Name: Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę nanoscale PCR do wysokoprzepustowego wykrywania patogenów DNA i RNA w próbkach oddechowych psów i koni. Ta technika poprawia efektywność diagnostyki weterynaryjnej i wspiera inicjatywy OneHealth.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisane tutaj prace nad testami patogenów układu oddechowego były wspierane przez wewnętrzne fundusze rozwojowe Cornell Animal Health Diagnostic Center. Opracowanie nanoskalowego przepływu pracy PCR i związanych z nim systemów zapewnienia jakości zostało częściowo sfinansowane (FOA PA-13-244) i przeprowadzone we współpracy z Siecią Badań i Odpowiedzi Laboratoriów Weterynaryjnych Agencji ds. Żywności i Leków (FDA Vet-LIRN) w ramach grantu nr 1U18FD005144-01. Opłaty za publikację zostały ufundowane przez VWR i Quanta Biosciences. Dziękujemy Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, XiuLin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang i Katrinie Walker za pomoc w napisaniu i przejrzeniu protokołu. Dziękujemy Mike'owi Carrollowi za nakręcenie wywiadów z autorami. Na koniec dziękujemy redaktorowi i trzem anonimowym recenzentom za ich pomocne komentarze.

<ol><li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li>
<li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), e123(2006).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+%28RT-PCR%29%3A+trends+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).</li>
<li>McCall, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+benchmark+for+microRNA+quantification+algorithms+using+the+OpenArray+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform.</a> BMC bioinformatics. 17 (1), 138(2016).</li>
<li>Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+traceability+of+cattle+using+an+OpenArray+genotyping+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform.</a> Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).</li>
<li>Grigorenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+screening+for+blood-borne+viral%2C+bacterial%2C+and+protozoan+parasites+using+an+OpenArray+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform.</a> J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).</li>
<li>Shu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).</li>
<li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+equine+herpesvirus+type+1+by+real+time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR.</a> J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).</li>
<li>Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bacteriophage+MS2+as+an+Internal+Control+in+Viral+Reverse+Transcription-PCR+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays.</a> J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).</li>
<li>Pusterla, N., Hussey, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+Herpesvirus+1+Myeloencephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Equine+Pract%22%5BJournal%5D)">Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).</li>
<li>Firth, C., Lipkin, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomics+of+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genomics of emerging pathogens.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).</li>
<li>Lecuit, M., Eloit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+whole+genome+NGS+for+infectious+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).</li>
<li>Dunne, G., Gurfield, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Veterinary+Diagnostic+Laboratory%2C+a+Model+for+the+One+Health+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).</li>
<li>Moutailler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+of+Ticks%3A+The+Rule+Rather+Than+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception.</a> PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539(2016).</li>
</ol>

Marcia Slater i Elen Ortenberg są pracownikami firmy Thermo Fisher Scientific Inc., która produkuje odczynniki i przyrządy użyte w tym artykule.

Procedura ta była stosowana do rutynowych testów patogenów układu oddechowego w naszym laboratorium w ciągu sześciu miesięcy (2-3 razy w tygodniu). Odnieśliśmy również sukces, stosując tę samą procedurę do profilowania patogenów jelitowych w próbkach kału i izolatach bakteryjnych na oddzielnie dostosowanej płytce. Po wyprodukowaniu płyt doświadczony personel może wykonać kroki 2-7 w ciągu jednego standardowego dnia roboczego. Najbardziej krytycznymi etapami są prawidłowe uszczelnienie płytki przedwzmacniacza, przeniesienie wstępnie amplifikowanych próbek między płytami (co musi być wykonane szybko, aby zapobiec parowaniu) oraz końcowe pokrycie płytki wzmacniającej. Wykorzystanie arkusza kalkulacyjnego makr jako przewodnika do analizy wyników (sprawdzanie krzywych dla próbek i kontroli) było również krytyczne, ponieważ znacznie zmniejszyło ilość czasu i papierkowej roboty potrzebnej do tego procesu. Dostarczony arkusz kalkulacyjny makr jest przykładem; Musiałby zostać zmodyfikowany lub ponownie utworzony dla płyt o różnych konfiguracjach. Może to łatwo wykonać ktoś, kto ma podstawową wiedzę na temat arkuszy kalkulacyjnych.
