Name: Mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj metodę mapowania optycznego węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości przestrzenniej i czasowej. Technika Langendorffa umożliwia badanie mechanizmów arytmii i zespołu chorej zatoki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wspierani przez start-up University of Wisconsin-Madison Medical School (A.V.G.).

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (NIH Pub. No. 80-23). Wszystkie metody i protokoły stosowane w tych badaniach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Protokołu Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wisconsin zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych opublikowanymi przez NIH (publikacja nr 85-23, poprawiona w 1996 r.). Wszystkie zwierzęta wykorzystane w tym badaniu otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania.
1. Usuwanie serca i perfuzja Langendorffa
<ol>
	<li>Przed izolacją serca należy podgrzać roztwór Tyrode do temperatury 37 °C, korzystając z kąpieli wodnej i płaszcza wodnego.</li>
	<li>Znieczulij mysz 5% izofluranem/95%O2.</li>
	<li>Zadbaj o odpowiedni poziom znieczulenia, sprawdzając utratę odruchu bólowego.</li>
	<li>Wykonaj torakotomię. Otwórz klatkę piersiową za pomocą zakrzywionych 5.5-calowych nożyczek Mayo i 5,5-calowych kleszczy hemostatycznych Kelly'ego, aby wykonać 1-centymetrowe cięcie z przodu klatki piersiowej.
	<ol>
		<li>Szybko wyjmij serce z klatki piersiowej (w ciągu 30 sekund). Użyj 4-calowych zakrzywionych kleszczyków tęczówki, aby chwycić tkankę płucną i wyciąć płuco, grasicę i serce wraz z osierdziem za pomocą 4,3-calowych nożyczek do tęczówki. Nie chwytaj bezpośrednio za serce.</li>
		<li>Umyj go w natlenionym (95%O2 / 5% CO2), stałym (36,8 ± 0,4°C) roztworze modyfikowanym Tyrode. Stosować następujący skład roztworu (w mM): 128,2 NaCl, 4,7 KCl, 1,19 NaH2PO4, 1,05 MgCl2, 1,3 CaCl2, 20,0 NaHCO3 i 11,1 glukozy (pH 7,35 ± 0,05).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kąpiąc się w tym samym roztworze, zidentyfikuj płuca, grasicę i tkankę tłuszczową. Ostrożnie wypreparuj je z serca. Użyj zakrzywionych 3-calowych nożyczek Vannas-Tubingen i kleszczyków 4.3" #5.</li>
	<li>Następnie zidentyfikuj aortę i wprowadź ją do kaniulacji na specjalnie wykonanej kaniuli 21 G. Użyj dwóch zakrzywionych kleszczyków do #5B 4,3 cala.</li>
	<li>Po kaniulacji należy jednocześnie przeprowadzić perfuzję (przez kaniulę z szybkością przepływu ~5 ml/min; należy to dostosować w zależności od ciśnienia w aorcie, patrz poniżej) i superfuzję (w kąpieli z szybkością przepływu ~50 ml/min) serca z podgrzanym i przefiltrowanym roztworem tylody przez cały czas trwania eksperymentu. Przepuść roztwór perfuzyjny przez wbudowany filtr nylonowy 11 μm, aby zapobiec zatkaniu krążenia wieńcowego.</li>
	<li>Za pomocą przetwornika ciśnienia (lub manometru) podłączonego za pomocą 3-drogowego kranu Luer do przewodu perfuzyjnego monitoruj ciśnienie w aorcie i utrzymuj je w zakresie od 60 do 80 mmHg. W razie potrzeby dostosuj prędkość perfuzji, aby utrzymać ciśnienie w aorcie w tym zakresie.</li>
</ol>
2. Optyczne mapowanie sieci SAN z perfudzonego całego serca Langendorffa
<ol>
	<li>instrumentacja
	<ol>
		<li>Umieść serce poziomo i przypnij wierzchołek komory do pokrytego silikonem dna komory za pomocą kołków o średnicy 0,1 mm, aby zapobiec ruchowi wywołanemu strumieniem podczas eksperymentu. 12</li>
		<li>Wprowadzić małą rurkę silikonową (.012" ID x .005") do lewej komory (LV) przez żyłę płucną, lewe przedsionki (LA) i zastawkę mitralną (MV). Przymocuj rurkę za pomocą jedwabnego szwu (4-0) do sondującej tkanki łącznej.</li>
		<li>Ustaw serce tylną stroną skierowaną do góry (Rysunek 1A, lewy panel).</li>
