Name: Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj metodę syntezy peptydoidów z mieszanymi monomerami lizyny i argininy oraz oceny ich aktywności przeciwko Leishmania mexicana. Ta technika umożliwia rozwój nowych leków przeciw leiszmaniozie skórnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Radzie Badań nad Naukami Inżynieryjnymi i Fizycznymi (EPSRC) za wsparcie finansowe (HLB). Dziękujemy również Sridévi Maalika Ramanoudjame za jej pomoc podczas filmowania tego zabiegu.

1. Synteza peptoidów w fazie stałej
UWAGA: Peptoidy są syntetyzowane ręcznie przy użyciu procedury submonomeru syntezy peptoidów w fazie stałej. Ta metoda pozwala na wysoką wydajność sprzęgania i dobrą wydajność produktu końcowego. Synteza w fazie stałej pozwala również na łatwe usunięcie nadmiaru reagentów na końcu każdego etapu, a metoda została tutaj zmodyfikowana, aby umożliwić włączenie różnych funkcjonalizowanych monomerów kationowych (tj. reszt typu argininy i lizyny) do tej samej sekwencji. 1,2
<ol>
	<li>Synteza liniowego peptoidu 
	Uwaga: Przed rozpoczęciem syntezy należy przeprowadzić ocenę bezpieczeństwa. Wszystkie reakcje należy przeprowadzać pod wyciągiem i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (tj. jednorazowe rękawice nitrylowe, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny). Zachowaj szczególną ostrożność podczas korzystania z następujących odczynników i rozpuszczalników. Podejrzewa się, że dimetyloformamid (DMF) jest teratogenem, a dichlorometan (DCM) jest czynnikiem rakotwórczym. N,N'-diizopropylokarbodimid (DIC) i piperydyna są niebezpieczne dla oczu, skóry, poprzez wdychanie oddechowe i mogą powodować uczulenie skóry. Hydrazyna jest podejrzewana o działanie rakotwórcze, śmiertelne w przypadku wdychania i powoduje poważne oparzenia skóry lub oczu. Kwas bromooctowy jest również niebezpieczny dla skóry, oczu i dróg oddechowych i może powodować oparzenia w kontakcie. Kwas trifluorooctowy (TFA) jest lotną cieczą i może powodować poważne oparzenia, dlatego należy obchodzić się z nim ostrożnie. Zalecane są rękawice o dużej wytrzymałości.
	<ol>
		<li>Dodać 0,12 g żywicy Rink Amide zabezpieczonej przed Fmoc (0,1 mmol, typowe obciążenie 0,7 mmol/g) do zakorkowanego 20 ml polipropylenowego naczynia reakcyjnego z dwoma frytkami. Dodać 5 ml dimetyloformamidu (DMF) w celu spęcznienia żywicy i pozostawić naczynie na co najmniej 60 minut w temperaturze pokojowej. Opróżnij DMF za pomocą platformy próżniowej do ekstrakcji do fazy stałej.</li>
		<li>Aby zdezprotect grupę Fmoc na spęczniałej żywicy, dodaj 2 ml roztworu piperydyny (20% w DMF v/v). Umieść naczynie na platformie wytrząsarki w temperaturze pokojowej (450 obr./min) i potrząsaj przez 5 minut. Usuń roztwór za pomocą stacji próżniowej.
		<ol>
			<li>Powtórz deochronę Fmoc z 2 ml roztworu piperydyny i wstrząsaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór jak poprzednio.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umyj żywicę, dodając 2 ml DMF i mieszając żywicę przez 30 sekund. Odcedź DMF i powtórz jeszcze trzy razy.</li>
		<li>Do acetylacji dodać 1 ml roztworu kwasu bromooctowego (0,6 M w DMF) i 0,2 ml roztworu N,N'-diizopropylokarbidiimidu (DIC, 50% w DMF v/v). Pozostawić naczynie reakcyjne do wstrząsania przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór i trzykrotnie przemyj żywicę 2 ml DMF.</li>
		<li>Do wyporności dodać 1 ml roztworu aminy (1,5 M w DMF). Wstrząsaj żywicą przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór i trzykrotnie przemyj żywicę 2 ml DMF.
		<ol>
			<li>Aby dodać monomer typu argininy, wykonaj krok 1.7. W zależności od pożądanej sekwencji peptoidowej zostaną dodane różne aminy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórz kroki 1.1.4 i 1.1.5.</li>
		<li>Aby dodać monomer funkcjonalizowany guanidyną (tj. NArg), dodaj 1 ml niezabezpieczonego roztworu diaminy (1,5 M w DMF) do żywicy i wstrząsaj przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
		<ol>
			<li>Odcedź roztwór i trzykrotnie przemyj żywicę 2 ml DMF.</li>
			<li>Dodać 2-acetylodimedon (0,2 g, 1 mmol w 0,5 ml DMF, 10 równoważników), aby dodać grupę Dde do wolnej pierwszorzędowej aminy i wstrząsać przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór i trzykrotnie przemyj żywicę 2 ml DMF.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kontynuować syntezę submonomeru jak w ppkt 1.1.4 do 1.1.7, aż do uzyskania pożądanej sekwencji. Dodaj 2 ml DMF, aby umyć żywicę i powtórz trzy razy.</li>
		<li>Aby zdezprotect grupę Dde na żywicy, dodaj 4 ml 2% roztworu hydrazyny (w DMF v/v) i wstrząsaj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór i powtórz trzy razy.</li>
		<li>Odcedź roztwór i trzykrotnie przemyj żywicę 2 ml DMF.</li>
		<li>Dodać pirazolo-1-karboksyamidynę (6 równoważników na wolną aminę, tj. na monomery NArg, w minimalnej objętości DMF) i N,N-diizopropyloetyloaminę lub DIPEA (6 równoważników na wolną aminę) i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 60 minut.</li>
		<li>Odcedzić roztwór i trzykrotnie przemyć żywicę 2 ml dichlorometanu. Pozostaw żywicę do wyschnięcia na powietrzu na 10 minut, a następnie żywicę można przechowywać do momentu rozszczepienia (sekcja 2).</li>
		<li>Aby wstrzymać syntezę, należy trzykrotnie przemyć żywicę 2 ml DMF. Dodać 2 ml DMF, zakorkować naczynie syntezy i pozostawić w temperaturze pokojowej w dygestoriach. 
		UWAGA: Synteza może być wstrzymana po każdym etapie przemieszczenia (z wyjątkiem drugiego etapu przemieszczenia, w którym mogą powstawać diketopiperazyny).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deprotekcja łańcucha bocznego i rozszczepienie z żywicy
	<ol>
		<li>Przeprowadzić próbne rozszczepienie w celu sprawdzenia postępu syntezy (czystość i masa) w dowolnym momencie syntezy po etapach przemieszczenia, dodaniu lub usunięciu grupy chroniącej przed Dde lub po wykonaniu końcowej sekwencji.
		<ol>
			<li>Przenieś około 10 kulek żywicy z naczynia reakcyjnego do nowego wkładu ze spiekanego polipropylenu o pojemności 8 ml.</li>
			<li>Dodać 1 ml koktajlu rozszczepiającego kwas trifluorooctowy (zawierającego 95% TFA, 2,5%H2O, 2,5% triizopropylosililanu) i wstrząsać przez 90 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Przefiltrować koktajl rozszczepienia TFA z żywicy za pomocą spiekanego naczynia reakcyjnego do kolby o okrągłym dnie o pojemności 10 ml.</li>
			<li>Odparować koktajl łupliwy za pomocą wyparki obrotowej i ponownie rozpuścić powstały olej w 1 ml acetonitrylu/wody w celu poddania LC-MS lub analitycznej HPLC.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Do końcowego rozszczepienia: w tym samym spiekanym polipropylenowym kartridżu reakcyjnym, który jest używany do syntezy, dodać 4 ml koktajlu rozszczepienia TFA (95% TFA, 2,5%H2O, 2,5% triizopropylosilanu) i przykryć naczynie. Wstrząsaj przez 90 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przefiltrować koktajl rozszczepienia TFA z żywicy za pomocą spiekanego naczynia reakcyjnego do kolby o okrągłym dnie o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odparuj koktajl łupliwy za pomocą parownika obrotowego. Po usunięciu TFA produkt powinien być otrzymywany w postaci oleju. Aby wspomóc usuwanie tłuszczów tłuszczowych z tej ropy naftowej, dodaj 2 ml bezwodnego eteru dietylowego, a peptoid powinien się wytrącić.
		<ol>
			<li>Usunąć eter dietylowy za pomocą pipety i wyrzucić lub odparować za pomocą wyparki obrotowej. Powtórz trzykrotne wytrącanie eteru dietylowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozpuścić surowy peptoid w 10 ml acetonitrylu/zakwaszonego roztworu wodnego (50% acetonitrylu, 0,1% TFA w wodzie v/v). Przenieść do wstępnie zważonego pojemnika, zamrozić w temperaturze 20 °C i liofilizować do postaci suchego proszku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterystyka i Oczyszczanie
UWAGA: Synteza peptoidów może być monitorowana, a końcowy peptoid oceniany za pomocą analitycznego HPLC z odwróconą fazą przy użyciu kolumny C18 i spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej metodą elektrorozpylania (LC-MS). Wszystkie rozpuszczalniki HPLC rozpuszczalników do LC-MS powinny być świeżo przygotowane.
<ol>
	<li>Analityczna HPLC
	<ol>
		<li>Odważyć 1 mg peptoidu w małej szklanej fiolce. Dodać minimalną objętość acetonitrylu do rozpuszczenia i rozcieńczyć wodą do 1 ml. Upewnij się, że peptoid całkowicie się rozpuścił.</li>
		<li>Wstrzyknąć 10 μl do analitycznej HPLC (sugerowany gradient 0 - 100% rozpuszczalnika B przez 30 minut, gdzie rozpuszczalnik A = 95% wody, 5% acetonitrylu, 0,05% TFA i rozpuszczalnik B = 95% acetonitrylu, 5% wody, 0,03% TFA), zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Wizualizacja widma UV przy 220 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ESI LC-MS
	<ol>
		<li>Przygotować 1 mg/ml roztworu peptydu, jak w kroku 2.1.1.</li>
		<li>Wstrzyknąć 1 μl do elektrosprayu LC-MS w celu określenia, czy obecna jest masa cząsteczkowa docelowego peptoidu, korzystając z instrukcji producenta.</li>
		<li>Sprawdź masę docelową sekwencji peptoidów za pomocą kalkulatora peptoidów, zgodnie z instrukcjami na kalkulatorze. 26 To narzędzie internetowe umożliwia również przypisanie dowolnych produktów usuwania/dodawania widocznych w spektrum masowym. 26</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparatywna HPLC z odwróconą fazą
	<ol>
		<li>Surowe peptoidy rozpuścić w 2 ml zakwaszonej wody/acetonitrylu (95% wody, 5% MeCN, 0,1% TFA) i oczyścić preparatywnym RP-HPLC przy użyciu protokołu producenta. Określić gradient na podstawie czasu elucji uzyskanego z analitycznej HPLC, a wstrzyknięta ilość będzie zależeć od wymiarów kolumny.</li>
		<li>Wizualizacja za pomocą detektora ustawionego na 220 nm.</li>
		<li>Zebrać frakcje do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml, zamrozić w temperaturze 20 °C i poddać liofilizacji.</li>
		<li>Ponowna analiza frakcji za pomocą LC-MS i analitycznej HPLC zgodnie z protokołem producenta. Rekombinuj oczyszczone frakcje.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Testy biologiczne przeciwko pasożytom Leishmania mexicana 
Uwaga: Oceny bezpieczeństwa muszą być przeprowadzone przed rozpoczęciem syntezy. Leishmania mexicana jest sklasyfikowana w Wielkiej Brytanii jako patogen grupy zagrożenia 2 i przed rozpoczęciem badań należy zastosować odpowiednie środki kontroli. Wszystkie prace muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego klasy 2 i w odpowiednim sprzęcie ochrony indywidualnej noszonym (tj. rękawicach nitrylowych, okularach ochronnych i fartuchu laboratoryjnym).
<ol>
	<li>Subkultura pasożytów
	<ol>
		<li>Rozmrozić 1 ml zamrożonego bulionu Leishmania mexicana M379 w temperaturze -150 °C, umieszczając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 sekund.</li>
		<li>Przenieść roztwór podstawowy do 10 ml pożywki Schneidera (o pH 7,0 uzupełnionej 15% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliny/streptomycyny) w kolbie do hodowli 3 komórek o średnicy 25 cm z niewentylowaną nasadką.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 26 °C przez 72 godziny.</li>
		<li>Zbadaj pasożyty pod mikroskopem (powiększenie 400x), aby sprawdzić stan. Powinny to być promastigoty w stadium owada, formy procykliczne w fazie logarytmicznej z wieloma dzielącymi się komórkami.</li>
		<li>Utrzymuj procykliczne promastygoty poprzez hodowlę pasożytów do stężenia 5 x 105 pasożytów/ml co trzy dni. Policz komórki za pomocą ulepszonego hemocytometru Neubauera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształcenie stadium owada L. mexicana w stadium ssaka forma aksoniczna amastigoty 27
