Name: Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Poznaj metodę iPALM do trójwymiarowej mikroskopii superrozdzielczej włókien F-aktyny w komórkach ssaczych. Technika zapewnia nanometrową rozdzielczość przestrzenną i wysoką specyficzność etykietowania fluorescencyjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

YW i PK dziękują za wsparcie finansowe od Singapore National Research Foundation, przyznane PK (NRF-NRFF-2011-04 i NRF2012NRF-CRP001-084). Dziękujemy również otwartemu laboratorium MBI i ośrodkom mikroskopowym za wsparcie w zakresie infrastruktury.

<ol><li>Kanchanawong, P., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization-based+super-resolution+imaging+of+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization-based super-resolution imaging of cellular structures.</a> Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).</li>
<li>Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+by+super+resolution+fluorescence+microscopy+and+its+emerging+applications+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research.</a> Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).</li>
<li>Kanchanawong, P., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+light-based+imaging+of+three-dimensional+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure.</a> Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).</li>
<li>Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+subdiffraction+imaging+by+accumulated+binding+of+diffusing+probes%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).</li>
<li>Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5, 943-945 (2008).</li>
<li>Biteen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-moldecule+active-control+microscopy+%28SMACM%29+with+photo-reactivable+EYFP+for+imaging+biophysical+processes+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells.</a> Nat Methods. 5, 947-949 (2008).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super+resolution+imaging+of+chemical+synapses+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Super resolution imaging of chemical synapses in the brain.</a> Neuron. 68, 843-856 (2010).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talin+determines+the+nanoscale+architecture+of+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nature. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-delimited+adhesion-independent+clustering+of+e-cadherin+forms+the+nanoscale+building+blocks+of+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions.</a> Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).</li>
<li>Szymborska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Pore+Scaffold+Structure+Analyzed+by+Super-Resolution+Microscopy+and+Particle+Averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging.</a> Science. 341, 655-658 (2013).</li>
<li>Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+imaging+of+centrosomes+reveals+higher-order+organizational+features+of+pericentriolar+material%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material.</a> Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).</li>
<li>Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+no+more%3A+subdiffraction+view+of+the+pericentriolar+material+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture.</a> Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).</li>
<li>Mennella, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+microscopy+reveals+a+domain+of+the+centrosome+critical+for+pericentriolar+material+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization.</a> Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).</li>
<li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-492 (2010).</li>
<li>Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cortex+mechanics+and+cellular+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis.</a> Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructure+by+PALM%2C+iPALM%2C+and+correlative+iPALM-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM.</a> Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Methods. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+in+the+presence+of+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+IRE%22%5BJournal%5D)">Communication in the presence of noise.</a> Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).</li>
<li>Good, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+ion+buffers+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen ion buffers for biological research.</a> Biochemistry. 5, 467-477 (1966).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Shin, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShin%2C+WD+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).</li>
<li>Aquino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+nanoscopy+of+three-dimensional+volumes+by+4Pi+detection+of+stochastically+switched+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores.</a> Nat Methods. 8, 353-359 (2011).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).</li>
<li>Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnanometre+single-molecule+localization%2C+registration+and+distance+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements.</a> Nature. 466, 647-651 (2010).</li>
<li>Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Localization+Microscopy+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Visualization of Localization Microscopy Data.</a> Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).</li>
<li>El Beheiry, M., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ViSP%3A+representing+single-particle+localizations+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions.</a> Nat Methods. 10, 689-690 (2013).</li>
<li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nat Methods. 9, 152-158 (2012).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Yamashiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+single-molecule+speckle+microscopy+reveals+modification+of+the+retrograde+actin+flow+by+focal+adhesions+at+nanometer+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales.</a> Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+super+resolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346, (2014).</li>
<li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super+resolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range%2C+limits%2C+and+membrane+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).</li>
<li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+nanoscopy+using+sCMOS+camera-specific+single-molecule+localization+algorithms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms.</a> Nat Methods. 10, 653-658 (2013).</li>
<li>Daostorm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAOSTORM%3A+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat methods. 8, 279(2011).</li>
<li>Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+STORM+using+compressed+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Faster STORM using compressed sensing.</a> Nat Methods. 9, 721-723 (2012).</li>
<li>Van Engelenburg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+ESCRT+machinery+at+HIV+assembly+sites+reveals+virus+scaffolding+of+ESCRT+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits.</a> Science. 343, 653-656 (2014).</li>
<li>Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabright+photoactivatable+fluorophores+created+by+reductive+caging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging.</a> Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Układ optyczny iPALM oparty jest na konstrukcji obiektywu 4-π z podwójnym przeciwieństwem, jak pokazano na rysunku 1A. Układ jest zbudowany zarówno z niestandardowych części optomechanicznych, jak i komercyjnych, jak opisano wcześniej23 i wymieniono w tabeli 1. Oprócz naszej konfiguracji, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) jest gospodarzem systemu, który jest dostępny dla społeczności naukowej w Centrum Zaawansowanego Obrazowania w Kampusie Badawczym Janel...

Wizualizacja złożonych struktur komórkowych od dawna stanowi integralną część biologicznych spostrzeżeń i odkryć. Chociaż mikroskopia fluorescencyjna może obrazować komórki o wysokiej specyficzności molekularnej, jej zdolność rozdzielcza jest ograniczona przez dyfrakcję do ~ 200 nm w płaszczyźnie obrazu (x,y lub wymiar boczny) i > 500 nm wzdłuż osi optycznej (z lub wymiar osiowy)1,2. W związku z tym obserwacja cech ultrastrukturalnych historycznie ograniczała się do mikroskopii elektronowej (EM). Na szczęście niedawny rozwój mikroskopii superrozdzielczej pozwolił obejść tę granicę, umożliwiając rozdzielczość przestrzenną w zakresie 10 - 100 nm1-6. W szczególności podejścia super rozdzielczości oparte na lokalizacji pojedynczej cząsteczki, znane pod akronimami takimi jak PALM (PhotoActivated Localization Microscopy)4, FPALM (Fluorescence PhotoActivated Localization Microscopy)5 (d)STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)6,7, PAINT (Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topography)8, GSDIM (Ground State Depletion Microscopy, a następnie indywidualny powrót molekularny)9lub SMACM (Single-Molecule Active-Control Microscopy)10, a także ich trójwymiarowe (3D) implementacje, takie jak interferometryczna PALM (iPALM)11 lub 3D-STORM12, były cenne w ujawnianiu nowych informacji na temat organizacji wielu struktur biologicznych w nanoskali, w tym aksonów i synaps neuronalnych13, zrostów ogniskowych14,15, połączeń komórka-komórka16, porów jądrowych17 i centrosomów18-20, żeby wymienić tylko kilka.
Kolejną ultrastrukturalną cechą komórek, dla której potencjalnie przydatna jest mikroskopia superrozdzielcza, jest cytoszkielet aktynowy. Złożona siatka nitkowatej (f)-aktyny w korze komórkowej odgrywa zasadniczą rolę w kontroli kształtu komórki i właściwości mechanicznych21. Organizacja f-aktyny jest aktywnie i dynamicznie regulowana przez liczne białka regulatorowe, które silnie wpływają na polimeryzację, sieciowanie, obrót, stabilność i topologię sieci22. Jednakże, chociaż charakterystyka architektury siatki f-aktyny jest ważna dla mechanistycznego wglądu w różnorodny zakres procesów komórkowych, mały rozmiar (~ 8 nm) włókien f-aktyny utrudnia ich obserwację za pomocą konwencjonalnej mikroskopii świetlnej ograniczonej dyfrakcją; w związku z tym wizualizacja subtelnej struktury aktyny była dotychczas wykonywana wyłącznie przez EM. W tym miejscu opisujemy protokoły wizualizacji cytoszkieletu f-aktyny w przylegających komórkach ssaków, wykorzystując technikę mikroskopii super rozdzielczej iPALM, aby wykorzystać jej bardzo wysoką precyzję w 3D11,23. Chociaż instrument iPALM jest wysoce specjalistyczny, instrukcja konfiguracji takiego instrumentu została opisananiedawno23, podczas gdy dostęp do mikroskopu iPALM znajdującego się w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa został również udostępniony społeczności naukowej przy minimalnych kosztach. Ponadto opisane w niniejszym dokumencie metody przygotowania próbek mają bezpośrednie zastosowanie do alternatywnych podejść do super rozdzielczości 3D, takich jak te oparte na astygmatycznym rozogniskowaniu funkcji rozproszenia punktowego (PSF)12 lub detekcji dwupłaszczyznowej24, które są szerzej dostępne.
Zauważamy, że niezbędnym składnikiem do mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji pojedynczych cząsteczek jest fotoprzełączalny fluorofor25, który pozwala spełnić trzy krytyczne wymagania dla mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji pojedynczej cząsteczki: i) wysoka jasność i kontrast pojedynczej cząsteczki w stosunku do sygnałów tła; ii) rzadki rozkład pojedynczych cząsteczek w danym kadrze obrazu; oraz (iii) wysoka gęstość przestrzenna etykietowania wystarczająca do uchwycenia profilu podstawowej struktury (znana również jako kryterium doboru próby Nyquista-Shannona)26. W związku z tym, aby uzyskać zadowalające wyniki, należy położyć równy nacisk zarówno na właściwe przygotowanie próbek w celu optymalizacji fotoprzełączania fluoroforów i zachowanie leżącej u ich podstaw ultrastruktury, jak i na aspekty instrumentacji i akwizycji eksperymentów.

