Przygotowanie i charakterystyka in vitro środków kontrastowych na bazie dendrymerów do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie przygotowania i charakterystyki dendrymerycznego chelatacji paramagnetycznej, która może być stosowana jako środek kontrastowy do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego oraz wykazanie jego działania w eksperymencie obrazowania. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie środków kontrastowych MRI, takie jak właściwości i skuteczność dendrymerycznych środków kontrastowych. Główną zaletą tej techniki jest wygodne przygotowanie skutecznego środka kontrastowego MRI o wysokiej zawartości białka, zapewniając tym samym jego łatwą charakterystykę.

Metoda ta może zostać rozszerzona na dalsze modyfikacje strukturalne i optymalizacje funkcjonalne dendrymerycznych środków kontrastowych MRI, co ma ogromne znaczenie dla potencjalnych zastosowań in vivo. Implikacje rozciągają się na badania biomedyczne i obrazowanie diagnostyczne, ponieważ wysoka szybkość cząsteczkowa dendrymerycznych środków kontrastowych powoduje dłuższy czas retencji tkanek i znacznie wzmacnia sygnał MRI. Najpierw rozpuść jeden gram makrocyklicznego prekursora estru tributylowego DO3A w pięciu mililitrach DMF.

Dodaj 0,67 grama węglanu potasu i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Dodawać 0,87 grama 4-butanianu 4-nitrofenylu tert-butylo-2-bromo-4 porcjami przez godzinę i kontynuować mieszanie mieszaniny reakcyjnej przez 18 godzin. Następnie usuń DMF za pomocą destylacji próżniowej bańka-bańka w temperaturze od 40 do 60 stopni Celsjusza.

Oczyścić pozostałość za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym w celu uzyskania okrągłego ciała stałego. Rozpuścić jeden gram ciała stałego w mieszaninie 10 mililitrów etanolu i 150 mikrolitrów siedmiu normalnych roztworów amoniaku w metanolu. Dodaj 150 miligramów palladu do węgla aktywnego i ustaw reaktor butelkowy w wodorogenatorze.

Wstrząsać mieszaniną przez 16 godzin w atmosferze wodoru o ciśnieniu 2,5 bara. Wlać zawiesinę ziemi okrzemkowej w etanolu do lejka ze spiekanego szkła Przefiltrować mieszaninę reakcyjną przez ziemię okrzemkową w celu usunięcia katalizatora palladowo-węglowego. Usunąć rozpuszczalnik z filtratu na wyparce obrotowej.

Powstałe ciało stałe rozpuścić w 15 mililitrach dichlorometanu i czterech równoważnych trietyloaminy. W tym celu dodaj 1,3 ekwiwalentu tiofosgenu i mieszaj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Usunąć rozpuszczalnik z mieszaniny reakcyjnej na wyparce obrotowej i oczyścić pozostałość za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym w celu otrzymania monomeru typu DOTA w postaci jasnobrązowego ciała stałego.

Przygotować 66,7 miligrama dendrymera G4 PAMAM z 10% roztworu w metanolu, odparowując rozpuszczalnik na wyparce obrotowej w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Rozpuść dendrymer w czterech mililitrach DMF. Dodaj 0,105 mililitra trietyloaminy do roztworu dendrymera i mieszaj przez 45 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza.

Następnie dodawaj 354 miligramy monomeru porcjami przez godzinę. Kontynuuj mieszanie w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą destylacji próżniowej od bańki do bańki.

Umieścić kolumnę chromatograficzną wykluczającą rozmiar, mieszając lipofilowe żelowe medium filtracyjne w metanolu przez trzy godziny w temperaturze pokojowej. Zbierz frakcje jednego mililitra, używając metanolu jako eluentu. Analizuj ułamki przez TLC.

Usunąć rozpuszczalnik z frakcji zawierających chroniony chelator dendrymeryczny na wyparce obrotowej. Uzyskaj widmo protonów NMR związku i zintegruj regiony aromatyczne i alifatyczne. Korzystając z tych wartości, określ liczbę chronionych makrocykli typu DOTA sprzężonych z dendrymerem G4 PAMAM.

Aby usunąć ochronę produktu, rozpuść ciało stałe w pięciu mililitrach kwasu mrówkowego i mieszaj mieszaninę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 36 godzin. Usuń kwas mrówkowy za pomocą wyparki obrotowej. Liofilizować pozostałości usunięte z wyparki obrotowej w celu uzyskania dendrymerowego chelatora.

Za pomocą protonowego NMR określ liczbę jednostek makrocyklicznych sprzężonych z dendrymerem. Rozpuść liofilizowany chelator w wodzie. Użyj 0,1 molowego wodorotlenku sodu, aby dostosować pH roztworu do 7,0.

Dodaj roztwór 113 miligramów chlorku gadolinu III w jednym mililitrze wody kroplami do roztworu chelatora przez okres czterech godzin. Okresowo dostosowywać pH do 7,0 za pomocą 0,05 molowego wodorotlenku sodu. Mieszaj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.

Następnie dodawaj 158 miligramów EDTA porcjami przez cztery godziny, korygując pH z powrotem do 7,0 w razie potrzeby. Mieszaj przez kolejne 24 godziny w temperaturze pokojowej. Umieścić kolumnę chromatograficzną wykluczającą wielkość z hydrofilowym żelowym medium filtracyjnym spęczniejącym w wodzie.

