System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Ogólnym celem niniejszego badania jest opracowanie systemu hodowli in vitro zakażonych wirusem Zika komórek ssaczych w celu zbadania replikacji wirusa Zika, a także wykorzystanie tej platformy in vitro w procesie opracowywania leków. Niniejszy szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący systemu hodowli komórkowej zakażonej wirusem Zika może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu patogenezy choroby wywoływanej przez wirusa Zika oraz ewolucji jego wirulencji. Główną zaletą tej techniki jest możliwość produkcji wirusa Zika na dużą skalę w celu opracowania leków i szczepionek.

Zacznij od zebrania komórek Vero przy 80% gęstości komórkowej w kolbie hodowlanej T75, odsysając medium z kolby i płucząc komórki dwiema mililitrami soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny i inkubuj kolbę w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Po inkubacji dodaj osiem mililitrów medium wzrostowego zawierającego serum, aby inaktywować trypsynę. Następnie przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml. Dalej, pobierz 10 µL zawiesiny komórkowej i wymieszaj z taką samą ilością 0,4% błękitu trypanu. Nanieś przygotowaną mieszaninę na szkiełko komory licznikowej i określ liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Wysiej łącznie siedem milionów komórek do kolby T160 w objętości 30 ml. Następnego dnia przygotuj odpowiednią wielokrotność zakażenia (MOI) inokulum wirusa Zika w 10 ml bezserwatkowego medium hodowlanego na każdą kolbę.

Bezpieczne obchodzenie się z wirusem jest kluczowe dla zapobiegania rozprzestrzenianiu się infekcji.

Usunąć zużytą pożywkę z kolby T160, a następnie dodać pełne 10 ml świeżo przygotowanego inokulum wirusowego. Inkubować zaszczepione kolby w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez cztery do sześciu godzin. Rozprzestrzeniać inokulum, delikatnie przechylając kolbę na boki w każdej godzinie inkubacji. Po zakończeniu inkubacji zastąpić inokulum 30 ml podgrzanej pożywki wzrostowej z dodatkiem surowicy. Następnie kontynuować hodowlę wirusową przez kolejne 96 godzin. Po czterech dniach zweryfikować postęp infekcji, obserwując pojawienie się plam wirusowych na monowarstwie komórkowej za pomocą mikroskopu fazowego. Wykonać obrazy w razie potrzeby przy powiększeniu 40x i 200x.

Zebrać nadpłyny z hodowli komórkowych w punkcie czasowym 96 godzin i odwirować nadpłyn przy 300 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć szczątki komórkowe. Po wirowaniu ostrożnie zebrać nadpłyny, nie naruszając osadu ze szczątków, i przelać je do probówek o pojemności 15 ml.

Przechowywać nadnadpłyny z kultur wirusowych w wielu alikwotach w temperaturze -80 °C.

Aby oznaczyć miano wirusa, najpierw należy wysiać naiwne komórki Vero na płytkę 12-dołkową w zagęszczeniu 1 × 10⁵ komórek na dołek, w objętości 2 ml. Następnego dnia należy przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne supernatantów kultur wirusowych, pobranych z kolby T160 przy użyciu medium bezzserwowego.

Podczas przygotowywania rozcieńczeń seryjnych supernatantu hodowli wirusowej do oznaczenia miana, należy przestrzegać zasad bezpiecznego obchodzenia się z wirusem, aby zapobiec zakażeniu.

Następnie usunąć zużyte medium z każdej studni płytki 12-dołkowej zawierającej komórki Vero i dodać 400 µl rozcieńczonego inokulum do komórek Vero w trzech powtórzeniach. Inkubować zaszczepione płytki w inkubatorze do hodowli tkanek przez cztery do sześciu godzin.

Po zakończeniu inkubacji zastąpić inokulum dwiema mililitrami pożywki uzupełnionej surowicą na każdą studnię. W 48 godzinie po inokulacji policzyć ogniska wirusowe w odpowiednich rozcieńczeniach, używając mikroskopu fazowego. Obliczyć miano wirusa jako liczbę jednostek tworzących plak (PFU) na mililitr.

Po zaszczepieniu komórek Vero w płytce 12-dołkowej wysokimi i niskimi mianami wirusa Zika oraz inkubacji przez 48 i 96 godzin, replikację genomu ocenia się za pomocą ilościowej PCR w celu oznaczenia ekspresji genomu wirusa Zika oraz immunocytochemicznie w celu wykrycia dwuniciowego RNA.

W celu przeprowadzenia immunocytochemii należy usunąć pożywkę z dołków płytki 12-dołkowej i dodać do każdego dołka 1 mL metanolu. Pozostawić komórki do utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Następnie utrwalone komórki przemyć trzykrotnie 1x PBS. Dodać bufor blokujący i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przeciwciało mysie monoklonalne anty-dwuniciowe RNA J2 rozcieńczyć w buforze blokującym w stosunku 1:100, dodać do komórek i inkubować je w tym roztworze przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przeciwciało wtórne kozie anty-mysie IgG-594 rozcieńczyć w buforze blokującym w stosunku 1:1 000, a po przemyciu komórek 1x PBS dodać je do komórek i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po przemyciu komórek 1x PBS przeprowadzić barwienie jąder komórkowych barwnikiem Hoechst i obserwować komórki przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z powiększeniem 100x.

Sześć godzin po wysianiu naiwnych komórek Vero na płytkę 12-dołkową, jak wcześniej, należy dodać interesujące cytokiny w określonych stężeniach w duplikacie biologicznym. 12 godzin po traktowaniu przeprowadza się infekcję wirusem Zika, uwzględniając dołki kontrolne ujemne bez infekcji. Cztery godziny po infekcji inokulum wirusowe zastępuje się medium z cytokinami, a następnie komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C przez kolejne 44 godziny. W 48. godzinie po infekcji należy policzyć plak wirusowe przy użyciu mikroskopu kontrastowego i wykonać reprezentatywne zdjęcia zainfekowanych komórek przy powiększeniu 40x.

Wykres ten przedstawia zawartość genomu wirusa Zika zmierzoną za pomocą RT-qPCR. Zarówno startery dla genotypu Pan, jak i dla szczepu PRVABC-59 wykazały taką samą czułość i swoistość. Zgodnie z oczekiwaniami, startery wirusa zapalenia wątroby C nie spowodowały amplifikacji żadnego produktu.

Przedstawiono kinetykę wzrostu wirusa Zika w wskazanych punktach czasowych w komórkach zainfekowanych niskim i wysokim mianem, w porównaniu z niezinfekowaną kontrolą pozorowaną. Wyniki analizy immunocytochemicznej pokazują, że w 48 godzinach po infekcji zainfekowane komórki tworzą kilka skupisk, natomiast w 96 godzinach po infekcji większość komórek jest zainfekowana. Wykres ten przedstawia modulację wzrostu wirusa Zika przez różne cytokiny w porównaniu z kontrolą nośnika.

Te obrazy w kontraście fazowym przedstawiają komórki zainfekowane wirusem Zika z zastosowaniem lub bez zastosowania cytokin. Plaki wirusowe utworzone przez zainfekowane komórki są widoczne jako ogniska. Należy zauważyć, że w studzienkach traktowanych interferonem nie występują plaki wirusowe.

Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak mapowanie domen wirusa Zika o wysokiej rozdzielczości w celu lokalizacji białek wirusowych i badania replikacji w komórkach komarów oraz ludzi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. w zakresie wyjaśnienia mechanizmu patogenezy choroby i ewolucji wirulencji wirusa. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać biegłą wiedzę na temat tego, jak ustanowić oparty na komórkach ssaków system hodowli zakaźnej wirusa Zika in vitro w celu badania replikacji wirusa Zika, a także na temat wykorzystania platformy in vitro w opracowywaniu leków i szczepionek.