<table><tbody><tr><td>stół optyczny</td><td>Newport, CA</td><td>RS4000</td><td>iPALM, zainstalowany na 4 Newport Stabilizatory wibroizolatory</td></tr><tr><td>wibroizolator do stołu optycznego</td><td>Newport, CA</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>laser-642</td><td>Newport, CA</td><td>1185055</td><td>moc wyjściowa = 100 mw</td></tr><tr><td>laser-561</td><td>Newport, CA</td><td>1168931</td><td>moc wyjściowa = 200 mw</td></tr><tr><td>laser-488</td><td>Newport, CA</td><td>1137970</td><td>moc wyjściowa = 200 mw</td></tr><tr><td>laser-405</td><td>Newport, CA</td><td>1142279</td><td>moc wyjściowa = 100 mw</td></tr><tr><td>szerokopasmowe lustra dielektryczne</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>BB1-E02</td><td>sumator laserowy</td></tr><tr><td>dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Semrock, NY</td><td>LM01-427-25</td><td></td></tr><tr><td>akustyczno-optyczny filtr przestrajalny</td><td>AA Opto-elektroniczny, Francja</td><td>AOTFnC-VIS-TN</td><td></td></tr><tr><td>Liniowy polaryzator</td><td>Newport, CA</td><td>05LP-VIS-B</td><td></td></tr><tr><td>płyta bazowa</td><td>lokalny warsztat</td><td>dostosowane</td><td></td></tr><tr><td>lustro obrotowe (22,5&deg;)</td><td>Reynard Corpporation, CA</td><td>dostosowane</td><td>22,5 i stopniowe zmotoryzowane</td></tr><tr><td>mocowania optyczne</td><td>New Focus, CA</td><td>8816</td><td></td></tr><tr><td>zmotoryzowany stolik translacyjny XYZ</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>MT3 / M-Z6</td><td>uchwyt na próbkę</td></tr><tr><td>kontroler serwomotoru T-Cube DC Thorlabs</td><td>, NJ</td><td>TDC001</td><td></td></tr><tr><td>Piezoelektryczny przesuwnik fazowy</td><td>Physik Instrumente, Niemcy</td><td>S-303.CD</td><td></td></tr><tr><td>obiektyw</td><td>Nikon, Japonia</td><td>MRD01691</td><td>obiektyw. Stopień translacji oleju Apo TIRF 60X/1.49</td></tr><tr><td></td><td>New Focus, CA</td><td>9062-COM-M</td><td></td></tr><tr><td>Siłownik silnika Pico</td><td>New Focus, CA</td><td>8301</td><td></td></tr><tr><td>obrotowy elektromagnes / migawka</td><td>DACO Instruments, CT</td><td>5423-458</td><td></td></tr><tr><td>3-kierunkowy rozdzielacz wiązki</td><td>Rocky Mountain Instruments,</td><td>CO dostosowany</td><td>rozdzielacz wiązki</td></tr><tr><td>Skaner piezoelektryczny Z / Tip / Tilt</td><td>Physik Instrumente, Niemcy</td><td>S-316.10</td><td></td></tr><tr><td>zmotoryzowany pięcioosiowy wyrównywacz przechyłu</td><td>New Focus, CA</td><td>8081</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler ethernet Picmotor</td><td>New Focus, CA</td><td>8752</td><td></td></tr><tr><td>Kontrolery piezoelektryczne/wzmacniacz/cyfrowy moduł operacyjny</td><td>Physik Instrumente, Niemcy</td> Filtr pasmowo-przepustowy <td>E-509/E-503/E-517</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Filtry</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Semrock, NY FF01-523/20filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-588/21</td><td></td></tr><tr><td>filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Semrock, NY</td> Filtr pasmowo-przepustowy <td>FF01-607/30</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Semrock, NY</td> Filtr wycinający <td>FF01-676/37</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Semrock, NY</td><td>NF01-405/488/561/635</td><td></td></tr><tr><td>zmotoryzowane koło filtrów ze sterownikiem</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>FW103H</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor, Wielka Brytania</td><td>DU-897U-CSO-#BV</td><td>3 zestawy</td></tr><tr><td>Komputery stacjonarne do sterowania kamerami i synchronizacji</td><td>Dell</td><td>Precision T3500</td><td>PC, 4 zestawy</td></tr><tr><td>szkiełek nakrywkowych z referencyjnym</td><td>Hestzig</td>, przygotowanie próbki VA <td>600-100AuF</td><td>. Dostępne znaki odniesienia o różnej gęstości i widmach</td></tr><tr><td>fibronektyna</td><td>Milipore, MT</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Elektron Nauki mikroskopowe,</td> utrwalenie PA <td>15710</td><td>. 