Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Ogólnym celem tego protokołu jest wykorzystanie mikroskopii do analizy tworzenia się biofilmów bakteryjnych na strzępkach nitkowatych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii, takie jak to, w jaki sposób na strzępkach tworzy się biofilm bakteryjny, jak specyficzne są i z czego są zbudowane. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie tworzenia się biofilmu bakteryjnego na strzępkach grzybów w wielu skalach, od nanometrów do centymetrów.

Demonstracja procedury zostanie wykonana przez Corę Miquel Guennoc z mojego laboratorium oraz Christophe'a Rose'a, inżyniera mikroskopii elektronowej z platformy INRA PTEF. Na początek przygotuj membrany celofanowe o tej samej średnicy co szalki Petriego, a następnie umieść je we wrzącym EDTA na 30 minut. Następnie użyj wody dejonizowanej do wypłukania arkuszy i dwukrotnego autoklawowania.

Aby przygotować wstępne kultury grzybów, zaszczepij grzyba na podłożu agarowym, pokrytym membraną celofanową poddaną wstępnej obróbce EDTA. Inkubuj kultury w optymalnej temperaturze, aby uzyskać kolonie o średnicy około jednego centymetra. Z kultury wstępnej zaszczepić szalkę Petriego odpowiednią pożywką agarową, pokrytą błoną celofanową EDTA, używając skalpela, aby delikatnie zadrapać zewnętrzny obszar kolonii przed kulturą, a następnie przenosząc strzępki na płytkę agarową.

Inkubuj płytki w optymalnej temperaturze, aż kolonie osiągną średnicę około jednego centymetra. Aby przygotować kultury bakteryjne, takie jak P.fluorescens BBc6, użyj sterylnej pętli, aby zebrać dwie do trzech pojedynczych kolonii bakteryjnych z podłoża agarowego i zaszczepić 25 mililitrów LB. Inkubuj kulturę w optymalnej temperaturze przez noc. Po wyhodowaniu bakterii przez noc odwiruj kulturę z prędkością 5 000 g przez trzy minuty.

A następnie zawiesić osad w 25 mililitrach sterylnego 0,1-molowego buforu fosforanu potasu. Po powtórzeniu wirowania użyj tego samego buforu, aby dostosować końcowe stężenie bakterii do 10 do dziewiątych komórek na mililitr. Napełnij sześciodołkową mikropłytkę pięcioma mililitrami zawiesiny bakteryjnej.

Użyj sterylnej żyletki, aby pociąć błonę celofanową kultury grzybów na kwadraty, z pojedynczą kolonią na każdej membranie. Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie usuń celofanowe kwadraty zawierające strzępki ze stałego podłoża i przenieś je do poszczególnych dołków zawiesiny bakteryjnej. Delikatnie potrząśnij mikropłytką, aż kolonie grzybów oderwą się od celofanu.

Następnie usuń arkusze celofanu, pozostawiając kolonie grzybów na talerzu. Inkubować mikropłytkę z delikatnym mieszaniem w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez pewien czas, w zależności od użytych szczepów i etapu, który ma być analizowany. W przypadku P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor należy inkubować kultury przez 30 minut, aby uzyskać biofilmy we wczesnym stadium, i do 16 godzin w przypadku dojrzałych biofilmów.

Aby usunąć bakterie planktonowe i bakterie elektrostatycznie przyczepione do strzępek, opłucz grzyba, przenosząc go na nową sześciodołkową mikropłytkę wypełnioną mocnym roztworem soli. Delikatnie potrząsaj talerzem przez minutę. Przenieś grzyba na nową sześciodołkową mikropłytkę zawierającą pięć mililitrów sterylnego 0,1-molowego buforu fosforanu potasu.

Delikatnie potrząsaj talerzem przez dwie minuty, a następnie przenieś grzyba do świeżego bufora. Trzymając kolonię grzybów w buforze, użyj skalpela, aby przeciąć kolonię mniej więcej na pół. Przenieś połowę kolonii do barwienia na szalkę Petriego zawierającą jeden mililitr sterylnej wody, uzupełnionej odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji sieci grzybów, takim jak aglutynina z kiełków pszenicy sprzężona z Alexa Fluor 633.

