Name: System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę hodowli komórek wirusa Zika in vitro przy użyciu linii komórkowej Vero. Ten protokół umożliwia badanie replikacji wirusa i wspiera rozwój leków oraz szczepionek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Aaronowi Braultowi i dr Brandy Russell z Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (CDC), USA za dostarczenie PRVABC59 szczepu wirusa Zika. Dziękujemy Nicholasowi Tenowi z Uniwersytetu Yale za redakcję tego manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award dla V.A.

Uwaga: Schematyczny opis przebiegu prac przedstawiono na Rysunku 1.
1. Komórki
<ol>
	<li>Do produkcji wirusa Zika oraz analizy cyklu replikacji wirusowej należy wykorzystać komórki Vero.</li>
	<li>Przygotować pełną pożywkę wzrostową zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy, penicylinę (100 units/ml), streptomycynę (100 units/ml) oraz 10 mM HEPES.</li>
	<li>Komórki Vero hodować w określonej pełnej pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.</li>
</ol>
2. Produkcja wirusa Zika
<ol>
	<li>Zbierz komórki Vero przy 80% gęstości komórek, używając 0,25% trypsyny w kolbie T-75, a następnie policz komórki.
	<ol>
		<li>Odsuń pożywkę z kolby hodowlanej T-75 i wypłucz komórki 2 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).</li>
		<li>Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny i inkubuj kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 min.</li>
		<li>Dodaj 8 ml pożywki wzrostowej zawierającej surowicę, aby dezaktywować trypsynę. Pipetuj wielokrotnie w górę i w dół, aby zawiesić komórki, a następnie przenieś je do probówki 15 ml.</li>
		<li>Pobierz 10 µl zawiesiny komórkowej i zmieszaj z równą ilością 0,4% błękitu trypanu. Nałóż przygotowaną mieszaninę na szkiełko komory licznikowej i określ liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zasiać łącznie 7 milionów komórek w objętości 30 ml do kolby T-160.</li>
	<li>Następnego dnia przygotuj odpowiednią wielokrotność infekcji (0,01 do 0,1 MOI) inokulum wirusa Zika w 10 ml bezsurowiczej pożywki hodowlanej na każdą kolbę.</li>
	<li>Usuń zużytą pożywkę z kolby T-160, a następnie dodaj świeżo przygotowane inokulum wirusowe (10 ml).</li>
	<li>Inkubuj zaszczepione kolby w 37 °C przy 5% CO2 przez 4-6 h. Rozprowadź inokulum, delikatnie przechylając kolby na boki co godzinę.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji zastąp inokulum ciepłą pożywką wzrostową uzupełnioną surowicą (30 ml) dla każdej kolby. Następnie kontynuuj hodowlę wirusa przez kolejne 96 h.</li>
	<li>Zweryfikuj przebieg infekcji, obserwując pojawienie się placków wirusowych na monowarstwie komórek za pomocą mikroskopu fazokontrastowego i wykonaj zdjęcia (Rysunek 2) w razie potrzeby przy powiększeniach 40X i 200X.</li>
</ol>
<img alt="Proces różnicowania komórek przy powiększeniu 40X i 200X, obraz mikroskopowy, badania nad biologią komórki." src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Plaque utworzone przez wirusa Zika na monowarstwie komórek Vero.Obrazy w jasnym polu przy różnych powiększeniach pokazują plaque wirusa Zika w 48 hpi. Zwróć uwagę na obecność zaokrąglonych ognisk komórkowych na monowarstwie. (Pasek skali = 50 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="8">
	<li>Zebrać nadsączniki z hodowli komórkowej w punkcie czasowym 96 hr i odwirować nadsącz przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia szczątków komórkowych.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać nadsącz, nie naruszając osadu ze szczątków, i przenieść go do probówek o pojemności 15 ml. W celu zagęszczenia cząstek wirusowych można przeprowadzić ultrawirowanie przy 24 000 x g (opcjonalnie).</li>
	<li>Przechowywać nadsączniki z hodowli wirusowej w wielu alikwotach w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Pomiar miana wirusa Zika za pomocą testu plackowego
<ol>
	<li>Wysiać naiwne komórki Vero w zagęszczeniu 1 x 105 liczba komórek na studzienkę w objętości 2 ml przy użyciu płytki 12-dołkowej.</li>
	<li>Następnego dnia, z wykorzystaniem medium bezsurowiczego, przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne supernatantów kultur wirusowych pobranych z kolby T-160. Usunąć zużyte medium z każdej studzienki i dodać 400 µl przygotowanego inokulum na komórki Vero w trzech powtórzeniach.</li>
	<li>Inkubuj zaszczepione kolby w temperaturze 37°C °C z dodatkiem 5% CO2 przez 4–6 h. Rozprowadzić inokulum, delikatnie przechylając płytkę na boki co godzinę.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji zastąpić inokulum podłożem uzupełnionym o surowicę (2 ml na dołek).</li>
	<li>W 48. godzinie po inokulacji należy policzyć ogniska wirusowe za pomocą mikroskopu kontrastowego. Oblicz miano wirusa jako liczba jednostek tworzących plaki (PFU) na ml. Patrz Rysunek 3 do testu plackowego.</li>
	<li>Utrwal i zabarw komórki w 4% roztworze formaldehydu i 0,1% roztworze fioletu krystalicznego, przygotowanych w 20% etanolu, aby uzyskać wyraźną wizualizację plamek.</li>
</ol>
4. Test replikacji genomu wirusa Zika
