roztwór przez stację próżniową.

Dodaj dwa mililitry DMF i mieszaj przez 30 sekund, aby zmyć żywicę. Odcedź DMF i powtórz pranie trzy razy. Aby rozpocząć syntezę submonomerów, dodaj jeden mililitr przygotowanego roztworu kwasu bromooctowego i 0,2 mililitra przygotowanego roztworu DIC.

Wstrząsaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odcedź roztwór i umyj go trzykrotnie, za każdym razem używając dwóch mililitrów DMF. Dodać jeden mililitr przygotowanego roztworu aminy.

Następnie potrząsaj żywicą przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór i umyj żywicę trzy razy, używając za każdym razem dwóch mililitrów DMF. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu kwasu bromooctowego i 0,2 mililitra roztworu DIC.

Wstrząsaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odcedź roztwór i umyj go trzykrotnie, za każdym razem używając dwóch mililitrów DMF. Aby wprowadzić monomer funkcjonalizowany guanidyną, dodaj jeden mililitr niezabezpieczonego roztworu diaminy do żywicy.

Wstrząsaj przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odcedź roztwór i trzykrotnie umyj żywicę dwoma mililitrami DMF. Dodaj 0,5 mililitra przygotowanego roztworu 2-acetylodimedonu.

Wstrząsaj przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odcedź roztwór i trzykrotnie umyj żywicę dwoma mililitrami DMF. Kontynuuj syntezę submonomeru, aż do uzyskania pożądanej sekwencji.

Następnie dodaj cztery mililitry przygotowanego roztworu hydrazyny i wstrząsaj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór i powtórz trzy razy. Następnie umyj żywicę trzy razy, używając dwóch mililitrów DMF na każde pranie.

Dodać DIPEA i sześć odpowiedników pirazola-1-karboksyamidyny na wolną aminę w sekwencji peptoidalnej. Wstrząsaj przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wstrząsania odcedź roztwór.

Umyj żywicę trzy razy, używając dwóch mililitrów dichlorometanu do każdego prania. Wysuszyć żywicę na powietrzu przez 10 minut i przechowywać do wykorzystania w przyszłości. Po dodaniu amin można przeprowadzić próbne rozszczepienie w celu sprawdzenia postępu syntezy.

Aby rozpocząć końcowe rozszczepienie, dodaj cztery mililitry koktajlu rozszczepienia do tego samego spiekanego wkładu reakcyjnego używanego do syntezy i przykryj naczynie. Wstrząsaj przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, za pomocą spiekanego naczynia reakcyjnego, przefiltrować koktajl łupliwy z żywicy do kolby okrągłodennej.

Odparuj koktajl łupliwy za pomocą parownika obrotowego. Dodaj dwa mililitry bezwodnego eteru dietylowego, aby wytrącić peptoid. Za pomocą pipety usuń eter dietylowy i wyrzuć.

Następnie powtórzyć trzykrotne wytrącanie eteru dietylowego. Po zakończeniu wytrącania rozpuść surowy peptoid w 10 mililitrach przygotowanego roztworu acetonitrylu i zakwaszonej wody. Przenieść do wstępnie zważonego pojemnika.

Następnie zamrażać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i liofilizować do suchego proszku gotowego do oczyszczenia metodą HPLC z odwróconymi fazami. Po wyhodowaniu pasożytów Leishmania mexicana i przekształceniu się w stadium amastigoty aksenowej, należy rozpocząć test cytotoksyczności, przygotowując roztwory podstawowe związków, jak opisano w protokole tekstowym. Dodać dwa mikrolitry pięciomilimolowego roztworu podstawowego peptydu, kontroli amfoterycyny B i kontroli DMSO do górnego rzędu płytki 96-dołkowej, jak opisano w protokole tekstowym.

Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 48 mikrolitrów świeżej pożywki do górnego rzędu. Dodać 25 mikrolitrów świeżej pożywki do wszystkich pozostałych rzędów. Następnie przeprowadzić seryjne rozcieńczanie, pipetując 25 mikrolitrów roztworu z górnego rzędu, dodając go do rzędu poniżej i mieszając.

Powtórzyć rozcieńczenia dla całej płytki, odrzucając ostatnie 25 mikrolitrów odpipetowanych z dolnego rzędu. Następnie przenieś kulturę pasożyta do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Wirować przez pięć minut w temperaturze 447 razy g.

Odlej stare podłoże i dodaj 10 mililitrów świeżego podłoża. Następnie za pomocą pipety delikatnie ponownie wymieszaj osad pasożytów w nowym podłożu. Policz za pomocą ulepszonego hemocytometru Neubauera i rozcieńcz kulturę do ośmiu milionów pasożytów na mililitr.

Po rozcieńczeniu kultury dodaj 25 mikrolitrów pasożytów do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 60 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji usunąć 40 mikrolitrów roztworu z każdej studzienki.

Dodać 90 mikrolitrów świeżej pożywki do każdego dołka i inkubować w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu żywotności komórek na bazie resazuryny do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Po zakończeniu inkubacji użyć czytnika płytek, aby zmierzyć fluorescencję. Przeanalizuj dane, usuwając średnie tło i porównując fluorescencję studzienek po normalizacji z resekcją do kontroli DMSO. W tym badaniu dwa peptoidy są syntetyzowane przy użyciu 120 miligramów żywicy amidowej każdy.

Produkty są oczyszczane za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a frakcje odpowiadające masie docelowej są łączone i otrzymywane w postaci białych proszków. Ilość zebrana dla dwóch peptoidów jest pokazana tutaj z wydajnością około 30% dla frakcji o czystości powyżej 90%. Czystość produktu ocenia się za pomocą analitycznej HPLC z odwróconymi fazami i wizualizuje się przy 220 nanometrach absorbancję szkieletu amidowego.

Oba peptoidy są postrzegane jako jednorodne. Reprezentatywne wyniki testów cytotoksyczności wobec L Mexicana przedstawiono tutaj. Pięciomilimolowe roztwory podstawowe związków są wytwarzane w DMSO klasy hodowli komórkowej i testowane w trzech egzemplarzach co najmniej dwa razy, aby zapewnić wiarygodne dane.

Można zauważyć, że peptoid B jest bardziej skuteczny niż peptoid A w zmniejszaniu odsetka żywotnych pasożytów, przy czym oba mają działanie zależne od dawki. Po obejrzeniu tej metody powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować, charakteryzować i oczyszczać peptoidy, które zawierają zarówno monomery typu lizyny, jak i argininy oraz jak używać ich w testach cytotoksyczności przeciwko Leishmania mexicana. Nasza metoda dodawania podwójnej funkcjonalności kationowej do peptoidów dodaje tylko jeden dodatkowy prosty krok do powszechnie stosowanej metody syntezy peptoidów submonomerów.

Stosując tę metodę, można dodać podmonomery typu lizyny lub argininy o różnych długościach, aby zwiększyć różnorodność bibliotek, na przykład z łańcuchami bocznymi o długości od dwóch do sześciu atomów węgla. Podczas próby syntezy peptoidów bardzo ważne jest, aby pamiętać o dokładnym umyciu żywicy między krokami, aby zapobiec niepożądanemu dodawaniu lub usuwaniu produktów. Metoda ta toruje naukowcom drogę do zbadania aktywności biologicznej mieszanych peptydów funkcjonalizowanych kationowo i porównania tej aktywności z tymi, które zawierają wyłącznie monomery typu lizyny lub argininy.

Wreszcie, nie zapominaj, że pasożyty i kilka odczynników używanych w tym protokole mogą być bardzo niebezpieczne. Dlatego ważne jest, aby zawsze używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej i w razie potrzeby pracować pod wyciągiem lub w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego.