Name: Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę pomiaru dyfuzji białek w błonach limfocytów pierwotnych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji. Technika ta pozwala badać dynamikę receptorów błonowych w żywych komórkach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Vladanie Vukojeviç, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet za utrzymanie instrumentu Zeiss Confocor 3 i za pomocne wskazówki dotyczące pomiarów komórek. To badanie zostało sfinansowane z grantów Vetenskapsrådet (numer grantu 2012- 1629), Magnus Bergvalls stiftelse oraz Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

<ol><li>Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+structure+and+dynamics+of+cell+membranes%3A+an+update+of+the+Singer-Nicolson+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).</li>
<li>Bagawath-Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+Induce+Faster+Membrane+Diffusion+of+MHC+Class+I+and+the+Ly49A+Receptor+in+a+Subpopulation+of+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+for+the+study+of+membrane+dynamics+and+protein%2Flipid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions.</a> Methods. 46, 116-122 (2008).</li>
<li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).</li>
<li>Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lpor.200910041/abstract">Fluorescence correlation spectroscopy in vivo.</a> Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).</li>
<li>Lidke, D. S., Wilson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+act%3A+quantifying+protein+behaviour+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells.</a> Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).</li>
<li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+progress+in+single+particle+tracking%3A+from+methods+to+biophysical+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Rep Prog Phys. 78, 124601(2015).</li>
<li>Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).</li>
<li>Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImFCS%3A+a+software+for+imaging+FCS+data+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization.</a> Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).</li>
<li>Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F-techniques%3A+advances+in+receptor+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">The F-techniques: advances in receptor protein studies.</a> Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).</li>
<li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+novel+variations+of+an+established+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).</li>
<li>Widengren, J., Thyberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FCS+cell+surface+measurements--photophysical+limitations+and+consequences+on+molecular+ensembles+with+heterogenic+mobilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities.</a> Cytometry A. 68, 101-112 (2005).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).</li>
<li>Meinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+NK+cell+magnetic+bead+isolation+methods+on+phenotype+and+function+of+murine+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells.</a> J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).</li>
<li>Bacia, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+dual-color+fluorescence+cross-correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy.</a> Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).</li>
<li>Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+coefficients+of+several+rhodamine+derivatives+as+determined+by+pulsed+field+gradient-nuclear+magnetic+resonance+and+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy.</a> J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).</li>
<li>Petrasek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).</li>
<li>Stromqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+FCCS+procedure+applied+to+Ly49A-MHC+class+I+cis-interaction+studies+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes.</a> Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).</li>
<li>Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/j100036a009">Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study.</a> J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).</li>
<li>Humpolickova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 91, L23-L25 (2006).</li>
<li>Guo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+approach+to+the+analysis+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+data+II%3A+application+to+simulated+and+in+vitro+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data.</a> Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).</li>
<li>Ries, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+suppression+of+sample-related+artifacts+in+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).</li>
<li>Chiu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+kinetics+of+the+androgen+receptor+shown+by+multimodal+Image+Correlation+Spectroscopy+%28mICS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS).</a> Sci Rep. 6, 22435(2016).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten protokół FCS może być stosowany do oceny dynamiki molekularnej cząsteczek powierzchniowych na wszystkich typach komórek odpornościowych (mysie, ludzkie lub inne gatunki). FCS mierzy przestrzenno-czasową dynamikę molekularną aż do rozdzielczości pojedynczej cząsteczki w żywych komórkach. Gęstość molekularną, a także szybkość dyfuzji i dynamikę grupowania badanych białek można wyodrębnić z krzywych autokorelacji.
Znakowanie fluorescencyjne ma kluczowe znaczenie dla udanych eksperymentów z FC...