		<li>Przymocuj krawędź wyrostka RA (RAA) do silikonowego dna komory za pomocą szpilek o średnicy 0,1 mm. Dostosuj jego poziom, aby tylna powierzchnia RA była płaska i pozwoliła na zlokalizowanie jej w płaszczyźnie ogniskowej aparatu. Umożliwi to pomiary optyczne z maksymalnej powierzchni przedsionka.</li>
		<li>Pętlę żyły głównej górnej (SVC) i dolnej (IVC) za pomocą szwu jedwabnego (4-0), rozciągnąć i przypiąć drugi koniec szwu do dna komory pokrytej silikonem (patrz ryc. 3A). Upewnij się, że szwy nie blokują optycznego pola widzenia.</li>
		<li>Umieść wykonaną na zamówienie elektrodę stymulacyjną na krawędzi RAA. Do wykonania elektrod należy użyć pokrytych silikonem srebrnych drutów o średnicy 0,25 mm, z odstępem między elektrodami 0,5 mm i pozbawionymi krzemu na długości 1 mm na końcu stymulacji. Następnie umieść dwie elektrody monopolarne EKG z igłą 12 mm (rozmiar 29) w pobliżu podstawy prawej i lewej komory. Umieść uziemioną elektrodę EKG w pobliżu wierzchołka komór .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienia
	<ol>
		<li>Ponieważ zarówno barwniki fluorescencyjne, jak i elektromechaniczny rozłączający blebbitatynę są wrażliwe na światło, wszystkie opisane poniżej procedury należy wykonać w ciemnym pomieszczeniu. Najpierw przygotować wrażliwy na napięcie barwnik RH-237 lub di-4-ANNEPS jako roztwór podstawowy, 1,25 mg/ml w dimetylosulfotlenku (2,5 mM), podwielokrotność (30 μl każdy) i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć 5-10 μl podstawowego roztworu barwnika w 1 ml ogrzanego (37 °C) roztworu tyrodu, a następnie wstrzyknąć go do linii perfuzji wieńcowej przez okres 5-7 minut za pomocą wbudowanego portu do wstrzykiwań Luer.</li>
		<li>Przygotować wcześniej blebbistatynę w postaci roztworu podstawowego (2 mg/ml w dimetylosulfotlenku 6,8 mM) i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
		<li>Po 20 minutach stabilizacji dodać 0,5 ml podgrzanej (37 °C) blebbistatyny do perfuzatu i rozcieńczyć 0,1 ml blibstatyny w 1 ml podgrzanego (37 °C) roztworu tyrodu. Następnie wstrzykiwać do linii perfuzji wieńcowej przez okres 5-7 minut za pomocą wbudowanego portu do wstrzykiwań Luer.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mapowanie optyczne sieci SAN z izolowanego preparatu przedsionkowego
<ol>
	<li>instrumentacja
	<ol>
		<li>W przypadku preparatu izolowanego przedsionka należy wyizolować i kanniulować serce, jak opisano powyżej w krokach 1.1-1.5 w przypadku przygotowania całego serca.</li>
		<li>Wypreparuj komory z dala od przedniej strony. Zobacz rysunek 1A, prawy panel, wycięcie #1, aby uzyskać szczegółowe informacje.</li>
		<li>Otwórz RZS, przecinając zastawkę trójdzielną (TV) wzdłuż osi TV-SVC. Zobacz rysunek 1A, prawy panel, wycięcie #2, aby uzyskać szczegółowe informacje.</li>
		<li>Przetnij przyśrodkową kończynę crista terminalis, aby otworzyć RAA. Patrz rysunek 1A, prawy panel, wycięcie #3.</li>
		<li>Otwórz przednią ścianę wolną od przedsionków, wykonując cięcie od linii środkowej poprzedniego cięcia # 3 do krawędzi prawego dolnego rogu RAA, spłaszcz i przypnij wolną ścianę przedsionka do dna komory pokrytej silikonem. Zobacz kierunek pokazany przez pustą strzałkę na rysunku 1A, wycięcie #4. Zachowaj obrzeże tkanki komorowej w celu przypięcia preparatu, aby zapobiec uszkodzeniu przedsionków.</li>
		<li>Podobnie, otwórz LA, przecinając MV wzdłuż górnego rogu wyrostka LA (LAA).</li>
		<li>Aby otworzyć LAA, przeciąć od środka otwartego LAA, przez przednią ścianę wolną przedsionka aż do blisko środkowej krawędzi LAA.</li>
		<li>Otwórz wolną ścianę przedsionka w tym samym kierunku, a następnie spłaszcz i przypnij ją do dna komory pokrytej Sylgardem.</li>