Ze względu na bardzo małą ilość próbki załadowanej na płytkę wzmacniającą (33 nl), wymagane jest wstępne amplifikacja. W optymalizacji tego protokołu (nie pokazano) porównaliśmy szereg parametrów przedwzmacniacza, w tym miks główny, dodanie losowych starterów, liczbę cykli, czas wyżarzania i rozcieńczenie przed amplifikacją. Każdy cel miał swoje własne optymalne warunki, a te opisane tutaj reprezentują te, które dały najlepszą ogólną granicę wykrywalności dla naszego panelu. Panel ten obejmuje szeroki zakres patogennych celów i typów próbek, które są spotykane w rutynowych weterynaryjnych testach diagnostycznych, ale modyfikacje procedur wstępnego amplifikacji mogą być konieczne dla różnych paneli. Zoptymalizowane przez producenta warunki amplifikacji są oparte na standardowym protokole PCR w czasie rzeczywistym opartym na sondzie z 10-minutową aktywacją enzymatyczną w temperaturze 95 °C, a następnie denaturacją w temperaturze 95 °C i wyżarzaniem/przedłużaniem w temperaturze 60 °C. Startery i sondy są wstępnie drukowane na płytach również w warunkach zoptymalizowanych przez producenta, dzięki czemu nie wymagają miareczkowania. Połączenie etapów odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji dla wszystkich próbek (niezależnie od rodzaju celu) było konieczne w celu utrzymania wydajności przepływu pracy. Odwrotna transkrypcja wszystkich próbek jest również korzystna dla maksymalizacji czułości. Co więcej, zastosowanie miksu głównego dla przedwzmacniacza, który jest zoptymalizowany pod kątem minimalizacji inhibitorów, pozwala na wszechstronność w łączeniu różnych typów próbek na tej samej płycie.
Test matrycy grypy Centrum Kontroli Chorób (CDC) opisany przez Shu i wsp.7 i dostosowany tutaj do reakcji w skali nanolitrów jest uniwersalny test na grypę A, który jest odpowiedni do testowania próbek od ludzi i zwierząt towarzyszących. Został zaprojektowany do uniwersalnego wykrywania genu macierzy wszystkich wirusów grypy A za pomocą reakcji w skali mikrolitrów. Jest on stosowany na całym świecie jako część Panelu CDC ds. Wirusa Grypy Ludzkiej oraz Panelu CDC ds. Wirusa Świńskiej Grypy. Zaadaptowany tutaj test EHV-18 wykrywa ważny patogen układu oddechowego koni, który może powodować poronienia i choroby neurologiczne (sprawdzone przez Pusterla i Hussey10). Znaczenie dostosowania tych testów do platformy o wysokiej przepustowości z niezależną od gatunku kontrolą wewnętrzną polega na tym, że można je włączyć do podejścia do nadzoru OneHealth. Posiadanie obu tych testów na platformie testowej o wysokiej przepustowości ułatwi gotowość na wypadek sytuacji awaryjnych w placówkach klinicznych, schroniskach i wydarzeniach związanych z występami.
Wyniki opisane powyżej były reprezentatywne dla wszystkich celów na płytce, z wyjątkiem Mycoplasma cynos, który wykazał znacznie większą zmienność w wydajności analitycznej. Było to prawdopodobnie spowodowane nieoptymalną temperaturą topnienia (Tm) starterów, która powinna wynosić 58-60 °C (idealna sonda Tm to 68-70 °C). Ograniczeniem tej platformy jest to, że zaprojektowanie i wyprodukowanie płytek zajmuje więcej czasu niż zamówienie pojedynczych sond, co ogranicza możliwość szybkiej modyfikacji sekwencji. Innym ograniczeniem PCR w czasie rzeczywistym jest brak możliwości wykrycia nowych lub nieoczekiwanych patogenów. Można to do pewnego stopnia przezwyciężyć, projektując testy, które pasują do sekwencji u wielu gatunków, ale bezstronne metodologie oparte na sekwencjonowaniu całego genomu są bardziej odpowiednie do odkrywania nowych czynników. Pytania z dnia 11,12
Nanoskalowy PCR w czasie rzeczywistym pozwala na nowy paradygmat testowania opartego na syndromie, a nie na gatunkach, co jest przydatne do zmniejszania kosztów odczynników i pracy w wysokoprzepustowej diagnostyce molekularnej. Testy panelowe na dużą skalę przy użyciu tego podejścia mogą ułatwić wysiłki związane z nadzorem OneHealth, takie jak te opisane przez Dunne'a i Gurfielda13 oraz Moutaillera i wsp.14. Wczesne pobranie próbek wymazów, zwykle w ciągu 3 dni od wystąpienia objawów klinicznych, daje najlepszą szansę na zidentyfikowanie obecności patogenów układu oddechowego. Pojawienie się chorób zakaźnych jest często nieprzewidywalne, a testy, które można przeprowadzić na różnych gatunkach bez konieczności modyfikacji odczynników, są idealne do przygotowania się. Przyszłe zastosowania tej technologii będą prawdopodobnie dotyczyły patotypowania, profilowania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe oraz dalszych klinicznych paneli diagnostycznych opartych na syndromach. Nanoskalowy PCR w czasie rzeczywistym jest najbardziej przydatny do szybkich, wysokoprzepustowych badań przesiewowych wielu próbek i typów patogenów i byłby uzupełniony bezstronnymi lub częściowo stronniczymi podejściami opartymi na sekwencjonowaniu do identyfikacji nowych i pojawiających się patogenów.

