Hybrid-Cut: ulepszona metoda cięcia opornych próbek tkanek roślinnych

Ogólnym celem metody cięcia tkanek metodą cięcia hybrydowego jest poprawa integralności pociętych opornych tkanek roślinnych, tych z twardymi włóknami i kryształami krzemionki, w celu stworzenia odpowiednich próbek tkanek do badań anatomicznych i biologicznych. Rośliny, które zawierają wysoki poziom kryształów i krzemionki, mogą cierpieć z powodu poważnego rozdarcia parafiny i problemów podczas cięcia. Metoda ta znacznie poprawia integralność tkanek.

Główną zaletą tej techniki jest to, że cięcie w bardzo niskiej temperaturze w kriosacie utwardza blok parafinowy, znacznie zmniejszając problem ścinania kryształów. Zastosowanie tej techniki może obejmować między innymi hybrydyzację in situ, FISH i ocenę wewnętrzną. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy mające na celu zapewnienie ścisłego przylegania bloku parafiny do etapu mogą okazać się trudne.

Na początek wybierz dojrzałe rośliny storczyków phalaenopsis w fazie pięciu liści. Ostrożnie usuń liście, rozrywając je wzdłuż środkowego żebra. Za pomocą ostrego skalpela ostrożnie usuń pąki pachowe z podstawy trzeciego lub czwartego liścia w systemie monopodialnym.

Natychmiast umieścić próbki w szklanej fiolce scyntylacyjnej zawierającej 15 mililitrów lodowatego utrwalacza PFA. Zastosuj próżnię do próbek w utrwalaczu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut. Z próbek zostaną uwolnione małe pęcherzyki.

Powtarzaj ten krok, aż większość próbek opadnie po zwolnieniu próżni. Na koniec przytrzymaj odkurzacz przez noc i powoli go zwolnij następnego dnia. Następnie zanurz utrwalone próbki w 15 mililitrach PBS i umieść na lodzie na 15 minut.

Odwodnić próbki w 15 mililitrach etanolu w serii rosnących stężeń. 30%50%70%85%95%i wreszcie 100%Infiltrować próbki 15 mililitrami mieszaniny etanolu i substytutu ksylenu o objętości od dwóch do jednego w temperaturze pokojowej. Kontynuować infiltrację, umieszczając kolejno próbki w 15 mililitrach każdego z poniższych.

Mieszanina jeden do jednego objętościowo etanolu i substytutu ksylenu, mieszanina objętości do dwóch objętości etanolu i substytutu ksylenu, a na koniec czysty substytut ksylenu. Następnie inkubuj tkanki w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Naciekać próbki 15 mililitrami substytutu ksylenu i mieszaniny parafiny w temperaturze 60 stopni Celsjusza.

Na koniec naciekaj parafinę w 15 milimetrach czystej parafiny dwa razy przez 12 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Powtórz ten krok następnego dnia. Aby rozpocząć osadzanie, najpierw rozgrzej metalowe formy do 62 stopni Celsjusza, a następnie wlej około 13 mililitrów stopionego wosku do podstawy formy.

Za pomocą rozgrzanych kleszczyków przenieś próbkę tkanki do formy i ustaw ją w żądanej pozycji. Ostrożnie przenieś formę na płytę chłodzącą i odstaw ją, aż wosk stężeje. Następnie za pomocą żyletki przyciąć blok próbki parafiny do kolumny o odpowiedniej wielkości z trapezową powierzchnią u góry.

Dodaj 800 mikrolitrów optycznego związku do temperatury cięcia lub OCT do środka etapu kriostatu. Umieść blok parafinowy na stoliku i szybko ustaw blok tkanki w żądanej pozycji. Przenieść blok parafiny i stolik do komory krystatycznej.

Szybko zamroź OCT w temperaturze minus 42 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie schłodzić adapter krystatu i temperaturę komory odpowiednio do minus 20 stopni Celsjusza i minus 16 stopni Celsjusza. Przymocuj blok i stolik do adaptera crystat.