	<ol>
		<li>Dzień 0: Przygotować 10 ml kultury pasożytów w stadium logarytmicznym przy 5 x 105 pasożytów/ml w pożywce Schneider's Insect (o pH 7,0 uzupełnionej 15% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) w kolbie do hodowli 3-komórkowej o średnicy 25 cm z niewentylowaną nasadką.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 26 °C przez 48 godzin.</li>
		<li>Dzień 3: Przenieść 10 ml kultury do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 447 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Odlej starą pożywkę i dodaj 10 ml pożywki Schneider's Insect (o pH 5,5, uzupełnionej 20% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny). Delikatnie zawiesić osad pasożytów w nowym podłożu za pomocą pipety.</li>
		<li>Policz liczbę pasożytów za pomocą ulepszonego hemocytometru Neubauera. Rozcieńczyć do stężenia 5 x 105 pasożytów/ml pożywką o pH 5,5 i przenieść do kolby do hodowli 3 komórek o średnicy 25 cm.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 26 °C przez około 6 dni.</li>
		<li>Dzień 9: Zbadaj pasożyty pod mikroskopem (400X). Powinny znajdować się w niereplikującym, zakaźnym stadium metacyklicznej promastygoty.</li>
		<li>Policz liczbę pasożytów za pomocą ulepszonego hemocytometru Neubauera. Rozcieńczyć do stężenia 5 x 105 pasożytów/ml pożywką o pH 5,5.</li>
		<li>Usunąć 10 ml hodowli komórkowej i przenieść do kolby do hodowli komórkowej. Inkubować w temperaturze 32 °C przez 5 dni.</li>
		<li>Dzień 14: Sprawdź wygląd pasożytów pod mikroskopem (400X). Powinny znajdować się w stadium patogennej amastigoty, pozbawione wici charakterystycznej dla promastigotów i gotowe do testu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test cytotoksyczności na amasztygotach aksenowych L. mexicana. 
	UWAGA: Testy biologiczne peptydów wykorzystują testy wysokoprzepustowe przeprowadzane na płytkach 96-dołkowych. Protokół ten opisuje badanie amestigoty L. mexicana axisticate, ale identyczne testy można również przeprowadzić na pasożytach w stadium promastigoty w odpowiednich pożywkach. Związki inkubuje się z pasożytami w stężeniach od 3 do 100 μM przez 60 minut, a następnie inkubuje przez 24 godziny po 10-krotnym rozcieńczeniu. Wyniki uzyskuje się poprzez pomiar fluorescencji studzienek po inkubacji za pomocą roztworu żywotności komórek na bazie resazuryny (np. alamarBlue).
	<ol>
		<li>Przygotować złożone roztwory podstawowe. Odważyć 1 mg końcowego oczyszczonego produktu peptyidowego za pomocą wagi analitycznej. Dodać odpowiednią objętość dimetylosulfotlenku (DMSO) klasy biologii molekularnej do stężenia 5 mM. Przygotować 6 μl porcji i zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwory związków na 96-dołkowych płytkach (zalecany układ płytek można zobaczyć w sekcji wyników, rysunek 6) w trzech powtórzeniach od 100 do 3 μM. Dodać 2 μl 5 mM roztworu podstawowego każdego związku w górnym rzędzie (tj. A). Dodaj 48 μl świeżej pożywki Schneider's Insect (o pH 5,5 i 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny(P/S)) do górnego rzędu za pomocą pipety wielokanałowej. Dodaj 25 μl pożywki Schneider's Insect do wszystkich pozostałych rzędów (B - F).
		<ol>
			<li>Przeprowadzić rozcieńczenie seryjne, pipetując 25 μl roztworu z górnego rzędu. Dodaj do poniższego rzędu i wymieszaj. Rozcieńczenia przeprowadzać do ostatniego rzędu, w którym należy wyrzucić ostatnie 25 μl roztworu.</li>
			<li>Stosować amfoterycynę B (zapasy 5 mM) jako kontrolę pozytywną i DMSO (2% roztwór) jako kontrolę ujemną w trzech egzemplarzach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować roztwór dla pasożytów: przenieść kulturę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 447 x g przez 5 minut. Odleć starą pożywkę i dodać 10 ml pożywki Schneider's Insect (o pH 5,5 i 20% FBS, 1% P/S).</li>
		<li>Delikatnie rozpuść osad pasożytów w nowej pożywce za pomocą pipety i policz za pomocą ulepszonego hemocytometru Neubauera. Rozcieńczyć kulturę do 8 x 106 pasożytów/ml.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 25 μl kultury L. mexicana. Inkubować płytki przez 60 minut w temperaturze 32 °C.</li>
		<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i pobrać 40 μl roztworu z każdej studzienki.</li>
		<li>Dodać 90 μl świeżej pożywki i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 32 °C.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 10 μl roztworu żywotności komórek na bazie resazuryny. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 32 °C.</li>
		<li>Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika płytek (λex = 540 nm, λem = 600 nm), zgodnie z instrukcjami producenta. Analizuj dane, usuwając średnie tło (tylko ze średnich odwiertów) i porównując fluorescencję studzienek po normalizacji w odniesieniu do kontroli DMSO.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+method+for+the+preparation+of+peptoids+oligo%28N-substituted+glycines%29+by+submonomer+solid-phase+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient method for the preparation of peptoids oligo(N-substituted glycines) by submonomer solid-phase synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992).</li>
<li>Bolt, H. L., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+method+for+the+synthesis+of+peptoids+containing+both+lysine-type+and+arginine-type+monomers%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A practical method for the synthesis of peptoids containing both lysine-type and arginine-type monomers.</a> Org. Biomol. Chem. 14, 1211-1215 (2016).</li>
<li>Mojsoska, B., Zuckermann, R. N., Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+study+of+novel+peptoids+that+mimic+the+structure+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship study of novel peptoids that mimic the structure of antimicrobial peptides.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2015).</li>
<li>Chongsiriwatana, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoids+that+mimic+the+structure%2C+function%2C+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2794-2799 (2008).</li>
<li>Eggimann, G. A., Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+Anti-leishmanial+Effects+of+Linear+Peptoids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating the Anti-leishmanial Effects of Linear Peptoids.</a> Chem Med Chem. 10, 233-237 (2015).</li>
<li>Kapoor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+Peptoids+Are+Effective+against+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial Peptoids Are Effective against Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3054-3057 (2011).</li>
<li>Ryge, T. S., Frimodt-Moller, N., Hansen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activities+of+twenty+lysine-peptoid+hybrids+against+clinically+relevant+bacteria+and+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activities of twenty lysine-peptoid hybrids against clinically relevant bacteria and fungi.</a> Chemotherapy. 54, 152-156 (2008).</li>
<li>Huang, M. L., Benson, M. A., Shin, S. B. Y., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+Cyclic+Peptoids+That+Exhibit+Antimicrobial+Activity+by+Disrupting+Staphylococcus+aureus+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic Cyclic Peptoids That Exhibit Antimicrobial Activity by Disrupting Staphylococcus aureus Membranes.</a> Eur. J. Org. Chem. , 3560-3566 (2013).</li>
<li>Huang, M. L., Shin, S. B. Y., Benson, M. A., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+Linear+and+Cyclic+Peptoid+Oligomers+as+Potent+Antimicrobial+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">A Comparison of Linear and Cyclic Peptoid Oligomers as Potent Antimicrobial Agents.</a> Chem Med Chem. 7, 114-122 (2012).</li>
<li>Bolt, H. L., Eggimann, G. A., Denny, P. W., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarging+the+Chemical+Space+of+Anti-leishmanials%3A+a+Structure-Activity+Relationship+Study+of+Peptoids+against+Leishmania+mexicana%2C+a+Causative+Agent+of+Cutaneous+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Chem+Comm%22%5BJournal%5D)">Enlarging the Chemical Space of Anti-leishmanials: a Structure-Activity Relationship Study of Peptoids against Leishmania mexicana, a Causative Agent of Cutaneous Leishmaniasis.</a> Med Chem Comm. , (2016).</li>
<li>The World Health Organisation. Leishmaniasis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/leishmaniasis/en/">http://www.who.int/leishmaniasis/en/</a> (2016).</li>
<li>Chon, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+overuse+and+resistance+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+therapy%22%5BJournal%5D)">Antibiotic overuse and resistance in dermatology.</a> Dermatologic therapy. 25, 55-69 (2012).</li>
<li>Alvar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis+Worldwide+and+Global+Estimates+of+Its+Incidence%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence.</a> PLOS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+of+trypanosomiases+and+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis.</a> Trends Parasitol. 21, 508-512 (2005).</li>
<li>Kedzierski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis+Vaccine%3A+Where+are+We+Today%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Global+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today?</a> J Global Infect Dis. 2, 177-185 (2010).</li>
<li>Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in leishmaniasis.</a> Clin Microbiol Rev. 19, 111-126 (2006).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+from+Host-Defense+Peptides%3A+Cationic%2C+Amphipathic+Peptoids+with+Potent+Anticancer+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Learning from Host-Defense Peptides: Cationic, Amphipathic Peptoids with Potent Anticancer Activity.</a> PLOS ONE. 9, (2014).</li>
<li>Wender, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Design%2C+Synthesis%2C+and+Evaluation+of+Molecules+That+Enable+or+Enhance+Cellular+Uptake%3A+Peptoid+Molecular+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13003-13008 (2000).</li>
<li>Schröder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoidic+Amino-+and+Guanidinium-Carrier+Systems%3A+Targeted+Drug+Delivery+into+the+Cell+Cytosol+or+the+Nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptoidic Amino- and Guanidinium-Carrier Systems: Targeted Drug Delivery into the Cell Cytosol or the Nucleus.</a> J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).</li>
<li>Kömel, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptoids%3A+Introduction+of+novel+cationic+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptoids: Introduction of novel cationic side chains.</a> Eur. J. Med. Chem. 79, 231-243 (2014).</li>
<li>Hein-Kristensen, L., Knapp, K. M., Franzyk, H., Gram, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+membrane+activity+of+%CE%B1-peptide%2F%CE%B2-peptoid+chimeras%3A+Influence+of+amino+acid+composition+and+chain+length+on+the+activity+against+different+bacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial membrane activity of α-peptide/β-peptoid chimeras: Influence of amino acid composition and chain length on the activity against different bacterial strains.</a> BMC Microbiology. 11, 1-12 (2011).</li>