16%</td></tr><tr><td>aldehyd glutarowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, PA</td><td>16220</td><td>25%</td></tr><tr><td>triton X-100</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC cells</td><td>Life Technologies, CA</td><td>C-015-10C</td><td></td></tr><tr><td>Medium 200</td><td>Life Technologies, CA</td><td>M-200-500</td><td></td></tr><tr><td>Czynniki</td> <td>śródbłonka dużych naczyńLife Technologies, CA</td><td>A14608-01</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td></td> buforowana fosforanem Dulbecco <td>14190367</td><td></td></tr><tr><td>Pennicylina/Streptomycyna</td><td></td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Life Technologies, CA</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>P1851</td><td>PHEM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>1. baza, Malezja</td><td>BIO-1825</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Millipore, MT</td><td>5985</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen, CA</td><td>A22287</td><td>barwienie</td></tr><tr><td>borowodorku sodu (NaBH4)</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>480886</td><td>wygaszanie glukozy</td></tr><tr><td></td><td>1. zasada, Malezja</td><td>BIO-1101</td><td>bufor obrazowania</td></tr><tr><td>oksydaza glukozowa</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>katalaza</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>cysteamina</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>Epoksydowe</td><td>thorlaby, NJ</td><td>G14250</td><td></td></tr><tr><td>wazelina</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>16415</td><td>próbka uszczelniająca</td></tr><tr><td>lanolinę</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>L7387</td><td></td></tr><tr><td>wosk parafinowy</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, obrazowanie PA</td><td>16915-04</td><td>. Wózek typu HF</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien f-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (ipalm)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia bezpośrednią wizualizację określonych biomolekuł w komórkach. Jednak w przypadku konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona przez dyfrakcję do ~ 200 nm w płaszczyźnie obrazu i > 500 nm wzdłuż osi optycznej. W rezultacie, mikroskopia fluorescencyjna przez długi czas była poważnie ograniczona w obserwacji cech ultrastrukturalnych w komórkach. Niedawny rozwój metod mikroskopii superrozdzielczej przezwyciężył to ograniczenie. W szczególności pojawienie się fotoprzełączalnych fluoroforów umożliwia mikroskopię superrozdzielczą opartą na lokalizacji, która zapewnia moc rozdzielczą zbliżającą się do skali długości molekularnej. W tym miejscu opisano zastosowanie metody trójwymiarowej mikroskopii superrozdzielczej opartej na mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek i interferometrii wielofazowej, zwanej interferometryczną mikroskopią lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM). Metoda ta zapewnia rozdzielczość niemal izotropową rzędu 20 nm we wszystkich trzech wymiarach. Protokoły wizualizacji nitkowatego cytoszkieletu aktynowego, w tym przygotowanie próbki i działanie instrumentu iPALM, są opisane tutaj. Protokoły te są również łatwe do dostosowania i pouczające w badaniu innych cech ultrastrukturalnych w komórkach.