		<li>Częściowo usunąć tkankę przegrody międzyprzedsionkowej. Zmniejszy to rozpraszanie sygnału optycznego z tkanki, która nie jest ostra. Dlatego w tym preparacie dostępne są zarówno LA i RA, jak i SAN i połączenie przedsionkowo-komorowe (AVJ) (ryc. 1B).</li>
		<li>Podnieś końcowy preparat o około 0,5 mm od dna komory pokrytej silikonem, aby umożliwić superfuzję zarówno z powierzchni nasierdziowej, jak i wsierdziowej.</li>
		<li>Preparat należy rozlać z podgrzanym (37 °C) roztworem tyrodu ze stałą szybkością ~12 ml/min dla skoncentrowanego przepływu zlokalizowanego w pobliżu SVC i ~30 ml/min dla superfuzji w kąpieli.</li>
		<li>Umieść specjalnie wykonaną elektrodę Ag/AgCl2 (o średnicy 0.25 mm) na krawędzi wypreparowanego RAA. Następnie umieść dwie elektrody igłowe EKG 12 mm (29G) (monopolarne) w pobliżu odpowiednio RAA i LAA. Umieść uziemiającą elektrodę EKG w pobliżu AVJ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienia
	<ol>
		<li>Wykonaj bezpośrednią aplikację barwnika wrażliwego na napięcie (RH-237 lub di-4-ANNEPS). W tym celu należy rozcieńczyć 1-2 μl podstawowego roztworu barwnika w 1 mm ogrzanego (37 °C) roztworu tyrodu i powoli uwalniać rozcieńczony barwnik na powierzchni preparatu za pomocą pipety o średnicy 1 mm.</li>
		<li>Alternatywnie, należy wykonać barwienie przedsionków barwnikiem wrażliwym na napięcie przez perfuzję wieńcową serca z perfuzją Langendorffa, podobną do opisanej powyżej dla preparatu dla całego serca (kroki 2.2.1-2.2.2).
		<ol>
			<li>Po barwieniu perfuzji wieńcowej wyizolować preparat przedsionkowy zgodnie z opisem. W razie potrzeby wykonaj dodatkowe barwienie powierzchni, aby osiągnąć zadowalający poziom fluorescencji. Szybka izolacja przedsionków nie wybiela barwnika i nie wpływa na jakość barwienia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Unieruchomić preparat za pomocą elektromechanicznego rozłącznika, blebbistatyny. Rozcieńczyć 3-5 μl roztworu podstawowego bróbstatyny w podgrzanym (37 °C) roztworze Tyrode i powoli uwalniać rozcieńczoną blebbistatynę na powierzchni preparatu i otaczającego roztworu. Ponieważ wykazano, że bróbstatyna jest wrażliwa na światło,13,14 należy unikać długotrwałej ekspozycji na światło podczas przygotowywania i barwienia.</li>
		<li>Wykonaj dodatkową aplikację blabistatyny w takiej ilości, jaka jest potrzebna, aby stłumić skurcz. Zwykle można użyć do 3 dodatkowych aplikacji (3-5 μl na każdą aplikację), aby wystarczająco stłumić artefakt ruchu, aby dokładnie zrekonstruować aktywację SAN i przedsionkową.</li>
		<li>Dodać dodatkowe 0,5 ml podgrzanej blebbistatyny do perfuzatu. Podczas tej procedury należy wstrzymać superfuzję na 30 sekund, aby barwnik/bbistatyna mogły zabarwić tkankę przedsionkową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Konfiguracja mapowania optycznego
UWAGA: Szczegółowy opis systemu mapowania optycznego znajduje się w innym miejscu. 12
<ol>
	<li>Użyj kamery o rozdzielczości czasowej 2 000 klatek/s lub wyższej oraz serii obiektywów pojemnościowych, aby osiągnąć rozdzielczość przestrzenną 100 μm/piksel lub wyższą. Jest to wymagane do zrekonstruowania aktywacji sieci SAN i propagacji wewnątrzwęzłowej.</li>
	<li>Aby zredukować artefakt ruchu spowodowany wibrującym roztworem, przymocuj małą szklankę nakrywkową do powierzchni roztworu nad preparatem serca/izolowanego przedsionka.</li>
	<li>Stosować światło wzbudzenia (długość fali 520 ± 45 nm) dostarczane przez stałoprądową, niskoszumową lampę halogenową. Skieruj przefiltrowaną wiązkę światła na preparat za pomocą elastycznego, rozwidlonego światłowodu.</li>
