Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)
1 grudnia 2016
Przedstawiamy protokół zastosowania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM), 3-wymiarowej metody mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w super rozdzielczości, do obrazowania cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków. Takie podejście umożliwia opartą na świetle wizualizację cech strukturalnych w nanoskali, które w przeciwnym razie pozostałyby nierozwiązane przez konwencjonalną mikroskopię optyczną z ograniczoną dyfrakcją.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków na poziomie ultrastrukturalnym, przy użyciu trójwymiarowej metody mikroskopii super rozdzielczości o nazwie iPALM. Obrazowanie iPALM zapewnia rozdzielczość przestrzenną poniżej trendu nanometrowego we wszystkich trzech wymiarach. Umożliwia to wizualizację ultrastruktur za pomocą sond fluorescencyjnych, co pozwala na wysoką specyficzność znakowania.
Procedura przedstawiona w tym filmie powinna być szybko adaptowalna i pouczająca w zakresie wizualizacji innych cech ultrastrukturalnych w komórkach poprzez lokalizację pojedynczej cząsteczki w oparciu o mikroskopię superrozdzielczości. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania komórek na szkiełkach nakrywkowych na płytce sześciodołkowej. Aby złożyć próbkę do obrazowania, użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie usunąć szkło nakrywkowe próbki ze studzienki buforowej.
Następnie szybko i delikatnie stuknij nadmiar bufora, dotykając krawędzi szkła nakrywkowego złożonym, chłonnym papierem. Umieść szklaną osłonę komórką skierowaną do góry na kawałku czystego papieru do soczewek. Przepłukać próbkę, umieszczając na niej od 30 do 50 mikrolitrów buforu do obrazowania.
Usunąć nadmiar bufora, przechylając i stukając złożonym papierem chłonnym. Po kilkukrotnym powtórzeniu etapu płukania umieścić na próbce od 30 do 50 mikrolitrów buforu do obrazowania. Osusz krawędź szkła nakrywkowego i umieść wiele bardzo małych kropek szybko utwardzającej się żywicy epoksydowej na wysuszonym obszarze.
Powoli opuść kolejną wstępnie oczyszczoną szklankę nakrywkową numer 1.5 na środek celi zawierającej 22-milimetrową szklaną pokrywę. Pozwól, aby bufor obrazowania zwilżył oba szkła nakrywkowe przez działanie kapilarne. Małe kropki szybko utwardzającej się żywicy epoksydowej powinny przylegać do obu szkieł nakrywkowych.
Delikatnie dociśnij zmontowaną próbkę za pomocą złożonego papieru chłonnego, aby równomiernie rozłożyć nacisk. Użyj wystarczającego nacisku, aby cela próbki była cienka i równa, ale nie na tyle, aby zmiażdżyć komórki. Zmierz odpowiednią grubość, obserwując wzór pierścieni Newtona.
Upewnij się, że wykonujesz ten krok delikatnie, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza. W razie potrzeby poćwicz wcześniej kilka razy z pustymi okularami nakrywkowymi. Następnie zamknij próbkę stopioną wazeliną, parafiną lanolinową.
Następnie spłucz zapieczętowaną próbkę wodą dejonizowaną. Wysuszyć próbkę sprężonym powietrzem, aby była gotowa do zamontowania na mikroskopie. Przesuń sprężynową górną soczewkę obiektywu do góry, aby umożliwić wyjęcie uchwytu na próbkę.
Umieść zapieczętowaną próbkę na uchwycie próbki i zabezpiecz kilkoma małymi magnesami z metali ziem rzadkich. Nałóż olejek immersyjny po obu stronach próbki obrazowej. Umieść uchwyt próbki z powrotem w torze optycznym i delikatnie opuść górną soczewkę obiektywu.
Włącz lasery wzbudzające. Włącz także kamery EMCCD w trybie transferu klatek. Następnie należy obrócić odpowiednie filtry emisyjne.
Aktywuj migawkę mechaniczną, aby zablokować ścieżkę górnej belki i otworzyć ścieżkę dolnej belki. Ustaw ostrość na dolnej soczewce obiektywu poprzez przesuwanie w małych krokach za pomocą siłownika piezoelektrycznego. Gdy odniesienie jest już ostre, otwórz górną ścieżkę wiązki, blokując jednocześnie ścieżkę dolnej wiązki i ustaw ostrość górnej soczewki obiektywu w podobny sposób.
