Name: Hiperspolaryzowana spektroskopia i obrazowanie metabolicznego rezonansu magnetycznego 13C (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Poznaj hiperpolaryzację dynamiczną jądrową do obserwacji metabolizmu komórek raka prostaty w czasie rzeczywistym za pomocą spektroskopii i obrazowania rezonansu magnetycznego 13C.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.K. dziękuje za wsparcie Wyższej Szkoły Bioinżynierii (GSB) na Technische Universität München. Prace te były wspierane przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) w ramach SFB Collaborative Research Center 824, "Obrazowanie w celu wyboru, monitorowania i indywidualizacji terapii przeciwnowotworowych".

1. Przygotowanie roztworu zapasowego próbki
<ol>
	<li>Dodaj gadoterat megluminy (GadM, 0,5 mol/L) do stężonego kwasu [1-13C]pirogronowego, aby uzyskać końcowe stężenie GadM wynoszące 1 mmol/L. Do tej mieszaniny dodaj sól sodową rodnika trytylowego tris (8-karboksy-2,2,6,6-tetra-(hydroksyetylo)-benzo-[1,2-4,5]-bis-(1,3)-ditiolo-4-ylo)-metylu (OX063) do uzyskania końcowego stężenia 15 mmol/L. Mieszaj w vortexerze do całkowitego rozpuszczenia. 
	UWAGA: Przygotowanie tego roztworu zapasowego jest przeznaczone do użytku z przedklinicznym hiperpolaryzatorem DNP 3,35-T. W przypadku użycia klinicznego hiperpolaryzatora 7-T gadoterat megluminy nie jest wymagany, ponieważ przy wyższym polu magnetycznym jego korzyści są pomijalne. Dodatek środka kontrastowego na bazie gadolinu zwiększa osiągalną polaryzację w stanie stałym, a także szybkość polaryzacji. Jednak w stanie ciekłym środek kontrastowy skraca czas relaksacji T1.</li>
</ol>
2. Hodowla kultur komórkowych
<ol>
	<li>Hodować komórki PC3 w kolbie hodowlanej o powierzchni wzrostu 125-cm2. Użyć pożywki F-12K zawierającej 10% płodowego surowicy cielęcej (FCS) i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej z dodatkiem 5% CO2. Przed etapem rozpuszczania usunąć pożywkę z kolby hodowlanej. 
	UWAGA: Każda linia komórkowa wymaga odpowiedniego protokołu przygotowania do propagacji komórek. Wymagania należy skonsultować z dostawcą linii komórkowej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do eksperymentu
<ol>
	<li>Usunąć medium hodowlane i przemyć komórki ~ 10 mL roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS).</li>
	<li>Dodać 5 mL trypsyny do kolby i umieścić kolby z hodowlą komórkową w inkubatorze na 3 do 5 min.</li>
	<li>Dodać ~ 5 mL medium F-12K, aby zdezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Wymieszać 10 µL zawiesiny komórkowej z 10 µL roztworu barwiącego. Dobrze wymieszać za pomocą pipety i przenieść 10 µL mieszaniny do komory „szkiełka licznikowego”.</li>
	<li>Odessać i policzyć komórki w kolbie(ch). Przenieść odpowiednie objętości zawierające pożądaną liczbę komórek (np. 5 x 106 do 108) do plastikowych fiolek.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 1,200 x g przez 5 min i usunąć nadsącz.</li>
	<li>Resuspender komórki w medium F-12K zawierającym 10% FCS do całkowitej objętości 800 μL i przenieść je do naczynia reakcyjnego (2 mL). Umieścić naczynie reakcyjne w plastikowej fiolce wypełnionej ciepłą wodą.</li>
</ol>
4. Przygotowanie środka rozpuszczającego
UWAGA: Odczynnik rozpuszczający jest cieczą stosowaną do rozpuszczania hiperpolaryzowanej próbki. W zastosowaniach biologicznych rozpuszczanie przeprowadza się zazwyczaj przy użyciu buforów na bazie H2O lub tlenku deuteru (D2O), takich jak PBS lub tris(hydroksymetyl)aminometan (Tris), zawierających 1 g/L kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu PBS 20 mmol/L
	<ol>
		<li>Aby przygotować 100 mL czynnika rozpuszczającego, rozpuścić 36 mg fosforanu jednosodowego (NaH2PO4), 247 mg fosforanu dwusodowego (Na2HPO4) oraz 10 mg EDTA w roztworze wodorotlenku sodu (NaOH) 20 mmol/L w D2O. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia. 
		UWAGA: Do buforu dodaje się EDTA (1 g/L) w celu usunięcia ewentualnych jonów ferromagnetycznych, które mogą zakłócić hiperpolaryzację. NaOH jest stosowany do neutralizacji kwasu pirogronowego w stosunku molowym 1:1 w celu uzyskania pH 7,4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Chłodzenie wkładki o zmiennej temperaturze (VTI)
<ol>
	<li>W głównym oknie programu polaryzatora DNP-NMR kliknij „Cooldown”. 
	UWAGA: Powoduje to włączenie pompy próżniowej i odessanie powietrza z VTI do ciśnienia około 5,0 mbar. Następnie zawór iglicowy pomiędzy VTI a zbiornikiem z ciekłym helem otwiera się całkowicie, umożliwiając przepływ ciekłego helu do VTI. Natężenie przepływu jest regulowane za pomocą zaworu iglicowego w celu utrzymania optymalnej ilości ciekłego helu w VTI, aż do osiągnięcia temperatury wrzenia helu. Następnie z VTI odsysane jest powietrze do stanu niemal całkowitej próżni, a temperatura osiąga około 1,4 K. VTI jest wypełniane ciekłym helem do poziomu 65%. W tym momencie instrument jest gotowy do wprowadzenia próbki.</li>
</ol>
6. Przygotowanie i wprowadzanie próbek
<ol>
	<li>Za pomocą mikropipety nanieś ~ 8 µL roztworu zapasu próbki znakowanej 13C do plastikowego kubeczka.</li>
	<li>Przymocuj plastikowy kubeczek do pręta wprowadzającego i rozpocznij proces wprowadzania próbki, klikając „Insert sample” w głównym oknie programu. Wybierz „Normal sample” i kliknij „Continue”. 
	UWAGA: Podczas tego procesu zawór iglicowy najpierw się zamyka, aby przerwać przepływ ciekłego helu do VTI, a następnie ciśnienie w VTI wzrasta. Uchwyt próbki wewnątrz VTI zostaje podniesiony z ciekłego helu, zawór wlotowy na górze VTI otwiera się, a z zaworu wlotowego wprowadzany jest przepływ gazowego helu, aby zapobiec zanieczyszczeniu z zewnątrz wilgocią z powietrza.</li>
	<li>Po wyświetleniu komunikatu wciśnij pręt wprowadzający z przymocowanym plastikowym kubeczkiem w dół do VTI. Upewnij się, że dotarłeś do uchwytu próbki na dnie VTI. W przeciwnym razie gazowy hel może wypchnąć próbkę z VTI.</li>
	<li>Odłącz i wyjmij pręt wprowadzający.</li>
	<li>Zakończ procedurę, klikając „Next” w oknie dialogowym. Procedura wprowadzania próbki nie powinna trwać dłużej niż 10 s. 
	UWAGA: Następnie zawór wlotowy zamyka się, przepływ gazowego helu zostaje przerwany, uchwyt wraz z kubeczkiem z próbką zostaje zanurzony w ciekłym helu, a zawór iglicowy otwiera się, umożliwiając przepływ ciekłego helu do VTI. Po 5 – 10 min VTI schładza się poniżej 1.4 K, co pozwala na spolaryzowanie wszystkich wolnych elektronów.</li>
	<li>Potwierdź, że plastikowy kubeczek z próbką został prawidłowo wprowadzony do VTI, sprawdzając, czy nie jest on przymocowany do pręta wprowadzającego ani nie został wypchnięty z VTI przez gazowy hel. Następnie kliknij „Finish”.</li>
</ol>
7. Przeskanowanie mikrofalowe (opcjonalnie)
UWAGA: Skanowanie mikrofalowe pozwala na wyznaczenie optymalnej częstotliwości mikrofal w celu maksymalizacji szybkości hiperpolaryzacji jąder 13C w badanym związku.
<ol>
	<li>Aby zmierzyć zakres częstotliwości mikrofal, uruchom program RINMR, wpisz „HYPERSENSENMR”, a następnie kliknij „Select Config” i „Do Microsweep”.</li>
	<li>Aby rozpocząć proces, wybierz kartę „calibrate” w głównym oknie programu.</li>
	<li>Kliknij „Generate” i wybierz częstotliwość początkową i końcową (np. 94.100 GHz-94.200 GHz), wielkość kroku częstotliwości (np. 20 MHz), moc (100 mW) oraz czas (60 s). Kliknij „Continue”, „Enable” i „Start”. 
	UWAGA: Przy tych ustawieniach hiperpolaryzator najpierw polaryzuje próbkę przez 60 s, używając częstotliwości mikrofal 94.100 GHz i mocy 100 mW. Następnie aplikuje impuls radiowej częstotliwości (RF) 90° i rejestruje sygnał hiperpolaryzowanego 13C za pomocą wbudowanego spektrometru. Kroki te są powtarzane dla każdego stopnia w określonym zakresie częstotliwości. Do późniejszej hiperpolaryzacji wybierz częstotliwość mikrofal, dla której zmierzono maksymalną amplitudę sygnału.</li>
</ol>
8. Polaryzacja
<ol>
	<li>Aby zmierzyć przyrost polaryzacji, uruchom program RINMR, wpisz „HYPERSENSENMR”, a następnie kliknij „Select Config” i „Solid Build-up”.</li>
	<li>W głównym oknie programu polaryzatora DNP-NMR kliknij „Polarization”, aby rozpocząć proces hiperpolaryzacji.</li>