<li>Su, Y., Doherty, T., Waring, A. J., Ruchala, P., Hong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Arginine+and+Lysine+Residues+in+the+Translocation+of+a+Cell-Penetrating+Peptide+from+%2813%29C%2C+%2831%29P+and+%2819%29F+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Roles of Arginine and Lysine Residues in the Translocation of a Cell-Penetrating Peptide from (13)C, (31)P and (19)F Solid-State NMR.</a> Biochem. 48, 4587-4595 (2009).</li>
<li>Andreev, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidino+groups+greatly+enhance+the+action+of+antimicrobial+peptidomimetics+against+bacterial+cytoplasmic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes.</a> BBA Biomembranes. 1838, 2492-2502 (2014).</li>
<li>Foged, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+membrane-destabilising+properties+of+alpha-peptide%2Fbeta-peptoid+chimeras%3A+lessons+for+the+design+of+new+cell-penetrating+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and membrane-destabilising properties of alpha-peptide/beta-peptoid chimeras: lessons for the design of new cell-penetrating peptides.</a> BBA Biomembranes. 1778, 2487-2495 (2008).</li>
<li>Vedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiplasmodial+and+prehemolytic+activities+of+alpha-peptide-beta-peptoid+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Antiplasmodial and prehemolytic activities of alpha-peptide-beta-peptoid chimeras.</a> Chem Bio Chem. 8, 1781-1784 (2007).</li>
<li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pep-Calc.com%3A+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Computer-Aided+Mol+Des%22%5BJournal%5D)">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> J Computer-Aided Mol Des. , 1-7 (2016).</li>
<li>Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+developmental+cycle+of+Leishmania+mexicana+in+axenic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture.</a> Parasitol. 108, 1-9 (1994).</li>
<li>Gossage, S. M., Rogers, M. E., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+separate+growth+phases+during+the+development+of+Leishmania+in+sand+flies%3A+implications+for+understanding+the+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle.</a> Int J Parasitology. 33, 1027-1034 (2003).</li>
<li>Seo, J., Lee, B. C., Zuckermann, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSeo%2C+J+%22Comp+Biomaterials%22">Comp Biomaterials</a>. Ducheyne, P., et al. 2, Elsevier. 53-76 (2011).</li>
<li>Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dde+-+A+selective+primary+amine+protecting+group%3A+A+facile+solid+phase+synthetic+approach+to+polyamine+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Lett%22%5BJournal%5D)">Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates.</a> Tetrahedron Lett. 37, 2625-2628 (1996).</li>
<li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+%28alpha-peptoids%29+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (alpha-peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li>
<li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+Submonomer+Synthesis+of+Peptoid+Polymers+and+their+Self-Assembly+into+Highly-Ordered+Nanosheets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets.</a> J Vis Exp. , e3373(2011).</li>
<li>Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+unprotected+heterocyclic+side+chains+into+peptoid+oligomers+via+solid-phase+submonomer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).</li>
<li>Nakayama, G. R., Caton, M. C., Nova, M. P., Parandoosh, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+Alamar+Blue+assay+for+cellular+growth+and+viability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro.</a> J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Peptoidy są coraz częściej badane w dziedzinach biologii chemicznej i chemii medycznej w zastosowaniach takich jak nowe terapie3-5, środki do dostarczania komórek18,20 i narzędzia diagnostyczne. 29 Zazwyczaj sekwencje te są kationowe, aby zapewnić pewien stopień selektywności patogenu w stosunku do komórek ssaków, zdolność przenikania przez błony komórkowe, a także wspomagać rozpuszczalność w układach wodnych. W literaturze istnieje wiele przykładów peptydów kationowych, które zawierają wyłącznie reszty mimetyczne lizyny lub argininy. Jednak do tej pory synteza peptoidów, które zawierają obie te reszty kationowe w tej samej sekwencji, była utrudniona z powodu braku odpowiedniej procedury syntezy. Opisany tutaj protokół pozwala na wydajną syntezę mieszanych peptydów kationowych i jest wysoce pożądany, ponieważ oferuje drogę do modulacji właściwości biologicznych i chemicznych peptydów amfipatycznych.
Nasza metoda wykorzystuje adaptację do powszechnie stosowanej syntezy peptydów submonomerów i pozwala na dodanie monomerów typu lizyny i argininy w tej samej sekwencji. Wykorzystuje ona sprzężenia temperatury pokojowej i ustaloną chemię grup ochronnych, więc przewiduje się, że metoda ta będzie przydatna dla większości grup badawczych. Aby dodać ortogonalną ochronę dla reszty typu argininy, niezabezpieczona diamina jest dodawana w standardowych warunkach wypierania, a następnie zabezpieczana w 60-minutowym sprzężeniu z Dde-OH. Można stosować różne diaminy, co pozwala na zainstalowanie łańcuchów bocznych o długości od 2 atomów węgla do 6 atomów węgla, tj. odpowiednio 1,2-diaminoetan do 1,6-diaminoheksanu. Ochronny Dde-OH dobrze rozpuszcza się w DMF i jest bardzo wydajną i selektywną grupą ochronną dla amin pierwszorzędowych. Grupa ochrony Dde pozostawia nienaruszone aminy drugorzędowe, np. niechroniony koniec N łańcucha peptoidalnego. 30 Jednym z ograniczeń jest to, że cała synteza została przeprowadzona ręcznie; Przewiduje się jednak, że opracowane warunki sprzężenia sprawiają, że metoda ta może być stosowana w zautomatyzowanych syntezatorach peptydów/peptydów.
Deprotekcja grup Dde na żywicy jest przeprowadzana przy użyciu 2% roztworu hydrazyny w DMF w celu pozostawienia wolnych amin, które mogą być guanidynylowane na żywicy przy użyciu pirazolu-1-karboksyamidyny. Na każdą wolną aminę na żywicy stosuje się sześć równoważników pirazolo-1-karboksyamidyny i sześć równoważników DIPEA (tj. sześć równoważników dla każdego monomeru typu NArg, który ma być zainstalowany). Ponownie, ta reakcja jest również wydajna, a odczynnik pirazolo-1-karboksyamidyny ma dobrą rozpuszczalność w DMF. Zakończenie reakcji jest zwykle obserwowane przez LC-MS po 60 minutach w temperaturze pokojowej.
Ze względu na wszechstronność metody submonomerów, na etapie przemieszczenia można stosować szeroką gamę amin pierwszorzędowych, więc może być konieczna optymalizacja warunków w celu zwiększenia wydajności sprzęgania i ogólnej wydajności lub czystości produktu. 31 W przypadku omówionych powyżej sekwencji nie były konieczne żadne specjalne warunki dla udanego sprzężenia. Jednak dłuższe czasy przemieszczenia lub wyższe stężenia amin mogą być stosowane do problematycznych przemieszczeń (tj. do słabo nukleofilowych lub sterycznie masywnych amin). Niektóre aminy mogą nie być całkowicie rozpuszczalne w DMF, w takim przypadku zaleca się ich rozpuszczenie w N-metylo-2-pirolidonie (NMP) lub innych odpowiednich rozpuszczalnikach do reakcji w fazie stałej, tak jak w poprzedniej kompleksowej metodzie syntezy submonomerów peptoidów. 32 Wykazano, że w celu włączenia monomerów, które zawierają niezabezpieczone heteroatomy w łańcuchach bocznych, acetylacja przy użyciu kwasu chlorooctowego jest skuteczna w innych grupach. 33 Dodatkowo, inne żywice mogą być używane tą metodą do otrzymywania peptoidów o różnej funkcjonalizacji C-końca. Żywice Wang i żywice chlorku 2-chlorotrytylu są rutynowo stosowane w syntezie submonomerów peptoidów. Na przykład metoda ta jest z powodzeniem stosowana w przypadku żywicy chlorku 2-chlorotrytylu w naszej grupie. 2 Różne stałe podłoża będą wymagały innej procedury ładowania niż omówiona tutaj Rink Amide (w zależności od konkretnej użytej żywicy), dlatego przed syntezą należy to sprawdzić w literaturze.
Podobnie jak w przypadku syntezy peptydów, warunki ostatecznego rozszczepienia peptoidu z żywicy mogą być również zoptymalizowane pod kątem określonej sekwencji. W tym protokole użyto koktajlu rozszczepienia TFA (z triizopropylosilanem i wodą jako padlinożercami). Przedstawione tutaj peptoidy zawierały tylko ochronę Boc, która jest dość kwasowo-labilną grupą. Aby zapewnić całkowitą deprotekcję sekwencji z większym udziałem chronionych pozostałości lub mniej kwasowo-labilnych grup ochronnych, konieczne mogą być dłuższe czasy rozszczepienia (tj. czasy rozszczepienia przekraczające 2 godziny są zalecane dla sekwencji zawierających grupy chronione Pbf lub trzeciorzędowe estru butylowe). Alternatywne zmiatacze mogą być również stosowane do wyspecjalizowanych łańcuchów bocznych (na przykład etanedithiol lub 2-merkaptoetanol są często stosowane w peptydach, które mają łańcuchy boczne zawierające siarkę, takie jak cysteina lub metionina).
Przedstawiony test biologiczny jest standardowym testem cytotoksyczności, który można zmienić w celu dopasowania do różnych linii komórkowych. Ważne jest, aby pamiętać, że każda 96-dołkowa płytka powinna zawierać wystarczającą ilość kontrol, aby dać pewność uzyskanym wynikom. W tym przypadku amfoterycyna B jest stosowana jako kontrola pozytywna, ponieważ jest znanym lekiem stosowanym w leczeniu choroby, a DMSO jest stosowany jako kontrola ujemna, ponieważ jest to rozpuszczalnik używany do wytwarzania związków wyjściowych do testu. Jeżeli wykorzystywane są inne linie komórkowe, przed użyciem należy uzyskać alternatywne, odpowiednie kontrole i je zwalidować. L. mexicana inkubuje się z peptyidem w stężeniach od 100 do 2 μM przez jedną godzinę, a następnie roztwór pasożyta/peptoidu rozcieńcza się dziesięciokrotnie w celu inkubacji przez noc (tj. studzienki początkowo zawierające 100 μM peptydu rozcieńcza się do 10 μM).
Odczynnik żywotności komórek dodaje się do każdego dołka (10% całkowitej objętości studzienki) na koniec testu. Widoczna zmiana koloru jest widoczna między studzienkami z żywotnymi pasożytami (różowy), studzienkami kontrolnymi bez żywotnych pasożytów (niebieski) i widmem pomiędzy ze średnią liczbą żywotnych pasożytów. Fluorescencja jest proporcjonalna do liczby żywych komórek i odpowiada aktywności metabolicznej komórek; Barwnik resazurynowy (niefluorescencyjny) jest przekształcany w fluorescencyjną rezorufinę w reakcjach redukcji w komórkach aktywnych metabolicznie. 34 W tym teście czas inkubacji z odczynnikiem żywotności komórek został zoptymalizowany dla L. mexicana. Czas inkubacji z odczynnikiem żywotności będzie różny dla płytek wysiewanych w różnych stężeniach komórek lub z różnymi liniami komórkowymi (na przykład ta metoda może być również stosowana w przypadku komórek ssaków). W zależności od dokładnego zastosowanego czytnika płytek, przed wykonaniem pomiarów fluorescencji należy wziąć pod uwagę te kwestie. Wszelkie pęcherzyki powietrza w studzienkach należy usunąć, aby zapewnić dokładne odczyty. Niektóre czytniki płytek odczytują od spodu płytek, w takim przypadku należy użyć 96-dołkowych płytek z płaskim dnem. Inne maszyny mogą odczytywać od góry płytki, dlatego pokrywę płytki należy zdjąć przed pomiarem.
Wreszcie, w przyszłości protokół ten może być kompatybilny z automatycznymi syntezatorami, które są w stanie tworzyć wiele sekwencji równolegle. Dodatkowo przy użyciu tej metody możliwa jest również synteza cyklicznych peptoidów. Protokół ten powinien zapewnić naukowcom praktyczną procedurę syntezy, którą można wykorzystać do uzyskania dostępu do nowych rusztowań peptyidowych z monomerami typu lizyny i argininy, które mogą być przydatne w wielu zastosowaniach, w tym w materiałach lub dziedzinach medycznych.