Wiele funkcji komórek odpornościowych opiera się na dyfuzji molekularnej i interakcjach wewnątrz błon. Błony biologiczne są złożone, a wiele czynników, które mogą być ważne dla funkcjonowania komórek odpornościowych, może wpływać na szybkość translacyjnej dyfuzji białek w błonach komórkowych1. Niedawno wykazaliśmy, że komórki NK (natural killer), limfocyty należące do wrodzonego układu odpornościowego, wykazują różnicową dyfuzję dwóch badanych białek na błonie komórkowej w zależności od stanu aktywacji komórek NK2.
Spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) to technika, która jest w stanie określić ilościowo szybkość dyfuzji molekularnej w błonach biologicznych. Podaje średnią szybkość dyfuzji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie w stałej objętości, zwykle ostrości mikroskopu konfokalnego. Opiera się na pomiarze fluktuacji fluorescencji, które występują podczas ruchu molekularnego w układzie w stanie ustalonym. FCS jest szeroko stosowany do badania dyfuzji barwników i białek fluorescencyjnych, zarówno w roztworze, jak i w błonach lipidowych. Inne parametry wyjściowe wpływające na szybkość dyfuzji mogą być również pośrednio badane w ten sposób (np. zmiany konformacyjne białek lub oddziaływania cząsteczek na błonach komórkowych)3,4. FCS wyróżnia się na tle innych technik wysoką czułością, co daje możliwość wykrywania pojedynczych cząsteczek. Działa dobrze w przypadku stężeń molekularnych w zakresie od nanomolowych do milimolowych, co jest typowe dla endogennych poziomów ekspresji większości białek5. Co więcej, FCS może dać przybliżenie bezwzględnej liczby białek w badanej objętości, podczas gdy większość innych technik podaje tylko względne informacje o poziomach ekspresji białek. Inne metody pomiaru szybkości dyfuzji molekularnej w membranach obejmują odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP), śledzenie pojedynczych cząstek (SPT), wielootworowy FCS i metody korelacji obrazu. Metody FRAP i korelacji obrazów są technikami zespołowymi, które na ogół nie dostarczają informacji o bezwzględnej liczbie cząsteczek10. W porównaniu z SPT, przepustowość FCS jest wyższa w odniesieniu do charakterystyki średniej populacji. Analiza jest również mniej wymagająca, ponieważ mierzona jest średnia szybkość dyfuzji cząsteczek obecnych w ognisku lasera, a nie szybkość pojedynczych cząsteczek. Ponadto, o ile specjalistyczne mikroskopy nie są dostępne11, SPT nie może podać żadnych informacji o stężeniach, ponieważ standardowe oznakowanie SPT musi być bardzo niskie, aby umożliwić identyfikację pojedynczych cząsteczek. Z drugiej strony, FCS wymaga, aby badane cząsteczki były mobilne. Po prostu nie wykryje żadnych przypuszczalnie nieruchomych frakcji lub cząsteczek poruszających się bardzo wolno. Szybkość dyfuzji cząsteczek, które znajdują się w ognisku dłużej niż około jednej dziesiątej czasu akwizycji, nie będzie poprawnie odwzorowana w pomiarach FCS3,12. W związku z tym współczynniki dyfuzji rejestrowane przez FCS są zwykle szybsze niż szybkości dyfuzji zgłaszane za pomocą technik takich jak FRAP i SPT, w których brane są również pod uwagę frakcje bliskie unieruchomieniu i bardzo wolne. SPT dostarczy również bardziej szczegółowego opisu zmienności szybkości dyfuzji w populacji molekularnej niż FCS.
FCS określa ilościowo fluktuację intensywności fluorescencji w czasie w wzbudzonej objętości. W przypadku pomiarów membranowych przekłada się to na oświetlony obszar membrany. W tym artykule wykorzystujemy fakt, że takie fluktuacje są indukowane przez cząsteczki wykazujące dyfuzję Browna, a zatem poruszają się do i z objętości wzbudzenia. Istnieje również kilka innych możliwych źródeł fluktuacji sygnału fluorescencji, takich jak mruganie lub obecność stanu trypletowego we fluoroforach, efekty środowiskowe, wiązanie-rozwiązywanie ligandu lub ruch całej błony komórkowej. Te domniemane źródła błędów muszą być brane pod uwagę podczas projektowania eksperymentu FCS, aby dokładnie zinterpretować wyniki12,13. Zazwyczaj szybkość dyfuzji bocznej w błonach biologicznych jest niska ze względu na stłoczenie i interakcje, zarówno między białkami błonowymi, jak i między białkami a cytoszkieletem. Historycznie rzecz biorąc, stosowanie FCS w membranach było utrudnione przez brak fotostabilnych fluoroforów, które są wymagane, aby uniknąć bielenia podczas wydłużonego czasu przejścia przez wzbudzenie focus14. Jednak obecnie istnieje wiele opcji odpowiednich barwników fotostabilnych. Znaczne ulepszenia w detektorach i innym sprzęcie pozwalają również na wykrywanie białek fluorescencyjnych i barwników o niższej jasności. W tym miejscu opisano podstawowy protokół stosowania FCS przy użyciu mysich limfocytów pierwotnych, w których białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem. Przedstawiono również podejście polegające na dopasowaniu krzywych autokorelacji w celu wyodrębnienia współczynnika dyfuzji i gęstości cząsteczkowej. Protokół ma na celu zapewnienie łatwego stosowania przez immunologów, którzy nie mają wcześniejszego doświadczenia w technikach badania dyfuzji cząsteczek. Oczekuje się jednak podstawowej wiedzy na temat mikroskopii konfokalnej (aby uzyskać tę podstawową wiedzę, patrz odniesienie15). Protokół ten można stosunkowo łatwo dostosować do innych komórek zawiesinowych, zarówno linii komórkowych, jak i komórek pierwotnych. Dla bardziej doświadczonych użytkowników FCS istnieją bardziej wyrafinowane metody analizy, z których niektóre zostały opisane w dyskusji.