Z zapotrzebowaniem na szybkie i kompleksowe wykrywanie wielu czynników w diagnostyce klinicznej dla ludzi i zwierząt, metody diagnostyki molekularnej pojedynczego organizmu do wykrywania patogenów są uciążliwe, chyba że są stosowane dla dużej liczby próbek testowanych pod kątem pojedynczej choroby. W kontekście weterynaryjnym wysokowydajne metody diagnostyczne są szczególnie ważne ze względu na dodatkową potrzebę uwzględnienia patogenów pochodzących z wielu różnych gatunków. Podejścia OneHealth do zarządzania chorobami przenoszonymi przez żywność i nadzorem nad pojawiającymi się patogenami to przykłady potrzeb w zakresie testów, które obejmują szereg bakterii, wirusów (opartych na DNA lub RNA), pasożytów i grzybów. Wyzwaniem związanym z łączeniem ze sobą testów dla wielu analitów (multipleksowanie) w celu poprawy wydajności testów jest możliwa utrata czułości i duże obciążenie związane z optymalizacją i walidacją testów.
Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR) w skali nanolitrów jest alternatywą dla praktyki multipleksowania, która pozwala na jednoczesne przeprowadzanie wielu oddzielnych reakcji na tej samej próbce1. Platforma OpenArray jest zastosowaniem tej zasady2; łączy w sobie technologię mikromacierzy z PCR w czasie rzeczywistym. W oparciu o koncepcję multipleksowania przestrzennego, każda próbka jest testowana pod kątem dużej liczby obiektów w oddzielnych otworach przelotowych. Platforma ta była początkowo używana z dwuniciową chemią wiążącą DNA na bazie cyjaniny2, a teraz jest dostępna do chemii opartej na sondzie przy użyciu ciemnych sondhartowniczych 3. Platforma ta była wykorzystywana przede wszystkim do profilowania genetycznego u ludzi4 i zwierząt5 . Został niedawno zaadaptowany do wykrywania patogenów DNA i RNA przenoszonych przez krew przez Grigorenko i wsp.6 przy użyciu dwuetapowej procedury odwrotnej transkrypcji/wstępnego amplifikacji (PREAMP).
Opisujemy tutaj jednoetapową procedurę opartą na preampie do wykrywania obu typów patogenów w wydzielinach oddechowych oraz wielu innych typów próbek, które mogą być wykonane w całości w ciągu standardowego dnia pracy. Po zakończeniu jednoetapowego przedwzmacniacza próbki są przenoszone na płytkę 384-dołkową, która jest formatem akceptowanym przez zautomatyzowany system obsługi cieczy, który jest dostarczany z tą nanoskalową platformą PCR. System pobiera mieszankę wzorcową i próbkę po powierzchni maksymalnie 4 płytek (192 próbki i kontrole) jednocześnie. Podążając za tym procesem ładowania, opisujemy, w jaki sposób próbki są wzmacniane i analizowane za pomocą makroarkusza kalkulacyjnego, który podsumowuje średnią z 3 powtórzeń technicznych dla każdej kombinacji próba/cel w tabeli, która mieści się na jednej wydrukowanej stronie.
