Mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości

Ogólnym celem niniejszego protokołu eksperymentalnego jest przeprowadzenie mapowania optycznego węzła zatokowo-przedsionkowego myszy z nienaruszonego serca perfundowanego metodą Langendorffa lub z izolowanego preparatu przedsionków. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu elektrofizjologii i patofizjologii węzła zatokowo-przedsionkowego dotyczące mechanizmów nieprawidłowości pracy rozrusznika, zespołu chorego zatoku oraz różnych chorób związanych z arytmiami przedsionkowymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badanie wielu parametrów w nienaruszonych tkankach z bardzo wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu znieczulenia za pomocą testu ucisku palców, należy użyć zakrzywionych nożyc Mayo 5,5 cala oraz kleszczyków hemostatycznych Kelly 5,5 cala, aby wykonać nacięcie o długości jednego centymetra na przedniej części klatki piersiowej. Używając zakrzywionego pęsety Iris 4 cale, należy szybko chwycić tkankę płucną, a następnie za pomocą nożyczek Iris 4/3 cala wyciąć wspólnie płuca, grasicę i serce wraz z osierdziem. Tkanki należy przemyć w natlenionym zmodyfikowanym roztworze Tyrode'a o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie za pomocą zakrzywionych trzystopniowych nożyczek Vannasa Tubingen oraz czter czwartych calowych pęsety numer pięć usuń płuca, grasicę i tkankę tłuszczową z serca. Dalej, używając specjalnie wykonanej kaniuli 21G oraz dwóch zakrzywionych 4,3-calowych pęset B numer pięć, zakaniuluj aortę, jednocześnie przeprowadzając perfuzję i superperfuzję serca roztworem Tyrode o temperaturze 37 °C, kierując roztwór przez liniowy nylonowy filtr 11 µm przed perfuzją, aby zapobiec zapchaniu krążenia wieńcowego. Następnie podłącz przetwornik ciśnienia do zaworu Luer lock na linii perfuzyjnej za pomocą kurka trójdrożnego w celu monitorowania ciśnienia w aorcie, dostosowując prędkość perfuzji tak, aby utrzymać ciśnienie aortalne w zakresie od 60 do 80 mmHg w razie potrzeby.

Aby przeprowadzić mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego z serca perfundowanego metodą Langendorffa, umieść organ w orientacji poziomej stroną tylną do góry w szklanej komorze do kąpieli tkankowej i użyj szpilek o średnicy 0,1 mm, aby przymocować wierzchołek komory do pokrytego silikonem dna komory, co zapobiegnie ruchom wywołanym przez strumień podczas eksperymentu. Wprowadź małą rurkę silikonową do lewej komory poprzez żyłę płucną, lewy przedsionek i zastawkę mitralną, a następnie użyj szwu jedwabnego 40 do przymocowania rurki do otaczającej tkanki łącznej. Następnie użyj kolejnego szwu jedwabnego 40, aby zacisnąć pętlę na żyłach głównej górnej i dolnej oraz przymocuj krawędź uszka prawego przedsionka do dna komory.

Rozciągnij i przypnij drugi koniec szwu do dna komory, a następnie umieść wykonaną na zamówienie elektrodę stymulującą na krawędzi prawego przedsionka. Następnie umieść dwie jednobiegunowe elektrody igłowe do elektrokardiogramu o długości 12 milimetrów w pobliżu podstawy prawej i lewej komory, a elektrodę uziemiającą do elektrokardiogramu umieść w pobliżu wierzchołka komory. Aby zbarwić tkankę, wstrzyknij rozcieńczony barwnik do portu perfuzyjnego w linii perfuzji wieńcowej, tak aby podawanie trwało od pięciu do siedmiu minut.

Po 20 minutach stabilizacji dodać 0,5 mililitra blebbistatyny o temperaturze 37 °C do perfuzatu, a następnie wstrzyknąć 0,1 mililitra blebbistatyny rozcieńczonej w 1 mililitrze roztworu Tyrode'a o temperaturze 37 °C do linii perfuzji wieńcowej w ciągu kolejnych pięciu do siedmiu minut, używając przelotowego portu wtryskowego z zatrzaskiem Luer lock. Blebbistatynę należy stosować ostrożnie. Aby zapobiec wytrącaniu się inhibitora, najpierw rozpuścić blebbistatynę w medium ogrzanym do temperatury 37 °C i energicznie wymieszać roztwór.

Aby przeprowadzić mapowanie optyczne próbki, najpierw przymocuj małe szkiełko nakrywkę do powierzchni roztworu nad tkanką, aby zredukować artefakty ruchowe wynikające z wibracji roztworu. Następnie, używając elastycznego rozwidlonego światłowodu z światłem wzbudzenia dostarczanym przez niskoszumową lampę halogenową o stałym prądzie, skieruj filtrowaną wiązkę światła na tkankę i zarejestruj obraz otrzymanego sygnału fluorescencyjnego. Po kaniulacji serca, przeprowadzonej w sposób zaprezentowany powyżej, odseparuj komory od strony przedniej i otwórz prawy przedsionek przez zastawkę trójdzielną wzdłuż osi żyły głównej górnej i zastawki trójdzielnej, a następnie wykonaj nacięcie przez końcówkę przyśrodkową grzebienia końcowego (crista terminalis).