<table><tbody><tr><td>MACS NK Cell Isolation Kit mysz II</td><td>Miltenyi Biotec NordenAB</td><td>130-096-892</td><td>Negatywna selekcja komórek NK</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td><td>Inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td> <td>-</td><td></td> <td>wyprodukowana w domu&nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium 1640</td><td>PAA Firma zajmująca się hodowlą komórkową&nbsp;</td><td>E15-848</td><td>Przezroczyste podłoże</td></tr><tr><td>Klon przeciwciała 2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>Do blokowania receptorów Fc.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Ly49A&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Przeciwciało monoklonalne wyprodukowane we własnym zakresie i sprzężone w domu z przeciwciałem Alexa fluor 647</td></tr><tr><td>Clone JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H-2Dd&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>Sprzężony we własnym zakresie z MFP488</td></tr><tr><td>Clone 34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>Barwnik fluorescencyjny do koniugacji przeciwciał.</td></tr><tr><td>Poli-L-Lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Rozcieńczony w wodzie destylowanej (1.10)</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna (20 kDa) szczepiona glikolem polietylenowym (2 kDa)</td><td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td>Rozcieńczony w PBS (pH 7,4) do 0,5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Chlorek rodaminy 110</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>432202</td><td>Znany współczynnik dyfuzji: 3,3 &razy; 10&minus; 10 m2/sec 19</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A20006</td><td>Znany współczynnik dyfuzji: 4,4 &razy; 10&minus; 10 m2/sec 20</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>: Confocor 3</td><td>Oprogramowanie Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Matlab z zestawem narzędzi do dopasowania krzywych</td><td>Matlab</td><td>Wersja R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Komorowe szkło nakrywkowe</td><td>Termo-naukowe&nbsp;</td><td>155411</td><td>8 studzienek, dno borokrzemianowe 1,0</td></tr></tbody></table>

dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) to potężna technika badania dyfuzji cząsteczek w błonach biologicznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. FCS może określić ilościowo stężenie molekularne i współczynnik dyfuzji znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek w błonie komórkowej. Technika ta ma możliwość zbadania charakterystyki dyfuzji molekularnej cząsteczek w błonie komórkowej komórek odpornościowych w stanie ustalonym (tj. bez procesów wpływających na wynik w rzeczywistym czasie pomiaru). FCS nadaje się do badania dyfuzji białek, które ulegają ekspresji na poziomach typowych dla większości białek endogennych. W tym miejscu zademonstrowano prostą i solidną metodę określania szybkości dyfuzji białek błony komórkowej na limfocytach pierwotnych. Opisano skuteczny sposób wykonywania pomiarów na żywych komórkach barwionych przeciwciałami oraz powszechnie występujące obserwacje po akwizycji. Ostatnie postępy w rozwoju fotostabilnych barwników fluorescencyjnych można wykorzystać poprzez koniugację interesujących przeciwciał z odpowiednimi barwnikami, które nie wybielają się intensywnie podczas pomiarów. Dodatkowo pozwala to na detekcję jednostek wolno dyfuzyjnych, co jest wspólną cechą białek ulegających ekspresji w błonach komórkowych. Przedstawiono procedurę analizy mającą na celu wyodrębnienie parametrów stężenia molekularnego i dyfuzji z wygenerowanych krzywych autokorelacji. Podsumowując, zapewniony jest podstawowy protokół pomiarów FCS; Może być stosowany przez immunologów ze zrozumieniem mikroskopii konfokalnej, ale bez innego wcześniejszego doświadczenia w technikach pomiaru parametrów dynamicznych, takich jak szybkość dyfuzji molekularnej.

Typowy wynik pozwoli na wygenerowanie krzywej autokorelacji z czasem przejścia w zakresie od 10 msec do 40 msec dla białek błonowych. Liczba cząsteczek w przypadku białek ekspresowanych endogennie może wynosić od 0,5 do około 20 na μm2. Należy dokładnie sprawdzić, czy wartość CPM nie jest niższa od oczekiwanej, co może wskazywać na wpływ sygnału tła. Jako ogólną zasadę przyjmuje się, że sygnał CPM na komórkach akceptowany do analizy nie powinien być niższy niż 3% wartości CPM d...

Opisano metodę pomiaru dyfuzji białek w błonach pierwotnych komórek odpornościowych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS). W niniejszej pracy zilustrowano zastosowanie przeciwciał do znakowania fluorescencyjnego.

Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Ogólnym celem tego protokołu jest pomiar szybkości dyfuzji znakowanego białka w błonach pierwotnych komórek odpornościowych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji. Metoda ta może pomóc w identyfikacji kluczowych pytań w dziedzinie immunologii i biologii komórki, takich jak identyfikacja komórek NK o bardziej aktywnej dynamice receptorów błonowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że stosuje się ją z żywymi komórkami, dzięki czemu dokładnie odzwierciedla naturalny stan ruchu cząsteczek.Implikacje tej techniki rozciągają się na immunoterapię nowotworów, jeśli różne cechy komórek NK są powiązane z ich funkcją, dzięki której można lepiej przewidzieć skuteczność. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w ruch molekularny w komórkach odpornościowych, może być również stosowana do innych pierwotnych komórek i linii komórkowych w dowolnej dyscyplinie. Otwórz oprogramowanie w trybie eksperckim, z zaznaczoną opcją Skanuj nowe obrazy.Wybierz soczewkę obiektywu wodnego 40X w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. Na karcie Acquire (Pobieranie) naciśnij przyciski Config (Konfiguracja) i Scan (Skanuj), aby otworzyć kontrolki konfiguracji (Configuration Control ) i Scan Control (Kontrolka skanowania). Na karcie ConfoCor naciśnij przycisk Measure (Pomiar), aby otworzyć okno Measurement (Pomiar).Następnie utwórz folder, w którym zostaną zapisane pomiary FCS. Uruchom nową bazę danych obrazów, klikając przycisk Nowy na karcie Plik. Włącz lampę halogenową.Za pomocą przycisku Laser włącz odpowiednie lasery, aby wzbudzić fluorofory. Następnie określ ustawienia przechwytywania obrazu w oknie Configuration Control (Kontrola konfiguracji). Obejmuje to laser wzbudzający, filtry wzbudzenia i emisji, ścieżkę światła i używane detektory.Podobnie przejdź do okna Pomiar i dostosuj ustawienia FCS w zakładce Konfiguracja systemu. Aktywuj kanały detekcji dla nagrań FCS, przełączając Ch 1 dla kanału zielonego i Ch 2 dla kanału czerwonego. Podczas gdy laser stabilizuje się, co może potrwać do 30 minut, wyreguluj otwór.Najpierw umieść kroplę barwnika o pojemności 50 mikrolitrów centralnie w jednym dołku ośmiokomorowego szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną. Sąsiednie studzienki służą do wykonywania pomiarów komórek, ponieważ kalibracja jest zależna od szkiełka. Umieść kroplę wody destylowanej na soczewce obiektywu wodnego 40X i ustaw szkiełko.Następnie naciśnij Vis, aby wybrać źródło światła widzialnego i skup się na środkowej pozycji kropli fluoroforu. W oknie Pomiar oprogramowania wybierz zakładkę Akwizycja i w obszarze Pozycje przełącz bieżącą pozycję. Następnie wróć do zakładki Konfiguracja systemu w tym samym oknie i ustaw wysoką lub nasyconą moc dla zielonego lasera.Aby przetestować stabilność sygnału, naciśnij Start, aby otworzyć nowe okno wyświetlające krzywą Ślad czasu i Automatyczna korelacja. Sprawdź, czy sygnał fluorescencyjny jest wysoki, stabilny i czy oś y wykazuje wahania w zakresie kiloherców. Niższe wartości mogą być spowodowane nieprecyzyjnym ustawianiem ostrości lub degradacją barwnika.Następnie w oknie Pomiar wybierz przycisk O Dostosuj. Następnie wybierz właściwy kanał detekcji i naciśnij Auto Adjust X. Jeśli brakuje górnego limitu wynikowej krzywej lub nie jest ona wyśrodkowana, zaznacz opcję Coarse i ponownie naciśnij Auto Adjust X. Po dostosowaniu kierunku X zrób to samo dla kierunku Y, naciskając przycisk Auto Adjust Y.Usuń zaznaczenie opcji Coarse i naprzemiennie dostosowuj X i Y, naciskając Auto Adjust, aż oba będą miały wyraźne maksima i stabilne wartości.Jeśli komórki są znakowane dwoma różnymi fluoroforami, dodaj kroplę roztworu czerwonego fluoroforu do sąsiedniej komory. Następnie skalibruj drugi kanał. Ustaw czerwony laser na wysoką moc i powtórz procedurę kalibracji stabilności.Następnie mierzymy czas przejścia swobodnie dyfuzyjnych fluoroforów przez ognisko. Używamy następnie etapu, aby obliczyć obszar błony komórkowej, który znajduje się w ognisku. Aby rozpocząć, skup się na kropli roztworu, ostrożnie przeprowadzając procedurę regulacji.Następnie przechodzimy do zakładki Akwizycja w oknie Pomiar i ustawiamy czas akwizycji na 30 sekund z trzema powtórzeniami. Ustaw moc lasera na poziomie bliskim nasycenia i naciśnij Start, aby wykonać pomiar. Zapisz liczby na cząsteczkę lub CPM po zakończeniu pomiaru.Następnie wykonaj nowe pomiary, dokonując iteracyjnej redukcji mocy lasera. W tym zakresie mocy uwzględnij oczekiwaną moc nadchodzących pomiarów ogniwa. Następnie sprawdź, czy wartości CPM skalują się liniowo wraz z mocą lasera.Zakładając, że reszta skali jest liniowa, nasycenie przy najwyższej mocy jest dopuszczalne. Przy pierwszym użyciu nowo sprzężonego przeciwciała fluorescencyjnego należy wykonać pomiar FCS swobodnie dyfuzyjnych przeciwciał, aby określić ilościowo oczekiwany CPM. I ważne jest, aby