Ustalono jednolitą metodę analizy wyekstrahowanego DNA i/lub RNA z próbek za pomocą tej platformy. Wyodrębniono szeroką gamę próbek, poddano odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji w formacie 96-dołkowym, minimalizując ryzyko błędów. Badane próbki oddechowe obejmowały wymazy z nosa, wymazy z głębokiego gardła, płukanie przeztchawicze, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe i tkankę płucną. Ponieważ niektóre z badanych czynników mogą być również obecne we krwi obwodowej lub kale, włączyliśmy tego typu próbki do procedury. Ten usprawniony przepływ pracy pomaga zaoszczędzić czas i zasoby w porównaniu z przeprowadzaniem eksperymentów na wielu płytkach, umożliwiając wydajne testowanie dzięki panelowemu wykrywaniu genów patogenów i toksyn zamiast indywidualnych testów. Pokazany tutaj panel oddechowy zawierał 18 testów, z których każdy został wydrukowany w trzech otworach przelotowych, mieszczących do 48 próbek na płytce. Wykryte patogeny koni obejmowały adenowirusa koni 1 i 2, wirusa zapalenia tętnic koni, wirusa nieżytu nosa koni A i B, wirusa opryszczki koni (EHV) typu 1 i 4 oraz Streptococcus equi. Do patogenów psów należały: koronawirus układu oddechowego psów (betakoronawirus), wirus nosówki psów, adenowirus psów, wirus parainfluenzy psów, pneumowirus psów, Bordetella bronchiseptica i Mycoplasma cynos. Uwzględniono również uniwersalny test na grypę A i kontrolę wewnętrzną (RNA MS2).

<table><tbody><tr><td>Odczynnik lityczny Zap-OGlobin II</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546138</td><td>Opcjonalny odczynnik do przygotowania próbek krwi.</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td><td>Można zastąpić inne zestawy ekstrakcyjne odpowiednie dla pożądanych typów próbek. Ten zestaw jest dostarczany z PBS, buforem do lizy i buforem do płukania.</td></tr><tr><td>2x Jednoetapowa mieszanka RT-qPCR (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>Pula starterów specyficzna dla genu</td><td>IDT</td><td>na zamówienie niestandardowe</td><td>Może być generowana przez użytkownika lub kupowana z płytkami wzmacniającymi.</td></tr><tr><td>Losowa mieszanka starterów</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa 96-dołkowa płytka</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td>Może to być dowolna płytka, która pasuje do używanej konwencjonalnej maszyny do PCR.</td></tr><tr><td>Amplification master mix (OpenArray master mix)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta uszczelka samoprzylepna</td><td>Thermo-Fisher</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka foliowa</td><td>Excel Scientific</td><td>AF-100</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4482221</td><td></td></tr><tr><td>Płytka wzmacniająca (płytka QuantStudio 12K Flex OpenArray)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>Może być dostosowany do dowolnych testów zgodnych ze standardowymi warunkami TaqMan.&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw akcesoriów</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4469576</td><td>Zawiera pokrywki etui, zatyczki i płyn zanurzeniowy.</td></tr><tr><td>Końcówki AccuFill</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikator (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4471090</td><td></td></tr><tr><td>Liquid handler (OpenArray AccuFill System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457243</td><td>Jest on kupowany wraz z amplifikatorem.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do projektowania podkładów (Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>Szczegółowe specyfikacje podkładu i sondy można znaleźć w instrukcjach producenta.</td></tr><tr><td>Program do analizy obrazu (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Dostępne w http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Program arkusza kalkulacyjnego (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Dostępne pod adresem https://products.office.com/en-us/excel</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Zaburzacz tkankowy (TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Konwencjonalny termocykler (Veriti)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Można użyć dowolnego konwencjonalnego termocyklera z podgrzewaną pokrywą.</td></tr><tr><td>Wirówka do płytek PCR</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>To urządzenie ma tylko jedną prędkość (2,500 obr./min); wirnik uruchamia się, gdy pokrywa jest zamknięta i zatrzymuje się po naciśnięciu przycisku.</td></tr><tr><td>Bufor TE</td><td>Milipore</td><td>8890-100ML</td><td>10 mM chlorowodorek tris(hydroksymetylo)aminometanu, 1 mM Kwas etylenodiaminotetraoctowy, pH 8,0</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale pcr

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanolitrowa skala real-time PCR wykorzystuje multipleksowanie przestrzenne, aby umożliwić równoległe przeprowadzanie wielu testów na jednej płytce bez typowych wad łączenia reakcji razem. Zaprojektowaliśmy i oceniliśmy panel oparty na tej zasadzie, aby szybko zidentyfikować obecność powszechnych czynników chorobotwórczych u psów i koni z ostrą chorobą układu oddechowego. Niniejszy manuskrypt opisuje przepływ pracy diagnostycznej PCR w nanoskali do przygotowywania, amplifikacji i analizy docelowych sekwencji patogenów, koncentrując się na procedurach, które różnią się od reakcji w skali mikrolitrów. W przedstawionym panelu oddechowym 18 testów ustawiono w trzech egzemplarzach, mieszcząc do 48 próbek na płytce. Uniwersalny proces ekstrakcji i wstępnej amplifikacji został zoptymalizowany pod kątem wysokoprzepustowego przygotowania próbek w celu uwzględnienia wielu matryc oraz patogenów opartych na DNA i RNA. Przedstawiono reprezentatywne dane dla jednego celu RNA (matryca grypy A) i jednego celu DNA (herpeswirus koni 1). Możliwość szybkiego i dokładnego testowania w kierunku kompleksowej, opartej na syndromach grupy patogenów jest cennym narzędziem poprawiającym wydajność i ergonomię badań diagnostycznych oraz w diagnostyce i leczeniu ostrych chorób układu oddechowego.