Aby otworzyć przednią ścianę wolną przedsionka, należy wykonać nacięcie od linii środkowej nacięcia kończyny przyśrodkowej do krawędzi prawego dolnego rogu uszka prawego przedsionka, a następnie przypiąć spłaszczoną ścianę wolną przedsionka do dna komory pokrytej silikonem. Aby otworzyć uszko lewego przedsionka, należy przeciąć zastawkę mitralną wzdłuż górnego rogu zastawki mitralnej uszka lewego przedsionka. Następnie należy przypiąć otwarty lewy przedsionek w taki sam sposób, w jaki zrobiono to wcześniej w przypadku prawego przedsionka.

Następnie częściowo usuń tkankę komór. Zachowaj obwód tkanki komór do przypięcia preparatu, aby zapobiec uszkodzeniu przedsionków, i przypnij tkankę do dna komory pokrytej Sylgardem. Teraz unieś końcowy preparat o około 0,5 milimetra od dna komory pokrytej silikonem, aby umożliwić superfuzję zarówno z powierzchni epikardialnej, jak i endokardialnej, a następnie poddaj próbkę superfuzji roztworem Tyrode o temperaturze 37 °C.

Następnie umieść wykonaną na zamówienie elektrodę stymulującą z chlorku srebra na krawędzi wypreparowanego prawego uszka przedsionka. Umieść jedną jednobiegunową elektrodę igłową do EKG o długości 12 mm w pobliżu prawego i lewego uszka przedsionka, a elektrodę uziemiającą do EKG umieść w pobliżu połączenia przedsionkowo-komorowego. Aby zabarwić tkankę serca, użyj pipety 1 mm, aby powoli nanieść barwnik wrażliwy na napięcie rozcieńczony w roztworze Tyrode'a o temperaturze 37 °C bezpośrednio na tkankę.

Następnie unieruchom próbkę poprzez bezpośrednie naniesienie rozcieńczonej blebbistatyny na tkankę, a następnie podaj kolejne 0,5 ml blebbistatyny za pośrednictwem perfuzatu i przeprowadź mapowanie optyczne próbki zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Etapy barwienia tkanek oraz hamowania blebbistatyną są krytyczne i wymagają dokładnej realizacji oraz precyzyjnej procedury barwienia, aby parametry fizjologiczne przedsionków, w tym częstotliwość akcji serca, lokalizacja wiodącego rozrusznika oraz przewodzenie w przedsionkach, nie zostały zaburzone. Poniżej przedstawiono typową mapę konturową aktywacji prawego przedsionka zrekonstruowaną dla spontanicznego rytmu zatokowego w sercu myszy perfundowanym metodą Langendorffa, wraz z dwiema odpowiadającymi mapami konturowymi prawego przedsionka uzyskanymi przy częstotliwości próbkowania 1 oraz 0,5 ms.

Wczesny punkt aktywacji znajduje się w obszarze międzyżyłowym w pobliżu żyły głównej górnej, gdzie anatomicznie zdefiniowany jest węzeł zatokowo-przedsionkowy. W tym eksperymencie, po stymulacji przedsionka prawego przez co najmniej jedną minutę z częstotliwością od 10 do 12 Hz, przerwano stymulację elektryczną, a czas regeneracji węzła zatokowo-przedsionkowego obliczono jako odstęp czasowy pomiędzy ostatnim wywołanym potencjałem czynnościowym a pierwszym spontanicznym potencjałem czynnościowym. Aktywacja izolowanego preparatu przedsionków podczas spontanicznego rytmu zatokowego pozwala na precyzyjną identyfikację lokalizacji wiodącego rozrusznika.

Jeśli procedury chirurgiczne oraz ładowania barwnika zostaną przeprowadzone prawidłowo, nie powinny zostać zaobserwowane żadne istotne zmiany w charakterystyce fizjologicznej przedsionka. Chociaż barwienie tętnicze może wymagać większej ilości barwnika, sygnał fluorescencyjny w tkance obszaru węzła zatokowo-przedsionkowego wydaje się być bardziej stabilny przy tej metodzie ładowania, a czas zaniku intensywności sygnału po barwieniu wieńcowym jest niemal dwukrotnie dłuższy niż po barwieniu powierzchniowym. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać ukończona w 30–40 minut.

Podczas wykonywania tej procedury należy starannie zlokalizować anatomię przedsionków przed wykonaniem cięcia, aby uniknąć uszkodzenia tkanki przedsionkowej oraz węzła zatokowego. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne pomiary, takie jak konwencjonalne rejestracje za pomocą szklanych elektrod mitralnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące charakterystyki komutatywnych potencjałów błonowych. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie fizjologii intelektualnej do zgłębiania arytmii przedsionkowych, w tym dysfunkcji węzła zatokowego w sercu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania wysokorozdzielczego mapowania optycznego preparatu węzła zatokowego myszy.