	<li>Wybierz optymalną częstotliwość mikrofal (uzyskaną podczas skanowania mikrofalowego) oraz moc (np. 100 mW) dla próbki i kliknij „Next”.</li>
	<li>Włącz opcję „Polarization build-up monitoring” i kliknij „Finish”.</li>
	<li>Spolaryzuj próbkę do poziomu &gt; 95% (~ 60 min dla [1-13C]pirowinianu). 
	UWAGA: Podczas polaryzacji mikrofale są kierowane do VTI i do próbki, co powoduje ustawienie spinów 13C zgodnie z hiperpolaryzowanymi spinami niesparowanych elektronów. Aby zmierzyć przyrost hiperpolaryzacji, okresowo stosuje się impulsy RF o kącie odchylenia (FA) wynoszącym 5° (np. co 300 s), a otrzymany sygnał jest przedstawiany w postaci krzywej przyrostu polaryzacji.</li>
</ol>
9. Rozpuszczanie
<ol>
	<li>Gdy polaryzacja osiągnie poziom &gt; 95%, należy rozpocząć proces rozpuszczania, klikając „Dissolution” w głównym oknie programu polaryzatora DNP-NMR.</li>
	<li>Wybierz proces rozpuszczania z menu rozwijanego i kliknij „Next”. 
	UWAGA: Polaryzator umożliwia zdefiniowanie pożąnego procesu rozpuszczania poprzez wybór czasu podania gazu wypierającego.</li>
	<li>Wprowadź ~ 5 mL czynnika rozpuszczającego przez górny zawór do podgrzewanego naczynia w sekcji rozpuszczania polaryzatora. Oblicz dokładną objętość wymaganego czynnika rozpuszczającego, korzystając z następującego równania: 
	<img alt="Równanie dla równowagi statycznej; formuła V_{DA}." src="/files/ftp_upload/54751/54751eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie VDA to pożądana objętość czynnika rozpuszczającego, a mPA, mOX063 i mGad to odpowiednio masy pirogronianu, OX063 i gadoteratu megluminy dodane do roztworu zapasowego próbki.</li>
	<li>Umieść pręt rozpuszczający w pozycji aktywnej nad zaworem wlotowym. 
	UWAGA: Pozwala to instrumentowi na połączenie aparatury rozpuszczającej z naczyniem na próbkę w VTI.</li>
	<li>Kliknij „Finish”, aby rozpocząć proces rozpuszczania. 
	UWAGA: Czynnik rozpuszczający jest poddawany ciśnieniu 3 bar za pomocą gazu helowego, a następnie podgrzewany do 200 °C, co powoduje wzrost ciśnienia. Gdy ciśnienie osiągnie 10 bar, zawór iglicowy zamyka się, aby przerwać przepływ ciekłego helu do VTI. Uchwyt próbki podnosi naczynie z ciekłego helu. Pręt rozpuszczający jest opuszczany do VTI i łączony z naczyniem na próbkę. Przygotowany czynnik rozpuszczający jest tłoczony przez ciśnienie powstałe w naczyniu grzejnym zawierającym bufor rozpuszczający i gaz helowy, przez pręt rozpuszczający do naczynia, co powoduje szybkie rozpuszczenie próbki. Roztwór wypływa następnie do kolby zbiorczej przez plastikową rurkę. Pręt rozpuszczający z przymocowanym naczyniem jest następnie podnoszony z VTI.</li>
	<li>Przenieś pręt rozpuszczający z przymocowanym naczyniem do pozycji czyszczącej („cleaning”) i zakończ proces, klikając „Finish”.</li>
</ol>
10. Detekcja sygnału hiperpolaryzowanego 13C
<ol>
	<li>Spektroskopia magnetycznego rezonansu metabolicznego 13C in vitro
	<ol>
		<li>Zmieszać 200 µL hiperpolaryzowanej próbki o stężeniu 20 mmol/L z kolby zbiorczej z 800 µL roztworu komórek. 
		UWAGA: Końcowe stężenie [1-13C]pirowinianu wynosi 4 mmol/L.</li>
		<li>Dokładnie wymieszać zawiesinę za pomocą mikropipety i przenieść ok. 600 µL do 5-mm probówki NMR.</li>
		<li>Wprowadzić 5-mm probówkę NMR do spektrometru NMR 1-T. W głównym oknie oprogramowania kliknąć „Run”, aby rozpocząć pomiar, stosując serię stu impulsów RF 10° co 3 s. 
		UWAGA: Zmierzyć czas od momentu wstępnego mieszania hiperpolaryzowanej próbki z komórkami do rozpoczęcia akwizycji spektroskopowej. Należy upewnić się, że procedura mieszania nie trwa dłużej niż 30 s, aby zminimalizować utratę polaryzacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie magnetycznego rezonansu metabolicznego 13C
	<ol>
		<li>Aby przygotować pojemnik do eksperymentów in vitro z użyciem spektrometru MRI, należy wziąć strzykawkę 5-mL i podłączyć ją do cewnika (d = 1,2 mm), który jest wystarczająco długi, aby sięgać od izocentrum spektrometru do obszaru dostępnego spektrometru.</li>
		<li>Wypełnić pojemnik in vitro roztworem komórek o żądanej koncentracji dla danego eksperymentu (np. 108) lub roztworem enzymatycznym.</li>
		<li>Umieścić pojemnik in vitro w izocentrum magnesu MRI. Na pojemniku umieścić cewkę odbiorczą częstotliwości radiowej dostrojoną do 13C. W pobliżu umieścić skoncentrowany fantom kalibracyjny znakowany 13C (np. 10-mol/L 13C-mocznik).</li>
		<li>Wprowadzić „pojemnik in vitro” w pobliże izocentrum skanera NMR.</li>
		<li>Uruchomić standardową sekwencję lokalizacyjną 3-płaszczyznową skanera i w razie potrzeby skorygować położenie pojemnika in vitro względem izocentrum.</li>
		<li>Uruchomić „anatomiczną” sekwencję T2-zależną 1H obejmującą lokalizację pojemnika in vitro. Użyć następujących ustawień: 2D echo spinowe w orientacji axialnej, czas repetycji (TR) = 2 000 ms, czas echa (TE) = 20 ms, grubość warstwy = 1 mm, pole widzenia obejmujące pojemnik in vitro oraz 16 ech na jedno wzbudzenie. Na tym etapie należy upewnić się, że przeprowadzono shimming pola dla protonów.</li>
		<li>Na obrazach anatomicznych wybrać 5 sąsiadujących warstw wyśrodkowanych na obszarze zainteresowania. Zaplanować akwizycję kalibracji spektroskopowej 13C obejmującą wybrane warstwy anatomiczne. Użyć następujących ustawień: 2D sekwencja kalibracyjna Block-Siegert w orientacji axialnej z kodowaniem centricznym 12 x 12, TR = 1 000 ms, grubość warstwy = 5 mm, pole widzenia zgodne z obrazami anatomicznymi, liczba skanów (NS) = 64, szerokość pasma = 5 000 Hz oraz FA = 90°.</li>
		<li>Wybrać sekwencję kalibracji spektroskopowej 13C (więcej informacji w Schulte et al. 2011)75 z biblioteki sekwencji impulsowych. Pobrać sekwencję impulsową z komputera do skanera, klikając „Download”. Kliknąć „Spectra Prescan”, aby uruchomić preskan spektroskopowy. Na wykresie amplitudy widma dostosować pik z fantomu kalibracyjnego 13C do centrum częstotliwości skanera. Ustawić wzmocnienie odbiornika na maksimum. Kliknąć „Start”, aby uruchomić sekwencję kalibracji spektroskopowej 13C. Zanotować zgłoszone wzmocnienie nadawcze i częstotliwość centralną.</li>
		<li>Ustawić akwizycję obrazowania przesunięcia chemicznego (CSI) 13C obejmującą wybrane warstwy anatomiczne. Użyć następujących ustawień: 2D spektroskopowe obrazowanie echo-planar (EPSI) w orientacji axialnej z kodowaniem centricznym 12 x 12, TR = 400 ms, grubość warstwy = 5 mm, pole widzenia zgodne z obrazami anatomicznymi, NS = 300 oraz szerokość pasma = 5 000 Hz. 
		UWAGA: EPSI wielokrotnie próbkuje jedną linię w przestrzeni k po jednym wzbudzeniu RF, aby jednocześnie pozyskać informacje przestrzenne i spektralne. Więcej informacji na temat technik akwizycji znajduje się w artykule Durst et al. 201576.</li>
		<li>Pobrać sekwencję 13C CSI i uruchomić preskan spektroskopowy. Dostosować częstotliwość skanera i ustawić wzmocnienie nadawcze zgodnie z wynikiem sekwencji kalibracyjnej.</li>
		<li>Po przelaniu hiperpolaryzowanego roztworu do kolby zbiorczej, pobrać ok. 3 mL do strzykawki, a następnie wstrzyknąć do cewnika połączonego z pojemnikiem in vitro. Rozpocząć akwizycję. Po zakończeniu akwizycji zapisać plik z surowymi danymi do późniejszej rekonstrukcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. Rekonstrukcja danych
<ol>
	<li>Zastosuj jeden z dwóch opisanych modeli kinetycznych do analizy pozyskanych danych.
	<ol>
		<li>W pierwszej metodzie opisu kinetyki LDH, w celu wyznaczenia wartości kinetycznej (k), porównaj sumę sygnału mleczanu (MLAC) do sygnału wszystkich cząsteczek hiperpolaryzowanych (Mx)21,77. 
		<img alt="Równanie stałej równowagi dynamicznej k w kinetyce chemicznej, przedstawiające wzór k=M_LAC/ΣM_x." src="/files/ftp_upload/54751/54751eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 2"></li>
		<li>W drugiej metodzie zmierz sygnały mleczanu i pirogronianu w czasie, a następnie dopasuj je do modelu kinetycznego17,25,71. Aby obliczyć szybkość wymiany metabolicznej, kPA→LAC, oraz efektywną szybkość zaniku sygnału mleczanu, rLAC, zastosuj następujące równania różniczkowe liniowe z wykorzystaniem różniczkowego modelu wymiany dwumiejscowej, co dla mleczanu daje: 
		 
