Hiperspolaryzowana spektroskopia i obrazowanie metabolicznego rezonansu magnetycznego 13C
30 grudnia 2016
Dynamiczna polaryzacja jądrowa z późniejszym rozpuszczaniem próbki umożliwiła badania metabolizmu w systemach biologicznych w czasie rzeczywistym. Hiperspolaryzowany [1-13C]pirogronian zastosowano do badania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w linii komórkowej raka gruczołu krokowego in vitro.
Ogólnym celem tej procedury jest hiperpolaryzacja cząsteczek znakowanych węglem 13 przy użyciu dynamicznej polaryzacji jądrowej oraz pomiar ich enyzmatycznej konwersji za pomocą rezonansu magnetycznego węgla 13, obrazowania retroskopowego, in vitro. Metoda ta zwiększa sygnał rezonansowy węgla od 10 000 do 100 000 razy, umożliwiając odróżnienie warstwowych związków od ich produktów przemiany materii i zlokalizowanie ich w organizmie poprzez obrazowanie. Główną zaletą tej metody, w porównaniu np. z technikami VR, jest to, że zapewnia ona wgląd w metabolizm substancji naturalnie występujących w organizmach żywych w czasie rzeczywistym.
Również ta metoda może dostarczyć wglądu w metabolizm raka i tak jak to jest in vitro. Może być również stosowany do modeli zwierzęcych i pacjentów. Zastosowanie tej techniki wykracza poza lokalizację guza.
Może być stosowany do znajdowania i rozróżniania metabolicznych podtypów nowotworów oraz do monitorowania leczenia za pomocą najnowocześniejszych technik. Aby rozpocząć procedurę, najpierw przygotuj jednomilimolowy roztwór megluminianu gadoteranowego i stężonego jednowęglowego pirogronianu 13. Dodaj rodnik trytylowy OX063 do mieszaniny, aby uzyskać końcowe stężenie 15 milimoli i całkowicie go rozpuść.
W oprogramowaniu DNP Polarizer kliknij Cool Down', aby zmniejszyć temperaturę wkładki o zmiennej temperaturze lub VTI poniżej 1.4 kelwina. Po ostygnięciu VTI umieść około ośmiu mikrolitrów roztworu próbki znakowanego węglem 13 w plastikowym kubku na próbkę. Przymocuj kubek do pręta wprowadzającego próbkę.
W oprogramowaniu kliknij Włóż próbkę"Wybierz normalną próbkę"a następnie Dalej"Spowoduje to podniesienie uchwytu próbki i otwarcie zaworów wlotowych do VTI, umożliwiając wprowadzenie próbki. Po wyświetleniu monitu użyj pręta wprowadzającego, aby wepchnąć kubek na próbkę do VTI. Odłącz kubek na próbkę i ostrożnie wyjmij pręt wprowadzający.
Upewnij się, że próbka została odłączona od pręta i nie została wypchnięta z VTI podczas procedury zamykania. Kliknij Dalej, aby zamknąć zawory i opuścić kubek na próbkę do ciekłego helu, a następnie kliknij przycisk Zakończ"Aby znaleźć optymalną częstotliwość polaryzacji, najpierw uruchom oprogramowanie RINMR. Na ekranie konfiguracji kliknij Wybierz próbkę i wykonaj mikrozamiatanie, utwórz plik, w którym będą przechowywane dane.
Przełącz się z powrotem na oprogramowanie DNP Polarizer. Wybierz zakładkę Kalibruj, ustaw parametry zamiatania mikrofalowego, a następnie rozpocznij proces zamiatania mikrofalowego. Po zakończeniu przemiatania mikrofalowego zanotuj częstotliwość z maksymalną zmierzoną amplitudą sygnału.
Wróć do oprogramowania RINMR i wybierz Solid Build Up'Następnie w oprogramowaniu DNP Polarizer kliknij Polarization'Wprowadź optymalną częstotliwość mikrofal i moc. Kliknij Dalej'Włącz monitorowanie narastania polaryzacji'i kliknij Zakończ'Polaryzuj próbkę przez wystarczająco długi czas, aby osiągnąć ponad 95% polaryzację. Podczas polaryzacji podłącz kolbę zbiorczą do rurki wydechowej próbki hiperpolaryzatora i umieść ją w pobliżu spektrometru.