Peptoidy (lub glicyny z podstawionymi poli-N) to klasa mimetyki peptydów, które oferują podobne właściwości do peptydów i jako takie są coraz częściej badane pod kątem zastosowań medycznych i materiałowych. W peptydach łańcuch boczny każdego aminokwasu jest połączony z α-węglem szkieletu amidowego; W peptydach łańcuchy boczne są przesunięte na atom azotu szkieletu. Co najważniejsze, daje to peptoidom większą odporność na proteolizę.
Peptoidy są powszechnie syntetyzowane przy użyciu metody submonomerów zapoczątkowanej przez Zuckermanna i wsp., gdzie monomery peptoidowe mogą być budowane przez sekwencyjną haloacetylację funkcji aminy przyłączonej do stałego nośnika, a następnie przemieszczenie halogenu za pomocą pierwotnej aminy. 1 Nasza grupa opracowała niedawno adaptację do tej metody submonomerów, aby umożliwić po raz pierwszy włączenie reszt peptoidowych typu lizyny i argininy do tej samej sekwencji peptoidów. 2 To ręczne podejście do syntezy peptoidów w fazie stałej wykorzystuje dostępne na rynku odczynniki i powszechny sprzęt laboratoryjny, dzięki czemu jest dostępne dla większości laboratoriów. Wykazano, że peptoidy mają obiecujące działanie przeciwko szerokiej gamie bakterii Gram-ujemnych, bakterii Gram-dodatnich i gatunków grzybów, które są porównywalne z wieloma znanymi peptydami przeciwdrobnoustrojowymi. 3-9
W naszej pracy, peptoidy zostały użyte jako nowe związki przeciwinfekcyjne do leczenia zaniedbanej choroby tropikalnej leiszmaniozy. Leiszmanioza jest chorobą endemiczną w ponad 80 krajach na całym świecie i szacuje się, że na całym świecie zarażonych jest ponad 12 milionów ludzi. 11 Choroba jest wywoływana przez pasożyty pierwotniaków, które są przenoszone przez ukąszenie muchy piaskowej. Gatunki Leishmania mogą powodować leiszmaniozę skórną, stan, który prowadzi do bliznowacenia i uszkodzenia błon śluzowych, lub zagrażającą życiu leiszmaniozę trzewną, która powoduje śmiertelne uszkodzenie narządów. Obecnie nie jest dostępna żadna szczepionka przeciwko tej chorobie, a istniejące metody leczenia opierają się na niewielkiej liczbie leków, które mają poważne skutki uboczne. Ponadto oporność na istniejące leki jest pojawiającym się i poważnym problemem, dlatego pilnie potrzebne są nowe metody leczenia, aby skutecznie leczyć leiszmaniozę w przyszłości. 12-16
W tych przeciwbakteryjnych zastosowaniach, peptoidy są często projektowane jako amfipatyczne z mieszaniną kationowych i hydrofobowych monomerów. 3,4 Może to nadać peptoidom pewien stopień selektywności w stosunku do komórek bakteryjnych, zmniejszyć toksyczność dla komórek ssaków i poprawić ich aktywność jako transporterów molekularnych. 17-20 Większość peptoidów przeciwinfekcyjnych w literaturze zawiera kationowe łańcuchy boczne, które składają się wyłącznie z funkcjonalizowanych aminowo monomerów typu lizyny lub reszt typu argininy. Chimery peptydowo-peptoidowe, w których łańcuchy kationowe składają się z aminokwasów lizyny lub argininy, zostały również zsyntetyzowane w celu zbadania wpływu grup kationowych na aktywność i toksyczność. 21-25
Peptoidy polilizynowe mogą być łatwo syntetyzowane przy użyciu dostępnych na rynku amin chronionych przez Boc. Opisywane peptoidy poli-argininy można wytworzyć przy użyciu metody wykorzystującej pirazolo-1-karboksyamidynę jako czynnik guanidynylu. 18 Można to jednak zrobić dopiero po odcięciu peptoidu od żywicy i usunięciu ochrony Boc na łańcuchach bocznych, tak że każda reszta typu lizyny w sekwencji jest przekształcana w resztę argininy. Starając się dostroić właściwości chemiczne i biologiczne związków, opracowaliśmy metodę, która po raz pierwszy pozwala na włączenie podwójnej funkcjonalności kationowej (np. NLys i NArg) do dowolnej sekwencji peptoidów. cyfra arabska
Tutaj opisujemy syntezę, oczyszczanie i charakterystykę dwóch nowych peptoidów, które zawierają zarówno reszty typu lizyny, jak i argininy w tej samej sekwencji. Metoda wykorzystuje ortogonalną ochronę N-Boc i N-Dde na żywicy za pomocą pirazolu-1-karboksyamidyny jako odczynnika guanidynylu. Biologiczna ocena tych peptoidów jest również opisana w testach cytotoksyczności przeciwko Leishmania mexicana, czynnikowi wywołującemu leiszmaniozę skórną. Zapewnia to praktyczną metodę dostępu do peptoidów o podwójnej funkcjonalności kationowej i oceny ich aktywności biologicznej. Oczekuje się, że metoda ta pomoże w przyszłości w syntezie peptydów amfipatycznych przez społeczność peptoidów.