		<img alt="Równanie różniczkowe dla procesu biochemicznego; przedstawia zmianę szybkości w czasie; analiza wzoru." src="/files/ftp_upload/54751/54751eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 3"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga: Efektywna szybkość zaniku sygnału mleczanu rLAC zależy od czasu relaksacji podłużnej mleczanu (T1,LAC), przeciwnej szybkości wymiany metabolicznej z mleczanu do pirogronianu kLAC→PA, zastosowanego FA i TR, a także natężenia sygnału pirogronianu (MPA) i mleczanu (MLAC), z uwzględnieniem nieodwracalnej redukcji sygnału po każdym kolejnym wzbudzeniu: 
 
<img alt="Równanie szybkości metabolicznej, formuła rLAC; analiza kinetyczna w badaniach biochemicznych." src="/files/ftp_upload/54751/54751eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 4">
W związku z tym rLAC skutkuje pojedynczym, nierozdzielnym składnikiem zaniku sygnału. Ponieważ możliwe jest skorygowanie kąta odchylenia i czasu repetycji, a mimo istnienia strumienia LAC→PA, przyjmujemy, że szybkość wymiany mleczanu na pirogronian (kLAC→PA) nie musi być uwzględniona w obliczeniach, w oparciu o wyniki Harrison et al. z 2012 r.78. Ich wyniki wskazują, że kLAC→PA nie odgrywa tak kluczowej roli, jak można by przypuszczać. Tryb ten pozwala na ilościowe określenie czasu relaksacji T1 mleczanu. Model ten jest niezależny od podania pirogronianu do pomiaru, co w przypadku eksperymentów in vitro nie jest istotne i można to pominąć. Odgrywa on jednak ważną rolę w pomiarach in vivo79.

Rolf F. Schulte i Marion I. Menzel są zatrudnieni w GE Global Research.

13CMRSI z sondami hiperpolaryzacyjnymi jest obiecującą metodą monitorowania metabolizmu w czasie rzeczywistym, in vitro i in vivo. Bardzo ważnym aspektem przy stosowaniu tego procesu eksperymentalnego jest właściwa standaryzacja, zwłaszcza w odniesieniu do eksperymentów in vitro . Po pierwsze, przygotowanie próbki musi być wykonane prawidłowo i konsekwentnie, aby osiągnąć takie samo stężenie materiału hiperspolaryzowanego w każdym eksperymencie. Wymaga to precyzyjnego zważenia zarówn...

