Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Ogólnym celem tego protokołu jest pomiar szybkości dyfuzji znakowanego białka w błonach pierwotnych komórek odpornościowych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji. Metoda ta może pomóc w identyfikacji kluczowych pytań w dziedzinie immunologii i biologii komórki, takich jak identyfikacja komórek NK o bardziej aktywnej dynamice receptorów błonowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że stosuje się ją z żywymi komórkami, dzięki czemu dokładnie odzwierciedla naturalny stan ruchu cząsteczek.

Implikacje tej techniki rozciągają się na immunoterapię nowotworów, jeśli różne cechy komórek NK są powiązane z ich funkcją, dzięki której można lepiej przewidzieć skuteczność. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w ruch molekularny w komórkach odpornościowych, może być również stosowana do innych pierwotnych komórek i linii komórkowych w dowolnej dyscyplinie. Otwórz oprogramowanie w trybie eksperckim, z zaznaczoną opcją Skanuj nowe obrazy.

Wybierz soczewkę obiektywu wodnego 40X w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. Na karcie Acquire (Pobieranie) naciśnij przyciski Config (Konfiguracja) i Scan (Skanuj), aby otworzyć kontrolki konfiguracji (Configuration Control ) i Scan Control (Kontrolka skanowania). Na karcie ConfoCor naciśnij przycisk Measure (Pomiar), aby otworzyć okno Measurement (Pomiar).

Następnie utwórz folder, w którym zostaną zapisane pomiary FCS. Uruchom nową bazę danych obrazów, klikając przycisk Nowy na karcie Plik. Włącz lampę halogenową.

Za pomocą przycisku Laser włącz odpowiednie lasery, aby wzbudzić fluorofory. Następnie określ ustawienia przechwytywania obrazu w oknie Configuration Control (Kontrola konfiguracji). Obejmuje to laser wzbudzający, filtry wzbudzenia i emisji, ścieżkę światła i używane detektory.

Podobnie przejdź do okna Pomiar i dostosuj ustawienia FCS w zakładce Konfiguracja systemu. Aktywuj kanały detekcji dla nagrań FCS, przełączając Ch 1 dla kanału zielonego i Ch 2 dla kanału czerwonego. Podczas gdy laser stabilizuje się, co może potrwać do 30 minut, wyreguluj otwór.

Najpierw umieść kroplę barwnika o pojemności 50 mikrolitrów centralnie w jednym dołku ośmiokomorowego szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną. Sąsiednie studzienki służą do wykonywania pomiarów komórek, ponieważ kalibracja jest zależna od szkiełka. Umieść kroplę wody destylowanej na soczewce obiektywu wodnego 40X i ustaw szkiełko.

Następnie naciśnij Vis, aby wybrać źródło światła widzialnego i skup się na środkowej pozycji kropli fluoroforu. W oknie Pomiar oprogramowania wybierz zakładkę Akwizycja i w obszarze Pozycje przełącz bieżącą pozycję. Następnie wróć do zakładki Konfiguracja systemu w tym samym oknie i ustaw wysoką lub nasyconą moc dla zielonego lasera.

Aby przetestować stabilność sygnału, naciśnij Start, aby otworzyć nowe okno wyświetlające krzywą Ślad czasu i Automatyczna korelacja. Sprawdź, czy sygnał fluorescencyjny jest wysoki, stabilny i czy oś y wykazuje wahania w zakresie kiloherców. Niższe wartości mogą być spowodowane nieprecyzyjnym ustawianiem ostrości lub degradacją barwnika.

Następnie w oknie Pomiar wybierz przycisk O Dostosuj. Następnie wybierz właściwy kanał detekcji i naciśnij Auto Adjust X. Jeśli brakuje górnego limitu wynikowej krzywej lub nie jest ona wyśrodkowana, zaznacz opcję Coarse i ponownie naciśnij Auto Adjust X. Po dostosowaniu kierunku X zrób to samo dla kierunku Y, naciskając przycisk Auto Adjust Y.Usuń zaznaczenie opcji Coarse i naprzemiennie dostosowuj X i Y, naciskając Auto Adjust, aż oba będą miały wyraźne maksima i stabilne wartości.

Jeśli komórki są znakowane dwoma różnymi fluoroforami, dodaj kroplę roztworu czerwonego fluoroforu do sąsiedniej komory. Następnie skalibruj drugi kanał. Ustaw czerwony laser na wysoką moc i powtórz procedurę kalibracji stabilności.

Następnie mierzymy czas przejścia swobodnie dyfuzyjnych fluoroforów przez ognisko. Używamy następnie etapu, aby obliczyć obszar błony komórkowej, który znajduje się w ognisku. Aby rozpocząć, skup się na kropli roztworu, ostrożnie przeprowadzając procedurę regulacji.

Następnie przechodzimy do zakładki Akwizycja w oknie Pomiar i ustawiamy czas akwizycji na 30 sekund z trzema powtórzeniami. Ustaw moc lasera na poziomie bliskim nasycenia i naciśnij Start, aby wykonać pomiar. Zapisz liczby na cząsteczkę lub CPM po zakończeniu pomiaru.

Następnie wykonaj nowe pomiary, dokonując iteracyjnej redukcji mocy lasera. W tym zakresie mocy uwzględnij oczekiwaną moc nadchodzących pomiarów ogniwa. Następnie sprawdź, czy wartości CPM skalują się liniowo wraz z mocą lasera.

Zakładając, że reszta skali jest liniowa, nasycenie przy najwyższej mocy jest dopuszczalne. Przy pierwszym użyciu nowo sprzężonego przeciwciała fluorescencyjnego należy wykonać pomiar FCS swobodnie dyfuzyjnych przeciwciał, aby określić ilościowo oczekiwany CPM. I ważne jest, aby używać studzienek pokrytych PEG Poly-L-Lizyna dla wolnych przeciwciał.

