Mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest wykonanie optycznego mapowania węzła zatokowo-przedsionkowego myszy z nienaruszonego serca z perfuzją Langendorffa lub izolowanego preparatu przedsionkowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie elektro- i patofizjologii węzłów zatokowo-przedsionkowych dotyczące mechanizmów nieprawidłowości rozrusznika serca, zespołu chorej zatoki i różnych chorób związanych z arytmią przedsionków. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badanie wielu parametrów w nienaruszonych tkankach z bardzo wysoką rozdzielczością przestrzenną i atemporalną.

Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, użyj zakrzywionych 5.5-calowych nożyczek Mayo i 5.5-calowych kleszczy hemostatycznych Kelly'ego, aby wykonać jednocentymetrowe nacięcie z przodu klatki piersiowej. Używając czterocalowych zakrzywionych kleszczy tęczówki, szybko chwyć tkankę płucną i użyj nożyczek do tęczówki o długości czterech trzecich cala, aby wyciąć płuco, grasicę i serce razem z osierdziem. Umyj tkanki w natlenionym roztworze Tyrode modyfikowanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie użyj zakrzywionych trzycalowych nożyczek Vannas Tubingen i kleszczy o długości czterech trzecich cala numer pięć, aby usunąć płuca, grasicę i tkankę tłuszczową z serca. Następnie użyj specjalnie wykonanej kaniuli o rozmiarze 21 i dwóch zakrzywionych kleszczyków B o średnicy 4,3 cala, aby kaniulować aortę i jednocześnie perfuzjować i przelać serce roztworem Tyrode o temperaturze 37 stopni Celsjusza, kierując roztwór przez wbudowany filtr nylonowy o grubości 11 mikronów przed perfuzją, aby zapobiec zatkaniu krążenia wieńcowego. Następnie podłącz przetwornik ciśnienia do zamka Luer na linii perfuzyjnej za pomocą trójdrogowego kurka, aby monitorować ciśnienie w aorty, dostosowując prędkość perfuzji, aby utrzymać ciśnienie w aorcie w zakresie od 60 do 80 milimetrów słupa rtęci, jeśli to konieczne.

Aby uzyskać optyczne mapowanie węzła zatokowo-przedsionkowego z serca z perfuzją Langendorffa, ustaw narząd w orientacji poziomej z tylną stroną skierowaną do góry w komorze do kąpieli narządów ze szkła i użyj szpilek o średnicy 0,1 milimetra, aby przymocować wierzchołek komory do pokrytego silikonem dna komory, aby zapobiec ruchowi wywołanemu strumieniem podczas eksperymentu. Włóż małą silikonową rurkę do lewej komory przez żyłę płucną, lewe przedsionki i zastawkę mitralną i użyj jedwabnego szwu 40, aby przymocować rurkę do otaczającej tkanki łącznej. Następnie użyj kolejnych 40 jedwabnych szwów, aby zapiąć żyłę główną górną i dolną i przypiąć krawędź wyrostka prawego przedsionka do dna komory.

Rozciągnij i przypnij drugi koniec szwu do dna komory i umieść specjalnie wykonaną elektrodę stymulacyjną na krawędzi prawego uszka przedsionkowego. Następnie umieść dwie elektrody monopolarne igłowe z elektrokardiogramem o średnicy 12 milimetrów w pobliżu podstawy prawej i lewej komory, a naziemną elektrodę elektrokardiogramową umieść w pobliżu wierzchołka komory. Aby zabarwić tkankę, wstrzyknij rozcieńczony barwnik do wbudowanego portu perfuzyjnego linii perfuzji wieńcowej w celu dostarczania przez okres od pięciu do siedmiu minut.

Po 20 minutach stabilizacji dodaj 0,5 mililitra bróbstatyny o temperaturze 37 stopni Celsjusza do perfuzatu, a następnie wstrzyknij 0,1 mililitra bróbstatyny rozcieńczonej w 1 mililitrze roztworu Tyrode o temperaturze 37 stopni Celsjusza do linii perfuzji wieńcowej przez kolejne pięć do siedmiu minut za pomocą wbudowanego portu iniekcyjnego Luer lock. Blebbistatynę należy stosować ostrożnie. Aby zapobiec wytrącaniu się inhibitora, należy najpierw rozpuścić bhubistatynę w pożywce podgrzanej do klarownej temperatury 37 stopni i energicznie wymieszać mieszaninę.

Aby optycznie odwzorować próbkę, najpierw przymocuj małą pokrytą szklankę do powierzchni roztworu nad tkanką, aby zredukować wszelkie artefakty ruchu spowodowane wibrującym roztworem. Następnie za pomocą elastycznego rozwidlonego światłowodu ze światłem wzbudzającym dostarczanym przez stałoprądową, niskoszumową lampę halogenową, skieruj przefiltrowaną wiązkę światła na tkankę i zobrazuj wynikowy sygnał fluorescencyjny. Po kaniulacji serca, jak właśnie pokazano, wypreparuj komory od przedniej strony i otwórz prawy przedsionek przez zastawkę trójdzielną wzdłuż osi żyły głównej górnej zastawki trójdzielnej, a następnie nacięcie przez przyśrodkową kończynę crista terminalis.