<table><tbody><tr><td>Polipropylenowe wkłady ekstrakcyjne do fazy stałej z dwiema frytami</td>, <td>Crawford Scientific</td><td>12131017 i 12131015</td><td>wkłady 20 ml i 6 ml stosowane w tym preparacie</td></tr>, <tr><td>kwas trifluorooctowy</td>, <td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>T0431-100g</td><td>>98%; UWAGA: może powodować poważne oparzenia i podrażnienia dróg oddechowych</td></tr><tr><td>N,N'-diizopropylokarbodimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38370-100ML</td>><td>98%; UWAGA: stwarza zagrożenie dla oczu, skóry i dróg oddechowych, może również powodować uczulenie</td></tr><tr><td>Dimetyloformamid</td><td>Fischer Scientific</td><td>10346180</td><td>stopniu HPLC; UWAGA: podejrzenie teratogenu</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fischer Scientific</td><td>10407440</td><td>klasy HPLC</td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Fischer Scientific</td><td>10354263</td><td>99,8%; UWAGA: podejrzenie rakotwórczości</td></tr><tr><td>Kwas bromacetyczny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17000-100G</td><td>>99%; UWAGA: powoduje oparzenia i stwarza zagrożenie dla skóry, oczu i dróg oddechowych</td></tr><tr><td>(S)-(-)-alfa metylobenzyloamina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 115568-100G</td><td>98%; UWAGA: szkodliwy po połknięciu, toksyczny w kontakcie ze skórą, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, stosowany do syntezy monomeru Nspe</td></tr><tr><td>N-Boc 1,4-diaminobutan</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europa)</td><td>A1373-25g</td><td>>98%; UWAGA: powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, stosowany do syntezy monomeru NLys</td></tr><tr><td>N-Boc 1,2-diaminoetan</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europa)</td><td>A1371-25g</td><td>>97%; UWAGA: powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, stosowany do syntezy monomeru Nae</td></tr><tr><td>1,2-diaminobutan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D13208-100G</td><td>99%; UWAGA: łatwopalna ciecz i para, szkodliwa po połknięciu lub wdychaniu toksyczna w kontakcie ze skórą, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, stosowana w syntezie monomeru NhArg</td></tr><tr><td>1,4-diaminoetan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03550-250ML</td>><td>99,5%; UWAGA: łatwopalna ciecz i para, szkodliwa po połknięciu lub wdychaniu toksyczna w kontakcie ze skórą, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, stosowana w syntezie monomeru NnArg &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1H-pirazolo-1-karboksyamidyna HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>402516-10G</td><td>jako sól HCl; UWAGA: działa szkodliwie po połknięciu i może powodować reakcję alergiczną skóry, powoduje poważne uszkodzenie oczu</td></tr><tr><td>Monohydrat hydrazyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>207942-5G</td><td>odczynnik; UWAGA: podejrzewa się działanie rakotwórcze, śmiertelne w przypadku wdychania i powoduje poważne oparzenia skóry i oczu</td></tr><tr><td>2-acetylodimedon</td><td>Novabiochem</td><td>8510150005</td><td>Dde-OH</td></tr><tr><td>Rink Żywica amidowa</td><td>Novabiochem</td><td>8551190005</td><td>100-200 mesh, o dużym obciążeniu</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411027-1L</td><td>>99,5%, substancja kontrolowana, dlatego przed zakupem należy uzyskać odpowiednie pozwolenie; UWAGA: wysoce łatwopalna ciecz i para, szkodliwa w przypadku połknięcia i toksyczna w kontakcie ze skórą lub wdychana, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, szkodliwa dla organizmów wodnych o długotrwałych skutkach</td></tr><tr><td>Triizopropylosilan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781-50G</td><td>98%; UWAGA: łatwopalna ciecz i para, działa drażniąco na skórę i powoduje poważne podrażnienie oczu</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>DAL1025</td><td>Nie klasyfikowane jako niebezpieczne</td></tr><tr><td>Pożywka dla owadów</td><td>Schneidera Sigma Aldrich</td><td>S9895-1L</td><td>Sproszkowane podłoże należy przygotować przed użyciem zgodnie z instrukcjami producenta; Pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej przed użyciem w testach biologicznych</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>VWR</td><td>734-1793</td><td>Płaskie dno (aby umożliwić pomiar fluorescencji od dołu), poddane działaniu kultur tkankowych</td></tr><tr><td>Zbiorniki rozpuszczalników</td><td>VWR</td><td>613-1182</td><td>Używany z pipetą wielokanałową</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Starlab Group</td><td>S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810</td><td>Objętość końcówki zależy od użytej pipety. 10&nbsp; &mikro; l, 10 - 200&nbsp; &mikro; l oraz 1,000&nbsp; &mikro; l zalecane do testów</td></tr><tr><td>25 cm3 kolby do hodowli komórkowych</td><td>VWR</td><td>734-2312</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowe</td><td>VWR</td><td>525-0791</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (klasa biologii molekularnej)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td>Nie sklasyfikowany jako niebezpieczny</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>10082139-100mL</td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>15140148-20mL</td><td>Skrót: P/S</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46006-100mg</td><td>Amfoterycyna B trójwodzian, wzorzec analityczny VetranalTM</td></tr></tbody></table>

skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Ten protokół opisuje ręczną syntezę w fazie stałej liniowych peptoidów, które zawierają dwa różnie funkcjonalizowane monomery kationowe. W tej procedurze funkcjonalizowane aminami monomery peptoidowe "lizyny" i guanido funkcjonalizowane "argininą" mogą być włączone do tej samej sekwencji peptoidowej. W tej procedurze wykorzystuje się ochronę na żywicy (N-(1-(4,4-dimetylo-2,6-dioksocykloheksylideno)etylu) lub Dde, warunki ortogonalne do ochrony Boc monomerów lizyny. Późniejsza deprotekcja pozwala na wydajną reakcję guanidyniylacji na żywicy w celu wytworzenia reszt argininy. Procedura jest zgodna z powszechnie stosowaną metodą syntezy peptoidów submonomerów, co pozwala na wytwarzanie prostych peptoidów przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego i dostępnych na rynku odczynników. Opisano reprezentatywną syntezę, oczyszczanie i charakterystykę dwóch mieszanych peptoidów. Opisano również ocenę tych związków jako potencjalnych środków przeciwinfekcyjnych w testach przesiewowych przeciwko Leishmania mexicana. Pasożytniczy pierwotniak L. mexicana jest czynnikiem wywołującym leiszmaniozę skórną, zaniedbaną chorobę tropikalną, która dotyka nawet 12 milionów ludzi na całym świecie.