W tym celu pokryj szkiełko komorowe 200 mikrolitrami poli-L-lizyny szczepionej glikolem polietylenowym. Pozostaw roztwór na godzinę w temperaturze pokojowej. Roztwór podstawowy można przechowywać w lodówce do dwóch tygodni.

A bulion w proszku należy przechowywać w zamrażarce. Później usuń płyn i pozostaw komorę do wyschnięcia na powietrzu. Pod mikroskopem rozcieńczyć przeciwciało w PBS do ilości od jednego do 10 mikrogramów na mililitr.

Przystąpić do pomiaru czasu pasażu wolnych przeciwciał, jak opisano w poprzednim rozdziale dla wolnych fluoroforów. Aby wykonać pomiar w komórce, dodaj 125 mikrolitrów komórek w PBS plus 1% FCS z zawiesiny komórek znakowanej przeciwciałami. I 150 mikrolitrów przezroczystego podłoża Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 do pustej studzienki w szkiełku pokrytym PLL.

Pozwól komórkom inkubować w ciemności w temperaturze pomiaru przez co najmniej 20 minut przed kontynuowaniem, aby komórki mogły się połączyć i zrównoważyć. Rozpocznij obrazowanie od szybkich skanów XY, aby znaleźć najniższą możliwą moc lasera potrzebną do wyświetlenia komórek. Następnie wyśrodkuj obraz na okrągłej komórce o średniej jasności, w której membrana jest wyraźnie zaznaczona.

Bardzo ważne jest, aby w cytoplazmie nie było sygnału fluorescencyjnego. Powiększanie obrazu do momentu, gdy komórka pokryje większą część obrazu. Następnie skup się na górnej części błony komórkowej.

Zacznij od środka komórki i przesuwaj się w górę, aż na środku obrazu pojawi się mały okrągły obszar z równomierną fluorescencją. Kluczowe znaczenie ma staranne ustawienie ostrości. Jeśli ognisko nie znajduje się w błonie, wykryta fluorescencja nie będzie pochodzić z fluorescencyjnie znakowanych receptorów błonowych.

A co za tym idzie, wyniki nie będą odzwierciedlać ich zachowania. Teraz na karcie Akwizycja w oknie Pomiar wybierz pozycję do pomiaru FCS, aktywując celownik. Następnie ustaw liczbę powtórzeń w zakresie od sześciu do 10 i ustaw czas pomiaru na 10 sekund na powtórzenie.

Teraz wróć do zakładki Konfiguracja systemu w oknie Pomiar i zmniejsz moc lasera dla pomiarów FCS do zakresu od jednego do 10 mikrowatów. Następnie naciśnij Start. Jeśli ślad intensywności spadnie o więcej niż 30% w ciągu pierwszych 10 sekund, oznacza to, że ogniwo zostało zbyt mocno wybielone i należy zmierzyć inne ogniwo przy niższej mocy.

Jeśli sygnał zostanie utracony, ustaw ostrość w kierunku Z i wznów pomiar. Po zakończeniu pomiaru spójrz w okno Scan Control, aby sprawdzić, czy komórka jest nadal wyśrodkowana, aby upewnić się, że jej membrana została zmierzona. Jeśli komórka została przeniesiona, odrzuć dane.

Teraz przejdź do okna Automatyczna korelacja i ręcznie usuń pojedyncze powtórzenia, które zawierają manewry powiększania, bielenia, duże klastry lub inne artefakty. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Usuń, aby usunąć artefakty. Wybór rzeczywistych artefaktów wymaga praktyki.

Usuwanie powtórzeń jest prostym procesem, ale powtórzenia muszą być prawidłowo ocenione, aby wiedzieć, co należy usunąć, a co nie. Następnie zapisz końcowy plik w formacie FCS. Zachowaj tylko komórki, które mają co najmniej cztery powtórzenia po usunięciu artefaktów do dalszej analizy.

Typowa krzywa automatycznej korelacji receptora błonowego jest gładka i ma czas przejścia w zakresie od 10 do 400 milisekund. Ustaw domeny dopasowania tak, aby reprezentował zarówno początek, jak i koniec najbardziej stromej nachylonej części, reprezentującej dyfuzję. Korzystając z modelu swobodnej dyfuzji w dwóch wymiarach w celu dopasowania danych, zwróć uwagę na najbardziej nachyloną część krzywej.

Dopuszczalne są niewielkie fluktuacje na poziomie lub około jednej sekundy w skali tau, obserwowane w reszcie. Jeśli krzywa jest źle dopasowana, ale komórka nie ma widocznych problemów, takich jak przesuwanie, bielenie lub klastry, prawdopodobnie konieczna jest zmiana wartości początkowych lub górnych i dolnych granic modelu. Gdy model będzie dobrze dopasowany do krzywej automatycznej korelacji, wyodrębnij wartości parametrów zmiennych.

Liczba cząsteczek może wahać się od 0,5 do około 200 na mikron kwadratowy w przypadku białek o endogennej ekspresji. Sprawdź, czy wartość CPM z pomiaru komórkowego wynosi co najmniej 33% wartości zarejestrowanej dla swobodnie dyfuzujących przeciwciał. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć szybkość dyfuzji białek za pomocą fluorescencyjnej spektroskopii korelacji.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby trzymać komórki na lodzie do około 20 minut przed rozpoczęciem pomiaru. Nie mierz żadnych próbek dłużej niż dwie godziny.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób szybkość dyfuzji koreluje z poziomem ekspresji określonego białka. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii molekularnej i immunologii do badania dynamiki białek w żywych komórkach.