Name: Przygotowanie i charakterystyka in vitro środków kontrastowych na bazie dendrymerów do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Poznaj przygotowanie i charakteryzację dendrymerowych środków kontrastowych do rezonansu magnetycznego z jonami gadolinu. Ta metoda umożliwia uzyskanie wzmocnionego sygnału MRI in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe Towarzystwa Maxa Plancka, tureckiego Ministerstwa Edukacji Narodowej (stypendium doktoranckie dla S. G.) oraz Niemieckiej Służby Wymiany Akademickiej (DAAD, stypendium doktoranckie dla T. S.).

<ol><li>Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerbach%2C+AE+%22The+chemistry+of+contrast+agents+in+medical+magnetic+resonance+imaging.+2nd+ed%22">The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed</a>. , Wiley. (2013).</li>
<li>Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+basic+properties+of+contrast+agents+for+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).</li>
<li>Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gadolinium%28III%29+chelates+as+MRI+contrast+agents%3A+Structure%2C+dynamics%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications.</a> Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).</li>
<li>Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecules%2C+Dendrimers%2C+and+Nanomaterials+in+Magnetic+Resonance+Imaging%3A+The+Interplay+between+Size%2C+Function%2C+and+Pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics.</a> Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).</li>
<li>Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimers+and+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dendrimers and magnetic resonance imaging.</a> New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).</li>
<li>Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Characterization+of+a+Biotinylated+Multivalent+Targeted+Contrast+Agent%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPlusChem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent.</a> ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).</li>
<li>Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+luminescence+properties+of+a+kinetically+stable+dinuclear+ytterbium+complex+with+differentiated+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites.</a> Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).</li>
<li>Vibhute, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+pH-sensitive%2C+biotinylated+MRI+contrast+agents+and+their+conjugates+with+avidin%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin.</a> Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).</li>
<li>Vogel, A. I., Furniss, B. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVogel%2C+AI+%22Vogel%27s+textbook+of+practical+organic+chemistry.+5th+ed%22">Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed</a>. , Longman. (1989).</li>
<li>Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLundanes%2C+E+%22Chromatography+%3A+basic+principles%2C+sample+preparations+and+related+methods%22">Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods</a>. , Wiley-VCH. (2013).</li>
<li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).</li>
<li>Keeler, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeeler%2C+J+%22Understanding+NMR+spectroscopy.+2nd+ed%22">Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed</a>. , Wiley. (2010).</li>
<li>Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHillenkamp%2C+F+%22MALDI+MS+%3A+a+practical+guide+to+instrumentation%2C+methods+and+applications%22">MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications</a>. , Wiley-VCH. (2007).</li>
<li>Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lanthanide+induced+shifts+and+relaxation+rate+enhancements%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucl.+Magn.+Reson.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).</li>
<li>Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+Purification%2C+and+Characterization+of+Lanthanide+Complexes+for+Use+as+Contrast+Agents+for+Magnetic+Resonance+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging.</a> J. Vis. Exp. (53), e2844(2011).</li>
<li>Hagberg, G. E., Scheffler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+r1+and+r2+relaxivity+of+gadolinium-based+contrast+agents+on+the+T1-weighted+MR+signal+at+increasing+magnetic+field+strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).</li>
<li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+biological+evaluation+of+integrin+alpha%28v%29beta%283%29-targeted+PAMAM+dendrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmaceut%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).</li>
<li>Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+on+Gadolinium+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Primer on Gadolinium Chemistry.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).</li>
<li>Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+strategies+for+preparation+of+cyclen-based+MRI+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents.</a> Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).</li>
<li>Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAMAM+Dendrimers+Conjugated+with+an+Uncharged+Gadolinium%28III%29+Chelate+with+a+Fast+Water+Exchange%3A+The+Influence+of+Chelate+Charge+on+Rotational+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics.</a> Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).</li>
<li>Ali, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+relaxometric+studies+of+a+dendrimer-based+pH-responsive+MRI+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent.</a> Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).</li>
<li>Jackson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+dendrimer+molecules+by+transmission+electron+microscopy+%28TEM%29%3A+Staining+methods+and+Cryo-TEM+of+vitrified+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions.</a> Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).</li>
<li>Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer+toxicity%3A+Let%27s+meet+the+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge.</a> Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).</li>
<li>Rudovsky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAMAM+dendrimeric+conjugates+with+a+Gd-DOTA+phosphinate+derivative+and+their+adducts+with+polyaminoacids%3A+The+interplay+of+global+motion%2C+internal+rotation%2C+and+fast+water+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange.</a> Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improved+syntheses+of+dendrimer-based+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents%3A+New+bifunctional+diethylenetriaminepentaacetic+acid+ligands+and+nonaqueous+conjugation+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry.</a> J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).</li>
<li>Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28amidoamine%29+Dendrimer+Based+MRI+Contrast+Agents+Exhibiting+Enhanced+Relaxivities+Derived+via+Metal+Preligation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques.</a> Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).</li>
<li>Livramento, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+in+vivo+MRI+assessment+of+a+self-assembled+metallostar+compound+endowed+with+a+remarkable+high+field+relaxivity%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).</li>
<li>Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+the+Size+of+Dy2O3+Nanoparticles+for+Optimal+Performance+as+an+MRI+Contrast+Agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przygotowanie dendrymerycznego środka kontrastowego MRI wymaga odpowiedniego doboru jednostki monomerycznej (tj. chelatora dla Gd(III)). Zmniejszają toksyczność tego jonu paramagnetycznego i do tej pory służy temu celu szeroka gama chelatorów acyklicznych i makrocyklicznych1-3. Spośród nich makrocykliczne chelatory typu DOTA charakteryzują się najwyższą stabilnością termodynamiczną i bezwładnością kinetyczną, a zatem są najbardziej preferowanym wyborem do przygotowania obojętnych środków kontrastowych...

