Wykorzystanie technologii druku 3D do połączenia rezonansu magnetycznego z histologią: protokół sekcji mózgu

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest dokładne dopasowanie wolumenów obrazów z rezonansu magnetycznego do przekrojów histologicznych poprzez stworzenie spersonalizowanych, wydrukowanych w technologii 3D uchwytów do mózgu i pudełek do krojenia. Choć niniejszy film skupia się na tkance mózgowej pobranej od marmoszeta, protokół ten można zastosować do każdego mózgu, niezależnie od tego, czy pochodzi on od gryzonia, naczelnego spoza gatunku ludzkiego czy człowieka. Należy przygotować stanowisko pracy zgodnie z opisem zawartym w protokole.

Wypełnij probówkę Fomblinem i gazą do poziomu 20 ml. Ściśnij gazę, aby usunąć pęcherzyki powietrza w trakcie napełniania. Delikatnie osusz mózg z formaliny.

Następnie włóż mózg przodem w stronę dna probówki. Ostrożnie unieruchom mózg w probówce, owijając jego boki gazą, aby ustabilizować jego położenie. Resztę probówki wypełnij gazą i Fomblinem.

W trakcie pracy ostrożnie usuwaj pęcherzyki powietrza. Następnie zabezpiecz zakrętkę i uszczelnij probówkę parafina. Zaznacz zakrętkę i linię wzdłuż szczeliny między półkulami.

Następnie owiń probówkę ręcznikiem papierowym i włóż ją do cewki tak, aby oznaczenie znajdowało się w górnej pozycji centralnej. Wsuń cewkę do skanera MRI. Po akwizycji i postprocesingu otrzymujemy obraz ważony T2, który możemy wykorzystać do stworzenia cyfrowego modelu mózgu.

Otwórz obraz MRI w orientacji wieńcowej. Następnie użyj narzędzi transformacji, aby przepróbkować obraz do izotropowych wokseli o rozmiarze 1 milimetra. W kolejnym kroku zastosuj nieliniowy filtr redukcji szumów.

Wybierz tabelę wyszukiwania w ustawieniach wyświetlania. Następnie kliknij przycisk podwójnego progu (dual Threshold). Przesuń suwak na wykresie tak, aby objął on cały mózg.

Utwórz binarną maskę mózgu, korzystając z algorytmu segmentacji Threshold using min/max. W polu Lower limit wpisz wartość znajdującą się w lewym dolnym rogu wykresu intensywności, tuż poniżej skali. Następnie wybierz opcję Binary i odznacz pole Inverse threshold.

Wybierz algorytm Morphological, Fill holes. Zaznacz opcję Process in 2.5D. Aby wypełnić lukę między mózgiem tylnym a korą, wybierz line VOI.

Narysuj połączenie między móżdżkiem a korą po obu stronach mózgu w najbardziej bocznych punktach. Kontynuuj rysowanie połączeń VOI przez mózg. Przekształć obszary VOI w maskę binarną.

Użyj kalkulatora obrazów (Image calculator), aby połączyć binarne maski VOI i mózgu, wybierając operację OR. Zaznacz opcję Promote destination image type. Następnie wybierz algorytm morfologiczny Fill holes.

Następnie zaznacz opcję Process w 2.5D. Wybierz algorytm Extract surface, zaznacz Mask image, wprowadź nazwę, a następnie wybierz typ pliku ply. Przerwy w ramce cięcia odpowiadające położeniu płaszczyzny przekroju można ustawić zaczynając od przedniej części mózgu, tylnej części mózgu lub względem obszaru zainteresowania, takiego jak widoczne tutaj zmiany w istocie białej.

Używając narzędzia box VOI, narysuj ramkę wokół mózgu. Skopiuj i wklej ramkę na taką liczbę warstw MRI, jaka odpowiada zamierzonej grubości szczelin między płytkami. Następnie przesuń się o liczbę warstw MRI przypadającą na jeden przekrój i umieść ramkę w ten sam sposób co poprzednio, aby stworzyć kolejną szczelinę między ostrzami.

Powtórz ten proces w obrębie mózgu. Przekształć obszary VOI w postaci pudełek w maskę binarną. Następnie wyodrębnij powierzchnię, korzystając z funkcji Extract surface, tak jak zrobiono to wcześniej dla mózgu.

Wybierz maskę binarną przerwy między ostrzami. Użyj funkcji Image math, aby pomnożyć ją przez 10 000. Następnie użyj kalkulatora obrazów (Image calculator), aby dodać pomnożoną maskę binarną do przeباًplowanej izotropowej MRI.