<ol>
	<li>Wysiać naiwne komórki Vero w zagęszczeniu 1 x 105 komórek na studzienkę w objętości 2 ml, korzystając z płytki 12-dołkowej. Następnego dnia przygotować w trzech powtórzeniach inokula wirusowe o niskim i wysokim mianie (MOI 0,01 i 0,1; 400 µl/studzienkę), wykorzystując pożywkę bezsurowiczą. W przypadku infekcji pozorowanej (mock) zastosować wyłącznie pożywkę bezsurowiczą (400 µl/studzienkę).</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 3.2 do 3.4.</li>
	<li>W punktach czasowych 48 i 96 h zebrać próbki do analizy RNA oraz immunocytochemii (ICC).
	<ol>
		<li>W celu zbioru próbek RNA usunąć pożywkę, a następnie dodać 400 µl roztworu lizującego bezpośrednio do każdej studzienki i zebrać lizaty.</li>
		<li>W przypadku ICC usunąć pożywkę, a następnie utrwalić komórki, dodając 1 ml metanolu do każdej studzienki i inkubując płytkę w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
		<li>Z lizatu komórkowego wyizolować całkowite RNA przy użyciu zestawu do izolacji RNA zgodnie z instrukcją producenta. Ilość RNA oznaczyć za pomocą spektrofotometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić dwuetapową ilościową PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR), aby określić zawartość genomu ZIKV w zebranym RNA.
	<ol>
		<li>W celu przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji RNA przygotować najpierw mieszaninę reakcyjną o objętości 13 µl, składającą się z 5 µg wyizolowanego RNA, 1 µl dNTP (10 mM) oraz 1 µl przypadkowych heksamerów (250 ng) w probówce 0,2 ml. Inkubować probówkę w temperaturze 65 °C przez 5 min, a następnie umieścić na lodzie przez jedną minutę. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodać 1 µl odwrotnej transkryptazy, 4 µl 5x buforu do syntezy nici, 1 µl 0,1 M ditiotreitolu oraz 1 µl inhibitora RNazy. Inkubować probówkę przez dodatkowe 5 min w temperaturze 25 °C, a następnie przez 60 min w temperaturze 50 °C i inaktywować reakcję poprzez podgrzanie do 70 °C przez 15 min.</li>
		<li>Przeprowadzić qPCR, wykorzystując 1 µl otrzymanego cDNA z 12,5 µl 2x green dye super mix zawierającego polimerazę DNA oraz 1 µl 10 mM poszczególnych starterów specyficznych dla wirusa Zika [startery pan-genotypowe wirusa Zika (For: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3'), startery dla szczepu PRVABC59 genotypu azjatyckiego wirusa Zika (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3')], wirusa zapalenia wątroby C (JFH RTQ F: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') lub komórkowego genu referencyjnego GAPDH (For: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3'; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') w końcowej objętości reakcji 25 µl.</li>
		<li>Przeprowadzić PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z warunkami: 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 30 s (40 cykli).</li>
		<li>Wykorzystać poziom ekspresji GAPDH na podstawie wartości progu cyklu (Ct) do normalizacji pomiaru genomu wirusa Zika. Obliczyć wartość delta Ct (ΔCt) genomu Zika w stosunku do GAPDH i wyznaczyć wartość 2ΔCt. Następnie obliczyć zmianę krotności (fold change), wyznaczając stosunek znormalizowanej zawartości genomu Zika pomiędzy komórkami zainfekowanymi a niezakazionymi w określonych punktach czasowych. Wyniki replikacji genomu ZIKV przedstawiono na Rysunku 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić ICC z wykorzystaniem utrwalonych metanolem komórek.
	<ol>
		<li>Umyć utrwalone komórki trzy razy w 1x PBS i zablokować buforem blokującym do ICC (3% surowicy koziej, 3% BSA, 0,1% Triton-x 100 w PBS).</li>
		<li>Zastosować mysie monoklonalne przeciwciało anty-dsRNA J2 (1 µg/ml) w rozcieńczeniu 1:100 w buforze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyć komórki w 1x PBS i dodać wtórne przeciwciało kozie anty-mysie IgG-594 (1 µg/ml) w rozcieńczeniu 1:1 000 w buforze blokującym i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyć komórki w 1x PBS i zabarwić jądra komórkowe barwnikiem Hoechst, a następnie obserwować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 100X (Rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przesiewowa analiza biblioteki cytokin przeciwko infekcji wirusem Zika
<ol>
	<li>Wysiać naiwne komórki Vero w gęstości 1 x 105 komórek na dołek, używając płytki 12-dołkowej. Po przytwierdzeniu się komórek (6 h po wysianiu), dodać każdą cytokinę w określonych stężeniach w duplikacie biologicznym (objętość 2 ml/dołek). Uwzględnić kontrolę z samym nośnikiem (PBS).</li>
	<li>W 12. godzinie po traktowaniu przeprowadzić infekcję wirusem Zika (MOI 0,1 w 400 µl na dołek). Uwzględnić dołki kontrolne negatywne bez infekcji (mock).</li>
	<li>W 4. godzinie po infekcji zastąpić inokulum wirusowe pożywką z cytokinami (2 ml). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne 44 h.</li>
	<li>W 48. godzinie po infekcji policzyć plaki wirusowe przy użyciu mikroskopu fazowo-kontrastowego i wykonać reprezentatywne zdjęcia zainfekowanych komórek przy powiększeniu 40X (Rysunek 5).</li>
</ol>