Rezonans magnetyczny (MRI) to potężna i niejonizująca technika obrazowania, szeroko stosowana w badaniach biomedycznych i diagnostyce klinicznej, ze względu na jej nieinwazyjny charakter i doskonały wewnętrzny kontrast tkanek miękkich. Najczęściej stosowane metody MRI wykorzystują sygnał uzyskany z protonów wody, zapewniając obrazy o wysokiej rozdzielczości i szczegółowe informacje w tkankach oparte na różnicach w gęstości sygnałów wodnych. Natężenie sygnału i swoistość eksperymentów MRI można dodatkowo poprawić za pomocą środków kontrastowych (CA). Są to gatunki paramagnetyczne lub superparamagnetyczne, które wpływają na podłużne (T1) i poprzeczne (T2) czasy relaksacji, odpowiednio1,2.
Kompleksy gadolinu jonów lantanowców z ligandami kwasu poliaminowo-polikarboksylowego są najczęściej używanymi ligandami T1 CA. Gadolin(III) skraca czas relaksacji protonów wodnych T1, zwiększając w ten sposób kontrast sygnału w eksperymentach MRI3. Jednak gadolin jonowy jest toksyczny; jego rozmiar jest zbliżony do rozmiaru wapnia (II) i poważnie wpływa na sygnalizację wspomaganą wapniem w komórkach. Dlatego chelaty acykliczne i makrocykliczne są stosowane do neutralizacji tej toksyczności. Do tej pory opracowano różne ligandy wielozębne, w wyniku których powstały kompleksy gadolinu(III) o wysokiej stabilności termodynamicznej i obojętności kinetycznej1. Te oparte na 12-członowym cyklu azamakrocyklowym, w szczególności jego tetrakarboksylowej pochodnej DOTA (1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctan) są najbardziej zbadanymi i stosowanymi kompleksami tej klasy CA.
Niemniej jednak, CA typu GdDOTA są systemami o niskiej masie cząsteczkowej, wykazującymi pewne wady, takie jak niska skuteczność kontrastu i szybkie wydalanie przez nerki. Makromolekularne i wielowartościowe CA mogą być dobrym rozwiązaniem tych problemów4. Ponieważ biodystrybucja CA zależy głównie od ich wielkości, makrocząsteczkowe CA wykazują znacznie dłuższe czasy zatrzymywania w tkankach. Co równie ważne, wielowartościowość tych czynników skutkuje zwiększonym lokalnym stężeniem monomerycznej sondy MR (np. kompleksu GdDOTA), co znacznie poprawia pozyskiwany sygnał MR i jakość pomiaru.
Dendrymery są jednymi z najbardziej preferowanych rusztowań do przygotowania wielowartościowych CA do MRI4,5. Te silnie rozgałęzione makrocząsteczki o dobrze zdefiniowanych rozmiarach są podatne na różne reakcje sprzęgania na swojej powierzchni. W niniejszej pracy przedstawiono przygotowanie, oczyszczanie i charakterystykę dendrymerycznego CA do rezonansu magnetycznego składającego się z dendrymeru poli(amidoaminy) (PAMAM) generacji 4 (G4) sprzężonego z chelatami podobnymi do GdDOTA (DCA). Opisujemy syntezę reaktywnej pochodnej DOTA i jej sprzężenie z dendrymerem PAMAM. Po kompleksowaniu z Gd(III) przeprowadzono standardową procedurę charakterystyki fizykochemicznej DCA. Na koniec przeprowadzono eksperymenty MRI, aby wykazać zdolność DCA do tworzenia obrazów MR o silniejszym kontraście niż te uzyskane z CA o niskiej masie cząsteczkowej.

<table><tbody><tr><td>Cyclen</td><td>CheMatech</td><td>C002</td><td></td></tr><tr><td>tert-bromooctan butylu&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14917</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N-dimetyloformamid</td><td>Fluka</td><td>40248</td><td></td></tr><tr><td>Węglan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209619</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-(4-nitrofenylo)butrynowy</td><td>Aldrich</td><td>335339</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek tionylu&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>382662500</td><td>Uwaga: Substancja; toksyczna w przypadku wdychania</td></tr><tr><td>Brom</td><td>Acros Organics</td><td>402841000</td><td>Uwaga: powoduje poważne oparzenia skóry, śmiertelne w przypadku wdychania&nbsp;</td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan sodu</td><td>Acros Organics</td><td>196640010</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>VWR Chemicals</td><td>22711.29</td><td></td></tr><tr><td>tert-butylu 2,2,2-trichloroacetimidian</td><td>Aldrich</td><td>364789</td><td>Uwaga: substancja łatwopalna; działa drażniąco na skórę i oczy</td></tr><tr><td>Eterian trifluorku boru</td><td>Acros Organics</td><td>174560250</td><td>48% BF3. Uwaga: Substancja łatwopalna; powoduje oparzenia skóry, śmiertelne w przypadku wdychania</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Acros Organics</td><td>424270010</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td>Do chromatografii kolumnowej</td></tr><tr><td>n-heksan</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td>Do chromatografii kolumnowej</td></tr><tr><td>Aparatura do destylacji bańka-bańka (Kugelrohr)</td><td>B&uuml; chi</td><td></td><td>Typ modelu: Piec szklany B-585</td></tr><tr><td>Silicagel</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P090.2</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td>Do chromatografii kolumnowej</td></tr><tr><td>Dichlorometan&nbsp;</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td>Do chromatografii kolumnowej</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>Amoniak</td><td>Acros Organics</td><td>428381000</td><td>7 N Roztwór w metanolu</td></tr><tr><td>Pallad</td><td>Aldrich</td><td>643181</td><td>15% na mokro</td></tr><tr><td>Aparatura do uwodornienia PARR</td><td>PARR Instrument Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite 503</td><td>Aldrich</td><td>22151</td><td></td></tr><tr><td>Lejek ze szkła spiekanego</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiofosgen</td><td>Aldrich</td><td>115150</td><td>Uwaga: działa drażniąco na skórę; działa toksycznie w przypadku wdychania</td></tr><tr><td>Trietyloamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>348460010</td><td>Ekstra suche&nbsp;</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAMAM G4 Dendrimer</td><td>Andrews ChemService</td><td>AuCS - 297</td><td>10% wag. roztwór w MeOH</td></tr><tr><td>Lipophylic Sephadex LH-20</td><td>Sigma</td><td>LH20100</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do chromatografii cienkowarstwowej</td><td>Merck Millipore</td><td>1.05554.0001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>VWR Chemicals</td><td>20318.297</td><td></td></tr><tr><td>Lophylizer&nbsp;</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek gadollinium(III) sześciowodny</td><td>Aldrich</td><td>G7532</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Acros Organics</td><td>134070010</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>dowolne źródło</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuhydrat</td><td>Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy (ESI)</td><td>Agilent</td><td></td><td>Ion Syfon SL 1100&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor octanowy</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td>pH 