Następnie inkubować próbkę w ciemności. Po barwieniu spłucz próbkę, przenosząc ją na pokrywkę szalki Petriego zawierającą 10 mililitrów sterylnego 0,1-molowego buforu fosforanu potasu i delikatnie wstrząsaj przez jedną minutę. Zanurz szkiełko do połowy w pokrywie szalki Petriego i delikatnie ustaw wyciętą sekcję tak, aby unosiła się nad szkiełkiem.

Następnie powoli podnieść szkiełko z roztworu buforowego, pozwalając, aby próbka delikatnie osiadła na szkiełku. Najdelikatniejszym aspektem jest ułożenie próbki na szkiełku. Aby uniknąć opisu biofilmu, próbka i szkiełko muszą być zanurzone podczas umieszczania próbki, a próbka nie może być już przesuwana przed obrazowaniem.

Na koniec dodaj 10 mikrolitrów przeciwblaknącego podłoża montażowego do próbki i przykryj ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Zbadaj szkiełka pod konfokalnym mikroskopem laserowym z obiektywem 10x lub 40x. Użyj kombinacji skanowania kafelków i funkcji Z-stack, aby uzyskać globalne widoki 3D kolonii grzybów i biofilmów.

Aby przeprowadzić mikroskopię elektronową, po wypłukaniu grzyba w mocnym roztworze soli, jak poprzednio, przenieś grzyba do sterylnej wody, a nie do bufora, aby zapobiec tworzeniu się kryształków soli podczas etapu odwadniania. Przenieś biofilmy do uchwytu na próbkę i usuń nadmiar wody. Następnie przenieś próbki do komory skaningowego mikroskopu elektronowego o zmiennym ciśnieniu.

Na etapie chłodzenia Peltiera należy zamrozić próbkę do temperatury minus 50 stopni Celsjusza, pozwalając jej powoli wyschnąć bezpośrednio w komorze SEM, przy zmiennym ciśnieniu 100 paskali ustawionym na 15 godzin. Pobrać próbkę i przenieść ją do systemu osadzania filmu w wysokiej próżni. Następnie pokryj próbkę dwunanometrową platyną pod plazmą argonową.

Obserwuj pokrytą próbkę za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, za pomocą pistoletu do emisji pola przy użyciu detektora o wysokiej rozdzielczości w soczewce i elektronicznego wysokiego napięcia jednego kilowolta. Ta analiza biofilmów w mezoskali pokazuje heterogeniczny rozkład biofilmu P.fluorescens BBc6 w kolorze zielonym na strzępkach L.bicolor S238N, pokazanych na czerwono. Analiza umożliwiła również śledzenie tworzenia się biofilmu w czasie, od wczesnych etapów, w których tylko niektóre bakterie oznaczone GFP były przyczepione do strzępek, pokazanych na czerwono, do tworzenia grubego, dojrzałego biofilmu.

Jak pokazano tutaj, obrazy w mezoskali o wysokiej rozdzielczości wykorzystano również do przeprowadzenia analizy w skali mikro, aby uzyskać architektury kolonii. Ponadto, w tej projekcji o maksymalnej intensywności 2D obrazu konfokalnego 3D o wysokiej rozdzielczości, specyficzne znakowanie za pomocą SYPRO Ruby, pokazanego na czerwono, wskazuje na obecność białek w matrycy, z bakteriami BBc6 znakowanymi GFP i grzybem znakowanym FUN-1 w kolorze ciemnozielonym. Po odwodnieniu i zakodowaniu tej samej próbki, za pomocą obrazowania SEM uzyskano dalsze szczegóły dotyczące struktury biofilmu.

Zielone groty strzałek wskazują na komórki bakteryjne w biofilmie, a żółte groty wskazują na strzępki grzybów. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu około dwóch i pół godziny dla jednej próbki, nie licząc czasu inkubacji potrzebnego do tworzenia biofilmu i hodowli mikroorganizmów. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że powodzenie metody w dużym stopniu zależy od zdolności do uzyskania bardzo cienkich kolonii grzybów, zbudowanych z zaledwie kilku warstw strzępek.

Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak mutageneza lub hybrydyzacja in situ, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak funkcjonalna lub chemiczna charakterystyka biofilmu, lub do badania biofilmów wielogatunkowych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z wielu dziedzin, takich jak medycyna, nauki o środowisku, przemysł spożywczy i tak dalej, do badania tworzenia biofilmu podczas interakcji z bakteriami grzybowymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i analizować tworzenie się biofilmu bakteryjnego na strzępkach grzybów.