<ol><li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> N Engl J Med. , 1-11 (2016).</li>
<li>Lucey, D. R., Gostin, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Zika+Pandemic%3A+Enhancing+Preparedness%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness.</a> JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).</li>
<li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).</li>
<li>Schuler-Faccini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Association+Between+Zika+Virus+Infection+and+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb+Mortal+Wkly+Rep%22%5BJournal%5D)">Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).</li>
<li>Foy, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probable+non-vector-borne+transmission+of+Zika+virus%2C+Colorado%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA.</a> Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).</li>
<li>Kuno, G., Chang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+sequencing+and+genomic+characterization+of+Bagaza%2C+Kedougou%2C+and+Zika+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses.</a> Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).</li>
<li>Dick, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).</li>
<li>Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).</li>
<li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report%2C+French+Polynesia%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia.</a> Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).</li>
<li>Baronti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+coding+sequence+of+zika+virus+from+a+French+polynesia+outbreak+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013.</a> Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic%2C+Yap+State%2C+Micronesia%2C+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+Zika+virus+in+Western+Hemisphere%2C+2015+%5BLetter%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter].</a> Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).</li>
<li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).</li>
<li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).</li>
<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+detection+of+Zika+virus+and+evaluation+with+field-caught+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes.</a> Virol J. 10, 311(2013).</li>
<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Hiratsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+interferon-alpha+during+pregnancy%3A+effects+on+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Perinat+Med%22%5BJournal%5D)">Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus.</a> J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).</li>
<li>Ozaslan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+therapy+for+acute+hepatitis+C+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy.</a> Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiono uproszczony protokół hodowli wirusa Zika in vitro . Przedstawiono kluczowe etapy, w tym identyfikację optymalnych punktów końcowych dla ekspansji hodowli wirusa, pomiar miana i ilościowe określenie replikacji genomu. Wirus Zika jest ludzkim patogenem, dlatego podczas obchodzenia się z czynnikami zakaźnymi należy ściśle przestrzegać procedur bezpieczeństwa biologicznego. Linia komórkowa nerki małpy, Vero, została wykorzystana do zademonstrowania różnych testów wirusologicznych. Kinetyk...