5,8</td></tr><tr><td>Oranżan ksylenolowy</td><td>Aldrich</td><td>52097</td><td>20 &mu; M w buforze octanowym</td></tr><tr><td>Hydrofilowy Sephadex G-15</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0020-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 Membrana</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC900324</td><td>Ultracel-3 (MWCO 3000)</td></tr><tr><td>Wiruj</td> spektrometr NMR <td>z dowolnym źródłem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td>Avance III 300 MHz</td></tr><tr><td>Topspin</td><td>Bruker</td><td></td><td>Version 2.1</td></tr><tr><td>Przyrząd do analizy spalania</td><td>EuroVector SpA</td><td></td><td>Analizator elementarny EuroEA 3000&nbsp;</td></tr><tr><td>Instrument MALDI-ToF MS</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Voyager-STR</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6672.3</td><td></td></tr><tr><td>tert-butylowy alkohol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE16.1</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki Norell NMR</td><td>Deutero GmbH</td><td>507-HP-7</td><td></td></tr><tr><td>Rurka</td> <td>koncentryczna NMRDeutero GmbH</td><td>koncentryczny b-5-7</td><td></td></tr><tr><td>DLS instrument</td><td>Malvern</td><td></td><td>Zetasizer Nano ZS</td></tr><tr><td>0,20 &mu; m Filtr PTFE&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>KC94.1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki z plastikową probówką</td><td>z dowolnego źródła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dotarem</td><td>Guerbet</td><td></td><td>NDC 67684-2000-1</td></tr><tr><td>Skaner MRI</td><td>Bruker</td><td></td><td>BioSpec 70/30 USR magnes (7 T). Uwaga: potencjalne zagrożenia związane z silnymi polami magnetycznymi</td></tr><tr><td>Cewka RF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Cewka objętościowa o podwójnej częstotliwości (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)Paravision</td></tr> <tr><td>(oprogramowanie)</td><td>Bruker</td><td></td><td>Wersja 5.1</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i charakterystyka in vitro środków kontrastowych na bazie dendrymerów do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Paramagnetyczne kompleksy gadolinu(III) z acyklicznymi lub makrocyklicznymi chelatami są najczęściej stosowanymi środkami kontrastowymi (CA) do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI). Ich celem jest zwiększenie tempa relaksacji protonów wodnych w tkance, a tym samym zwiększenie kontrastu obrazu MR i swoistości pomiarów MRI. Obecnie klinicznie zatwierdzone środki kontrastowe to cząsteczki o niskiej masie cząsteczkowej, które są szybko usuwane z organizmu. Zastosowanie dendrymerów jako nośników chelatatorów paramagnetycznych może odegrać ważną rolę w przyszłym rozwoju bardziej wydajnych środków kontrastowych do rezonansu magnetycznego. W szczególności wzrost lokalnego stężenia gatunków paramagnetycznych powoduje wyższy kontrast sygnału. Co więcej, ten CA zapewnia dłuższy czas retencji tkanek ze względu na wysoką masę cząsteczkową i rozmiar. W tym miejscu demonstrujemy wygodną procedurę przygotowania makromolekularnych środków kontrastowych MRI na bazie dendrymerów z poli(amidoaminy) (PAMAM) z monomakrocyklicznymi chelatorami typu DOTA (DOTA – 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctan). Jednostka chelatująca została dołączona poprzez wykorzystanie reaktywności grupy izotiocyjanianów (NCS) w stosunku do grup powierzchniowych aminy dendrymeru PAMAM w celu utworzenia mostków tiomocznikowych. Produkty dendrymeryczne oczyszczono i przeanalizowano za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego, spektrometrii mas i analizy pierwiastkowej. Na koniec zarejestrowano obrazy MR o wysokiej rozdzielczości i porównano kontrasty sygnałowe uzyskane z przygotowanych dendrymerów i dostępnych na rynku środków monomerycznych.