	<li>Przefiltrować emitowaną fluorescencję przez filtr długoprzepustowy (>715 nm). Zbieraj, digitalizuj i zapisuj pozyskany sygnał fluorescencyjny na komputerze za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta kamery.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie danych
UWAGA: Dane mapowania optycznego są gromadzone i przechowywane jako seria matryc o natężeniu fluorescencji w różnych punktach czasowych. Każdy piksel reprezentuje miarę intensywności fluorescencji pobranej z określonego miejsca na preparacie tkankowym w określonym punkcie czasowym. Fluorescencja tła jest automatycznie usuwana na piksel, aby umożliwić lepszą wizualizację zmian fluorescencji wywołanych zmianami napięcia membrany i odwróconych tak, aby odpowiadały potencjałom czynnościowym (AP) mierzonym przez systemy mikroelektrod. Szczegółowe informacje na temat różnych etapów przetwarzania danych obrazowania optycznego, w tym segmentacji obrazu, filtrowania przestrzennego, filtrowania czasowego i usuwania dryfu linii bazowej, znajdują się w przeglądzie ukierunkowanym. 15
<ol>
	<li>Ręcznie lub przy użyciu specjalnego algorytmu (na przykład progowania lub wykrywania krawędzi)15 w celu określenia granic tkanek należy utworzyć maskę binarną o wymiarach 1 (uwzględnione piksele) i 0 (wykluczone piksele) i zastosować maskę do każdej klatki w sekwencji. Ten proces tworzy obraz binarny, który podświetla obszary zainteresowania do dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Aby poprawić stosunek sygnału do szumu danych optycznych, przefiltruj sygnały w wybranych obszarach zainteresowania. W tym celu należy zastosować filtrowanie przestrzenne (tj. uśrednianie sąsiednich pikseli fluorescencyjnych zdefiniowanych przez żądany pojemnik konwolucji lub jądro, na przykład 3 x 3 lub, w przypadku danych zaszumionych, 5 x 5) i/lub czasowe (na przykład Butterworth, Czebyszew typ 1, Czebyszew typ 2, Eliptyczny itp.) (Rysunek 2). Należy pamiętać o możliwości wystąpienia artefaktów wywołanych filtrowaniem podczas interpretowania danych. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz recenzję. 15</li>
	<li>W razie potrzeby usuń dryft linii bazowej w nagraniach optycznych (za pomocą filtrowania górnoprzepustowego lub dopasowania wielomianu do oryginalnego sygnału), a następnie znormalizuj każdy sygnał piksela od 0 (minimalna fluorescencja) do 1 (maksymalna fluorescencja).</li>
	<li>Wybierz okno czasowe, które obejmuje czasy aktywacji wszystkich pikseli dla pojedynczej propagacji punktu dostępowego. Przypisz każdemu pikselowi czas aktywacji jako czas maksymalnej pochodnej skoku w górę (dF/dtmax, gdzie F to intensywność fluorescencji). Korzystając ze wszystkich czasów aktywacji pikseli, zrekonstruuj mapę aktywacji izochronicznej. Każdy izochron pokaże więc piksele aktywowane w tym samym czasie.</li>
	<li>Aby zrekonstruować mapę rozkładu czasu trwania AP (APD), dla każdego piksela oblicz czas trwania między czasem aktywacji a czasem na określonym poziomie repolaryzacji (na przykład przy 80% repolaryzacji, APD80). Korzystając ze wszystkich wartości APD pikseli, zrekonstruuj mapę izoochronną rozkładu APD. Każdy izochron pokaże więc piksele o tym samym APD.</li>
	<li>Aby obliczyć prędkość przewodzenia dla propagacji AP, należy dopasować powierzchnię preparatu do danych dotyczących czasu aktywacji obliczonych w ppkt 5.4. W tym celu należy użyć wielomianowego dopasowania powierzchni lub lokalnego wygładzenia powierzchni jądra, a następnie obliczyć lokalne wektory prędkości przewodzenia na podstawie gradientu dopasowanej powierzchni.</li>
	<li>Aby utworzyć mapę repolaryzacji, przypisz każdemu pikselowi czas repolaryzacji, zdefiniowany jako maksymalna druga pochodna (d2F/dt2) sygnału optycznego na końcu OAP lub czas 90% repolaryzacji.</li>
</ol>