Wirus Zika (ZIKV) jest ważnym ludzkim patogenem związanym z małogłowiem i słabymi wynikami ciąży1,4. ZIKV należy do zestawu flawiwirusów istotnych z medycznego punktu widzenia, które mogą powodować wady neurologiczne, takich jak wirusy dengi, Zachodniego Nilu i zapalenia mózgu St. Louis. Głównym sposobem przenoszenia wirusa jest przenoszenie komarów Aedes aegypti, a ponadto odnotowano również przenoszenie drogą płciową5,6. ZIKV stał się poważnym globalnym problemem zdrowotnym ze względu na rozszerzające się rozmieszczenie geograficzne wektora komara i jego silną korelację z wadami wrodzonymi. ZIKV został po raz pierwszy wyizolowany w 1947 roku od rezusa wartowniczego w lesie Zika w Ugandzie, a pierwszy przypadek u człowieka odnotowano w 1952roku. Osoby, które zostaną zakażone wirusem ZIKV, mają łagodne objawy, takie jak gorączka, wysypka, ból głowy, zapalenie spojówek i bóle mięśni/stawów. Zakażone kobiety w ciąży mogą przenosić ZIKV na rozwijający się płód1. Zakażenie ZIKV powiązano również z zespołem Guillaina-Barrego, autoimmunologiczną demielinizacją nerwów obwodowych9.
Genom wirusa Zika składa się z jednoniciowej cząsteczki RNA o dodatnim znaczeniu, która ma około 10,8 kilozasad długości. Struktura genomu jest zorganizowana jako 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, z regionami niekodującymi (NCR) flankującymi region kodujący białko6. Pojedynczemu poliproteinie (3,419 aa) ulega translacji, która jest rozszczepiana ko- i potranslacyjnie na 10 mniejszych peptydów. Zarówno struktury pętli macierzystej RNA 5'NCR, jak i 3'NCR odgrywają kluczową rolę w rozpoczęciu translacji i replikacji genomu wirusa. Składniki strukturalne genomu składają się z białek kapsydu, błony i otoczki. Białka niestrukturalne mają kluczowe znaczenie dla replikacji genomu.
Obecnie szczepy wirusa Zika są pogrupowane w trzy główne genotypy: zachodnioafrykańskie, wschodnioafrykańskie i azjatyckie6,10-13. Sugeruje się, że linia wschodnioafrykańska rozprzestrzeniła się na Afrykę Zachodnią i Azję, gdzie późniejewoluowała12. Genotyp azjatycki jest odpowiedzialny za obecne ogniska epidemii w obu Amerykach. Wirus Zika może być hodowany zarówno w komórkach komarów, jak i ssaków. Pierwotne fibroblasty skóry, niedojrzałe komórki dendrytyczne, korowe nerwowe komórki progenitorowe i komórki Vero są podatne na zakażenie wirusem Zika10,14,15. Wykazano, że zarówno interferony typu I, jak i typu II ograniczają wzrost ZIKV w fibroblastach skóry15. Celem tego badania jest zapewnienie szczegółowego protokołu produkcji i oznaczania azjatyckiego genotypu wirusa ZIKA PRVABC59 w systemie hodowli komórek ssaków oraz wykazanie użyteczności tego systemu hodowli zakaźnej jako platformy rozwoju leków. Zasób ten może przynieść ogromne korzyści społeczności badawczej zajmującej się wirusem Zika i neurologią, aby dokładniej wyjaśnić mechanizmy patogenezy wirusa i ewolucji zjadliwości wirusów.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>2,5% trypsyna, 10x [-] Czerwień fenolowa&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina &ndash; Automatyczny licznik komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Countess-cell counting&nbsp; szkiełka komorowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>mysie</td> przeciwciało monoklonalne anty-dsRNA Thermo Scientific <td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>J2&nbsp;</td><td>Angielski & Doradztwo Naukowe Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>Koza anty-królicza IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>INDEKS GÓRNY III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio12K Flex System do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr> Linia komórkowa <tr>Vero<td>bez RNaz</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>Szczep wirusa Zika PRVABC59</td><td>Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 alfa&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>200-01A&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa</td><td>Peprotech</td><td>300-01A&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Interferon alfa A&nbsp; &nbsp;</td><td>R & D Systems</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>Interferon beta</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Wirówka Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>5415R</td><td>Wirówka Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop immunofluorescencyjny Nikon Eclipse Ti z Nikon Intenselight C-HGFI</td><td></td><td>Nikon Visit Nikon na zamówienie</td><td></td></tr></tbody></table>