Obecnie najszerzej stosowaną metodą kliniczną do oceny stopnia zaawansowania guza, ponownej oceny stopnia zaawansowania, monitorowania odpowiedzi na leczenie oraz wykrywania nawrotów szerokiej gamy nowotworów jest PET z użyciem [18F]-FDG.1 Jednak w ostatnim czasie pojawiło się kilka nowych i alternatywnych podejść. Jedną z tych metod jest 13CMRSI. Technika ta polega na wprowadzeniu cząsteczki 13C do próbki biologicznej, a następnie wykonaniu małoinwazyjnego MRI w celu oceny metabolizmu in vitro lub in vivo w czasie rzeczywistym. Niemniej jednak największym wyzwaniem w przypadku 13CMRSI, w porównaniu z innymi metodami takimi jak PET z [18F]-FDG czy tomografia komputerowa, jest niski stosunek sygnału do szumu.
Sygnał NMR jest bezpośrednio proporcjonalny do poziomu polaryzacji, czyli stosunku różnicy w populacji jąder o spinie ½ w dwóch stanach energetycznych do całkowitej populacji (Ryc. 1A). Polaryzacja jest iloczynem stosunku gyromagnetycznego (γ) jąder i natężenia przyłożonego pola magnetycznego podzielonym przez temperaturę. Typowa polaryzacja jąder 1H wynosi od 0,001% do 0,005% przy 3 T, co skutkuje stosunkowo niskim stosunkiem sygnału do szumu. Współczesny, zaawansowany obrazowanie MRI stało się skuteczną metodą obrazowania wyłącznie dzięki wysokiej zawartości 1H w próbkach biologicznych oraz wysokiemu stosunkowi gyromagnetycznemu 1H (γ1H = 42,576 MHz/T). Jednak obserwacja innych jąder, takich jak węgiel, jest bardziej wymagająca. Jedyny stabilny, magnetycznie aktywny izotop węgla, 13C, stanowi zaledwie 1,1% wszystkich atomów węgla. Ponadto stosunek gyromagnetyczny 13C (γ13C = 10,705 MHz/T) jest czterokrotnie niższy niż dla 1H, co prowadzi do niższej wydajności detekcji. Podsumowując, niska zawartość 13C oraz niskie γ13C sprawiają, że termiczne pomiary 13C osiągają jedynie 0,0176% czułości pomiaru 1H-NMR in vivo.
Dynamiczna polaryzacja jądrowa
Metodą pozwalającą przezwyciężyć stosunkowo niską czułość pomiarów 13C jest DNP. Została ona pierwotnie opisana dla metali w 1953 roku przez Alberta W. Overhausera. W swoim artykule stwierdził on: „Wykazano, że jeżeli rezonans spinowy elektronów przewodzenia zostanie nasycony, jądra zostaną spolaryzowane w takim samym stopniu, w jakim stałyby się, gdyby ich stosunek gyromagnetyczny był taki sam jak w przypadku spinu elektronu.”2 Pod koniec tego samego roku Carver i Slichter potwierdzili eksperymentalnie hipotezę Overhausera3. W 1958 roku Abragam i Proctor opisali ten efekt dla elektronów w cieczach i nazwali go „efektem ciała stałego”. W temperaturach poniżej 4 K polaryzacja spinu elektronowego osiąga niemal 100% i jest o ponad trzy rzędy wielkości wyższa niż polaryzacja spinu jądrowego (Rysunek 1B)4. Dzieje się tak dlatego, że stosunek gyromagnetyczny elektronu (γe = 28024,944 MHz/T) jest o trzy rzędy wielkości wyższy niż stosunki gyromagnetyczne jąder. Słabe oddziaływania między elektronami a jądrami, takie jak efekt Overhausera, efekt ciała stałego, efekt krzyżowy oraz efekt mieszania termicznego, umożliwiają transfer polaryzacji ze spinów elektronowych na spiny jądrowe przy użyciu promieniowania mikrofalowego o częstotliwości bliskiej odpowiadającej częstotliwości rezonansu paramagnetycznego elektronów (EPR)5,6. Teoria DNP była dalej rozwijana, aby uwzględnić większą liczbę elektronów oraz mieszanie termiczne. Niemniej jednak do dziś nie opublikowano jednolitego, ilościowego opisu teoretycznego DNP7,8.
<img alt="Schemat procesu hiperpolaryzacji; wpływ DNP na polaryzację w funkcji temperatury, porównanie spinów." src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Zrozumienie dynamicznej polaryzacji jądrowej i hiperpolaryzacji. A) Schematyczne porównanie populacji spinów w stanie polaryzacji równowagi termicznej oraz w stanie hiperpolaryzacji. B) Polaryzacja jest zależna od temperatury. Polaryzacja elektronu (e-) osiąga 100% poniżej 1,4 K. DNP umożliwia transfer polaryzacji z e- na jądra 13C, co zwiększa ich polaryzację nawet 105-krotnie. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Aby wprowadzić DNP do badań systemów biologicznych z wykorzystaniem 13C NMR, konieczne było opracowanie metody szybkiego rozpuszczania próbek. 50 lat po hipotezie Overhausera, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. rozwiązali trudny technicznie problem doprowadzenia hiperpolaryzowanej zamrożonej próbki do stanu ciekłego przy minimalnej utracie hiperpolaryzacji6. DNP z rozpuszczaniem (dissolution DNP) otworzyło nowe pole badawcze zwane 13CMRSI, dostarczając nowej metody badania i charakteryzowania różnych stanów chorobowych9,10. Jako stabilne nośniki niesparowanego elektronu zazwyczaj stosuje się rodnik trytylowy tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2-4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063) lub (2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl (TEMPO). Są one mieszane z pożądaną cząsteczką znakowaną 13C i poddawane napromieniowaniu mikrofalowemu o częstotliwości zbliżonej do odpowiadającej częstotliwości EPR. Dzięki tej technice polaryzację jąder 13C można zwiększyć do 37%11. Skutkuje to 105-krotnym zwiększeniem polaryzacji w porównaniu do polaryzacji w równowadze termicznej11,12. Jednak w momencie przerwania napromieniowania mikrofalowego i/lub przeniesienia cząsteczki 13C do stanu ciekłego, polaryzacja zanika w czasie relaksacji podłużnej (T1) spolaryzowanego jądra 13C. Zatem wynalezienie technik szybkiego rozpuszczania lub jakiejkolwiek późniejszej metody skracającej czas przed pomiarem eksperymentalnym (t.j. wtryskiem) ma kluczowe znaczenie dla zastosowań biologicznych13.