Kluczowymi wymaganiami dla iPALM są wyrównanie, rejestracja i kalibracja systemów optycznych. Są one niezbędne do zapewnienia właściwej interferencji w trójpłaszczyznowym dzielniku wiązki, który jest wymagany do wyznaczenia współrzędnej z. Aby umożliwić ciągły monitoring, niezbędne są stałe punktowe źródła fluorescencji. Można to osiągnąć wykorzystując fluorescencyjne nanocząstki Au lub bimetaliczne23, których fotoluminescencja wynika z lokalnego powierzchniowego rezonansu plaz...

Przedstawiamy protokół zastosowania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM), 3-wymiarowej metody mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w super rozdzielczości, do obrazowania cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków. Takie podejście umożliwia opartą na świetle wizualizację cech strukturalnych w nanoskali, które w przeciwnym razie pozostałyby nierozwiązane przez konwencjonalną mikroskopię optyczną z ograniczoną dyfrakcją.

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja cytoszkieletu aktynowego w adherentnych komórkach ssaków na poziomie ultrastrukturalnym, z wykorzystaniem metody mikroskopii superrozdzielczej trójwymiarowej zwanej iPALM. Obrazowanie iPALM zapewnia nanometrową rozdzielczość przestrzenną w trzech wymiarach. Umożliwia to wizualizację ultrastruktur przy użyciu sond fluorescencyjnych, co zapewnia wysoką specyficzność znakowania.Procedura przedstawiona w tym filmie powinna być szybko adaptowalna i pomocna w wizualizacji innych cech ultrastrukturalnych komórek za pomocą mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji pojedynczych cząsteczek. Rozpocznij procedurę od przygotowania komórek na szkiełkach podstawowych w płytce sześciodołkowej. Aby przygotować próbkę do obrazowania, użyj precyzyjnej pęsety, aby delikatnie wyjąć szkiełko z dołka z buforem.Następnie szybko i delikatnie usuń nadmiar buforu, dotykając krawędzi szkiełka nakrywnego złożonym, chłonnym papierem. Połóż szkiełko nakrywne stroną z komórkami do góry na czystym papierze do soczewek. Przepłucz próbkę, nakładając na nią od 30 do 50 µL buforu do obrazowania.Usuń nadmiar buforu, przechylając preparat i osuszając go złożonym papierem absorbującym. Po kilkukrotnym powtórzeniu etapu płukania, nanieś 30 do 50 µL buforu do obrazowania na próbkę. Osusz krawędź szkiełka nakrywnego i nanieś kilka bardzo małych kropek szybko utwardzalnej żywicy epoksydowej na osuszony obszar.Powoli opuść kolejne, uprzednio oczyszczone szkiełko nakrywkowe nr 1,5 na środek komórki zawierającej szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm. Pozostaw bufor obrazujący, aby zwilżył oba szkiełka nakrywkowe poprzez działanie kapilarne. Małe kropki szybko utwardzanej żywicy epoksydowej powinny przylgnąć do obu szkiełek nakrywkowych.Delikatnie dociśnij zmontowaną próbkę za pomocą złożonego papieru chłonnego, aby równomiernie rozłożyć nacisk. Zastosuj nacisk wystarczający do uzyskania cienkiej i jednorodnej warstwy komórek w komorze próbki, ale nie na tyle silny, aby je zmiażdżyć. Odpowiednią grubość określ, obserwując wzór pierścieni Newtona.Należy wykonać ten krok ostrożnie, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby warto wcześniej kilkakrotnie poćwiczyć na pustych szkiełkach nakrywkowych. Następnie próbkę należy uszczelnić roztopioną wazeliną z lanoliną i parafina.Następnie wypłucz zamkniętą próbkę wodą dejonizowaną. Osusz próbkę sprężonym powietrzem, aby przygotować ją do zamocowania w mikroskopie. Przesuń w górę sprężynowy obiektyw górny, aby umożliwić wyjęcie uchwytu próbki.Umieść zapieczętowaną próbkę na uchwycie do próbek i zabezpiecz ją kilkoma małymi magnesami neodymowymi. Nałóż olej imersyjny po obu stronach obrazowanej próbki. Umieść uchwyt do próbek z powrotem w torze optycznym i ostrożnie opuść górny obiektyw.Włącz lasery