używać studzienek pokrytych PEG Poly-L-Lizyna dla wolnych przeciwciał.W tym celu pokryj szkiełko komorowe 200 mikrolitrami poli-L-lizyny szczepionej glikolem polietylenowym. Pozostaw roztwór na godzinę w temperaturze pokojowej. Roztwór podstawowy można przechowywać w lodówce do dwóch tygodni.A bulion w proszku należy przechowywać w zamrażarce. Później usuń płyn i pozostaw komorę do wyschnięcia na powietrzu. Pod mikroskopem rozcieńczyć przeciwciało w PBS do ilości od jednego do 10 mikrogramów na mililitr.Przystąpić do pomiaru czasu pasażu wolnych przeciwciał, jak opisano w poprzednim rozdziale dla wolnych fluoroforów. Aby wykonać pomiar w komórce, dodaj 125 mikrolitrów komórek w PBS plus 1% FCS z zawiesiny komórek znakowanej przeciwciałami. I 150 mikrolitrów przezroczystego podłoża Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 do pustej studzienki w szkiełku pokrytym PLL.Pozwól komórkom inkubować w ciemności w temperaturze pomiaru przez co najmniej 20 minut przed kontynuowaniem, aby komórki mogły się połączyć i zrównoważyć. Rozpocznij obrazowanie od szybkich skanów XY, aby znaleźć najniższą możliwą moc lasera potrzebną do wyświetlenia komórek. Następnie wyśrodkuj obraz na okrągłej komórce o średniej jasności, w której membrana jest wyraźnie zaznaczona.Bardzo ważne jest, aby w cytoplazmie nie było sygnału fluorescencyjnego. Powiększanie obrazu do momentu, gdy komórka pokryje większą część obrazu. Następnie skup się na górnej części błony komórkowej.Zacznij od środka komórki i przesuwaj się w górę, aż na środku obrazu pojawi się mały okrągły obszar z równomierną fluorescencją. Kluczowe znaczenie ma staranne ustawienie ostrości. Jeśli ognisko nie znajduje się w błonie, wykryta fluorescencja nie będzie pochodzić z fluorescencyjnie znakowanych receptorów błonowych.A co za tym idzie, wyniki nie będą odzwierciedlać ich zachowania. Teraz na karcie Akwizycja w oknie Pomiar wybierz pozycję do pomiaru FCS, aktywując celownik. Następnie ustaw liczbę powtórzeń w zakresie od sześciu do 10 i ustaw czas pomiaru na 10 sekund na powtórzenie.Teraz wróć do zakładki Konfiguracja systemu w oknie Pomiar i zmniejsz moc lasera dla pomiarów FCS do zakresu od jednego do 10 mikrowatów. Następnie naciśnij Start. Jeśli ślad intensywności spadnie o więcej niż 30% w ciągu pierwszych 10 sekund, oznacza to, że ogniwo zostało zbyt mocno wybielone i należy zmierzyć inne ogniwo przy niższej mocy.Jeśli sygnał zostanie utracony, ustaw ostrość w kierunku Z i wznów pomiar. Po zakończeniu pomiaru spójrz w okno Scan Control, aby sprawdzić, czy komórka jest nadal wyśrodkowana, aby upewnić się, że jej membrana została zmierzona. Jeśli komórka została przeniesiona, odrzuć dane.Teraz przejdź do okna Automatyczna korelacja i ręcznie usuń pojedyncze powtórzenia, które zawierają manewry powiększania, bielenia, duże klastry lub inne artefakty. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Usuń, aby usunąć artefakty. Wybór rzeczywistych artefaktów wymaga praktyki.Usuwanie powtórzeń jest prostym procesem, ale powtórzenia muszą być prawidłowo ocenione, aby wiedzieć, co należy usunąć, a co nie. Następnie zapisz końcowy plik w formacie FCS. Zachowaj tylko komórki, które mają co najmniej cztery powtórzenia po usunięciu artefaktów do dalszej analizy.Typowa krzywa automatycznej korelacji receptora błonowego jest gładka i ma czas przejścia w zakresie od 10 do 400 milisekund. Ustaw domeny dopasowania tak, aby reprezentował zarówno początek, jak i koniec najbardziej stromej nachylonej części, reprezentującej dyfuzję. Korzystając z modelu swobodnej dyfuzji w dwóch wymiarach w celu dopasowania danych, zwróć uwagę na najbardziej nachyloną część krzywej.Dopuszczalne są niewielkie fluktuacje na poziomie lub około jednej sekundy w skali tau, obserwowane w reszcie. Jeśli krzywa jest źle dopasowana, ale komórka nie ma widocznych problemów, takich jak przesuwanie, bielenie lub klastry, prawdopodobnie konieczna jest zmiana wartości początkowych lub górnych i dolnych granic modelu. Gdy model będzie dobrze dopasowany do krzywej automatycznej korelacji, wyodrębnij wartości parametrów zmiennych.Liczba cząsteczek może wahać się od 0,5 do około 200 na mikron kwadratowy w przypadku białek o endogennej ekspresji. Sprawdź, czy wartość CPM z pomiaru komórkowego wynosi co najmniej 33% wartości zarejestrowanej dla swobodnie dyfuzujących przeciwciał. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć szybkość dyfuzji białek za pomocą fluorescencyjnej spektroskopii korelacji.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby trzymać komórki na lodzie do około 20 minut przed rozpoczęciem pomiaru. Nie mierz żadnych próbek dłużej niż dwie godziny.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób szybkość dyfuzji koreluje z poziomem ekspresji określonego białka. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii molekularnej i immunologii do badania dynamiki białek w żywych komórkach.