Monitoruj szerokość powiernika na wyświetlaczu komputera, aby uzyskać optymalną ostrość. Aby zapewnić prawidłowe centrowanie, otwórz zarówno górną, jak i dolną ścieżkę belki. Ręcznie wyreguluj górną soczewkę obiektywu, podczas gdy dolny obiektyw jest utrzymywany na stałym poziomie za pomocą pary mikrodrobnych ustalających, aż obrazy odniesienia nałożą się na siebie tak blisko, jak to możliwe, najlepiej w obrębie jednego piksela.
Następnie należy dokonać precyzyjnych korekt, tak aby obrazy referencyjne nakładały się na siebie w odległości jednej dziesiątej piksela EMCCD. Wyreguluj dwugórne zwierciadła piezoelektryczne za pomocą oprogramowania sterującego, utrzymując obie soczewki obiektywu i dolne lustra odbijające na stałym poziomie. Porównaj środki powierników górnego i dolnego widoku obiektywu za pomocą wyświetlacza komputera, aby pokierować procesem.
Przy włączonych laserach, kamerach stale przesyłających strumieniowo, a zarówno górna, jak i dolna ścieżka wiązki są otwarte, oscylują uchwyt próbki Z piezoelektryczny za pomocą sinusoidalnego przebiegu napięcia generowanego przez oprogramowanie sterujące dla ciągłej oscylacji osi Z o wielkości 400 nanometrów. Ręcznie przesuń zmotoryzowany zespół rozdzielacza wiązki w górę lub w dół, aż intensywność oscylacji odniesienia. Ze względu na pożądany efekt interferencji pojedynczych fotonów, oznacza to ścisłe dopasowanie długości ścieżek optycznych.
W optymalnych przypadkach można osiągnąć stosunek piku do doliny większy niż 10. Aby upewnić się, że zarówno amplituda, jak i faza na każdej powierzchni są tak jednolite, jak to możliwe w całym polu, wyreguluj dolne lustro zespołu rozdzielacza wiązki małymi krokami, aby precyzyjnie dostroić szczelinę i kąty nachylenia. Wykonaj dokładne wyrównanie rozdzielacza wiązki, przesuwając próbkę w krokach co osiem nanometrów Z na ponad 800 nanometrach.
Monitoruj intensywność odniesienia między kamerami od pierwszej do trzeciej. Dostosuj wysokość, położenie i nachylenie dolnego lustra w zespole rozdzielacza wiązki małymi krokami, tak aby faza oscylacji pierwszej kamery względem drugiej kamery była zmaksymalizowana, najlepiej pod kątem 120 stopni. Po zakończeniu wstępnego wyrównania przetłumacz próbkę na skanowanie w poszukiwaniu odpowiedniego pola widzenia, które zawiera zarówno komórki do obrazu, jak i wiele powierników w pobliżu.
Umieść obudowę wokół systemu, aby zablokować rozproszone światło i zakłócenia otoczenia. Po znalezieniu obszaru obrazowania należy ponownie przesunąć próbkę i zapisać krzywą kalibracyjną do wykorzystania w kolejnych ekstrakcjach współrzędnych Z. Za pomocą polecenia uzyskaj skany kalibracyjne w porównaniu z pozycją piezoelektryczne próbki w głównym interfejsie.
Po znalezieniu żądanego obszaru i uzyskaniu krzywej kalibracyjnej wprowadź odpowiednie nazwy plików do oprogramowania. Otwórz zarówno górną, jak i dolną ścieżkę wiązki, a następnie zwiększ moc wzbudzenia lasera o długości 642 nanometrów do maksimum. W przypadku Alexa Fluor 647 może być konieczny początkowy okres wyłączenia Fluor-4.
Eksponować ze stałym wzbudzeniem 642 nanometrów przez pięć minut lub dłużej, jeśli to konieczne, aż do zaobserwowania mrugania pojedynczej cząsteczki. Oprogramowanie pozwala na automatyczne zwiększenie fotoaktywacji o 405 nanometrów w trakcie akwizycji. Aby elementy nitkowate były wyraźnie widoczne, zwykle wymagana jest duża liczba ramek akwizycji.