wzbudzające. Włącz również kamery EMCCD w trybie transferu klatek. Następnie wprowadź odpowiednie filtry emisyjne.Aktywuj mechaniczną migawkę, aby zablokować górną ścieżkę wiązki i otworzyć dolną ścieżkę wiązki. Ustaw ostrość dolnego obiektywu, przesuwając go w małych przyrostach za pomocą aktuatora piezoelektrycznego. Po ustawieniu ostrości znacznika fiducjalnego otwórz górną ścieżkę wiązki, blokując jednocześnie dolną ścieżkę wiązki, a następnie w podobny sposób ustaw ostrość górnego obiektywu.Monitoruj szerokość znacznika na ekranie komputera w celu uzyskania optymalnej ostrości. Aby zapewnić prawidłowe centrowanie, otwórz górną i dolną ścieżki wiązki. Ręcznie reguluj górny obiektyw, podczas gdy dolny obiektyw pozostaje nieruchomy dzięki parze mikrometrycznych śrub regulacyjnych, aż obrazy znacznika zostaną nałożone na siebie tak dokładnie, jak to możliwe, idealnie w obrębie jednego piksela.Następnie przeprowadź precyzyjne regulacje, aby obrazy punktów referencyjnych nakładały się na siebie w obrębie jednej dziesiątej piksela EMCCD. Dostrój dwa górne lustra piezoelektryczne zamontowane na osiach za pomocą oprogramowania sterującego, utrzymując oba obiektywy oraz dolne lustra odbijające w stałej pozycji. Aby przeprowadzić ten proces, porównuj centra punktów referencyjnych w widokach z górnego i dolnego obiektywu na ekranie komputera.Przy włączonych laserach, stale transmitujących obrazach z kamer oraz otwartych górnej i dolnej ścieżkach wiązki, wywołaj oscylację piezoelementu osi Z uchwytu próbki za pomocą sinusoidalnego przebiegu napięcia generowanego przez oprogramowanie sterujące, aby uzyskać ciągłą oscylację wzdłuż osi Z o amplitudzie 400 nanometrów. Ręcznie przesuń zmotoryzowany zespół dzielnika wiązki w górę lub w dół, aż do momentu, gdy intensywność punktu referencyjnego zacznie oscylować. Ze względu na pożądany efekt interferencji pojedynczych fotonów, oznacza to zbliżone dopasowanie długości ścieżek optycznych.W optymalnych przypadkach można osiągnąć stosunek szczytu do doliny większy niż 10. Aby zapewnić, że zarówno amplituda, jak i faza na każdej powierzchni są jak najbardziej jednorodne w całym polu, należy regulować dolne lustro zespołu dzielnika wiązki w małych krokach, aby precyzyjnie dostroić przerwę oraz kąty nachylenia. Precyzyjne wyrównanie dzielnika wiązki należy przeprowadzić, przesuwając próbkę w osi Z w krokach o wielkości 8 nanometrów na dystansie 800 nanometrów.Monitoruj intensywność punktów referencyjnych w kamerach od pierwszej do trzeciej. Dostosuj wysokość, pozycję i nachylenie dolnego lustra w układzie dzielnika wiązki małymi krokami w taki sposób, aby zmaksymalizować fazę oscylacji kamery pierwszej względem kamery drugiej, idealnie do 120 stopni. Po zakończeniu wstępnego wyrównania przesuń próbkę, aby wyskanować odpowiednie pole widzenia, które zawiera zarówno komórki do obrazowania, jak i kilka pobliskich punktów referencyjnych.Umieścić wokół układu osłonę, aby zablokować światło rozproszone i zakłócenia otoczenia. Po zlokalizowaniu obszaru obrazowania, ponownie przesunąć próbkę i zarejestrować krzywą kalibracyjną do wykorzystania w kolejnych ekstrakcjach współrzędnej Z. W głównym interfejsie należy użyć polecenia acquire calibration scans versus sample piezo position.Po znalezieniu pożądanego obszaru i uzyskaniu krzywej kalibracyjnej, wprowadź odpowiednie nazwy plików do oprogramowania. Otwórz ścieżki wiązki górnej i dolnej, a następnie zwiększ moc wzbudzenia lasera o długości 642 nm do maksimum. W przypadku Alexa Fluor 647 może być wymagany wstępny okres wygaszania Fluor-4.Naświetlaj stałym wzbudzeniem o długości 642 nanometrów przez pięć minut lub dłużej, jeśli jest to konieczne, aż do zaobserwowania migotania pojedynczych cząsteczek. Oprogramowanie umożliwia automatyczny wzrost fotoaktywacji 405 nanometrów w