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circ Res. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduction+barriers+and+pathways+of+the+sino-atrial+pacemaker+complex%3A+their+role+in+normal+rhythm+and+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2012).</li>
<li>Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sinoatrial+node%2C+a+heterogeneous+pacemaker+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure.</a> Cardiovasc Res. 47 (4), 658-687 (2000).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinoatrial+Node+Reentry+in+a+Canine+Chronic+Left+Ventricular+Infarct+Model%3A+The+Role+of+Intranodal+Fibrosis+and+Heterogeneity+of+Refractoriness%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Arrhythm+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness.</a> Circ Arrhythm Electrophysiol. , (2013).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex.</a> Eur Heart J. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>John, R. M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinus+Node+and+Atrial+Arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Sinus Node and Atrial Arrhythmias.</a> Circulation. 133 (19), 1892-1900 (2016).</li>
<li>Swaminathan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+CaMKII+causes+cardiac+sinus+node+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice.</a> J Clin Invest. 121 (8), 3277-3288 (2011).</li>
<li>Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+the+murine+sinus+node%3A+high-resolution+optical+mapping+of+ankyrin-B+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299 (2), H482-H491 (2010).</li>
<li>Egom, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+sinoatrial+node+function+and+increased+susceptibility+to+atrial+fibrillation+in+mice+lacking+natriuretic+peptide+receptor+C%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C.</a> J Physiol. 593 (5), 1127-1146 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> J Vis Exp. (55), e3275(2011).</li>
<li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
<li>Swift, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+blebbistatin+for+cardiac+optical+mapping+and+other+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications.</a> Pflugers Arch. 464 (5), 503-512 (2012).</li>
<li>Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analysis+of+cardiac+optical+mapping+data+obtained+with+potentiometric+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (7), H753-H765 (2012).</li>
<li>Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organisation+of+the+mouse+sinoatrial+node%3A+structure+and+expression+of+HCN+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels.</a> Cardiovasc Res. 73 (4), 729-738 (2007).</li>
<li>Verheijck, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+features+of+the+mouse+sinoatrial+node+in+relation+to+connexin+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution.</a> Cardiovasc Res. 52 (1), 40-50 (2001).</li>
<li>Krishnaswamy, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+parasympathetic+nervous+system+regulation+of+the+sinoatrial+node+in+Akita+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice.</a> J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).</li>
<li>Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+action+potential+durations+in+isolated+mouse+left+and+right+atria+recorded+using+voltage-sensitive+dye+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2634-H2643 (2004).</li>
<li>Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cardiac+pacemaker+circuits%3A+methodological+puzzles+of+the+sinoatrial+node+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping.</a> Circ Res. 106 (2), 255-271 (2010).</li>
<li>Aschar-Sobbi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+atrial+arrhythmia+susceptibility+induced+by+intense+endurance+exercise+in+mice+requires+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha.</a> Nat Commun. 6, 6018(2015).</li>
<li>Hansen, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+driven+by+micro-anatomic+intramural+re-entry+revealed+by+simultaneous+sub-epicardial+and+sub-endocardial+optical+mapping+in+explanted+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts.</a> Eur Heart J. 36 (35), 2390-2401 (2015).</li>
<li>Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+heart+rate+in+a+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrocardiol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart.</a> J Electrocardiol. 44 (6), 626-634 (2011).</li>
<li>Kanlop, N., Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+study+of+blebbistatin-induced+chaotic+electrical+activities+in+isolated+rat+atrium+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations.</a> J Physiol Sci. 60 (2), 109-117 (2010).</li>
<li>Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 152-160 (2010).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sinoatrial+node+function+and+intra-atrial+conduction+in+murine+gain-of-function+Scn5a%2B%2FDeltaKPQ+hearts+suggest+an+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).</li>
</ol>