Istnieją trzy główne wymagania, które kandydacka cząsteczka musi spełnić, aby odnieść sukces 13badania CMRSI. Po pierwsze, 13Badane jądro musi charakteryzować się wystarczająco długim czasem T21 (&gt; 10 s). Wybór 13Znakowanie węglem (C-label) jest kluczowe. Najlepszymi kandydatami na jądra są atomy węgla niebędące w bezpośrednim kontakcie z 1jądra H poprzez wiązanie. Musi być ono również szybko metabolizowane w ciągu 2–3 T1 krótki czas, co prowadzi do powstania produktu metabolicznego o przesunięciu chemicznym znacząco różniącym się od substancji wyjściowej. Mieszanina próbek w stanie stałym musi również tworzyć szkło amorficzne, aby rozkład przestrzenny zmniejszył odległość między elektronem a 13C, co umożliwia transfer polaryzacji. Jeśli cząsteczka kandydacka nie tworzy naturalnie szkła amorficznego, musi być wysoce rozpuszczalna w czynniku szkłotwórczym, takim jak glicerol lub dimetylosulfotlenek14Wymagania te sprawiają, że liczba cząsteczek kandydackich jest stosunkowo niewielka. Jednak nawet po udanym odkryciu odpowiedniej cząsteczki opracowanie funkcjonalnego protokołu hiperpolaryzacji może być wyzwaniem technicznym.9,14,15.
W ostatnich latach pomyślnie spolaryzowano kilka substratów, takich jak [1-13C]pirogronian12,16-36, [2-13C]pirogronian37, [1-13C]pirogronian etylu38, [1-13C]mleczan39, [1-13C]fumaran40-43, 13C-węglan36,44,45, [1-13C]octan sodu43,46-49, 13C-mocznik6,36,50,51, [5-13C]glutamina15,52,53, [1-13C]glutaminian53,54, [1-13C]2-oksoglutaran55, [1-13C]alanina i inne14,56. Szczególnie interesującym i powszechnie stosowanym substratem do hiperpolaryzacji jest [1-13C]pirogronian. Jest on szeroko wykorzystywany w badaniach przedklinicznych do badania komórkowego metabolizmu energetycznego w różnych jednostkach chorobowych14,17,22. [1-13C]pirogronian spełnia wszystkie wymagania niezbędne do skutecznej hiperpolaryzacji, w tym posiada stosunkowo długi czas T1 oraz charakteryzuje się szybkim transportem przez błonę komórkową przed późniejszym metabolizmem. Badania przedkliniczne z użyciem [1-13C]pirogronianu są obecnie wdrażane do praktyki klinicznej57.
Metabolizm pirogronianu
Powszechnie wiadomo, że istnieje bezpośredni związek między mutacjami w DNA komórek nowotworowych a zmianami w ich szlakach metabolicznych. Już w latach 20. XX wieku Otto Warburg odkrył, że w guzach występuje zwiększony metabolizm glukozy i produkcja mleczanu w porównaniu z tkanką zdrową58-60. Następnie opisano różne zmiany w innych szlakach metabolicznych, takich jak szlak pentozofosforanowy, cykl kwasu trójkarboksylowego, fosforylacja oksydacyjna oraz synteza nukleotydów i lipidów.
Pirogronian jest produktem końcowym glikolizy. W guzie ulega on glikolizie beztlenowej katalizowanej przez LDH61 i reaguje z zredukowaną formą koenzymu nikotynamidoadeninodynukleotydu (NADH), co prowadzi do powstania mleczanu i utlenionej formy koenzymu (NAD+). Alternatywnie pirogronian ulega reakcji transaminacji z glutaminianem w celu utworzenia alaniny, katalizowanej przez aminotransferazę alaninową (ALT). Obie reakcje są łatwo odwracalne. Pirogronian ulega również dekarboksylacji katalizowanej przez dehydrogenazę pirogronianową (PDH) do dwutlenku węgla i acetylo-CoA, co stanowi reakcję nieodwracalną na tym etapie. Zmiany w szybkościach tych reakcji mogą być powiązane z metabolizmem guza17,21,22,25,62. Ścieżki metaboliczne przedstawiono w podsumowaniu na Rysunku 2.
<img alt="Schemat procesu hiperpolaryzacji; wpływ DNP na polaryzację w funkcji temperatury, porównanie spinów." src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat głównych reakcji metabolicznych pirogronianu. Konwersja pirogronianu do mleczanu jest katalizowana przez LDH, a konwersja pirogronianu do alaniny jest katalizowana przez ALT. Pirogronian jest nieodwracalnie przekształcany w acetyl-CoA i CO2 przez PDH, a CO2 znajduje się w równowadze zależnej od pH z wodorowęglanem80. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wykrywanie hiperpolaryzowanego [1-13C]pirogronianu oraz jego metabolitów zostało wcześniej zademonstrowane w sercu szczura37,63-65, wątrobie66, mięśniach i nerkach62,67. Jedno z badań wykazało istotne różnice w stosunku mleczanu do alaniny pomiędzy normalną a na czczo wątrobą szczura66 oraz wykazało silnie podwyższony poziom hiperpolaryzowanego [1-13C]mleczanu w raku wątroby68,69. Istnieją dowody na to, że stopień złośliwości guza można zidentyfikować w transgenicznym gruczolakoraku prostaty myszy (TRAMP) przy użyciu hiperpolaryzowanego [1-13C]pirogronianu22, przy czym poziomy hiperpolaryzowanego mleczanu wykazują wysoką korelację z stopniem histologicznym wyciętych guzów. Sugerowano również, że alanina katalizowana z pirogronianu przez ALT może być użytecznym markerem w raku hepatokomórkowym szczura23.
Pomiar strumienia metabolicznego pirogronian-mleczan był stosowany do monitorowania niedokrwienia63,65,70 oraz jako odpowiedź na leczenie cytotoksyczną chemioterapią17,40, lekami celowanymi24,25,41 lub radioterapią26 w modelach zwierzęcych. Wykorzystywano go również do wykrywania odpowiedzi na inhibitor fosfatydyloinozytolu 3-kinazy (PI3K) LY294002 w mysich modelach glejaka i raka piersi25. Po leczeniu zaobserwowano również zmiany w metabolizmie pirogronianu w guzach mózgu26 oraz raku prostaty24,71.
Rak prostaty
Rak prostaty jest najczęściej występującym nowotworem u starszych mężczyzn i drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworów u mężczyzn na całym świecie72. Do tej pory nie opracowano niezawodnych, nieinwazyjnych metod wczesnej diagnostyki i charakterystyki raka prostaty73,74, co podkreśla pilną potrzebę wprowadzenia nowych technik obrazowania metabolicznego umożliwiających precyzyjną detekcję i określanie stopnia zaawansowania choroby u pacjentów. Rak prostaty został wykorzystany jako model do zademonstrowania możliwości zastosowania DNP w roztworze w połączeniu z 13CMRSI u pacjentów57. Prace te kontynuowano w pierwszym badaniu klinicznym z wykorzystaniem [1-13C]pirogronianu i 13CMRSI do obrazowania raka prostaty, które zostało niedawno zakończone (NCT01229618).
Motywacją do podjęcia niniejszej pracy była chęć szczegółowego przedstawienia szerszemu gronu odbiorców zastosowania 13Metoda CMRSI w warunkach przedklinicznych z wykorzystaniem komórek. Pomiar metabolizmu [1- katalizowanego przez LDH13C]pirogliconian do [1-13mleczan in vitro w linii komórkowej raka prostaty PC3, demonstrujemy możliwe zastosowanie DNP w stanie rozpuszczonym w in vitro badania i omawiają kluczowe etapy oraz wyzwania występujące podczas eksperymentów.