Aby otworzyć wolną ścianę przedsionka, należy wykonać nacięcie od linii środkowej nacięcia kończyny przyśrodkowej do krawędzi prawego dolnego rogu wyrostka prawego przedsionka i przypiąć spłaszczoną wolną ścianę przedsionka do dna komory pokrytej silikonem. Aby otworzyć uszek lewego przedsionka, przeciąć zastawkę mitralną wzdłuż górnego rogu zastawki mitralnej lewego przedsionka. Następnie przypnij otwarte lewe przedsionek, tak jak to było wcześniej zrobione dla prawego przedsionka.

Następnie częściowo usuń tkankę komorową. Zachować obręcz tkanki komorowej do przypinania preparatu, aby zapobiec uszkodzeniu przedsionków i przypiąć tkankę do dna komory pokrytej Sylgardem. Teraz podnieś końcowy preparat o około 0,5 milimetra od dna komory pokrytej silikonem, aby umożliwić superfuzję zarówno z powierzchni nasierdzia, jak i wsierdzia i przelej próbkę roztworem tyrodu o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie umieść specjalnie wykonaną elektrodę chlorku srebra do stymulacji na krawędzi wypreparowanego wyrostka prawego przedsionka. Umieść jedną elektrodę monopolarną z 12-milimetrową igłą elektrokardiogramu w pobliżu każdego z przydatków prawego i lewego przedsionka, a elektrodę elektrokardiogramu uziemionego umieść w pobliżu połączenia komorowego przedsionków. Aby zabarwić tkankę serca, użyj pipety o średnicy 1 milimetra, aby powoli uwolnić wrażliwy na napięcie barwnik rozcieńczony w roztworze Tyrode o temperaturze 37 stopni Celsjusza bezpośrednio na tkankę.

Następnie unieruchomić próbkę poprzez bezpośrednie nałożenie rozcieńczonej blebbistatyny na tkankę, a następnie podać kolejne 0,5 mililitra blibstatyny przez perfuzat i optycznie odwzorować próbkę, jak właśnie pokazano. Etapy barwienia tkanek i hamowania bróbstatyny mają kluczowe znaczenie, co wymaga dokładnego wdrożenia i precyzyjnej procedury barwienia, tak aby nie miało to wpływu na parametry fizjologiczne przedsionków, w tym tętno, alokację głównego rozrusznika serca i przewodnictwo przedsionkowe. Tutaj pokazano typową mapę konturową aktywacji prawego przedsionka zrekonstruowaną pod kątem spontanicznego rytmu zatokowego dla serca myszy z perfuzją Langendorffa z dwiema odpowiadającymi im mapami konturu prawego przedsionka uzyskanymi przy częstotliwościach próbkowania 1 i 0,5 milisekundy.

Punkt wczesnej aktywacji znajduje się w obszarze międzykonwidentnym w pobliżu żyły głównej górnej, gdzie anatomicznie zdefiniowany jest węzeł zatokowo-przedsionkowy. W tym eksperymencie, po stymulacji uszka prawego przedsionka przez co najmniej jedną minutę z częstotliwością od 10 do 12 Hz, stymulacja elektryczna została zatrzymana, a czas regeneracji węzła zatokowo-przedsionkowego obliczono jako odstęp czasu między ostatnim uchwyconym potencjałem czynnościowym a pierwszym spontanicznym potencjałem czynnościowym. Aktywacja izolowanego preparatu przedsionkowego podczas spontanicznego rytmu zatokowego pozwala na dokładne zidentyfikowanie obszaru lokalizacji wiodącego rozrusznika.

Jeśli zabiegi chirurgiczne i ładowanie barwnikiem są odpowiednio przestrzegane, nie należy zaobserwować istotnych zmian w fizjologicznych cechach przedsionka. Chociaż barwienie tętnic może wymagać większej ilości barwnika, sygnał fluorescencyjny w tkance węzła zatokowo-przedsionkowego wydaje się być bardziej stabilny dzięki tej metodzie ładowania, z czasem zaniku intensywności sygnału po barwieniu wieńcowym prawie dwa razy dłuższym niż po barwieniu powierzchniowym. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w 30, 40 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy zwrócić uwagę na zlokalizowanie anatomii przedsionków przed wykonaniem cięcia, aby uniknąć uszkodzenia tkanki przedsionkowej i węzła zatokowego. Po tej procedurze można wykonać inne pomiary, takie jak konwencjonalne zapisy szklanych elektrod mitralnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące charakterystyki przemiennego potencjału transbłonowego. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się fizjologią intelektu do badania arytmii przedsionkowej, w tym dysfunkcji węzłów zatokowo-przedsionkowych w sercu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać mapowanie optyczne w wysokiej rozdzielczości preparatu węzła zatokowego myszy.