Przygotowanie DCA składało się z dwóch etapów: 1) syntezy monomerycznego chelatora typu DOTA (Rycina 1) oraz 2) sprzężenia chelatora z dendrymerem G4 PAMAM i kolejnej przygotowania dendrymerycznego kompleksu Gd(III) (Rycina 2). W pierwszym etapie przygotowano oparty na cyklenie chelator typu DOTA zawierający cztery kwasy karboksylowe oraz grupę ortogonalną nadającą się do dalszych modyfikacji chemicznych. Proces przygotowania rozpoczynał ...

Ten protokół opisuje przygotowanie i charakterystykę dendrymerowego środka kontrastowego do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI), który przenosi makrocykliczne chelaty koordynujące paramagnetyczne jony gadolinu. W serii eksperymentów MRI in vitro środek ten wytwarzał wzmocniony sygnał MRI w porównaniu z dostępnym na rynku analogiem monomerycznym.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro środków kontrastowych na bazie dendrymerów do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie przygotowania i charakterystyki dendrymerowego paramagnetycznego chelatu, który może być stosowany jako środek kontrastowy w obrazowaniu rezonansem magnetycznym, oraz zademonstrowanie jego działania w eksperymencie obrazowym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kontrastów do MRI, takie jak właściwości i skuteczność dendrymerowych środków kontrastowych. Główną zaletą tej techniki jest wygodne przygotowanie wydajnego środka kontrastowego do MRI o wysokiej zawartości białka, co zapewnia jego łatwą charakterystykę.Metodę tę można rozszerzyć o dalsze modyfikacje strukturalne i optymalizacje funkcjonalne dendrymerowych środków kontrastowych do MRI, co ma duże znaczenie dla potencjalnych zastosowań in vivo. Implikacje obejmują badania biomedyczne i obrazowanie diagnostyczne, ponieważ wysoka masa cząsteczkowa środków kontrastowych opartych na dendrymerach powoduje dłuższy czas retencji w tkankach i znacznie wzmacnia sygnał MRI. W pierwszej kolejze rozpuść jeden gram makrocyklicznego prekursora DO3A w postaci estru tributylowego w pięciu mililitrach DMF.Dodaj 0,67 g węglanu potasu i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Dodaj 0,87 g tert-butylo-2-bromo-4-nitrofenylomaślanu w częściach w ciągu godziny i kontynuuj mieszanie mieszaniny reakcyjnej przez 18 godzin. Następnie usuń DMF za pomocą próżniowej destylacji kolba-do-kolby w temperaturze od 40 do 60 °C.Oczyść pozostałość za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, aby uzyskać stałą substancję o formie kulistej. Rozpuść jeden gram tej substancji w mieszaninie 10 ml etanolu i 150 µL siedmiomolarnego roztworu amoniaku w metanolu. Dodaj 150 mg palladu na węglu aktywnym i umieść reaktor butelkowy w wodoratorze.Mieszaninę wstrząsać przez 16 godzin w atmosferze wodoru pod ciśnieniem 2,5 bar. Do spiekanego lejka szklanego wlać zawiesinę ziemi okrzemkowej w etanolu. Przefiltrować mieszaninę reakcyjną przez ziemię okrzemkową, aby usunąć katalizator z palladu na węglu. Rozpuszczalnik odparować z filtratu za pomocą rotacyjnego koncentratora.Rozpuścić otrzymaną substancję stałą w 15 mililitrach dichlorometanu i czterech ekwiwalentach trietyloaminy. Do tak przygotowanego roztworu dodać 1,3 ekwiwalenta tiofosgenu i mieszać mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Usunąć rozpuszczalnik z mieszaniny reakcyjnej za pomocą ewaporatora rotacyjnego, a pozostałość oczyścić