Gdy wszystko będzie gotowe, rozpocznij akwizycję zestawów obrazów RAW za pomocą polecenia uruchom akwizycję iPALM w głównym interfejsie. Podczas akwizycji dostosuj poziom aktywacji zdjęcia, dostosowując intensywność lasera 405 nanometrów, aby w razie potrzeby utrzymać odpowiednią gęstość mrugania. Gdy szkiełko nakrywkowe próbki jest prawidłowo zmontowane, pierścienie Newtona można obserwować gołym okiem w świetle otoczenia lub standardowym oświetleniu fluorescencyjnym.
Ekstrakcja pozycji osiowych emiterów fluorescencji wymaga jednoczesnej wielofazowej interferencji w obrazowaniu iPALM, która jest kalibrowana przez zmiany intensywności danego odniesienia w trzech EMCCD. Intensywności są następnie normalizowane i dopasowywane do określenia różnic fazowych. Oto rekonstrukcyjny obraz iPALM z każdą współrzędną lokalizacji renderowaną przez Gaussa 2D o szerokości odpowiadającej niepewności lokalizacji.
Współrzędna Z jest kolorowana zgodnie z paskiem kolorów. Widoczne są obszary o gęstych i rzadkich nitkowatych cechach. Pokazano tutaj obrazy rekonstrukcyjne iPALM cytoszkieletu aktynowego komórek HUVEC oznaczonych falloidyną Alexa Fluor 647.
Kolor obrazu wskazuje współrzędne Z zgodnie z paskiem kolorów. Histogram przekroju poprzecznego jest generowany na podstawie współrzędnych lokalizacji XY wzdłuż długiej osi obszaru ramkowego. Dopasowanie Gaussa pokazuje pełną szerokość w połowie maksimum 43,88 nanometra związanego z przekrojem poprzecznym.
Ten histogram przedstawia pozycję Z współrzędnych lokalizacji w obszarze obramowanym. Dopasowanie Gaussa pokazuje pełną szerokość przy połowie maksimum 17,50 nanometra. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 90 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak wizualizować cytoszkielet aktynowy w ultrastrukturze za pomocą iPALM poprzez proste przygotowanie i montaż, wyrównanie optyczne, akwizycję surowych danych i późniejszą analizę w celu rekonstrukcji obrazów o super rozdzielczości. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaniom w dziedzinie biologii komórki w celu zbadania architektury cytoszkieletu aktynowego w nanoskali, a także struktur adhezyjnych komórek, takich jak zrosty ogniskowe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wykorzystania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM) do wizualizacji cytoszkieletu aktynowego w adherentnych komórkach ssaków. Metoda ta umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości struktur w skali nanometrycznej, które zazwyczaj nie są widoczne przy użyciu konwencjonalnych technik mikroskopowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopowe
Wstęp
- Cytościan aktynowy odgrywa kluczową rolę w strukturze i funkcji komórki.
- Konwencjonalne metody mikroskopowe są ograniczone przez dyfrakcję.
- Techniki superrozdzielczości umożliwiają zwiększenie możliwości obrazowania.
- iPALM zapewnia obrazowanie trójwymiarowe z rozdzielczością nanometrową.
Cel badania
- Wizualizacja cytoszkieletu aktynowego na poziomie ultrastrukturalnym.
- Zaprezentowanie możliwości adaptacji techniki iPALM do obrazowania różnych struktur komórkowych.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dla badaczy z tej dziedziny.
Zastosowane metody
- Przygotowanie adherentnych komórek ssaków na szkiełkach podstawowych.
- Zastosowanie sond fluorescencyjnych w celu uzyskania wysokiej specyficzności znakowania.
- Wykorzystanie precyzyjnej pęsety do manipulacji próbkami.
- Zastosowanie techniki iPALM do obrazowania z rozdzielczością nanometryczną.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja cytoszkieletu aktynowego w trzech wymiarach.
- Wykazanie wysokiej rozdzielczości przestrzennej w obrazowaniu struktur komórkowych.
- Protokół jest możliwy do dostosowania do innych cech ultrastrukturalnych.
- Osiągnięcie wysokiej specyficzności znakowania przy użyciu sond fluorescencyjnych.
Wnioski
- iPALM jest skuteczną metodą badania cytoszkieletu aktynowego.