trakcie akwizycji. Zazwyczaj wymagana jest duża liczba klatek akwizycji, aby cechy włókniste były wyraźnie widoczne.Po przygotowaniu rozpocznij akwizycję zestawów surowych obrazów, korzystając z polecenia start iPALM acquisition w głównym interfejsie. Podczas akwizycji dostrój poziom fotoaktywacji, regulując intensywność lasera 405 nanometrów, aby w razie potrzeby utrzymać odpowiednią gęstość mrugania. Jeśli szkiełko nakrywkowe próbki zostało prawidłowo zmontowane, gołym okiem w świetle otoczenia lub standardowym oświetleniu fluorescencyjnym można zaobserwować pierścienie Newtona.Wyznaczenie pozycji osiowych emitterów fluorescencji wymaga jednoczesnej interferencji wielofazowej w obrazowaniu iPALM, która jest kalibrowana poprzez zmiany natężenia określonego punktu odniesienia w trzech detektorach EMCCD. Następnie natężenia są normalizowane i dopasowywane w celu określenia różnic fazowych. Poniżej znajduje się zrekonstruowany obraz iPALM, w którym każda współrzędna lokalizacji jest przedstawiona za pomocą rozkładu Gaussa 2D o szerokości odpowiadającej niepewności lokalizacji.Współrzędna Z jest pokolorowana zgodnie z paskiem kolorów. Widoczne są obszary o gęstych i rzadkich strukturach włóknistych. Przedstawiono tutaj obrazy z rekonstrukcji iPALM cytoszkieletu aktynowego komórek HUVEC znakowanych faloidyną Alexa Fluor 647.Kolor obrazu wskazuje współrzędne Z zgodnie z paskiem kolorów. Histogram przekroju poprzecznego został wygenerowany z współrzędnych lokalizacji XY wzdłuż długiej osi zaznaczonego obszaru. Dopasowanie Gaussa wskazuje pełną szerokość połówkową (FWHM) wynoszącą 43,88 nanometrów w odniesieniu do przekroju poprzecznego.Ten histogram przedstawia pozycję Z współrzędnych lokalizacji w zaznaczonym obramowaniem obszarze. Dopasowanie gaussowskie wykazuje pełną szerokość połówkową (FWHM) wynoszącą 17.50 nanometrów. Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w 90 minut, jeśli jest prowadzona prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat wizualizacji cytoszkieletu aktynowego na poziomie ultrastrukturalnym przy użyciu iPALM, obejmującą proste przygotowanie i montaż próbek, wyrównanie optyczne, akwizycję surowych danych oraz późniejszą analizę w celu rekonstrukcji obrazów o superrozdzielczości. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie biologii komórki do eksploracji architektury nanoskali cytoszkieletu aktynowego, a także struktur adhezji komórkowej, takich jak adhezje ogniskowe.

three-dimensional-super-resolution-microscopy-f-actin-filaments

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach...

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Tworzenie właściwej sieci sarkomerowej jest ważne dla dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości, które pozwala na ilościową ocenę strukturalnego dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, w celu poprawy warunków hodowli sprzyjających rozwojowi serca.

Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek

Obecny protokół opisuje metodę wizualizacji i pomiaru pierścieni aktynowych i innych składników okresowego szkieletu błony początkowego segmentu aksonu przy użyciu hodowanych neuronów hipokampa szczura i mikroskopii iluminacyjnej o strukturze 3D (3D-SIM).

Pomiar właściwości okresowego szkieletu błonowego początkowego segmentu aksonu przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (3D-SIM)

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Poznaj metodę iPALM do trójwymiarowej mikroskopii superrozdzielczej włókien F-aktyny w komórkach ssaczych. Technika zapewnia nanometrową rozdzielczość przestrzenną i wysoką specyficzność etykietowania fluorescencyjnego.

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM) (Wideo) | JoVE Journal

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)

Przeglądaj więcej filmów