<table><tbody><tr><td>HiperSense DNP Polaryzator</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>3,35 T przedkliniczny hiperpolaryzator DNP</td></tr><tr><td>GE/Agilent MR901</td><td>GE Healthcare/Agilent Technologies</td><td></td><td>7-tonowy przedkliniczny skaner MRI, z małym otworem przeznaczony do eksperymentów na gryzoniach</td></tr><tr><td>Spinsolve Carbon</td><td>Magritek</td><td></td><td>1 T Spektrometr NMR z magnesem trwałym</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu monbasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Wersenian disodowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy - 13C1</td><td>Cambridge Isotopes Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Dotarem (0,5 mmol/L)</td><td>Guerbet</td><td></td><td>gadoteran megluminy&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>tris (8-karboksyl-2,2,6,6-tetra-(hydroksyetylo)-benzo-[1,2&ndash; Sól sodowa 4,5]-bis-(1,3)-ditiole-4-ylo)-metylu (OX063)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>rodnik trytylowy stosowany jako źródło wolnych elektronów</td></tr><tr><td>linii komórkowej PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL1435</td><td></td></tr><tr><td>F-12K&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td></td><td>ATCC SCRR-30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA, 1x</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy kubek na próbkę</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013-MSDS</td><td></td></tr></tbody></table>

hiperspolaryzowana spektroskopia i obrazowanie metabolicznego rezonansu magnetycznego 13c

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

W ostatnich dziesięcioleciach pojawiły się nowe metody oceny stopnia zaawansowania nowotworu, regeneracji, monitorowania odpowiedzi na leczenie i wykrywania nawrotów różnych nowotworów w połączeniu z najnowocześniejszą pozytonową tomografią emisyjną z 18F-fluorodeoksyglukozą ([18F]-FDG PET). 13Obrazowanie spektroskopowe metodą rezonansu magnetycznego C (13CMRSI) jest małoinwazyjną metodą obrazowania, która umożliwia monitorowanie metabolizmu in vivo i w czasie rzeczywistym. Podobnie jak w przypadku każdej innej metody opartej na magnetycznym rezonansie jądrowym (NMR) 13C, stoi ona przed wyzwaniem niskiej polaryzacji termicznej i wynikającego z niej niskiego stosunku sygnału do szumu ze względu na stosunkowo niski stosunek żyromagnetyczny wynoszący 13C i jego niską naturalną obfitość w próbkach biologicznych. Pokonując te ograniczenia, dynamiczna polaryzacja jądrowa (DNP) z późniejszym rozpuszczaniem próbki umożliwiła ostatnio powszechnie stosowanym systemom NMR i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) pomiar, badanie i obrazowanie kluczowych szlaków metabolicznych w różnych systemach biologicznych. Szczególnie interesującą i obiecującą cząsteczką wykorzystywaną w 13CMRSI jest pirogronian [1-13C], który w ciągu ostatnich dziesięciu lat był szeroko stosowany w badaniach in vitro, przedklinicznych, a ostatnio klinicznych w celu zbadania metabolizmu energii komórkowej w nowotworach i innych chorobach. W artykule przedstawiono technikę rozpuszczania DNP przy użyciu przedklinicznego hiperpolaryzatora DNP o masie 3,35 T i wykazano jego zastosowanie w badaniach in vitro. Podobny protokół dla hiperpolaryzacji może być również stosowany w większości badań in vivo. W tym celu użyliśmy dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i katalizowaliśmy reakcję metaboliczną pirogronianu [1-13C] na [1-13C] mleczan w linii komórkowej raka gruczołu krokowego, PC3, in vitro przy użyciu 13CMRSI.

Wyniki „przeskanowania mikrofalowego” przedstawiono na Rysunku 3. Wskazują one, że optymalna częstotliwość mikrofal dla próbki [1-13C]pirogluinianu wynosi 94,156 GHz dla lokalnego hiperpolaryzatora o natężeniu pola 3,35 T. Wszystkie kolejne eksperymenty z hiperpolaryzacją (n = 14) przeprowadzono przy użyciu tej częstotliwości mikrofal z mocą 100 mW. Naświetlanie mikrofalowe stosowano przez 60 do 80 min, co doprowadziło do uzyskania hiperpolaryzacji w stanie stałym przekraczającej 90%. Wyniki p...

Dynamiczna polaryzacja jądrowa z późniejszym rozpuszczaniem próbki umożliwiła badania metabolizmu w systemach biologicznych w czasie rzeczywistym. Hiperspolaryzowany [1-13C]pirogronian zastosowano do badania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w linii komórkowej raka gruczołu krokowego in vitro.