Jako wynik reprezentatywny opisano syntezę i charakterystykę dwóch 12-resztkowych peptoidów zawierających odpowiednio dwa monomery typu lizyny i dwa monomery typu argininy. Przedstawiono również kolejne wyniki testu cytotoksyczności.
Dwa peptoidy [(NnArgNspeNspe)(NaeNspeNspe)]2 (a) oraz [(NhArgNspeNspe)(NLysNspeNspe)]2 (b) zostały zsyntetyzowane z użyciem 120 mg żywicy Rink Amide dla każdego z nich (ładunek = 0,79 mmol/g). Wszystkie etapy acetylacji i substytucji przeprowadzono zgodnie z powyższym opisem, stosując odczynniki zakupione komercyjnie. W przypadku tych reszt, w etapie substytucji wykorzystano następujące aminy: Nspe (S)-(-)-α-metylobenzylaminę, Nae N-(tert-butoksykarbonylo)-1,2-diaminoetan, NLys N-(tert-butoksykarbonylo)-1,4-diaminobutan. W przypadku reszt pochodnych argininy sprzęgnięto następujące niechronione diaminy: NhArg 1,4-diaminobutan lub NnArg 1,2-diaminoetan, a następnie przeprowadzono ochronę na żywicy za pomocą 2-acetyldimedonu (Dde-OH). Po zsyntetyzowaniu całej sekwencji, deprotekcja Dde za pomocą hydrazyny uwalnia wolne grupy aminowe do guanidynilacji.
<img alt="Schemat porównania struktury chemicznej dwóch peptydów; zawarto słowa kluczowe analizy strukturalnej." src="/files/ftp_upload/54750/54750fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Struktury peptoidów (a) [(NnArgNspeNspe)(NaeNspeNspe)]2 oraz (b) [(NhArgNspeNspe)(NLysNspeNspe)]2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu syntezy chemicznej, pokazujący etapy ochrony i deprotekcji amin z zastosowaniem strzałek reakcji." src="/files/ftp_upload/54750/54750fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Metoda stosowana do syntezy mieszanych peptoidów argininy/lizyny. i. Standardowy etap substytucji w metodzie submonomerowej z wykorzystaniem diaminy; ii. Dodanie Dde-OH, 90 minut w celu ochrony wolnej grupy aminowej; iii. Dalsze dodatki w celu wydłużenia łańcucha peptoidowego przy użyciu metody submonomerowej; iv. Deprotekcja Dde przy użyciu 2% hydrazyny w DMF; v. Guanidynilacja wolnej grupy aminowej na żywicy z użyciem pyrazolo-1-karboksamidyny i DIPEA w DMF; vi. Odszczepienie kwasowe z żywicy i deprotekcja grup Boc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Po odszczepieniu od żywicy i liofilizacji otrzymano surowe produkty w postaci białych proszków: (a) 154 mg, (b) 163 mg. Produkty oczyszczono za pomocą RP-HPLC zgodnie z opisem, wykonując wtryski o maksymalnej masie 50 mg przy użyciu pompy LC z detektorem UV-vis (λ = 250 nm) na kolumnie analitycznej 250 mm x 10 mm, 5 µm; szybkość przepływu = 2 ml/min. Frakcje odpowiadające docelowej masie połączono i otrzymano w postaci białych proszków: (a) 54 mg (b) 65 mg; końcowe wydajności wyniosły około 30% dla frakcji o czystości &gt;90%.
Tożsamość końcowych związków po oczyszczeniu potwierdzono metodą LC-MS (patrz Rysunek 3) przy użyciu spektrometru mas potrójnego quadrupolo wyposażonego w UPLC i detektor z matrycą fotodiod. Dokładną spektrometrię mas przeprowadzono na tym samym spektrometrze dla jonów [M+2H]2+. Stwierdzono bliską zgodność następujących mas obliczonych i obserwowanych (Rysunek 4): (a) obliczona = 896,0026 amu, obserwowana = 896,0038 amu; (b) obliczona = 952,0691 amu, obserwowana = 952,0730 amu.
<img alt="Dane chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas oraz TIC wraz z diagramami widm mas dla analizy peptydów." src="/files/ftp_upload/54750/54750fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. LC-MS dla oczyszczonych peptoidów. (a) m/z = 1,792 oraz (b) m/z = 1,903. Gdzie góra to TIC, środek to widmo LC-MS, a dół to chromatogram UV przy 220 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres spektrometrii mas, TOF MS ES+, wartość obserwowana a obliczona, analiza m/z, identyfikacja peptydów." src="/files/ftp_upload/54750/54750fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Dokładne dane spektrometrii mas dla peptoidów (a) i (b). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Czystość produktu oceniono za pomocą analitycznej RP-HPLC (pompa LC z detektorem UV-vis na kolumnie analitycznej, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 µm; szybkość przepływu = 1 ml/min), a wizualizację przeprowadzono przy 220 nm, co odpowiada absorbancji szkieletu amidowego. Rysunek 5a oraz 5b wykazują, że związki są jednorodne.
<img alt="Wyniki chromatografii; wykresy absorbancji w funkcji czasu retencji dla analizy rozdziału związków." src="/files/ftp_upload/54750/54750fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 
Rysunek 5. Analityczna HPLC dla oczyszczonych peptoidów (a) i (b). Zastosowano gradient 0-100% B w ciągu 30 minut, temperatura kolumny 40 °C (A = 95% H2O, 5% MeCN, 0,05% TFA; B = 95% MeCN, 5% H2O, 0,03% TFA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Oczyszczone peptoidy (a) oraz (b) przetestowano w testach cytotoksyczności przeciwko aksenicznym amastygotom L. mexicana. Zamrożone materiały zapasowe L. mexicana rozmrożono i przekształcono w stadium amastygot gotowych do analizy. 72 godziny po rozmrożeniu pasożyty powinny znajdować się w stadium promastygot owadzych w formie procyklicznej, w fazie logarytmicznej z licznymi dzielącymi się komórkami. Na tym etapie pasożyty mogą zostać przekształcone w stadium amastygot poprzez opisany wzrost pH i zmianę temperatury.27 W 9. dniu transformacji pasożyty będą znajdować się w niepowielającym się, zakaźnym stadium metacyklicznych promastygot. Ostatecznie, w 14. dniu, pasożyty powinny przejść w patogenne stadium amastygot, w którym brakuje im charakterystycznych dla promastygot wici.28
Roztwory stokowe związków o stężeniu 5 mM przygotowano w DMSO klasy do hodowli komórkowych i przetestowano w trzech powtórzeniach w co najmniej dwóch niezależnych seriach, aby zapewnić zebranie wiarygodnego zestawu danych. Reprezentatywny plan płytki 96-dołkowej przedstawiono na Rysunku 6. Po zakończeniu analizy do każdego dołka dodano odczynnik do oceny żywotności komórek, a następnie zmierzono fluorescencję zgodnie z opisem, aby obliczyć żywotność pasożytów dla każdego przetestowanego stężenia (patrz Rysunek 7). Wartości ED50 obliczono odpowiednio jako &gt;100 µM dla peptoidu (a) oraz 37 µM dla peptoidu (b). Naniesione słupki błędów przedstawiają zmienność między dołkami jako odchylenie standardowe; widać, że wartości te są uzasadnione dla większości słupków.
<img alt="Tabela eksperymentu z rozcieńczeniami szczegółowo opisująca protokoły dla Amfoterycyny B, peptoidu i DMSO w badaniach przesiewowych leków." src="/files/ftp_upload/54750/54750fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Reprezentatywny plan płytki 96-dołkowej dla testu cytotoksyczności dwóch roztworów peptoidów (w tym kontroli pozytywnej i negatywnej). med+ = pożywka (pożywka dla owadów Schneidera, pH 5.5, 20% FBS, 1% P/S). L. mex. = kultura pasożyta o zagęszczeniu 8 x 106/ml w med+. AmphoB = 5 mM w DMSO. Peptoid = roztwór stokowy 5 mM w DMSO. Puste dołki powinny zawierać wodę sterylną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przeżywalności; stężenie związku wpływa na peptoidy A/B i AmphoB; dane zależność dawka-odpowiedź." src="/files/ftp_upload/54750/54750fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Wyniki testu cytotoksyczności przeciwko aksenicznym amastigotom pasożyta L. mexicana z użyciem peptoidu (a) oraz (b). Widać, że peptoid (b) jest skuteczniejszy od peptoidu (a) w redukcji odsetka żywych pasożytów, przy czym oba związki wykazują efekt zależny od dawki. Naniesione słupki błędów przedstawiają zmienność między studniami jako odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie monomerów typu lizyny i argininy do tej samej sekwencji peptoidu oraz ocena aktywności tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytom wywołującym zaniedbaną chorobę tropikalną, jaką jest leiszmanioza skórna. Nowoczesne środki terapeutyczne w leczeniu leiszmaniozy skórnej są pilnie potrzebne, a niniejsza procedura może pomóc w identyfikacji i opracowaniu peptoidów jako nowej klasy potencjalnych środków przeciwdziałających infekcjom w przebiegu tej zaniedbanej choroby tropikalnej. Główną zaletą tego protokołu jest możliwość syntezy peptoidów zawierających mieszaną funkcjonalność kationową.Jest to wysoce pożądane, ponieważ może pomóc w modulowaniu aktywności biologicznej sekwencji. Chociaż testy te są przeprowadzane przeciwko ssaczej formie pasożyta, mogą być one również zastosowane przeciwko stadium owadzemu Leishmania mexicana lub w odniesieniu do linii komórkowych ssaków. Wizualna demonstracja tej metody jest bardzo przydatna, ponieważ pokazuje ona etapowy charakter syntezy, a także hodowlę pasożyta w różnych punktach cyklu życiowego Leishmania mexicana.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować roztwory w dimetyloformamidzie zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie do zamkniętego polipropylenowego naczynia reakcyjnego o pojemności 20 ml z dwoma fritami należy dodać 0,1 mmol żywicy Rink amide chronionej grupą Fmoc. Należy dodać 5 ml dimetyloformamidu i pozostawić naczynie na 60 minut w temperaturze pokojowej.Następnie odlej DMF, korzystając z platformy próżniowej do ekstrakcji w fazie stałej. Potem dodaj dwa mililitry przygotowanego roztworu piperydyny. Umieść naczynie na wytrząsarce przy 450 RPM w temperaturze pokojowej i wytrząsaj przez pięć minut.Odessać roztwór za pomocą stacji próżniowej. Następnie dodać dwa mililitry roztworu piperydyny i wstrząsać w tych samych warunkach przez 15 minut. Po zakończeniu wstrząsania odessać roztwór za pomocą stacji próżniowej.Dodaj dwa mililitry DMF i mieszaj przez 30 sekund, aby wypłukać żywicę. Odlej DMF i powtórz płukanie trzy razy. Aby rozpocząć syntezę submonomeru, dodaj jeden mililitr przygotowanego roztworu kwasu bromooctowego oraz 0,2 mililitra przygotowanego roztworu DIC.Wstrząsać przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zlać roztwór i przemyć trzykrotnie, używając za każdym razem 2 mL DMF. Dodać 1 mL przygotowanego roztworu aminy.Następnie wstrząsać żywicą przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Odlać roztwór i trzykrotnie przemyć żywicę, używając za każdym razem 2 mL DMF. Następnie dodać 1 mL roztworu kwasu bromooctowego oraz 0,2 mL roztworu DIC.Wstrząsać przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zlać roztwór i przemyć trzy razy, używając za każdym razem dwóch mililitrów DMF. Aby wprowadzić monomer zfunkcjonalizowany guanidyną, dodać do żywicy jeden mililitr roztworu niechronionej diaminy.Wstrząsać przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zlać roztwór i trzykrotnie przemyć żywicę dwiema mililitrami DMF. Dodać 0,5 mililitra przygotowanego roztworu 2-acetyl dimedonu.Mieszać przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zlać roztwór i trzykrotnie przemyć żywicę dwiema mililitrami DMF. Kontynuować syntezę submonomeru aż do uzyskania pożądanej sekwencji.Następnie dodaj cztery mililitry przygotowanego roztworu hydrazyny i wstrząsaj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Zlej roztwór i powtórz tę czynność trzykrotnie. Następnie przemyj żywicę trzykrotnie, używając dwóch mililitrów DMF do każdego płukania.Dodaj DIPEA oraz sześć ekwiwalentów pyrazolo-1-karboksamidyny na każdą wolną grupę aminową w sekwencji peptoidowej. Mieszaj przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu mieszania odlej roztwór.Przemyj żywicę trzykrotnie, używając dwóch mililitrów dichlorometanu do każdego płukania. Pozostaw żywicę do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut i przechowuj do przyszłego użycia. Po dodaniu amin można przeprowadzić testowe odszczepienie, aby sprawdzić postęp syntezy.Aby rozpocząć końcowe odszczepienie, należy dodać cztery mililitry koktajlu do odszczepiania do tego samego kartridża reakcyjnego z fritem, który był używany podczas syntezy, a następnie przykryć naczynie. Wstrząsać przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, używając naczynia reakcyjnego z fritem, przefiltrować koktajl do odszczepiania z żywicy do kolby okrągłodennej.Odparuj koktajl do klawowania za pomocą rotavapora. Dodaj dwa mililitry bezwodnego eteru dietylowego, aby wytrącić peptoid. Za pomocą pipety usuń eter dietylowy i wylej go.Następnie powtórz wytrącanie w eterze dietylowym trzy razy. Po zakończeniu wytrącania rozpuść surowy peptoid w 10 mililitrach przygotowanego roztworu acetonitrylu i zakwaszonej wody. Przenieś całość do wcześniej zważonego pojemnika.Następnie zamrozić w temperaturze -20 °C i liofilizować do postaci suchego proszku gotowego do oczyszczania za pomocą HPLC w fazie odwróconej. Po hodowli pasożytów Leishmania mexicana i ich transformacji do aksenicznego stadium amastigota, rozpocząć test cytotoksyczności od przygotowania roztworów zapasowych związków zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Do górnego rzędu płytki 96-dołkowej dodać 2 µL roztworu zapasowego peptoidu o stężeniu 5 mM, kontrolę z amfoterycyną B oraz kontrolę DMSO, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Używając pipety wielokanałowej, należy dodać 48 µL świeżej pożywki do górnego rzędu. Do wszystkich pozostałych rzędów należy dodać 25 µL świeżej pożywki. Następnie należy przeprowadzić rozcieńczanie seryjne, pipetując 25 µL roztworu z górnego rzędu, dodając go do rzędu poniżej i mieszając.Powtórz rozcieńczenia dla całej płytki, odrzucając ostatnie 25 µl wypipowane z dolnego rzędu. Następnie przenieś kulturę pasożytów do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Wiruj przez pięć minut przy 447 ×g.Odlać zużyte medium i dodać 10 mililitrów świeżego medium. Następnie, używając pipety, delikatnie resuspender pellet pasożytów w nowym medium. Policzyć komórki za pomocą ulepszonej komory liczydłowej Neubauera i rozcieńczyć kulturę do stężenia ośmiu milionów pasożytów na mililitr.Po rozcieńczeniu hodowli należy dodać 25 µL pasożytów do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 60 minut w temperaturze 32 °C. Po zakończeniu inkubacji należy pobrać 40 µL roztworu z każdej studzienki.Do każdego dołka dodaj 90 µL świeżej pożywki i inkubuj w temperaturze 32 °C przez 24 godziny. Następnie do każdego dołka dodaj 10 µL roztworu do oceny żywotności komórek opartego na rezaurynie. Inkubuj w temperaturze 32 °C przez cztery godziny.Po zakończeniu inkubacji użyj czytnika płytek, aby zmierzyć fluorescencję. Przeanalizuj dane, odejmując średnie tło i porównując fluorescencję w dołkach po normalizacji względem kontroli DMSO. W niniejszym badaniu zsyntetyzowano dwa peptoidy, wykorzystując po 120 milligrams żywicy rink amide dla każdego z nich.Produkty są oczyszczane za pomocą odwrotnej fazy wysokosprawnej chromatografii cieczowej, a frakcje odpowiadające docelowej masie są łączone i otrzymywane w postaci białych proszków. Ilość zebranych dwóch peptoidów przedstawiono tutaj, przy wydajności około 30% dla frakcji o czystości powyżej 90%. Czystość produktu ocenia się za pomocą analitycznej HPLC w fazie odwróconej i wizualizuje przy 220 nanometrach, co odpowiada absorbancji szkieletu amidowego.Oba peptoidy okazały się być homogeniczne. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki testów cytotoksyczności przeciwko L Mexicana. Roztwory zapasowe związków o stężeniu 5 mM przygotowano w DMSO klasy do hodowli komórkowej i przetestowano w trzech powtórzeniach co najmniej dwukrotnie, aby zapewnić wiarygodność danych.Wykazano, że peptoid B jest skuteczniejszy od peptoidu A w redukcji odsetka żywych pasożytów, przy czym oba wykazują efekt zależny od dawki. Po zapoznaniu się z tą metodą powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat syntezy, charakteryzacji i oczyszczania peptoidów zawierających monomery typu lizynowego i argininowego oraz sposobu ich wykorzystania w testach cytotoksyczności przeciwko Leishmania mexicana. Nasza metoda wprowadzania podwójnej funkcjonalności kationowej do peptoidów dodaje jedynie jeden dodatkowy prosty etap do powszechnie stosowanej metody submonomerowej syntezy peptoidów.Stosując tę metodę, w celu zwiększenia różnorodności biblioteki można dodać submonomery typu lizyny lub argininy o różnych długościach, na przykład z łańcuchami bocznymi o długości od dwóch do sześciu węgli. Podczas przeprowadzania syntezy peptoidów bardzo ważne jest pamiętanie o dokładnym przemywaniu żywicy pomiędzy poszczególnymi etapami, aby zapobiec powstawaniu niepożądanych produktów addycji lub delecji. Metoda ta otwiera badaczom drogę do zgłębiania aktywności biologicznej mieszanych peptoidów funkcjonalizowanych kationowo oraz do porównywania tej aktywności z peptoidami zawierającymi wyłącznie monomery typu lizyny lub argininy.Na koniec należy pamiętać, że pasożyty oraz niektóre z odczynników stosowanych w tym protokole mogą być niezwykle niebezpieczne. Dlatego ważne jest, aby zawsze używać odpowiednich środków ochrony osobistej i pracować w dygestorium lub komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego, gdy jest to wymagane.

an-efficient-method-for-synthesis-peptoids-with-mixed-lysine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano prostą i ogólną metodę manualnej syntezy peptoidów z wykorzystaniem podstawowego sprzętu i dostępnych komercyjnie odczynników, co umożliwia łatwą syntezę peptoidów w większości laboratoriów. Opisano syntezę, oczyszczanie i charakterystykę amfifilowego peptoidu 36-meru, a także jego samoorganizację w wysoko uporządkowane nanoarkusze.

Synteza peptoidów metodą submonomerową w fazie stałej oraz ich samoorganizacja w wysoko uporządkowane nanoarkusze

Opisano wydajną syntezę na fazie stałej funkcjonalizowanego trimeru bis-peptydowego z wykorzystaniem procedury odszczepiania typu „safety catch” z żywicy HMBA.

Synteza na fazie stałej funkcjonalizowanego bis-peptydu z wykorzystaniem metodologii „safety catch”

Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Tablice peptydowe syntetyzowane metodą SPOT mogą być używane do analizy specyficzności substratowej metylotransferaz lizynowych białek (PKMT) oraz do zdefiniowania spektrum substratów PKMT, aby zrozumieć ich biologiczną rolę. Protokół ten opisuje, jak syntetyzować macierze peptydowe, metylować je za pomocą PKMT i analizować wyniki.

Analiza swoistości metylotransferaz lizyny białkowej przy użyciu macierzy peptydowych SPOT

Przedstawiono prostą i ogólną metodę syntezy cyklicznych peptydów za pomocą promieniowania mikrofalowego. Procedura ta umożliwia syntezę cyklicznych peptydów szkieletowych ze zbiorem różnych konformacji przy zachowaniu łańcuchów bocznych i ugrupowań farmakoforycznych, a tym samym pozwala na badanie przesiewowe pod kątem konformacji bioaktywnej.

Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Opisany jest protokół ręcznej syntezy oligo-peptoidów, po którym następuje analiza sekwencji za pomocą spektrometrii mas.

Synteza i analiza oligo-peptoidów za pomocą spektrometrii mas

Synteza amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) jest znaczącym wyzwaniem ze względu na obecność wielu azotów aminowych, co wymaga rozsądnego użycia grup ochronnych w celu zamaskowania tych reaktywnych funkcji. W tym artykule opisujemy łatwą metodę otrzymywania tych nowych klas cząsteczek samoorganizujących się.

Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) i pokrewnych biomateriałów

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

Ten protokół opisuje efektywną metodę produkcji wysokiej jakości proteoliposomu metodą dializy dwuwarstwowej przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. Metoda ta zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

Protokół ten opisuje metodę produkcji i oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz cytotoksyczności peptydu kationowego Mel4 oraz naśladowcy peptydu RK758. Integrując syntezę chemiczną, ekspresję rekombinowaną oraz standaryzowane testy funkcjonalne, zapewnia usprawniony proces produkcji i testowania peptydów oraz naśladowców małych cząsteczek.

Produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców

Poznaj metodę syntezy peptydoidów z mieszanymi monomerami lizyny i argininy oraz oceny ich aktywności przeciwko Leishmania mexicana. Ta technika umożliwia rozwój nowych leków przeciw leiszmaniozie skórnej.

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

Przeglądaj więcej filmów