system zakaźnych hodowli komórek wirusa zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Wirus Zika (ZIKV) to nowy patogen, który jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu, takimi jak małogłowie, wady wzroku i zaburzenia wzrostu. ZIKV jest wirusem RNA z rodziny Flaviviridae. ZIKV jest przenoszony głównie przez komary, ale może być również przenoszony przez pionową transmisję z matki na płód, a także przez kontakt seksualny. Do tej pory nie ma niezawodnych metod leczenia ani szczepionek, które chroniłyby osoby zakażone wirusem. Opracowanie powtarzalnego, skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych wirusa Zika ma kluczowe znaczenie dla badania mechanizmów molekularnych replikacji wirusa Zikov, a także opracowywania leków i szczepionek. W związku z tym przedstawiono tutaj protokół opisujący system hodowli in vitro wirusa Zika oparty na komórkach ssaków do produkcji wirusa i analizy wzrostu. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat tworzenia się blaszek miażdżycowych przez wirusa Zika na monowarstwie komórkowej oraz testu płytkiowego do pomiaru miana wirusa. Określa się kinetykę replikacji genomu wirusa i dwuniciowe produkty pośrednie replikacji genomu RNA. Ta platforma hodowlana została wykorzystana do badań przesiewowych biblioteki małego zestawu cytokin, co zaowocowało identyfikacją interferonu-α (IFN-α), IFN-β i IFN-γ jako silnych inhibitorów wzrostu wirusa Zika. Podsumowując, w badaniu tym przedstawiono system hodowli wirusa Zika in vitro i różne testy wirusologiczne, które mogą przynieść ogromne korzyści społeczności naukowej w dalszym wyjaśnianiu mechanizmów patogenezy wirusa i ewolucji zjadliwości wirusów. Przeciwwirusowy IFN-alfa może być dalej oceniany jako opcja profilaktyczna, profilaktyczna i lecznicza w przypadku zakażeń wirusem Zika w populacjach wysokiego ryzyka, w tym u zakażonych kobiet w ciąży.

W niniejszym badaniu wykorzystano szczep wirusa Zika (PRVABC59; numer akcesyjny GenBank KU501215) o genotypie azjatyckim12. Do badania infekcji wirusem Zika de novo użyto komórek Vero przy 80% konfluencji. Do produkcji wirusa i późniejszej charakterystyki wirologicznej zastosowano wirusa Zika z wczesnego pasażu (P3). Płytki wirusowe zaobserwowano w drugim dniu infekcji. Potomstwo wirusa Zika uwalniane z początkowo zainfekowanej komórki może rozprzestrzeniać się na sąsi...

Wirus Zika (ZIKV), nowy patogen, jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu i małogłowiem. Stworzenie skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych ma kluczowe znaczenie dla badań nad replikacją ZIKV, a także dla opracowywania szczepionek i leków. W niniejszej pracy zilustrowano i omówiono różne testy wirusologiczne dotyczące ZIKV.