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

W tym artykule przedstawiono dwa rodzaje mysich preparatów SAN: 1) nienaruszony SAN w całym sercu z perfuzją Langendorffa oraz 2) SAN w izolowanym, otwartym preparacie przedsionkowym. Te dwa rodzaje preparatów służą różnym celom eksperymentalnym. W preparacie całego serca z perfuzją Langendorffa zachowana jest nienaruszona struktura przedsionkowa, co umożliwia badanie złożonych zaburzeń rytmu serca, takich jak migotanie przedsionków, a także interakcji między SAN a przedsionkiem podczas nawentnych tachyarytmii. 6</s...

Nowatorskie przełomy naukowe, które prowadzą do skoków w zrozumieniu ludzkiej fizjologii, są często poprzedzone postępem technologicznym. Na przykład fluorescencyjne mapowanie optyczne umożliwia badanie wielu parametrów fizjologicznych zarówno w komórkach, jak i tkankach. 1,2 Znacząco poszerzyło to naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób struktura anatomiczna jest powiązana z funkcjami i dysfunkcjami elektrofizjologicznymi. W sercu naturalny rozrusznik serca i układy przewodzenia, takie jak węzeł zatokowo-przedsionkowy (SAN) i połączenie przedsionkowo-komorowe, składają się z miocytów węzłowych, które są izolowane przez otaczające miocyty przedsionkowe. 3-5 Taka organizacja tworzy złożone trójwymiarowe struktury o wyspecjalizowanych właściwościach elektrycznych. Uznano, że zarówno strukturalna, jak i funkcjonalna przebudowa tych struktur rozrusznika serca tworzy znaczące niejednorodności elektrofizjologiczne. 6,7 Zrozumienie mechanizmu leżącego u podstaw tego, w jaki sposób takie heterogenności skutkują dysfunkcjami SAN i arytmogenezą przedsionków, przyniesie ogromne korzyści w klinicznym leczeniu tych chorób. Wymaga techniki wizualizacji propagacji sygnałów elektrycznych na poziomie tkanki, takiej jak mapowanie optyczne. 
Ostatnio, coraz więcej dowodów dowiodło postępu mapowania optycznego w badaniach nad elektrofizjologią i patologią przedsionków. 2 Jednak nowatorskie i rygorystyczne badania zależą od dokładnej interpretacji danych eksperymentalnych, których ważność i stabilność zależą od starannych protokołów eksperymentów. Genetycznie zmodyfikowane myszy są szeroko wykorzystywane do badań jako modele zwierzęce chorób ludzkich, w tym zespołu chorej zatoki, nieprawidłowości rozrusznika serca i arytmii przedsionków. 6,8-11 Tak więc połączenie fluorescencyjnego mapowania optycznego z transgenicznymi modelami myszy stanowi potężne narzędzie do badania nieprawidłowości elektrycznych serca związanych z różnymi patologiami. W tym artykule przedstawiono protokół do optycznego mapowania myszy w wysokiej rozdzielczości sieci SAN i atrium. W szczególności omawiamy i porównujemy różne podejścia do ładowania barwnika, wpływ czasu na wybielanie barwnika i stabilność tętna podczas eksperymentu.