Wyniki przedstawiono na Rysunkach 1 i 2 dla reprezentatywnego testu RNA (macierz grypy) oraz testu DNA (EHV-1), z wykorzystaniem kombinacji kontroli dodatnich i próbek klinicznych przekazanych do rutynowych badań diagnostycznych. Sygnały fluorescencji emitowane podczas tej typowej reakcji przedstawiono na Rysunku 1, który obrazuje surowe wartości fluorescencji w funkcji cyklu. Wszystkie względne wartości progu cyklu (Ct) zostały wygenerowane automatycznie przez oprogramowanie urządzenia do amplifikacji. Fluorescencja tła została wykorzystana jako oddzielna miara do oceny jakości naniesienia próbki, zamiast włączać ją do odczytów fluorescencji przed obliczeniem wartości Ct.
Analityczna granica wykrywalności (LOD) dla każdego celu została obliczona na podstawie ogólnej średniej wartości Ct przy poziomie wykrywalności 95% powiększonej o 2 odchylenia standardowe w puli kontroli dla wszystkich celów. Najwyższym rozcieńczeniem, przy którym co najmniej 95% powtórzeń było pozytywnych dla reprezentatywnych testów, było 50 kopii; wykrycie 5 kopii zakończyło się sukcesem w 50% powtórzeń. W żadnym z testów nie wykryto ilości poniżej jednej kopii. LOD dla testów RNA i DNA obliczono na wartościach Ct wynoszących odpowiednio 21,92 i 20,05. Wartości te uznano za punkty odcięcia dla raportowania wyników jako pozytywne w przeciwieństwie do podejrzanych (potencjalnie niepowtarzalnych).
Inne aspekty wydajności analitycznej celów oceniano za pomocą szeregowych rozcieńczeń połączonych kontroli pozytywnych przeprowadzonych w trzy różne dni (Rysunek 2). Średnia wydajność reprezentatywnych testów RNA i DNA wynosiła odpowiednio 101,1% i 106,6%; całkowita średnia wydajność dla wszystkich celów wyniosła 101,3%. Testy charakteryzowały się również dobrą liniowością (R2&gt;0,98). Zmienność pomiędzy powtórzeniami w obrębie próbek zazwyczaj mieściła się w granicach odchyleń standardowych 0,2 zarówno dla próbek klinicznych, jak i kontroli. Nie zaobserwowano reaktywności krzyżowej pomiędzy żadnym z celów.
Arkusz Final Results w pliku uzupełniającym przedstawia reprezentatywne wyniki ilościowe dla 10 klinicznych próbek diagnostycznych i 4 kontroli. Próbki kliniczne stanowią podzbiór rutynowo badanych rodzajów materiałów, w tym wymazów z nosa/gardła, tkanki płucnej oraz próbek kału. Jedna próbka kału (końska) w tym zestawie wykazuje nieudaną kontrolę wewnętrzną MS2, co wskazuje na obecność inhibitorów w próbce. Sytuację tę zazwyczaj rozwiązuje się poprzez rozcieńczenie eluatów i/lub ponowną ekstrakcję. Podobnie jak w tym przypadku, kontrola negatywna amplifikacji powinna być negatywna dla wszystkich celów, a kontrola negatywna ekstrakcji powinna zawierać jedynie kontrolę wewnętrzną. W zestawie klinicznym próbki wykazały wartości Ct dla betakoronawirusa, Bordetella bronchiseptica, wirusa pomoru psów typu A, wirusa parainfluenzu psów, pneumowirusa psów oraz grypy A.