Hiperspolaryzowana spektroskopia i obrazowanie metabolicznego rezonansu magnetycznego 13C

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

Ogólnym celem tej procedury jest hiperpolaryzacja cząsteczek znakowanych węglem 13 przy użyciu dynamicznej polaryzacji jądrowej oraz pomiar ich enyzmatycznej konwersji za pomocą rezonansu magnetycznego węgla 13, obrazowania retroskopowego, in vitro. Metoda ta zwiększa sygnał rezonansowy węgla od 10 000 do 100 000 razy, umożliwiając odróżnienie warstwowych związków od ich produktów przemiany materii i zlokalizowanie ich w organizmie poprzez obrazowanie. Główną zaletą tej metody, w porównaniu np. z technikami VR, jest to, że zapewnia ona wgląd w metabolizm substancji naturalnie występujących w organizmach żywych w czasie rzeczywistym.Również ta metoda może dostarczyć wglądu w metabolizm raka i tak jak to jest in vitro. Może być również stosowany do modeli zwierzęcych i pacjentów. Zastosowanie tej techniki wykracza poza lokalizację guza.Może być stosowany do znajdowania i rozróżniania metabolicznych podtypów nowotworów oraz do monitorowania leczenia za pomocą najnowocześniejszych technik. Aby rozpocząć procedurę, najpierw przygotuj jednomilimolowy roztwór megluminianu gadoteranowego i stężonego jednowęglowego pirogronianu 13. Dodaj rodnik trytylowy OX063 do mieszaniny, aby uzyskać koń

hyperpolarized-13c-metabolic-magnetic-resonance-spectroscopy

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano proces wytwarzania hiperpolaryzowanego ksenonu za pomocą optycznego pompowania wymiany spinowej (SEOP). Metoda ta pozwala na ok. 10000-krotne zwiększenie polaryzacji spinu jądrowego Xe-129 i znajduje zastosowanie w spektroskopii oraz obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego jąder. Przedstawiono przykłady eksperymentów w fazie gazowej oraz w stanie roztworu.

Hiperpolaryzowany ksenon w zastosowaniach NMR i MRI

Ten artykuł ma na celu opisanie podstawowego protokołu łączenia przezczaszkowej stymulacji prądem stałym (tDCS) z pomiarami spektroskopii magnetycznego rezonansu protonowego (1H-MRS) w celu zbadania wpływu obustronnej stymulacji na metabolizm pierwotnej kory ruchowej.

Zastosowanie spektroskopii rezonansu magnetycznego jako narzędzia do pomiaru wpływu przezczaszkowej stymulacji elektrycznej na pierwotny metabolizm kory ruchowej

Choroby nerwowo-mięśniowe często wykazują zróżnicowaną czasowo, przestrzennie niejednorodną i wieloaspektową patologię. Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie tej patologii za pomocą nieinwazyjnych metod obrazowania metodą rezonansu magnetycznego.

Ilościowy rezonans magnetyczny w chorobach mięśni szkieletowych

Zwiększenie czułości zapewniane przez dynamiczną polaryzację jądrową (DNP) umożliwia śledzenie procesów metabolicznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR i MRI. Omówiono charakterystykę i wydajność dedykowanego zestawu DNP do rozpuszczania, przeznaczonego do badania reakcji enzymatycznych.

Oprzyrządowanie do dynamicznej polaryzacji jądrowej do rozpuszczania do pomiarów szybkości reakcji enzymatycznych w czasie rzeczywistym za pomocą NMR

Wielokompartmentowy dynamiczny fantom jest używany do symulacji niektórych interesujących biologicznych badań metabolicznych przy użyciu hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego.

Wykorzystanie wielokompartmentowego dynamicznego fantomu pojedynczego enzymu do badań hiperspolaryzowanych czynników rezonansu magnetycznego

Nowa metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR), rapid scan EPR (RS-EPR), została zademonstrowana do przestrzennego obrazowania spektralnego 2D, która jest lepsza od tradycyjnej techniki ciągłej fali (CW) i otwiera nowe możliwości obrazowania in vivo. Wyniki są demonstrowane na częstotliwości 250 MHz, ale technika ta ma zastosowanie na dowolnej częstotliwości.

Szybki skan elektronowy rezonansu paramagnetycznego otwiera nowe możliwości obrazowania fizjologicznie ważnych parametrów in vivo

Prezentujemy protokół do pomiaru zależności pola magnetycznego od czasu relaksacji spinowo-sieciowej 13związków wzbogaconych w C, hiperpolaryzowanych za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej, przy użyciu szybkiej relaksometrii z cyklem pola. W szczególności wykazaliśmy to za pomocą pirogronianu [1-13C], ale protokół można rozszerzyć na inne hiperspolaryzowane substraty.

Pomiar zależności pola magnetycznego od relaksacji sieci spinowej hiperspolaryzowanego [1-13C]pirogronianu

Opisujemy eksperymentalny układ do podawania hiperspolaryzowanych metabolitów znakowanych 13znakowanymi C w trybie ciągłej perfuzji do izolowanego perfundowanego serca myszy. Dedykowane podejście do akwizycji 13C-NMR umożliwiło ilościowe określenie aktywności enzymów metabolicznych w czasie rzeczywistym, a wieloparametryczna analiza 31P-NMR umożliwiła określenie zawartości ATP i pH w tkankach.

Badanie metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej [1-13C] pirogronianu i spektroskopii 13C/31P NMR

Rękopis przedstawia szczegółowy protokół użycia hiperspolaryzowanego odzyskiwania nasycenia chemicznego ksenonu-129 (CSSR) do śledzenia wymiany gazowej w płucach, oceny pozornej grubości ściany przegrody pęcherzykowej i pomiaru stosunku powierzchni do objętości. Metoda ta może pomóc w diagnozowaniu i monitorowaniu chorób płuc.

Ilościowa miara struktury i funkcji płuc uzyskana z hiperpolaryzowanej spektroskopii ksenonowej

Protokół ten integruje niestandardowy system bioreaktora z hiperspolaryzowaną spektroskopią NMR ¹³C w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, poprawiając odtwarzalność i dokładność kinetyczną w badaniach metabolicznych i badaniach przesiewowych leków.

Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego 13C NMR

Poznaj hiperpolaryzację dynamiczną jądrową do obserwacji metabolizmu komórek raka prostaty w czasie rzeczywistym za pomocą spektroskopii i obrazowania rezonansu magnetycznego 13C.

Hiperspolaryzowana spektroskopia i obrazowanie metabolicznego rezonansu magnetycznego ¹³C

Przeglądaj więcej filmów