<table><tbody><tr><td>Płaszcz wodny</td><td>Kąpiel tkankowa serii Radnoti</td><td>1660 do procedur izolacji dużych narządów lub pojedynczych komórek Kąpiel</td><td></td></tr><tr><td>wodna / cyrkulator</td><td>Wzmacniacz ciśnienia Fisher Scientific</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>Filtry z siatki nylonowej EMD Millipore</td><td>Przetwornik ciśnienia Fisher Scientific</td><td>NY1102500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>AD Instrumenty</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>Kołki minutienne ze stali nierdzewnej - średnica 0,1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td> Pompa do superfuzji <td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki do Tubingen&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont</td><td>World Precision Instruments</td><td>501201, 500085</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo</td><td>World Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne Kelly</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>501241</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do tęczówki</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Iris nożyczki</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>elektrody igłowe EKG 12 mm (29 rozmiarów) (monopolarne)&nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>liniowy port wtrysku Luer</td><td>Kamera CMOS Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L&nbsp;</td><td>SciMedia</td><td>MiCAM-05&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Żarówka halogenowa</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Dysfunkcje węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) i związane z nimi powikłania stanowią ważne przyczyny zachorowalności u pacjentów z chorobami serca. Opracowanie nowatorskich terapii farmakologicznych w celu wyleczenia tych pacjentów opiera się na dokładnym zrozumieniu zarówno normalnej fizjologii, jak i patofizjologii SAN. Wśród badań nad rozrusznikiem serca, mysi SAN jest szeroko stosowany ze względu na jego możliwość modyfikacji ekspresji różnych genów kodujących kanały jonowe SAN lub białka przenoszące wapń. Pojawiające się dowody z badań elektrofizjologicznych i histologicznych dowiodły również reprezentatywności i podobieństwa struktury i funkcji SAN myszy do większych ssaków, w tym obecności wyspecjalizowanych szlaków przewodzenia z SAN do przedsionka oraz złożonej hierarchii rozruszników serca w SAN. Ostatnio technika mapowania optycznego znacznie ułatwiła eksplorację i badanie pochodzenia wzbudzenia i przewodzenia w obrębie i z mysiego SAN, co z kolei poszerzyło wiedzę na temat SAN i przyniosło korzyści w klinicznym leczeniu chorób związanych z dysfunkcją SAN. W tym manuskrypcie opisaliśmy szczegółowo, jak wykonać mapowanie optyczne myszy SAN z nienaruszonego, perfundowanego Langendorffem serca oraz z izolowanego preparatu przedsionkowego. Protokół ten jest użytecznym narzędziem do lepszego zrozumienia fizjologii i patofizjologii SAN myszy.

