Analiza cytometryczna przepływu aktywności litycznej komórek NK w ludzkiej krwi pełnej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie liczby komórek NK i poziomów aktywacji cytotoksycznej w ludzkiej próbce krwi pełnej w szybki, wiarygodny i stabilny sposób. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie immunologii, takie jak: Jaki jest wpływ zewnętrznych interwencji na bioaktywność komórek NK? Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka i dokładna, a jednocześnie zapewnia powtarzalne wyniki we wszystkich eksperymentach.

Aby wyizolować komórki NK z ludzkiej krwi pełnej, najpierw umieść 15-mililitrowe probówki oznaczone jako próbka krwi pełnej, frakcja ujemna i frakcja dodatnia w odpowiednich pozycjach w stojaku na probówki separatora komórek. Po załadowaniu wszystkich probówek włóż stojak separatora do minipróbnika w celu automatycznego etykietowania i wybierz opcję Odczynnik w menu, aby podświetlić pozycję, w której fiolka zostanie umieszczona na stojaku. Wybierz opcję Czytaj odczynnik, aby aktywować czytnik kodów 2D i trzymaj odpowiednią fiolkę z odczynnikiem przed czytnikiem kodów 2D pod kątem od 0,5 do 2,5 centymetra od pokrywy czytnika kodów.

Umieścić odczytaną fiolkę w odpowiednim miejscu na stojaku separatora. Następnie na karcie Separacja zaznacz żądane pozycje. Następnie otwórz podmenu Etykietowanie i wybierz program do automatycznego etykietowania.

Przypisz mikrokulki odczynnika do separacji komórek do pozycji stojaka 1, 2, 3 i 4. I wybierz program separatonowy Posselwb. Wybierz program Rinse Wash.

Wprowadź 1500 mikrolitrów dla objętości próbki w podmenu Objętość i naciśnij Enter. Następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć rozdzielanie komórek. Kliknij przycisk OK, aby potwierdzić, że dostępna jest wystarczająca ilość buforu do przetworzenia wszystkich próbek.

Aby przygotować próbkę do testu cytotoksyczności, najpierw oznacz 1,5-mililitrowe probówki dla każdej próbki i / lub uczestnika, jeśli to konieczne, a następnie wylej pożądany stosunek komórek NK i komórek K562 znakowanych DIO do każdej probówki. Zebrać komórki przez odwirowanie i ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Następnie ponownie zawieś mieszaninę komórek w 500 mikrolitrach niekompletnego podłoża komórkowego NK i oznacz komórki w każdej probówce 5 mikrolitrami jodku propidyny.

Zebrać komórki przez kolejne odwirowanie i inkubować kulturę wybrakowaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Pod koniec inkubacji odwirować komórki w tych samych warunkach wirowania i ponownie zawiesić osad w 25 mikrolitrach świeżej, niekompletnej pożywki do hodowli komórek NK. Aby przeanalizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej, najpierw kliknij przycisk uruchamiania w oprogramowaniu cytometru przepływowego do obrazowania, aby przepłukać system.

Następnie kliknij przycisk wykresu rozrzutu, aby utworzyć cztery wykresy rozrzutu i załaduj podwójną dodatnią rurkę kontrolną. Korzystając z podwójnej dodatniej próbki kontrolnej, określ żądaną intensywność lasera o mocy 405 miliwatów, aby detektor nie był przeciążony, i ustaw kamerę tak, aby uzyskała odpowiednią liczbę zliczeń komórek. Ustawienie lasera o mocy 405 miliwatów na intensywność, która jest odpowiednia do wykrywania zarówno DIO, jak i PI, będzie wymagało doświadczenia zarówno z barwnikami, jak i zakresem wykrywania cytometru przepływowego.

Po zakończeniu pozyskiwania podwójnej próbki kontroli dodatniej załaduj próbkę kontrolną tylko DIO, wybierz obiektyw 40X i wyłącz laser o mocy 642 miliwatów i kanał Brightfield. Rozmnożyć odpowiednią liczbę komórek i powtórzyć pobieranie próbki zawierającej tylko jodek propidyny. Po uruchomieniu wszystkich próbek kontrolnych włącz ponownie laser o mocy 405 miliwatów i kanał Brightfield, a następnie kliknij przycisk Set Intensity (Ustaw intensywność).

Następnie na karcie Pobieranie plików wprowadź niestandardową nazwę pliku i wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki danych. Następnie wprowadź liczbę komórek, które mają zostać pobrane. Załaduj pierwszą probówkę z próbką eksperymentalną i kliknij przycisk Pobierz.

Po uruchomieniu wszystkich próbek otwórz aplikację do analizy cytometru przepływowego do obrazowania i otwórz pojedynczy eksperymentalny plik RIF. Na karcie Wynagrodzenie wybierz opcję Utwórz nową macierz. Oprogramowanie poprosi o wybór plików jednokolorowych i połączy je w celu utworzenia pliku macierzy, który zostanie wybrany do zastosowania kompensacji kanałów.

Użyj funkcji Bloki konstrukcyjne, aby skonfigurować odpowiednie wykresy kropkowe. Następnie kliknij funkcję statystyk, aby uzyskać dostęp do numerów komórek w każdej bramie. W tym reprezentatywnym eksperymencie pobrano próbki krwi zgodnie ze wskazaniami i zmierzono stężenie komórek NK na mililitr krwi pełnej dla każdego biegacza i średnio dla każdego punktu czasowego.

Trzech z czterech biegaczy wykazało podobny niewielki wzrost liczby komórek NK po wysiłku. Natychmiast po nim nastąpił gwałtowny spadek, po czym powoli wraca do normy, 24 do 48 godzin po zakończeniu wydarzenia. Średnio liczba komórek NK zmniejszyła się o 1,5 godziny po wysiłku, ale wróciła do prawie normalnego poziomu po 24 godzinach.

Po obliczeniu liczby komórek, aktywność cytotoksyczna komórek NK została natychmiast przeanalizowana, jak właśnie wykazano, ze średnim spadkiem cytotoksyczności komórek NK natychmiast i 1,5 godziny po zakończeniu ćwiczenia, które znacznie wzrosło przez 24 godziny po wysiłku. Cytotoksyczność NK pozostała wysoka w porównaniu z poziomami sprzed wysiłku, choć nieznacznie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około cztery godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać i scharakteryzować liczbę komórek NK i aktywność cytotoksyczną z próbek ludzkiej krwi w powtarzalny sposób hydropochowy.