Teraz pokrój tkanki na grubość 10 mikrometrów. Za pomocą kleszczy podnieś skrawki tkanki i umieść je tak, aby unosiły się na 800 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC na szkiełku pokrytym poli-l-lizyną. Przenieś szkiełka na płytę grzejną ustawioną na 42 stopnie Celsjusza.

Pozwól, aby sekcje się spłaszczyły i użyj bibuły filtracyjnej, aby wchłonąć wodę z krawędzi. Pozostaw próbkę na gorącej płycie w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez noc, aby umożliwić zamontowanie tkanki na szkiełku. Aby odparafinować próbki, najpierw umieść zamontowane szkiełka tkankowe w stojaku do barwienia.

Dodaj 150 mililitrów ksylenu do słoika do barwienia i zanurz stojak ze szkiełkami na pięć minut. Następnie należy ponownie uwodnić próbki, umieszczając je w zmniejszających się stężeniach etanolu, po 150 mililitrów każda, przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Na koniec zanurz próbki w podwójnie destylowanej wodzie na trzy minuty.

Wybarwić próbki, umieszczając szkiełka w 150 mililitrach roztworu hematoksyliny na 1,5 minuty. Płukać przez kilka sekund w 150 mililitrach podwójnie destylowanej wody zawierającej jedną do dwóch kropli kwasu N solnego, a następnie krótko umyć szkiełka wodą podwójnie destylowaną. Odwodnić próbki jeszcze raz, używając serii 150 mililitrów zwiększającego się stężenia etanolu przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Zanurz próbki w 150 mililitrach ksylenu na pięć minut. Na koniec zamontuj próbki, delikatnie dodając 600 mikrolitrów podłoża montażowego na bazie ksylenu na każde szkiełko, a następnie nakładając szkiełko nakrywkowe na próbkę. Za pomocą tej metody wygenerowano skrawki tkanek storczyków phalaenopsis, w tym zwykle trudny do przekrojenia pączek pachowy, który zawiera wysoki poziom kryształów.

Zachowano szczegółowe struktury, co pozwoliło na wizualizację ciał białkowych. Cięcie hybrydowe dało również wyraźne przekroje w celu wizualizacji merystemu wierzchołkowego pędu kiełkującego nasiona. Zdjęcia te pokazują przygotowanie poprzecznych odcinków liści roślin ryżu i pszenicy przy użyciu tradycyjnych technik cięcia parafiny w porównaniu z hybrydami.

Uprawy te zazwyczaj zawierają wysoki poziom krzemionki, co sprawia, że są trudne do cięcia. Integralność tkanek w przekrojach hybrydowych uległa znacznej poprawie, a kluczowe struktury, często zniekształcone lub trudne do znalezienia w próbkach parafiny, zostały zachowane w całości w tkance ciętej hybrydowo. Dodatkowo rozdarcie zaobserwowano tylko w próbkach wyciętych z parafiny.

Dodatkowo, silne zachowanie anatomii sprawia, że hybrydowe tkanki cięte są przydatne do badań przestrzennych wzorców ekspresji genów. Tutaj hybrydyzację in situ z aktyną i cykliną B1:1 przeprowadzono na hybrydowych odcinkach ciętych drugich i trzecich pąków pachowych storczyków phalaenopsis. Ulepszone zachowanie anatomiczne pozwoliło na wykrycie wyższych poziomów ekspresji docelowych genów w rozwijających się komórkach merystematycznych trzecich pąków pachowych.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać temperaturę na poziomie minus 16 stopni Celsjusza, aby utwardzić blok parafinowy. Powinno to zaowocować dobrej jakości przekrojem tkanki. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody po tym, jak wiele razy nie udało nam się przeprowadzić udanego cięcia w storczykach przy użyciu tradycyjnej metody parafinowej lub kriosekcji.

Zgodnie z tą procedurą, wszystkie eksperymenty, takie jak hybrydyzacja in situ i FISH, mogą być przeprowadzane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, w tym badanie lokalizacji przestrzennej i funkcji genów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać wysokiej jakości cięcie tkanek w próbce opornych roślin.