za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, aby otrzymać monomer typu DOTA w postaci jasnobrązowego ciała stałego.Przygotuj 66,7 milligrams dendrymeru G4 PAMAM z 10% roztworu w metanolu, odparowując rozpuszczalnik za pomocą rotavapora w temperaturze 40 °C. Rozpuść dendrymer w czterech mililitrach DMF. Dodaj 0,105 mililitrów trietyloaminy do roztworu dendrymeru i mieszaj przez 45 minut w temperaturze 60 °C.Następnie dodać 354 mg monomeru w częściach w ciągu godziny. Kontynuować mieszanie w temperaturze 45 °C przez 48 godzin. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą próżniowej destylacji z kolby do kolby.Przygotuj kolumnę do chromatografii wykluczania wielkości, zawieszając lipofilne medium do filtracji żelowej w metanolu przez trzy godziny w temperaturze pokojowej. Zbieraj frakcje o objętości jednego mililitra, stosując metanol jako eluent. Przeanalizuj frakcje za pomocą TLC.Usunąć rozpuszczalnik z frakcji zawierających chroniony dendrymerowy chelator za pomocą wirówki rotacyjnej. Wykonać widmo protonowego NMR związku i zintegrować obszary aromatyczne oraz alifatyczne. Na podstawie otrzymanych wartości określić liczbę chronionych makrocykli typu DOTA sprzężonych z dendrymerem PAMAM G4.Aby przeprowadzić deprotekcję produktu, rozpuścić ciało stałe w pięciu mililitrach kwasu mrówkowego i mieszać mieszaninę w temperaturze 60 °C przez 36 godzin. Kwas mrówkowy usunąć za pomocą wirówki rotacyjnej. Pozostałość z wirówki rotacyjnej poddać liofilizacji w celu otrzymania chelatora dendrymerowego.Za pomocą protonowego NMR wyznacz liczbę jednostek makrocyklicznych sprzężonych z dendrymerem. Rozpuść liofilizowany chelatywizator w wodzie. Użyj 0,1 molarnego wodorotlenku sodu, aby dostosować pH roztworu do 7,0.Do roztworu chelatora dodawać kroplami roztwór 113 mg chlorku gadolinu(III) w 1 mL wody przez cztery godziny. Okresowo korygować pH do wartości 7.0 za pomocą 0,05 M wodorotlenku sodu. Mieszaninę mieszać w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.Następnie, w ciągu czterech godzin, dodawaj porcjami 158 miligramów EDTA, korygując w razie potrzeby pH z powrotem do wartości 7.0. Mieszaj przez kolejne 24 godziny w temperaturze pokojowej. Wypełnij kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczkowego hydrofilowym medium do filtracji żelowej spęcznionym w wodzie.Skoncentruj mieszaninę reakcyjną, nałóż ją na kolumnę i eluuj wodą dejonizowaną. Odwiruj oczyszczoną próbkę w jednostce filtra wirówkowego o progu odcięcia 3 kDa przez 30 minut przy 1 800 ×g. Powtórz filtrację około pięciu razy, aby usunąć nadmiar gadolinu i EDTA.Potwierdzić brak wolnych jonów gadolinu w filtracie za pomocą testu z pomarańczowym ksylenolem. Usunąć substancje lotne z przefiltrowanej próbki i poddać pozostałość liofilizacji w celu otrzymania dendrymerycznego środka kontrastowego. Przygotować roztwór zapasowy DCA w wodzie o stężeniu od 5 do 10 mM.Aby określić dokładne stężenie DCA, najpierw połącz 360 µL roztworu zapasowego z 60 µL standardu D2O i tert-butanolu. Umieść 400 µL próbki w zewnętrznej rurce NMR. Do rurki z próbką wprowadź współosiową rurkę insertową NMR zawierającą roztwór referencyjny tert-butanolu i wody.Uzyskaj widmo NMR protonowego i zmierz przesunięcie częstotliwości między sygnałami tert-butanolu w roztworze referencyjnym i próbce. Oblicz stężenie DCA, korzystając z przedstawionego wzoru, uwzględniając