<img alt="Wykresy amplifikacji czasu rzeczywistego PCR, wykres fluorescencji w funkcji cyklu, analiza ilościowa DNA." src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Wykresy amplifikacji. Odczyty fluorescencji naniesiono na wykres w funkcji cykli amplifikacji dla analizy RNA (A) oraz analizy DNA (B). Trójkąty oznaczają wartości Ct. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wartość CT a logarytm liczby kopii; wyniki qPCR; wykresy A, B; porównanie dni 1–3; analiza danych." src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Krzywe wzorcowe. Krzywe wzorcowe z testów RNA i DNA wykonanych w trzy różne dni zostały przedstawione na wykresach w celu zademonstrowania liniowości i zakresu amplifikacji z wykorzystaniem kontroli dodatnich. Wartości progu cyklu (Ct) naniesiono w funkcji logarytmu dziesiętnego (log10) liczby kopii RNA (A) lub DNA (Bstandard. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównawczy schemat statyczny, przedstawiający układ genów wirusowych do analizy sekwencji i kategoryzacji." src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Schemat płytki do amplifikacji i lokalizacja celów. Płytki stosowane do nanoskalowych testów PCR w czasie rzeczywistym na tej platformie mają rozmiar szkiełek przedmiotowych i są zorganizowane w 48 podmacierzy po 64 otwory przelotowe, co daje łącznie 3072 otwory przelotowe dla poszczególnych reakcji. Tutaj pokazano jedną podmacierz z 18 celami w trzech powtórzeniach. Każda próbka jest nanoszona do jednej podmacierzy przez robot do obsługi cieczy. Płytki są powlekane związkami hydrofilowymi i hydrofobowymi, aby zatrzymać odczynniki w otworach przelotowych dzięki napięciu powierzchniowemu. Chip ze stali nierdzewnej jest „wzorowany fotolitograficznie i trawiony na mokro w celu utworzenia prostokątnej macierzy 3072 mikroobrobionych, 320 µm otwory o objętości 3 nl każdy2Skróty dla celów są następujące: BCOR, psio-oddechowy koronawirus (betakoronawirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, adenowirus psia; CPIV, wirus psi paragrypy; CPNV, pneumowirus psi; DISTA/B, wirus psi pomory A i B; EADV1/2, adenowirus koni 1/2; EAV, wirus tętniczaki koni; EHV1/4, herpeswirus koni typu 1/4; ERVA/B, wirus kataru koni A/B; IVM, białko macierzy grypy A; MCYNOS, Mycoplasma cynos; MS2, kontrola wewnętrzna (fag RNA MS2); SEQU, Streptococcus equi.
<img alt="schemat przenoszenia z płytki 96-dołkowej do 384-dołkowej; konfiguracja automatycznego dozownika cieczy do dystrybucji próbek." src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2. Mapa przeniesienia płytek. Przedstawiono mapę przeniesienia materiału między płytkami z kodowaniem kolorystycznym, umożliwiającą wykorzystanie stałej pipety 8-kanałowej do przeniesienia próbek z płytki wstępnej (preamp) o 96 dołkach do płytki o 384 dołkach. Alternatywnie można zastosować pipetę z regulowanym zakresem. Tą samą procedurę przeprowadza się każdorazowo, niezależnie od liczby próbek znajdujących się na płytce.
<img alt="Tabela z reprezentatywnymi wynikami analizy PCR; przedstawiająca wartości próbek dla wymazu psiego oraz kontroli." src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Plik uzupełniający"> 
Plik uzupełniający. Dostarczono arkusz kalkulacyjny z obsługą makr, zawierający dwa makra służące do formatowania wyników w tabeli podsumowującej (zgodnie z opisem w protokole). W pliku (w sekcji Final Results) zamieszczono przykładową tabelę wyników wygenerowaną przez makra. Dwa makra uzupełnią nazwy próbek w pierwszej kolumnie (do 48 próbek) oraz średnią z trzech wartości Ct dla każdego celu w przypadku wyników dodatnich; należy zauważyć, że cele, które nie uległy amplifikacji, pozostają w tej tabeli puste. Tabelę tę można łatwo wydrukować na jednej kartce papieru i wykorzystać jako punkt odniesienia do efektywnej weryfikacji surowych danych. W karcie wyników końcowych (final results tab) przedstawiono reprezentatywne wyniki dla 10 próbek klinicznych i 4 kontroli. Skróty nazw testów wymieniono w legendzie do Tabela 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Wysokoprzepustowe testowanie patogenów opartych na DNA i RNA za pomocą nanoskalowego PCR jest opisane za pomocą syndromicznego panelu PCR na psach i koniach.

Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Ogólnym celem tej metodyki testowania za pomocą PCR w czasie rzeczywistym jest jednoczesne wykrywanie patogenów opartych na DNA i RNA w sposób wysokoprzepustowy. Kwasy nukleinowe z próbek klinicznych zostaną poddane wstępnej amplifikacji z zastosowaniem wspólnej puli starterów naniesionej na płytkę OpenArray, a następnie przeanalizowane pod kątem obecności patogenów. Metoda ta może wspierać działania nadzoru nad chorobami zakaźnymi w ramach koncepcji OneHealth.W porównaniu z tradycyjnymi technikami, metoda ta pozwala na przetestowanie większej liczby próbek pod kątem większej liczby celów bez ich wzajemnych interferencji, co zwiększa efektywność testowania. Metoda wykorzystuje specjalistyczną nanopłytkę PCR. Primery i sondy są naniesione na krawędzie otworów przelotowych, a próbki są dozowane za pomocą automatycznego systemu przenoszenia cieczy.Zademonstrujemy tę metodę na próbkach klinicznych badanych pod kątem panelu patogenów układu oddechowego koni i psów. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować płytkę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Płytka użyta w tym przypadku jest skonfigurowana dla 18 celów w trzech powtórzeniach.Dodaj pożywkę do wymazów i płukania tchawicy, tak aby objętość cieczy wynosiła co najmniej 1–2 ml. Energicznie wymieszaj wymaz i DMEM w probówce za pomocą wortexa. Następnie za pomocą pipety przenieś około 1 ml pożywki do nowej probówki.Do każdej probówki z kuleczkami dodaj 235 µL buforu lizującego oraz 175 µL próbki. Postępuj zgodnie z protokołem producenta w celu ekstrakcji całkowitego kwasu nukleinowego. Przygotuj się do odwrotnej transkrypcji i preamplifikacji kwasu nukleinowego (tzw. preamp), zgodnie z opisem w protokole tekstowym, uprzednio weryfikując mapę próbek.Do każdego dołka standardowej płytki 96-dołkowej, korzystając wyłącznie z lewej strony płytki, dodaj 8,5 µL master mixu do preamplifikacji oraz 5,5 µL próbki DNA/RNA. Po połączeniu próbek, kontroli pozytywnych i kontroli negatywnych z mieszanką do preamplifikacji, szczelnie zamknij standardową płytkę 96-dołkową za pomocą przezroczystej folii uszczelniającej. Usuń nadmiar folii za pomocą żyletki, aby zapobiec powstawaniu szczelin w uszczelnieniu podczas cyklów.Odwiruj zamkniętą płytkę przez 20 sekund, używając wirówki do płytek PCR. Sprawdź, czy wszystkie odczynniki zebrały się na dnie dołków płytki. Po włączeniu konwencjonalnego termocyklera wybierz program cykli wstępnych (preamp) i uruchom program.Płytkę 96-dołkową należy umieścić w termocyklerze dopiero wtedy, gdy dolna część urządzenia osiągnie temperaturę wymaganą do syntezy cDNA, monitorując odczyt temperatury na ekranie. Po zakończeniu etapu wstępnej amplifikacji (preamp) należy sprawdzić, czy płytka pozostała szczelnie zamknięta. Po założeniu podwójnych rękawiczek i nakrywek na rękawy należy usunąć uszczelnienie z płytki po wstępnej amplifikacji.Następnie ostrożnie zdejmij i wyrzuć zewnętrzne rękawiczki. Rozcieńcz produkty z etapu preamp w stosunku jeden do pięciu, dodając 56 µL buforu TE do każdej studzienki w kolumnach od pierwszej do szóstej na płytce preamp 96-dołkowej i mieszając poprzez pipetowanie w górę i w dół. Aby to zrobić, dociskaj tłok pipety tylko do pierwszego ogranicznika, pobieraj ciecz z dna i wydzielaj ją wyżej, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.Dodać bufor TE do wszystkich sześciu kolumn, niezależnie od niewykorzystanych studzienek. Przygotować transfer z płytki 384-dołkowej na płytkę do amplifikacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zakończeniu etapów przygotowawczych założyć nowe, dopasowane podwójne rękawiczki oraz osłony na rękawy.Ze względu na wysoką szybkość odparowywania podczas pipetowania małych objętości, kluczowe jest sprawne dozowanie master mixu oraz