Po wybraniu widoku triplanarnego można zobaczyć mapę ostrzy MRI pokazującą miejsca nacięć mózgu w trzech rzutach ortogonalnych. W programie Netfabb Professional należy wybrać opcję Add part, a następnie wybrać modele Blade Gap oraz Brain Model plys.

Wybierz model mózgu i kliknij tryb naprawy. Użyj przycisku wyboru powłoki, aby zaznaczyć mózg. Następnie przełącz zaznaczenie na pozostałe powłoki i usuń je.

Następnie zastosuj naprawę i usuń starą część. Mając zaznaczony mózg, wybierz opcję Przesuń (Move). Kliknij Przenieś do początku (to origin) i zapisz parametry w polach X, Y oraz Z.

Są one niezbędne do utrzymania odpowiedniego ustawienia szczeliny między ostrzami. Kliknij przycisk translate. Następnie zamknij okno.

Wybierz model Blade Gap i przetransportuj go, korzystając z parametrów zapisanych w poprzednim kroku. Wybierz model Brain i kliknij tryb naprawy (repair mode). Użyj przycisku wyboru powłoki (shell selection), aby zaznaczyć mózg.

Następnie wybierz Smooth triangles. W polu Iterations wprowadź wartość cztery. Następnie zaznacz opcję Prevent volume shrinking.

Wybierz opcję Reduce Triangles i wpisz 200000 w polu Target Triangle Count. Następnie wybierz Automatic repair i wykonaj naprawę domyślną. Zatwierdź naprawę.

Następnie wyeksportuj wygładzony model mózgu w formacie STL. Zaimportuj wygładzony model mózgu do programu Meshmixer. Użyj narzędzi rzeźbiarskich, aby wygładzić obszary zaznaczone liniowymi VOI.

Następnie należy naprawić wszelkie pozostałe drobne defekty modelu. Wygładzony i zedytowany model mózgu należy zaimportować do programu Netfabb Professional. Następnie należy dodać część: brain slicer parts marmoset.

Wybierz opcję Shells do parts. Następnie zmień nazwę każdej części zgodnie z opisem w protokole. Korzystając z ustawień zaznaczania opisanych w protokole, klikaj i przeciągaj części, aby ustawić mózg w centrum ramki.

Przeciągnij elementy, aby dostosować głębokość mózgu w obszarze zaznaczenia. Wybierz wygładzony, edytowany model mózgu, model wycinający w obszarze zaznaczenia i wybierz operację boolean. Kliknij model mózgu, aby zmienić jego kolor na czerwony.

Następnie wybierz odejmowanie boole'owskie. Zastosuj obliczenia. Zaznacz pola dotyczące wystających elementów, które mogłyby przeszkodzić w prawidłowym umieszczeniu mózgu.

Sposób ich usuwania znajduje się w sekcji uzupełniającej protokołu. Wybierz model przerwy między ostrzami i kliknij przycisk przesuń. Wykonaj pomiar w pozycji Z.

Będzie to pozycja najbardziej tylnej szczeliny między ostrzami. Następnie zamknij okno. Wybierz część ostrza z listy części urządzenia do krojenia mózgu i kliknij Przesuń.

Wprowadź wartość Z z poprzedniego kroku. Następnie wprowadź bieżące wartości pozycji X i Y. Wybierz opcję absolutnego przesunięcia (absolute Translation) i wykonaj przesunięcie.

Kliknij przycisk Duplicate. Jeśli grubość przekroju jest jednolita, tak jak pokazano tutaj, wprowadź całkowitą liczbę łopatek, łączną liczbę oraz wartość Z count, a w polu Z gap wpisz grubość przekroju. Następnie wybierz duplicate.

Wybierz część ostrza mikrotomu z elementów przecinarki do mózgu. Powtórz te same kroki przesuwania i powielania, które zostały wykonane w przypadku części ostrza. Zaznacz wszystkie ostrza mikrotomu oraz główny uchwyt ostrza, a następnie kliknij operację boole'owską.

Wybierz wszystkie noże mikrotomu, aby zmienić ich kolor na czerwony, i kliknij odejmowanie boole'owskie. Następnie zastosuj obliczenia. Wejdź w tryb naprawy i wybierz automatyczną naprawę.

Wykonaj rozszerzoną naprawę (Extended Repair), a następnie zastosuj poprawki. Eksportuj uchwyt ostrzy do formatu STL. Zaznacz wszystkie ostrza, główny i pomocniczy obszar ograniczający oraz wygładzony, edytowany model mózgu, a następnie kliknij operację boolowską.