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Ogólnym celem niniejszego badania jest opracowanie systemu hodowli in vitro zakażonych wirusem Zika komórek ssaczych w celu zbadania replikacji wirusa Zika, a także wykorzystanie tej platformy in vitro w procesie opracowywania leków. Niniejszy szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący systemu hodowli komórkowej zakażonej wirusem Zika może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmu patogenezy choroby wywoływanej przez wirusa Zika oraz ewolucji jego wirulencji. Główną zaletą tej techniki jest możliwość produkcji wirusa Zika na dużą skalę w celu opracowania leków i szczepionek.Zacznij od zebrania komórek Vero przy 80% gęstości komórkowej w kolbie hodowlanej T75, odsysając medium z kolby i płucząc komórki dwiema mililitrami soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny i inkubuj kolbę w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Po inkubacji dodaj osiem mililitrów medium wzrostowego zawierającego serum, aby inaktywować trypsynę. Następnie przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml. Dalej, pobierz 10 µL zawiesiny komórkowej i wymieszaj z taką samą ilością 0,4% błękitu trypanu. Nanieś przygotowaną mieszaninę na szkiełko komory licznikowej i określ liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Wysiej łącznie siedem milionów komórek do kolby T160 w objętości 30 ml. Następnego dnia przygotuj odpowiednią wielokrotność zakażenia (MOI) inokulum wirusa Zika w 10 ml bezserwatkowego medium hodowlanego na każdą kolbę.Bezpieczne obchodzenie się z wirusem jest kluczowe dla zapobiegania rozprzestrzenianiu się infekcji.Usunąć zużytą pożywkę z kolby T160, a następnie dodać pełne 10 ml świeżo przygotowanego inokulum wirusowego. Inkubować zaszczepione kolby w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez cztery do sześciu godzin. Rozprzestrzeniać inokulum, delikatnie przechylając kolbę na boki w każdej godzinie inkubacji. Po zakończeniu inkubacji zastąpić inokulum 30 ml podgrzanej pożywki wzrostowej z dodatkiem surowicy. Następnie kontynuować hodowlę wirusową przez kolejne 96 godzin. Po czterech dniach zweryfikować postęp infekcji, obserwując pojawienie się plam wirusowych na monowarstwie komórkowej za pomocą mikroskopu fazowego. Wykonać obrazy w razie potrzeby przy powiększeniu 40x i 200x.Zebrać nadpłyny z hodowli komórkowych w punkcie czasowym 96 godzin i odwirować nadpłyn przy 300 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć szczątki komórkowe. Po wirowaniu ostrożnie zebrać nadpłyny, nie naruszając osadu ze szczątków, i przelać je do probówek o pojemności 15 ml.Przechowywać nadnadpłyny z kultur wirusowych w wielu alikwotach w temperaturze -80 °C.Aby oznaczyć miano wirusa, najpierw należy wysiać naiwne komórki Vero na płytkę 12-dołkową w zagęszczeniu 1 × 10⁵ komórek na dołek, w objętości 2 ml. Następnego dnia należy przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne supernatantów kultur wirusowych, pobranych z kolby T160 przy użyciu medium bezzserwowego.Podczas przygotowywania rozcieńczeń seryjnych supernatantu hodowli wirusowej do oznaczenia miana, należy przestrzegać zasad bezpiecznego obchodzenia się z wirusem, aby zapobiec zakażeniu.Następnie usunąć zużyte medium z każdej studni płytki 12-dołkowej zawierającej komórki Vero i dodać 400 µl rozcieńczonego inokulum do komórek Vero w trzech powtórzeniach. Inkubować zaszczepione płytki w inkubatorze do hodowli tkanek przez cztery do sześciu godzin.Po zakończeniu inkubacji zastąpić inokulum dwiema mililitrami pożywki uzupełnionej surowicą na każdą studnię. W 48 godzinie po inokulacji policzyć ogniska wirusowe w odpowiednich rozcieńczeniach, używając mikroskopu fazowego. Obliczyć miano wirusa jako liczbę jednostek tworzących plak (PFU) na mililitr.Po zaszczepieniu komórek Vero w płytce 12-dołkowej wysokimi i niskimi mianami wirusa Zika oraz inkubacji przez 48 i 96 godzin, replikację genomu ocenia się za pomocą ilościowej PCR w celu oznaczenia ekspresji genomu wirusa Zika oraz immunocytochemicznie w celu wykrycia dwuniciowego RNA.W celu przeprowadzenia immunocytochemii należy usunąć pożywkę z dołków płytki 12-dołkowej i dodać do każdego dołka 1 mL metanolu. Pozostawić komórki do utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Następnie utrwalone komórki przemyć trzykrotnie 1x PBS. Dodać bufor blokujący i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przeciwciało mysie monoklonalne anty-dwuniciowe RNA J2 rozcieńczyć w buforze blokującym w stosunku 1:100, dodać do komórek i inkubować je w tym roztworze przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przeciwciało wtórne kozie anty-mysie IgG-594 rozcieńczyć w buforze blokującym w stosunku 1:1 000, a po przemyciu komórek 1x PBS dodać je do komórek i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po przemyciu komórek 1x PBS przeprowadzić barwienie jąder komórkowych barwnikiem Hoechst i obserwować komórki przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z powiększeniem 100x.Sześć godzin po wysianiu naiwnych komórek Vero na płytkę 12-dołkową, jak wcześniej, należy dodać interesujące cytokiny w określonych stężeniach w duplikacie biologicznym. 12 godzin po traktowaniu przeprowadza się infekcję wirusem Zika, uwzględniając dołki kontrolne ujemne bez infekcji. Cztery godziny po infekcji inokulum wirusowe zastępuje się medium z cytokinami, a następnie komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C przez kolejne 44 godziny. W 48. godzinie po infekcji należy policzyć plak wirusowe przy użyciu mikroskopu kontrastowego i wykonać reprezentatywne zdjęcia zainfekowanych komórek przy powiększeniu 40x.Wykres ten przedstawia zawartość genomu wirusa Zika zmierzoną za pomocą RT-qPCR. Zarówno startery dla genotypu Pan, jak i dla szczepu PRVABC-59 wykazały taką samą czułość i swoistość. Zgodnie z oczekiwaniami, startery wirusa zapalenia wątroby C nie spowodowały amplifikacji żadnego produktu.Przedstawiono kinetykę wzrostu wirusa Zika w wskazanych punktach czasowych w komórkach zainfekowanych niskim i wysokim mianem, w porównaniu z niezinfekowaną kontrolą pozorowaną. Wyniki analizy immunocytochemicznej pokazują, że w 48 godzinach po infekcji zainfekowane komórki tworzą kilka skupisk, natomiast w 96 godzinach po infekcji większość komórek jest zainfekowana. Wykres ten przedstawia modulację wzrostu wirusa Zika przez różne cytokiny w porównaniu z kontrolą nośnika.Te obrazy w kontraście fazowym przedstawiają komórki zainfekowane wirusem Zika z zastosowaniem lub bez zastosowania cytokin. Plaki wirusowe utworzone przez zainfekowane komórki są widoczne jako ogniska. Należy zauważyć, że w studzienkach traktowanych interferonem nie występują plaki wirusowe.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak mapowanie domen wirusa Zika o wysokiej rozdzielczości w celu lokalizacji białek wirusowych i badania replikacji w komórkach komarów oraz ludzi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. w zakresie wyjaśnienia mechanizmu patogenezy choroby i ewolucji wirulencji wirusa. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać biegłą wiedzę na temat tego, jak ustanowić oparty na komórkach ssaków system hodowli zakaźnej wirusa Zika in vitro w celu badania replikacji wirusa Zika, a także na temat wykorzystania platformy in vitro w opracowywaniu leków i szczepionek.