korektę o dodany do próbki tert-butanol. W ten sam sposób określ stężenie dostępnego w handlu roztworu GdDOTA.Umieścić roztwory DCA i GdDOTA w buforze HEPES oraz kontrole wodne w dwóch zestawach plastikowych fiolek. Zamknąć fiolki zakrętkami, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Do strzykawki o pojemności 60 mililitrów wprowadzić poziomo próbki DCA o stężeniach 0.01 i 0.02 milimolarna, jedną próbkę GdDOTA o stężeniu 0.5 milimolarna, jedną próbkę GdDOTA o stężeniu 1.0 milimolarna oraz dwie kontrole wodne.Powtórz tę procedurę, ładując drugi zestaw próbek do drugiej strzykawki o pojemności 60 mililitrów. Wypełnij każdą strzykawkę roztworem GdDOTA o stężeniu jeden milimol i zabezpiecz końcówki strzykawek zaślepkami. Umieść jedną ze strzykawek poziomo w skanerze MRI w taki sposób, aby próbki znajdowały się w pionie względem skanera.Wsuń strzykawki do centrum skanera. Wybierz skan anatomiczny, aby ustawić strzykawkę w izocentrum magnesu. Następnie naciśnij przycisk sygnalizatora (traffic light), aby dostosować początkowe parametry skanowania i rozpocząć skanowanie.Wybierz metodę obrazowania pod kątem fast/slow (fast/slow angle shot), aby wykonać obrazowanie T1-zależne, lub metodę szybkiego nabywania obrazu z wzmocnieniem relaksacji (rapid acquisition with relaxation enhancement), aby wykonać obrazowanie T2-zależne. Wykorzystaj skan lokalizacyjny do wyboru przekroju w płaszczyźnie czołowej dla próbek ustawionych pionowo. Zoptymalizuj parametry akwizycji pod kątem stosunku kontrastu do szumu i wykonaj obrazowanie.Użyj okrągłego ROI, aby określić średnią amplitudę sygnału oraz odchylenie standardowe dla tła i dla każdej próbki. Oblicz stosunek sygnału do szumu. Analiza NMR, MALDI-TOF MS oraz analiza pierwiastkowa wykazały, że do dendrymeru G4 PAMAM sprzęgnięto średnio 49 jednostek makrocyklicznych.Za pomocą NMR wyznaczono również stężenia oraz czasy relaksacji podłużnej i poprzecznej roztworów DCA. Uzyskane wartości relaksywności porównano z komercyjnie dostępnym i stosowanym klinicznie monomerem GdDOTA. Wydajność DCA porównano również z monomerem GdDOTA.Dwa zestawy roztworów miały podobne stężenia gadolinu, określone na podstawie liczby sprzężonych jednostek makrocyklicznych, a pozostałe dwa zestawy miały podobne stężenia cząsteczkowe. W eksperymencie obrazowania T1-zależnego przy podobnych stężeniach gadolinu stosunek sygnału do szumu był nieco wyższy dla DCA niż dla GdDOTA. W przypadku roztworów o podobnych stężeniach cząsteczkowych stosunek sygnału do szumu dla DCA był około trzy razy większy niż dla GdDOTA.W eksperymencie z obrazowaniem ważonym T2 stosunek sygnału do szumu dla DCA był znacznie niższy niż dla GdDOTA w obu parach stężeń, szczególnie przy wyższych stężeniach DCA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować oczyszczony i scharakteryzowany środek kontrastowy do MRI oparty na dendrymerach. Postępując zgodnie z tą procedurą, można przygotować różne rodzaje dendrymerowych i nanometrycznych środków kontrastowych do MRI poprzez modyfikację jednostek cząsteczki, a następnie w wygodny sposób poddać je analizie.Po opanowaniu tej techniki badacze zajmujący się rozwojem środków kontrastowych do MRI powinni być w stanie przygotować szereg specyficznych sond do przeprowadzenia różnych badań funkcjonalnych o kluczowym znaczeniu dla współczesnego obrazowania molekularnego.