Użyj okna wyboru części, aby zmienić kolor wszystkich części, z wyjątkiem głównego pudełka, na czerwony. Następnie wybierz odejmowanie boole'owskie. Zastosuj obliczenia.

Przejdź do trybu naprawy i zaznacz pole dotyczące ostrych krawędzi, które mogłyby uszkodzić mózg. Można je naprawić w trybie naprawy programu Netfabb lub za pomocą narzędzi do rzeźbienia w programie Meshmixer.

Następnie wybierz Automatyczna naprawa. Przeprowadź Rozszerzoną naprawę. Następnie zastosuj naprawę.

Wyeksportuj Brain Box do formatu STL. W programie Cura wybierz opcję Load i zaimportuj Brain Box. Kliknij przycisk Rotate.

Następnie kliknij i przeciągnij, aby rozłożyć pudełko płasko. Edytuj ustawienia drukowania zgodnie z instrukcją opisaną w protokole. Następnie zapisz ścieżkę narzędzia.

Postępuj w ten sam sposób w przypadku uchwytu ostrza, a następnie powiel obiekt. Następnie zapisz ścieżkę narzędzia. Po nałożeniu cienkiej warstwy kleju na stół drukarki, wydrukuj obudowę mózgu oraz uchwyty ostrzy na drukarce 3D, korzystając z ustawień opisanych w protokole.

Po zakończeniu drukowania można przystąpić do przygotowania mózgu do cięcia. Przygotuj stanowisko pracy zgodnie z opisem w protokole. Ostrożnie umieść mózg w pudełku i upewnij się, że jest on stabilnie zamocowany.

Umieść noże mikrotomowe w uchwytach w odpowiednich szczelinach w pudełku. W rękawicach ochronnych mocno dociśnij uchwyty noży. Stosuj powolny, zrównoważony nacisk, aby przeciąć mózg.

Usuwaj plastry pojedynczo, zaczynając od przedniej części mózgu. Choć podejście to jest proste, metoda wymaga wielu etapów oraz zastosowania kilku rodzajów oprogramowania, dlatego badacze powinni zapoznać się z interfejsami użytkownika przed rozpoczęciem procedury. Poniższy schemat pracy podsumowuje protokół wykonania pudełka do krojenia mózgu marmosety.

Mózg utrwalono formaliną, a następnie wykonano obrazowanie MRI w obrazach ważonych T2 z rozdzielczością 150 mikronów. Obrazy poddano procesowi przetwarzania i progowaniu w celu utworzenia maski binarnej. Następnie powierzchnię wyrenderowano w oprogramowaniu do modelowania 3D.

Odejmowanie boole'owskie szablonu skrawacza od modelu mózgu pozwala na stworzenie cyfrowego modelu skrawacza do mózgu. Następnie obudowa skrawacza do mózgu jest drukowana na drukarce 3D. Mózg jest następnie stabilnie umieszczany w obudowie skrawacza w celu wykonania cięć.

Po pokrojeniu mózgu porównanie wizualne obrazów MRI in vivo i post-mortem oraz zdjęć powierzchni zewnętrznych plastrów wykazuje dobrą zgodność orientacji w wielu plastrach. Bardziej szczegółowe porównanie wysokorozdzielczego MRI post-mortem z przekrojami histologicznymi z wielu plastrów mózgu, barwionymi LFB CV, wykazuje dokładną i spójną zgodność we wszystkich strukturach mózgu marmosety. W tym modelu zwierzęcym stwardnienia rozsianego u zwierząt rozwijają się zmiany w istocie białej rozproszone w całym mózgu.

Stosując tę technikę, niewielkie zmiany wykryte w badaniu MRI in vivo można śledzić zarówno na obrazach MRI post-mortem, jak i na skrawkach histologicznych. Badania histologiczne i MRI post-mortem mogą również ujawnić zmiany, które zostały pominięte w badaniu MRI in vivo. W tym przypadku badanie MRI in vivo nie wykazało przekonujących dowodów w postaci normalnego, hiperintensywnego sygnału, który sugerowałby obecność zmian w którymkolwiek z pasm wzrokowych.

Niemniej jednak, w badaniu MRI pośmiertnym zaobserwowano hiperintensywność sygnału w obrębie drogi wzrokowej. Obszary te odpowiadały bezpośrednio zmianom w mielinie widocznym w przekroju histologicznym barwionym LFB CV. Podsumowując, przedstawiona tutaj metodologia pozwala badaczom na dokładną ocenę patologii leżącej u podstaw wyników MRI.

Uważamy, że jest to obiecujące podejście do identyfikacji nowych biomarkerów chorób obejmujących mózg oraz specyficznych procesów patologicznych, takich jak stan zapalny i remielinizacja.