zika-virus-infectious-cell-culture-system-vitro-prophylactic-effect

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System zakaźnej kultury komórkowej wirusa Zika i in vitro działanie profilaktyczne interferonów

Ten film demonstruje test do pomiaru zależnego od przeciwciał wzmocnienia (ADE) infekcji wirusem dengi za pomocą surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika. Test wykorzystuje cząstki reporterowe wirusa dengi (RVP) kodujące zielone białko fluorescencyjne. Przeciwciała w surowicy przeciwko wirusowi Zika reagują krzyżowo z RVP, tworząc kompleks. Związane przeciwciała zwiększają wychwyt RVP przez komórki wyrażające receptor Fc, który jest wykrywany za pomocą cytometrii przepływowej.

Test in vitro w celu zbadania zależnego od przeciwciał wzmocnienia infekcji wirusowej

Wideo demonstruje test in vitro do badania interferonów o działaniu przeciwwirusowym przeciwko wirusowi Zika, ludzkiemu patogenowi. W komórce gospodarza wirus Zika ulega namnażaniu po internalizacji, infekując sąsiednie komórki i tworząc odrębne strefy lub blaszki wirusowe. Interferon typu I, działając jako środek przeciwwirusowy, hamuje namnażanie się wirusa, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się blaszek wirusowych w monowarstwie komórki gospodarza.

Test in vitro do badań przesiewowych interferonów jako silnych inhibitorów wzrostu wirusa Zika

Ten film pokazuje procedurę zakażenia ludzkich płodowych nerwowych komórek macierzystych wirusem Zika. Zainfekowane komórki mogą być wykorzystane do dalszych badań.

Zakażenie płodowymi neuronalnymi komórkami macierzystymi wirusem Zika

Ten protokół opisuje odzyskiwanie zakaźnego wirusa Zika z dwuplazmidowego zakaźnego klonu cDNA.

Ratowanie i charakterystyka rekombinowanego wirusa z zakaźnego klonu wirusa Zika z Nowego Świata

Tutaj opisujemy metodę tworzenia modelu mikrocefalii wywołanej wirusem Zika u myszy. Protokół ten obejmuje metody inokulacji śródmózgowej wirusa Zika w stadium embrionalnym, noworodkowym i dorosłym.

Tworzenie mysich modeli zaburzeń neurologicznych wywołanych wirusem Zika przy użyciu strategii iniekcji domózgowych: embrionalnej, noworodkowej i dorosłej

Ten artykuł szczegółowo opisuje metody, które są używane do rozbudowy ludzkich komórek macierzystych mózgu płodu w hodowli, a także jak różnicować je na różne podtypy neuronów i astrocyty, z naciskiem na wykorzystanie nerwowych komórek macierzystych do badania infekcji wirusem Zika.

Zakażenie wirusem Zika hodowanych komórek macierzystych neuronalnego mózgu ludzkiego płodu do analizy immunocytochemicznej

Opisano protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych mysiego modelu Ifnar1-/- dla infekcji wirusem Zika (ZIKV). Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy szczepionek ZIKV, a także jest cenna dla oceny ich skuteczności.

Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-

Opisujemy metodę oceny wpływu istniejącej wcześniej odporności na wirusa dengi na infekcję wirusem Zika za pomocą ludzkiej surowicy, pierwotnych komórek ludzkich i kwantyfikacji infekcji za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich

Celem protokołu jest zademonstrowanie technik używanych do badania chorób wirusowych poprzez izolację i ilościowe określenie wirusa Zika z wielu narządów u myszy po zakażeniu.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Zika z wielu narządów myszy

W tej pracy opisujemy protokoły używane w testach opartych na replikonie i enzymach wirusowych do badań przesiewowych na obecność inhibitorów replikacji wirusa Zika w formacie wysokoprzepustowych.

Wysokoprzepustowe testy przeciwwirusowe do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów replikacji wirusa Zika

Tutaj pokazujemy użycie komórkowej impedancji elektrycznej (CEI) jako bardzo łatwej i prostej metody badania infekcji wirusem Zika i jego replikacji w ludzkich komórkach w czasie rzeczywistym. Ponadto test CEI jest przydatny do oceny związków przeciwwirusowych.

Komórkowa platforma impedancji elektrycznej do oceny inhibitorów wirusa Zika w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę hodowli komórek wirusa Zika in vitro przy użyciu linii komórkowej Vero. Ten protokół umożliwia badanie replikacji wirusa i wspiera rozwój leków oraz szczepionek.

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Przeglądaj więcej filmów