Skonfiguruj spektrometr NMR o jednej tesli z 13 seriami skanowania węglowego impulsów RF 110 stopni w trzysekundowych odstępach. Podczas polaryzacji pirogronianu rozpocznij przygotowanie hodowli komórkowej. Usunąć pożywkę komórkową z kolb do hodowli komórkowych.
Umyj komórki około 10 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Dodaj pięć mililitrów trypsyny do kolby hodowlanej. Inkubuj kulturę przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dezaktywuj trypsynę za pomocą około pięciu mililitrów pożywki F12K zawierającej 10% objętości płodowej surowicy cielęcej.
Następnie przenieś objętość zawiesiny komórkowej zawierającej żądaną liczbę komórek do plastikowej probówki wirówkowej. Odwirować próbkę komórkową o stężeniu 1200 G przez pięć minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś paletę w wystarczającej ilości podłoża F12K z 10% FCS, aby osiągnąć końcową objętość 800 mikrolitrów.
Przenieś zawiesinę do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki i umieść probówkę w plastikowym pojemniku wypełnionym ciepłą wodą. Aby rozpocząć zbieranie danych za pomocą spektroskopii rezonansu magnetycznego węgla 13, po przygotowaniu próbki komórki i polaryzacji pirogronianu większej niż 95 procent, kliknij przycisk Uruchom rozpuszczanie" w oprogramowaniu DNP Polarizer. Załadować określoną objętość roztworu rozpuszczalnego przez górny zawór komory rozpuszczania.
Przesuń drążek do rozpuszczania do pozycji aktywnej. Potwierdź, klikając Dalej'Gdy próbka komórki będzie gotowa do eksperymentu, kliknij Zakończ'w oprogramowaniu DNP Polarizer, aby zainicjować proces rozpuszczania. Poczekaj, aż proces rozpuszczania zostanie zakończony.
Dodaj 200 mikrolitrów hiperspolaryzowanego roztworu pirogronianu do 800 mikrolitrów próbki komórki. Dobrze wymieszaj pipetą, a następnie umieść około 600 mikrolitrów mieszaniny w pięciomilimetrowej probówce NMR. Załaduj rurkę NMR do spektrometru i kliknij Uruchom', aby rozpocząć pomiar.
Następnie przesuń patyczek do rozpuszczania z dołączonym kubkiem na próbkę do pozycji czyszczenia i kliknij przycisk Zakończ" w oprogramowaniu DNP Polarizer. Aby rozpocząć obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego węgla 13, po rozpoczęciu procesu hiperpolaryzacji, przenieś 800 mikrolitrów ponownie zawieszonej próbki komórek o liczbie komórek co najmniej 10 do ósmej do trzymililitrowej strzykawki. Podłączyć strzykawkę do długiego cewnika i umieścić strzykawkę na łóżku do skanowania MRI.
Upewnij się, że cewnik jest wystarczająco długi, aby sięgać poza skaner MRI. Umieść fantom kalibracyjny zawierający dziesięć molowych moczników węgla 13 z 10% megluminą gadorynianu obok strzykawki. Umieść cewkę odbiornika RF dostrojoną do węgla 13 na strzykawce.
Włóż łóżko skanujące do skanera tak, aby obiekt zainteresowania znajdował się w izocentrum skanera MRI. Podłączyć kolbę łączącą do rurki wydechowej próbki hiperpolaryzatora i umieścić ją blisko końca cewnika. Uruchom standardową sekwencję lokalizacji w trzech płaszczyznach i w razie potrzeby dostosuj pozycję strzykawki.