Mapowanie optyczne nienaruszonego węzła SAN z serca perfundowanego metodą Langendorffa 
Typowy przykład mapy konturowej aktywacji RA zrekonstruowanej dla spontanicznego rytmu zatokowego przedstawiono na Rysunku 3 dla serca myszy perfundowanego metodą Langendorffa. Wczesny punkt aktywacji znajduje się w obszarze międzyzatokowym w pobliżu SVC, gdzie anatomicznie zlokalizowany jest SAN.3,16 Dwie mapy konturowe aktywacji RA pozyskane przy często...

Tutaj prezentujemy protokół optycznego mapowania aktywności elektrycznej z prawego przedsionka myszy, a zwłaszcza węzła zatokowo-przedsionkowego, w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu eksperymentalnego jest przeprowadzenie mapowania optycznego węzła zatokowo-przedsionkowego myszy z nienaruszonego serca perfundowanego metodą Langendorffa lub z izolowanego preparatu przedsionków. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu elektrofizjologii i patofizjologii węzła zatokowo-przedsionkowego dotyczące mechanizmów nieprawidłowości pracy rozrusznika, zespołu chorego zatoku oraz różnych chorób związanych z arytmiami przedsionkowymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badanie wielu parametrów w nienaruszonych tkankach z bardzo wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu znieczulenia za pomocą testu ucisku palców, należy użyć zakrzywionych nożyc Mayo 5,5 cala oraz kleszczyków hemostatycznych Kelly 5,5 cala, aby wykonać nacięcie o długości jednego centymetra na przedniej części klatki piersiowej. Używając zakrzywionego pęsety Iris 4 cale, należy szybko chwycić tkankę płucną, a następnie za pomocą nożyczek Iris 4/3 cala wyciąć wspólnie płuca, grasicę i serce wraz z osierdziem. Tkanki należy przemyć w natlenionym zmodyfikowanym roztworze Tyrode'a o temperaturze 3

high-resolution-optical-mapping-of-the-mouse-sino-atrial-node

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Niniejszy raport zawiera szczegółowy opis metodologii i wyników jednoczesnego endokardialnego i epikardialnego mapowania optycznego wzbudzenia elektrycznego w nienaruszonym lewym przedsionku serca owczego perfundowanego metodą Langendorffa podczas indukowanego rozciąganiem migotania przedsionków.

Optyczne mapowanie wysokiej rozdzielczości wsierdzia i osierdzia w owczym modelu migotania przedsionków wywołanego rozciąganiem

Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).

Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Ten film pokazuje procedurę izolacji węzła zatokowo-przedsionkowego lub SAN od serca myszy. SAN mieści komórki zatokowo-przedsionkowe, które inicjują bicie serca poprzez generowanie spontanicznych potencjałów czynnościowych.

Izolacja węzła zatokowo-przedsionkowego z modelu mysiego: procedura zbierania węzła SA z mysiego serca

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

Udostępniamy krok po kroku protokół barwienia immunofluorescencyjnego całego węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) i węzła przedsionkowo-komorowego (AVN) u mysich serc.

Barwienie immunofluorescencyjne w całości mount, obrazowanie konfokalne i rekonstrukcja 3D węzła zatokowo-przedsionkowego i przedsionkowo-komorowego u myszy

Ten protokół ma na celu opisanie nowej metodologii pomiaru wewnętrznej szybkości wypalania serca za pomocą rejestracji matrycy mikroelektrod całej tkanki węzła zatokowo-przedsionkowego w celu identyfikacji wad rozrusznika serca u myszy. W tej metodzie można również wprowadzić środki farmakologiczne, aby zbadać ich wpływ na wewnętrzne rozruszniki serca.

Rejestracja szybkości wypalania węzłów zatokowo-przedsionkowych za pomocą matrycy mikroelektrod w celu identyfikacji wewnętrznych wad rozrusznika serca u myszy

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Poznaj metodę mapowania optycznego węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości przestrzenniej i czasowej. Technika Langendorffa umożliwia badanie mechanizmów arytmii i zespołu chorej zatoki.

Mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów