Ekstrakcja kapsułek roślinnych do zastosowań w mikrokapsułkowaniu

Ogólnym celem tej procedury jest ustanowienie usprawnionego procesu ekstrakcji kapsułek Sporopollenin Exine lub SEC do zastosowań mikrokapsułkowania. Ta metoda może szybko zapewnić czyste mikrowychwytywanie w zastosowaniach związanych z żywnością i opieką zdrowotną. Główną zaletą tej techniki jest to, że czas procesu ekstrakcji SEC można znacznie skrócić, aby uzyskać czyste, nienaruszone SEC.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w usprawniony proces ekstrakcji SEC i obszerną charakterystykę etapową, może być również wykorzystana do zbadania podstawowych ocen mikrostrukturalnych i morfologicznych różnych biomateriałów pochodzenia roślinnego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności z konwencjonalnym procesem ekstrakcji trwającym od 8 do 10 dni, obejmującym silnie kwasy w podwyższonych temperaturach. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj zestaw refluksowy w dygestoriach ze szklanym skraplaczem, systemem cyrkulacji wody i łaźnią wodną.

Ponieważ proces ekstrakcji SEC wiąże się z użyciem silnie kwasów i rozpuszczalników organicznych, proces ten powinien być wykonywany przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej, takich jak gogle, fartuch laboratoryjny, maska na twarz i rękawice z powiadomieniem o zagrożeniu. Ostrożnie zważ 100 gramów zarodników L clavatum, nie tworząc kurzu i z dala od źródeł zapłonu. Następnie powoli przenieś zarodniki do jednolitrowej kolby okrągłodennej z PTFE za pomocą magnetycznego pręta mieszającego.

Dodać 500 mililitrów acetonu do zarodników i delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Teraz umieść kolbę w łaźni wodnej ustawionej na 50 stopni Celsjusza i podłączonej do chłodnicy zwrotnej. Podgrzewać zawiesinę do refluksu przez sześć godzin, mieszając przy 200 obr./min.

Po pozostawieniu zawiesiny do ostygnięcia w temperaturze pokojowej, przefiltruj ją za pomocą bibuły filtracyjnej pod próżnią i zbierz odtłuszczone zarodniki na dużych szklanych szalkach Petriego. Wysuszyć zarodniki w temperaturze pokojowej, przykrywając szalki Petriego folią aluminiową z otworami do odparowania rozpuszczalnika. Po przeniesieniu wysuszonych, odtłuszczonych suchych zarodników do jednolitrowej kolby PTFE dodać 500 mililitrów 85% roztworu kwasu fosforowego.

Umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza i podłączyć ją do chłodnicy zwrotnej. Podgrzewać zawiesinę do refluksu przez 30 godzin, mieszając. Gdy zawiesina ostygnie do temperatury pokojowej, rozcieńczyć ją 500 mililitrami ciepłej wody dejonizowanej i zebrać SEC przez filtrację próżniową za pomocą bibuły filtracyjnej.

Następnie przenieś SEC do trzylitrowej szklanej zlewki, aby wykonać serię płukań. W dygestoriach dodaj 800 milimetrów gorącej wody dejonizowanej do SEC i delikatnie mieszaj przez 10 minut. Następnie przefiltrować zawiesinę za pomocą bibuły filtracyjnej pod próżnią.

Przenieś SEC do czystej trzylitrowej szklanej zlewki. Po pięciokrotnym powtórzeniu poprzednich kroków dodaj 600 mililitrów gorącego acetonu do SEC i delikatnie mieszaj przez 10 minut. Zebrać SEC przez filtrację w próżni i przenieść je do czystej trzylitrowej szklanej zlewki.

Po powtórzeniu poprzednich kroków z odpowiednimi rozpuszczalnikami, przenieś czyste SEC na sześć dużych szklanych szalek Petriego i susz w dygestoriach w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, aby usunąć całą wodę. Następnie wysusz SEC w piecu próżniowym w temperaturze 60 stopni Celsjusza i jednym milibarze próżni przez 10 godzin lub do uzyskania stałej wagi. Następnie przenieś wysuszone SEC do polipropylenowej butelki do przechowywania w suchej szafce.

Przygotuj 1,2 mililitra albuminy surowicy bydlęcej lub roztworu BSA w wodzie dejonizowanej i przenieś go do 50-mililitrowej probówki polipropylenowej. Dodaj 150 miligramów SEC do roztworu BSA. Mieszaj mieszaninę przez 10 minut, aby uzyskać jednorodny roztwór.