- Protokół ten można zastosować w różnych potrzebach obrazowania komórkowego.
- To podejście pogłębia naszą wiedzę na temat ultrastruktury komórkowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wizualizacja cytoszkieletu aktynowego w rozdzielczości nanometrowej umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celu poprzez ujawnienie dynamiki strukturalnej regulatorów cytoszkieletu. Wspiera to pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków, łącząc architekturę w skali molekularnej z fenotypami funkcjonalnymi w systemach istotnych dla danej choroby. Zdolność tej metody do adaptacji do innych cech ultrastrukturalnych zwiększa ciągłość translacyjną pomiędzy poszczególnymi etapami odkrywania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zależnych od aktyny szlaków sygnalizacyjnych oraz mechanizmów mechanotransdukcji istotnych dla celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe mapowanie przestrzenne organizacji filamentów w celu wyjaśnienia oddziaływania z celem w kontekście komórkowym.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez obrazowanie zmian ultrastrukturalnych po modulacji celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje dane o wysokiej swoistości i rozdzielczości poniżej 20 nm, służące do walidacji wyników przesiewów fenotypowych wpływających na dynamikę cytoszkieletu.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalne, izotropowe wyniki lokalizacji 3D, odpowiednie do standaryzacji testów i przygotowania do automatyzacji.
- Skalowalność: Możliwość adaptacji do formatów wielodołkowych i różnorodnych sond sprzężonych z fluoroforami w celu niezależnego od celu fenotypowania ultrastrukturalnego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając bezpośrednią obserwację przebudowy aktyny w modelach chorobowych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia dopasowanie biomarkerów poprzez korelacyjne obrazowanie architektury cytoszkieletu z odczytami funkcjonalnymi.
- Łagodzenie ryzyka: Zwiększa pewność w identyfikacji związków wiodących poprzez ograniczenie niejednoznaczności w interpretacji mechanizmów działania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając wyników ultrastrukturalnych, które wspierają decyzje dotyczące walidacji celu oraz optymalizacji związku wiodącego przed przejściem do fazy badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regulatorów cytoszkieletu poprzez bezpośrednią wizualizację reorganizacji filamentów.
- Przesiewanie: Umożliwia obrazowanie architektury aktyny gotowe do analizy i kompatybilne z kwantyfikacją w celu potwierdzenia trafień oraz eksploracji zależności SAR.
- Analityka: Dostarcza rozdzielone fazowo, wielokanałowe dane lokalizacyjne, umożliwiające statystyczne porównanie fenotypów strukturalnych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy nanoskalową dynamikę aktyny z funkcją komórkową w modelach przedklinicznych za pomocą korelacyjnej analizy strukturalno-funkcjonalnej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku możliwości obrazowania w superrozdzielczości do badań cytoszkieletu, adhezji i organelli w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez rozwiązanie niejednoznaczności mechanistycznych w węzłach sygnalizacji cytoszkieletu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki skalibrowanej ekstrakcji fazy interferometrycznej i wyrównaniu w oparciu o punkty fiducjalne.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie dowodów ultrastrukturalnych na zaangażowanie celu i modulację ścieżki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów cytoszkieletowych z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o rozdzielczość fenotypową w skali nanometrycznej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek oraz interferometrycznego przetwarzania sygnałów.
- Zależność od stabilnych kamer EMCCD, siłowników piezoelektrycznych i wielolaserowych układów wzbudzenia w celu ekstrakcji fazy 3D.
- Konieczność standaryzacji przygotowania próbek, znakowania punktów referencyjnych oraz kontroli środowiskowej w celu minimalizacji dryftu w ramach zespołów badawczych.
- Adaptacja do alternatywnych modeli wymaga optymalizacji gęstości znakowania, kompatybilności buforów oraz protokołów montażu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują dryft próbki podczas długotrwałych akwizycji oraz potrzebę uzyskania wysokiej wydajności fotonowej z sond fotoprzełączalnych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
Imaging Specimen Preparation
3:11
Sample Placement and iPALM Alignment
5:29
Calibration of the iPALM Setup
7:47
Data Acquisition
9:09
Results: Actin Cytoskeleton of Adherent Mammalian Cells Visualized by iPALM with Sub-20 nm Spatial Resolution in 3D
10:55
Conclusion