Następnie należy skonfigurować i uruchomić sekwencję anatomiczną z protonem T2 obejmującą lokalizację strzykawki. Z uzyskanych obrazów anatomicznych wybierz pięć ciągłych wycinków obszaru zainteresowania, w tym fantom węgla 13. Skonfiguruj akwizycję kalibracji spektroskopowej węgla 13 i wybierz sekwencję kalibracji bloku 2D siegerta z biblioteki sekwencji impulsów.
Pobierz sekwencję impulsów do skanera i uruchom spektroskopowe skanowanie wstępne. Na wykresie wielkości widma ustaw pik fantomowy kalibracji węgla 13 na środku częstotliwości skanera. Ustaw wzmocnienia odbiornika na maksimum i kliknij Skanuj', aby uruchomić sekwencję kalibracji.
Zapisz zgłoszone wzmocnienie transmisji i częstotliwość centryczną. Następnie skonfiguruj akwizycję obrazowania przesunięcia chemicznego węgla 13 dla wybranych wycinków anatomicznych. Wybierz sekwencję obrazowania spektroskopowego 2D echo-planarnego i pobierz sekwencję impulsów do skanera.
Uruchom spektroskopowe skanowanie wstępne i dostosuj częstotliwość centryczną oraz wzmocnienie transmisji na podstawie wartości kalibracji, aby zakończyć konfigurację spektrometru MRI. Gdy pirogronian osiągnie 95% polaryzacji, kliknij Uruchom rozpuszczanie'w oprogramowaniu DNP Polarizer i załaduj środek rozpuszczający. Przesuń drążek do rozpuszczania do pozycji aktywnej.
Kliknij Dalej'a następnie Zakończ'Gdy rozpuszczona hiperspolaryzowana próbka dotrze do kolby zbiorczej, pobierz około 1 mililitra hiperspolaryzowanego roztworu do strzykawki i wstrzyknij go do cewnika tak, aby 200 mikrolitrów dotarło do próbki komórki. Kliknij przycisk Skanuj, aby rozpocząć pobieranie danych eksperymentalnych. Po zakończeniu zbierania danych przesuń patyczek do rozpuszczania z dołączonym kubkiem na próbkę do pozycji czyszczenia i kliknij przycisk Zakończ" w oprogramowaniu DNP NMR.
Szybkość wymiany metabolicznej pirogronianu na mleczan badano w komórkach PC3 raka gruczołu krokowego, monitorując intensywność sygnału spektroskopii węglowej 13 NMR hiperspolaryzowanego mleczanu i pirogronianu w odniesieniu do częstotliwości i czasu. Wartości kinetyczne mleczanu oceniono za pomocą prostego modelu proporcjowego i dwumiejscowego modelu różnicowego wymiany i znormalizowano do liczby komórek. W obu modelach zaobserwowano tendencję do zmniejszania się produkcji mleczanu wraz ze wzrostem liczby komórek.
Przypisuje się to wyższym stężeniom komórek i większej lepkości próbki. Próbki, w których liczba komórek jest mniejsza niż dwa razy dziesięć do siedmiu, wykazują bardzo mały stosunek sygnału mleczanu do szumu, a tym samym duże wartości odchylenia standardowego wskazujące, że próbki powinny zawierać co najmniej taką liczbę komórek, aby uzyskać dane informacyjne. Lokalizację przestrzenną osiągnięto za pomocą rezonansu magnetycznego o dobrej rozdzielczości spektralnej, co pozwoliło na uzyskanie obrazów węgla 13 dla określonych obszarów częstotliwości.
Rozkład przestrzenny został określony na podstawie surowych danych. Obraz węgla 13 może być również zarejestrowany razem z wcześniej uzyskanym obrazem protonu. Po opanowaniu i prawidłowym wykonaniu eksperyment ten można wykonać w mniej niż 60 minut.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić hiperpolaryzację pożądanej cząsteczki przy użyciu techniki dynamicznej polaryzacji jądrowej oraz jak wykonywać proste eksperymenty ze spektroskopią NMR i obrazowaniem komórki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby być bardzo szybkim. Po tym, jak hiperspolaryzowana próbka opuści polaryzator, pamiętaj, że tracisz cały uzyskany sygnał NMR w mniej niż dwie minuty.
Podsumowując, rozpuszczanie DNP może być stosowane do różnych zastosowań. Obejmuje to badanie chorób takich jak cukrzyca, przyglądanie się zmianom metabolicznym różnych rodzajów raka, ale także mierzenie pH tkanek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie wykorzystuje dynamiczną polaryzację jądrową do hiperpolaryzacji cząsteczek znakowanych węglem 13, co umożliwia obserwację procesów metabolicznych w systemach biologicznych w czasie rzeczywistym. Praca koncentruje się na pomiarze aktywności dehydrogenazy mleczanowej w linii komórkowej raka prostaty in vitro.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Onkologia
Wstęp
- Dynamiczna polaryzacja jądrowa zwiększa sygnał węgla-13 od 10 000 do 100 000 razy.
- Technika ta pozwala na rozróżnienie związków warstwowych od ich produktów metabolicznych.
- Zapewnia ona wgląd w czasie rzeczywistym w metabolizm substancji naturalnie występujących w żywych organizmach.
- Metodę tę można zastosować zarówno w badaniach in vitro, jak i w modelach in vivo.
Cel badania
- W celu hiperpolaryzacji cząsteczek znakowanych węglem 13 dla zwiększenia jakości obrazowania.
- W celu pomiaru konwersji enzymatycznej w czasie rzeczywistym.
- W celu zbadania procesów metabolicznych w komórkach nowotworowych.
Zastosowane Metody
- Dynamiczna polaryzacja jądrowa w celu hiperpolaryzacji cząsteczek.
- Magnetyczny rezonans jądrowy węgla-13 do pomiarów metabolicznych.
- Techniki obrazowania retroskopowego do lokalizacji w systemach biologicznych.
- Badania in vitro z wykorzystaniem linii komórkowych raka prostaty.
Główne wyniki
- Osiągnięto monitorowanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej w czasie rzeczywistym.
- Metoda ta pomyślnie pozwoliła na rozróżnienie produktów metabolicznych.
- Dzięki temu podejściu uzyskano wgląd w metabolizm nowotworowy.
- Technika ta wykazuje potencjał do zastosowania w modelach zwierzęcych oraz u pacjentów ludzkich.
Wnioski
- Dynamiczna polaryzacja jądrowa jest potężnym narzędziem do badania metabolizmu.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie procesów metabolicznych w nowotworach.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć warunki kliniczne w badaniach pacjentów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Hiperpolaryzowana spektroskopia i obrazowanie magnetycznego rezonansu metabolicznego 13C umożliwiają monitorowanie konwersji enzymatycznej w systemach żywych w czasie rzeczywistym, stanowiąc potężne narzędzie do walidacji celów w procesie odkrywania leków onkologicznych. Dzięki przezwyciężeniu naturalnie niskiej czułości 13C NMR za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej, metoda ta dostarcza ilościowych odczytów metabolicznych, które wspierają mechanistyczną redukcję ryzyka oraz zwiększają pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych. Możliwość zastosowania tej techniki zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo, czyni ją pomostem translacyjnym w ocenie wpływu terapeutycznego na metabolizm nowotworowy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar aktywności dehydrogenazy mleczanowej jako funkcjonalnego wskaźnika modulacji szlaków metabolicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowy pomiar konwersji pirogronianu do mleczanu w czasie rzeczywistym, co wspiera biologiczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów zaangażowanych w metabolizm energetyczny nowotworów.
- Wartość prognostyczna: Generuje dane kinetyczne, które mogą zostać znormalizowane do liczby komórek, co pozwala na analizę porównawczą między różnymi warunkami eksperymentalnymi w celu potwierdzenia wiarygodności celu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Umożliwia otrzymanie zestandaryzowanych, hiperpolaryzowanych roztworów pirogronianu 13C, które służą jako spójny substrat do pomiaru aktywności enzymatycznej w układach komórkowych.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza pomiary natężenia sygnału hiperpolaryzowanego mleczanu i pirogronianu w funkcji czasu, co pozwala na obliczenie szybkości wymiany metabolicznej.
- Powtarzalność: Wymaga minimalnych progów liczby komórek (np. 2×10⁷ komórek) w celu uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu, co określa standardy projektowania analiz i przygotowania próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Bezpośrednio modeluje efekt Warburga w komórkach raka prostaty PC3, łącząc wyniki techniki z kluczową cechą metabolizmu nowotworowego.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera płynne przejście od mechanistycznych badań in vitro do zastosowań w obrazowaniu in vivo z wykorzystaniem tego samego schematu hiperpolaryzacji.
- Podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia monitorowanie metabolicznych zmian wywołanych leczeniem równolegle z obrazowaniem anatomicznym, co wspiera kryteria go/no-go w rozwoju przedklinicznym.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków, dostarczając funkcjonalnych odczytów metabolicznych po związaniu z celem, ale przed przesiewaniem fenotypowym, co pomaga w priorytetyzacji związków wiodących w oparciu o modulację szlaków, a nie tylko o powinowactwo wiązania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących celów metabolicznych poprzez ilościowe określanie strumienia w konkretnych szlakach, takich jak konwersja pirogronianu katalizowana przez LDH.
- Przesiewanie: Umożliwia opracowanie testów dla enzymów metabolicznych z wykorzystaniem substratów hiperpolaryzowanych jako sond, z detekcją sygnału za pomocą 13CMRSI.
- Analityka: Pozwala na wyznaczenie parametrów kinetycznych z danych spektralnych i czasowych, co umożliwia zespołom porównywanie fenotypów metabolicznych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Ułatwia przejście od mechanizmów komórkowych do odpowiedzi całego organizmu dzięki zarejestrowanemu wspólnie obrazowaniu spektroskopowemu i anatomicznemu.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Stanowi funkcjonalność platformy możliwą do zastosowania w wielu celach i modelach chorobowych, nie ograniczoną do pojedynczego testu lub typu nowotworu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Dostarcza wglądu w mechanizmy funkcji celu poprzez pomiar przepływu metabolicznego w czasie rzeczywistym, co zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację protokołów hiperpolaryzacji i dyssolucji pomiędzy laboratoriami, wspierając powtarzalność pomiarów metabolicznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie modulacji celu z obserwowalnymi efektami metabolicznymi, co redukuje ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich zdolność do zmiany metabolizmu nowotworowego w systemach istotnych fizjologicznie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie dynamicznej polaryzacji jądrowej, spektroskopii NMR oraz technik hodowli komórkowych.
- Zależne od dostępu do przedklinicznego hiperpolaryzatora DNP (np. systemu 3,35 T) oraz kompatybilnego spektrometru NMR/MRI.
- Wymaga standaryzacji przygotowania próbek, czasu rozpuszczania i akwizycji danych między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów przy przejściu z modeli in vitro do in vivo, w tym w zakresie dawkowania, podawania i biodystrybucji.
- Ograniczenie praktyczne: sygnał hiperpolaryzowany zanika szybko (<2 minuty po rozpuszczeniu), co wymaga precyzyjnego zsynchronizowania momentu iniekcji i akwizycji danych.
Często zadawane pytania dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Hyperpolarization of [1-13C]Pyruvate
4:51
13C Magnetic Resonance Spectroscopy
6:10
13C Magnetic Resonance Imaging
9:20
Results: Metabolic Exchange of [1-13C]Pyruvate to [1-13C]Lactate in Prostate Carcinoma (PC3) Cells
10:40
Conclusion
3:47
Cell Culture Preparation
![Pomiar zależności pola magnetycznego od relaksacji sieci spinowej hiperspolaryzowanego [1-13C]pirogronianu](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F59399.jpg%3Fv%3D2026-08-30T10%253A42%253A00.000Z&w=384&q=75)
![Badanie metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej [1-13C] pirogronianu i spektroskopii 13C/31P NMR](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-08-31T08%253A03%253A24.000Z&w=384&q=75)