molecular-diffusion-plasma-membranes-primary-lymphocytes-measured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano technikę badania partycjonowania białek fluorescencyjnych w tratwach lipidowych błony plazmatycznej żywych komórek. Metoda ta wykorzystuje różnice w czasie dyfuzji białek znajdujących się wewnątrz lub na zewnątrz tratw lipidowych. Akwizycja danych może być przeprowadzana dynamicznie w warunkach kontrolnych lub po dodaniu leku.

Oznaczanie partycji sond znakowanych fluorescencyjnie w tratwach lipidowych w żywych komórkach metodą spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS)

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku po technice analizy fluktuacji k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) do pomiaru współczynników dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych białek błony plazmatycznej w żywych komórkach ssaków.

Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Prezentujemy nową technikę pomiaru bocznej dyfuzji gatunków powierzchniowo czynnych na granicy płyn-płyn poprzez połączenie monowarstwy kropelki z płaską monowarstwą.

Odzyskiwanie fluorescencji po połączeniu kropli w celu zmierzenia dwuwymiarowej dyfuzji monowarstwy fosfolipidowej

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu, jak zbudować mikroskop spektroskopii korelacji fluorescencji (svFCS) do pomiaru dyfuzji molekularnej na błonie komórkowej żywych komórek.

Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Testy limfocytotoksyczności komórkowej (CML) mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi autoreaktywnych oraz mechanizmów śmierci komórek in vitro. Jednak dzięki zastosowaniu technik obrazowania konfokalnego żywych komórek z użyciem barwników fluorescencyjnych, typ i kinetyka śmierci komórkowej, a także wykorzystywane szlaki, mogą być badane w znacznie większych szczegółach.

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T

Poznaj metodę pomiaru dyfuzji białek w błonach limfocytów pierwotnych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji. Technika ta pozwala badać dynamikę receptorów błonowych w żywych komórkach immunologicznych.

Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Przeglądaj więcej filmów