preparation-vitro-characterization-dendrimer-based-contrast-agents

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W tym filmie pokazujemy, jak znakować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) za pomocą chlorku manganu (MnCl2), który może wnikać do komórek poprzez napięciowo zależne kanały wapniowe, gdy komórki są biologicznie aktywne. Dodatkowo prezentujemy zastosowanie MnCl2 jako komórkowego środka kontrastowego w MRI w celu określenia żywotności hESC in vitro.

Znakowanie in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Prezentujemy proces metalacji, oczyszczania i charakterystyki kompleksów lantanowców. Opisane tutaj kompleksy mogą być sprzęgane z makrocząsteczkami, co umożliwia śledzenie tych cząsteczek za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym.

Przygotowanie, oczyszczanie i charakterystyka kompleksów lantanowców do zastosowania jako środki kontrastowe w obrazowaniu rezonansem magnetycznym

Wczesne wykrywanie apoptozy może pomóc w identyfikacji populacji komórek wysokiego ryzyka w różnych jednostkach chorobowych. Prezentujemy tutaj metodę łączenia białka służącego do wczesnego wykrywania apoptozy (Aneksyna V) z nanocząsteczką tlenku żelaza wykrywalną w badaniu MRI (SPIO). Metoda ta może zostać rozszerzona na inne interesujące białka w celu tworzenia sond do obrazowania molekularnego wykrywalnych za pomocą MRI.

Synteza sondy do detekcji apoptozy w MRI in vivo

Śledzenie komórek za pomocą MRI zyskało niezwykłą uwagę w ostatnich latach. Protokół ten opisuje znakowanie komórek dendrytycznych cząstkami bogatymi w fluor (19F), zastosowanie tych komórek in vivo oraz monitorowanie zakresu ich migracji do drenującego węzła chłonnego za pomocą 19F/1H MRI i 19F MRS.

Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego 19F / 1H

Czujniki fluorescencji są potężnymi narzędziami w naukach przyrodniczych. W tym miejscu opisujemy metodologię syntezy i wykorzystania czujników fluorescencyjnych na bazie dendrymerów do pomiaru pH w żywych komórkach i in vivo. Rusztowanie dendrytyczne wzmacnia właściwości sprzężonych barwników fluorescencyjnych, co prowadzi do poprawy właściwości wykrywania.

Synteza, dostarczanie komórkowe i zastosowanie in vivo czujników pH na bazie dendrymerów

Aby zademonstrować obrazowanie molekularne raka MR za pomocą środka kontrastowego MRI z małym peptydem specyficznym dla skrzepłych białek osocza w zrębie guza w modelu raka prostaty u myszy.

Obrazowanie molekularne MR raka prostaty z drobnocząsteczkowym środkiem kontrastowym ukierunkowanym na peptyd CLT1

Opisujemy ogólny protokół śledzenia komórek in vivo za pomocą MRI w modelu mysim z komórkami oznaczonymi ex vivo. Dołączony jest typowy protokół do znakowania komórek, przetwarzania akwizycji obrazu i kwantyfikacji.

Rezonans magnetyczny in vivo 19F do śledzenia komórek

Ten protokół opisuje syntezę biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek i ich zastosowanie jako multimodalnych, molekularnych środków obrazowania. Nanocząstki mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu lub manganu w rdzeniu nanocząstki generują kontrast MRI. Otoczka biofunkcjonalna zawiera fluorofory do obrazowania fluorescencyjnego i ligandy celujące do celowania molekularnego.

Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Bariera krew-mózg jest znaczącą przeszkodą w dostarczaniu terapii glejaka, choroby, na którą nie ma lekarstwa. W tym miejscu przedstawiamy sterowaną obrazem in vivo terapeutyczną platformę nano tlenku żelaza, która może ominąć tę fizjologiczną barierę ze względu na rozmiar i gromadzić się w guzie.

Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego

Poznaj przygotowanie i charakteryzację dendrymerowych środków kontrastowych do rezonansu magnetycznego z jonami gadolinu. Ta metoda umożliwia uzyskanie wzmocnionego sygnału MRI in vitro.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro środków kontrastowych na bazie dendrymerów do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie i charakterystyka in vitro środków kontrastowych na bazie dendrymerów do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

Przeglądaj więcej filmów