Zagęścić mieszaninę reakcyjną, załadować mieszaninę do kolumny i wymyć wodą dejonizowaną. Odwirować oczyszczoną próbkę w trzykilodaltonowej wirówce filtrującej przez 30 minut przy 1 800 razy g. Powtórz filtrację około pięć razy, aby usunąć nadmiar gadolinu i EDTA.

Potwierdzić brak wolnych jonów gadolinu w filtracie za pomocą testu z użyciem oranżu ksylenolowego. Usunąć substancje lotne z przefiltrowanej próbki i wysuszyć pozostałość na zimno w celu uzyskania dendrymerowego środka kontrastowego. Przygotować podstawowy roztwór DCA w wodzie o stężeniu od pięciu do 10 milimolów.

Aby określić dokładne stężenie DCA, najpierw połącz 360 mikrolitrów roztworu podstawowego z 60 mikrolitrami wzorca D2O i tert-butanolu. Umieścić 400 mikrolitrów próbki w zewnętrznej probówce NMR. Umieścić współosiową probówkę z wkładką NMR zawierającą tert-butanol i wodny roztwór odniesienia do probówki z próbką.

Uzyskaj widmo protonu NMR i zmierz przesunięcie częstotliwości między sygnałami tert-butanolu roztworów odniesienia i roztworów próbek. Obliczyć stężenie DCA, korzystając z podanego wzoru, korygując o dodany tert-butanol w próbce. W ten sam sposób należy określić stężenie dostępnego na rynku roztworu GdDOTA.

Umieść roztwory DCA i GdDOTA w buforze HEPES i regulatorach wody w dwóch zestawach plastikowych fiolek. Zamknąć fiolki nakrętkami, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Do 60-mililitrowej strzykawki załaduj poziomo 0,01 i 0,02 milimolowe próbki DCA, jedną z 0,5 i 1,0 milimolowych próbek GdDOTA oraz dwie kontrole wody.

Powtórz tę procedurę, ładując drugi zestaw próbek do drugiej strzykawki o pojemności 60 mililitrów. Napełnić każdą strzykawkę jednym milimolowym roztworem GdDOTA i zakryć końcówki strzykawki. Umieścić jedną ze strzykawek poziomo w skanerze MRI, tak aby próbki były pionowo w stosunku do skanera.

Wsunąć strzykawki na środek skanera. Wybierz skan anatomiczny, aby umieścić strzykawkę w izośrodku magnesu. Następnie naciśnij przycisk sygnalizacji świetlnej, aby dokonać regulacji początkowych parametrów skanowania i rozpocząć skanowanie.

Wybierz metodę zdjęcia pod szybkim/wolnym kątem, aby wykonać obrazowanie zależne T1 lub metodę szybkiej akwizycji z poprawą relaksacji, aby wykonać obrazowanie ważone T2. Użyj skanowania lokalizatora, aby wybrać wycinek koronalny dla próbek wyrównanych w pionie. Zoptymalizuj kontrast do parametrów akwizycji szumu i uzyskaj obraz.

Użyj kołowego zwrotu z inwestycji, aby określić średnią amplitudę sygnału i odchylenie standardowe dla tła i dla każdej próbki. Oblicz stosunek sygnału do szumu. NMR, MALDI-TOF MS i analiza elementarna wykazały, że średnio 49 jednostek makrocyklicznych było sprzężonych z dendrymerem G4 PAMAM.

Za pomocą NMR oznaczono również stężenia oraz czasy relaksacji podłużnej i poprzecznej roztworów DCA. Uzyskane wartości relaksacyjności porównano z dostępnym na rynku i stosowanym klinicznie monomerem GdDOTA. Wydajność DCA została również porównana z monomerem GdDOTA.

Dwa zestawy roztworów miały podobne stężenia gadolinu określone liczbą sprzężonych jednostek makrocyklicznych, a pozostałe dwa zestawy miały podobne stężenia molekularne. W eksperymencie obrazowania ważonego T1 z podobnymi stężeniami gadolinu stosunek sygnału do szumu był nieco wyższy dla DCA niż dla GdDOTA. Gdy roztwory miały podobne stężenia w poszczególnych cząsteczkach, stosunek sygnału do szumu DCA był około trzy razy większy niż w przypadku GdDOTA.

W eksperymencie obrazowania ważonego T2 stosunek sygnału do szumu DCA był znacznie niższy niż GdDOTA w obu parach stężeń, szczególnie przy wyższych stężeniach DCA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować oczyszczony i scharakteryzowany środek kontrastowy MRI na bazie dendrymerów. Po tej procedurze można przygotować różne rodzaje dendrymerycznych i nanowymiarowych środków kontrastowych MRI, modyfikując jednostki cząsteczki i wygodnie analizować.

Po opanowaniu tej techniki, naukowcy zajmujący się opracowywaniem środków kontrastowych do rezonansu magnetycznego powinni być w stanie przygotować szereg specyficznych sond do wykonywania różnych badań funkcjonalnych o krytycznym znaczeniu dla współczesnego obrazowania molekularnego.