Po przykryciu probówki bibułą filtracyjną przenieść ją do kolby liofilizatora i suszyć przez cztery godziny w próżni o ciśnieniu jednego milibara. Po wyschnięciu SEC załadowanych przez BSA usuń aglomeraty za pomocą moździerza i tłuczka. Teraz przenieś SEC załadowane BSA do 50-mililitrowej probówki i dodaj dwa mililitry wody dejonizowanej, aby usunąć resztki BSA.

Zebrać SEC przez odwirowanie w temperaturze 4 704 przez pięć minut. Po zakończeniu wyrzucić supernatant. Powtórz mycie wodą dejonizowaną.

Następnie przykryj probówkę zawierającą SEC załadowane BSA bibułą filtracyjną. Następnie przenieś SEC do zamrażarki na godzinę. Liofilizować SEC przez 24 godziny.

Przechowuj SEC w zamrażarce do czasu dalszej charakterystyki. Użyj pięciu miligramów SEC załadowanych BSA w dwumililitrowej tubie polipropylenowej. Dodaj 1,4 mililitra PBS i wiruj przez pięć minut.

Następnie sonda sonikuje zawiesinę o amplitudzie 40% przez trzy cykle po dziesięć sekund. Po zakończeniu przefiltruj roztwór za pomocą filtra polieterosulfonowego o grubości 0,45 mikrona. Po wykonaniu poprzednich kroków z SEC placebo, zmierz absorbenty SEC obciążonych BSA przy 280 nanometrach, używając placebo jako ślepej próby.

Na koniec określ ilościowo ilość BSA zamkniętego w kapsułkach za pomocą standardowej krzywej BSA w PBS. Obrazy SEM wskazują na nienaruszone zarodniki o unikalnej mikrostrukturze, a przed przetworzeniem w skali mikronów na obrazie przekrojowym obserwowano organelle sporoplazmatyczne. Po odtłuszczeniu zarodników i leczeniu alkaliami nie zaobserwowano żadnych zmian morfologicznych i strukturalnych.

Obrazy SEM po kwasolizie pokazują nienaruszone SEC pozbawione materiałów sporoplazmatycznych. Nie obserwuje się znacznego usunięcia materiału białkowego w odtłuszczonych i poddanych działaniu zasad SEC za pomocą analizy CHN. Większość materiałów białkowych jest usuwana za pomocą kwasolizy.

Analiza DIPA pokazuje równomierny rozkład wielkości SEC po kwasolizie do 30 godzin. Integralność strukturalna SEC zmniejsza się wraz z długotrwałą kwasotą. Dane SEM i DIPA pokazują, że po etapie odtłuszczania kwasica wytworzyła nienaruszone SEC o jednolitym rozkładzie wielkości.

Dane CLSM wskazują, że nieleczone SEC wykazują autofluorescencję ze względu na składniki sporoplazmy wewnątrz jamy zarodników. Po kwasolizie usuwa się tylko przetwarzanie, cała zawartość sporoplazmatyczna jest usuwana. Po enkapsulacji FITC-BSA obserwuje się zielony kwiatostan wewnątrz SEC.

Obrazy SEM pokazują nienaruszone mikrogrzbiety po załadowaniu BSA. Nie zaobserwowano istotnych zmian w średnicy, okrągłości i proporcji po załadowaniu BSA do SEC. Kwantyfikacja BSA z zamkniętych SEC potwierdza spójność procesu mikrokapsułkowania z 0,170 plus minus 0,01 grama obciążenia BSA na gram SEC.

Po opanowaniu ten usprawniony proces ekstrakcji SEC można wykonać w ciągu 48 godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Próbując tej procedury dla różnych zarodników roślin i pyłku, ważne jest, aby pamiętać o stopniowej ocenie strukturalnej analizy morfologicznej i pierwiastkowej, aby uzyskać nienaruszone i czyste kapsułki. Po tej procedurze można przeprowadzić inne procesy ekstrakcji z udziałem enzymów alkalicznych w celu sprawdzenia wykonalności zoptymalizowanego procesu dla różnych kapsułek roślinnych.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrokapsułkowaniem, dostarczaniem leków i inżynierią tkankową do badania różnorodnych SEC pochodzenia roślinnego jako biomateriałów nowej generacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ekstrahować i charakteryzować SEC z zarodników roślin i ziaren pyłku, a także przeprowadzać enkapsulację leków i biomakrocząsteczek do SEC.