próbek i natychmiastowe zamknięcie płytki. Do płytki 384-dołkowej należy dodać 2,5 µL master mixu do amplifikacji. W celach demonstracyjnych zastosowano tutaj płytki białe, jednak w celu zmniejszenia zmęczenia wzroku należy używać płytek czarnych.Przenieś 2,5 µL rozcieńczonego produktu preamp do płytki 384-dołkowej zgodnie z mapą w protokole tekstowym. Przedstawione tutaj kolorowe kostki ilustrują sekwencję przenoszenia dla pipety wielokanałowej. Natychmiast szczelnie przykryj płytkę folią uszczelniającą.Zdjąć zewnętrzne rękawiczki i osłony rękawów. Wirować płytkę 384-dołkową przez 20 sekund w wirówce do płytek PCR. Nie usuwać folii uszczelniającej, lecz umieścić płytkę 384-dołkową w analizatorze do pipetowania cieczy.Otwórz opakowanie zawierające zabezpieczoną płytkę do amplifikacji i ostrożnie umieść ją w pierwszym slocie analizatora cieczy, tak aby numer seryjny znajdował się po prawej stronie; trzymaj obudowę za krawędzie, nie dotykając powierzchni płytki. Po prawidłowym umieszczeniu wszystkiego w urządzeniu usuń foliową membranę z płytki 384-dołkowej wewnątrz analizatora cieczy. Kliknij „dalej”, a następnie zaznaczaj wszystkie pola w miarę wykonywania poszczególnych kroków.Zamknij drzwiczki analizatora do obsługi cieczy i niezwłocznie rozpocznij proces napełniania. Pozostań przy urządzeniu i przejdź do następnego kroku natychmiast po napełnieniu płytki. Podczas pracy analizatora zdejmij folię ochronną z dna pokrywy etui.Pozostaw górną folię na miejscu. Przygotuj czerwoną taśmę, lekko ją pociągając, aby odczepić ją od kleju. Wyjmij załadowaną płytkę do amplifikacji z urządzenia do dozowania cieczy i ostrożnie umieść ją w prasie do płytek, tak aby numer seryjny znajdował się po prawej stronie.Umieść pokrywkę na górze płytki, tak aby wycięcie znajdowało się po prawej stronie, a warstwa klejąca na spodzie. Ostrożnie dociśnij dźwignię prasy do płytek, zamykając ją; lampka będzie migać przez 20 sekund. W tym czasie nie wolno dotykać prasy do płytek.Gdy zapali się stałe zielone światło, podnieś dźwignię i ostrożnie wyjmij zalaną płytkę, trzymając ją za krawędzie. Trzymając uszczelnioną płytkę do amplifikacji pionowo za krawędzie obudowy, natychmiast włóż końcówkę strzykawki do otworu wlotowego na końcu obudowy, a następnie powoli wlej płyn imersyjny jednym łagodnym, ciągłym ruchem, aby wypełnić przestrzeń między płytką a pokrywą. Po zanurzeniu płytki pozostaw jeden mały pęcherzyk powietrza w narożniku.Kontynuując trzymanie płytki pionowo za krawędzie, uszczelnij otwór do ładowania, wkładając korek do otworu i przekręcając go zgodnie z ruchem wskazówek zegara, wywierając dostateczny nacisk aż do momentu odłamania się uchwytu. Oczyść obudowę za pomocą bezpyłowej ściereczki obficie spryskanej etanolem. Aby osuszyć obudowę, przetrzyj ją czystą ściereczką, wykonując ruchy w dół.Przenieś zamkniętą płytkę do urządzenia do amplifikacji. W zakładce instrument wybierz konsolę instrumentu. Wybierz urządzenie do amplifikacji, a następnie kliknij przycisk otwierania drzwiczek.Umieść płytkę do amplifikacji w pierwszym slocie adaptera do płytek, upewniając się, że adapter jest prawidłowo wyrównany z oznaczeniem w lewym górnym rogu. Zorientuj płytkę tak, aby kod kreskowy był skierowany do góry i w stronę przodu instrumentu. Po kliknięciu przycisku zamykania drzwi przejdź do karty głównej na dole ekranu.W menu Run wybierz OpenArray. Kliknij get plate IDs. Aby rozpocząć analizę, kliknij start run.Otwórz arkusz kalkulacyjny zawierający makro wyników. W wyeksportowanym pliku danych kliknij prawym przyciskiem myszy kartę na dole ekranu i wybierz opcję przenieś lub kopiuj. W polu do skoroszytu wybierz makro wyników.Następnie kliknij „przenieś na koniec” i zaznacz pole o treści „utwórz kopię”. Na koniec kliknij OK. Usuń starą kartę eksportu, a następnie zmień nazwę nowo dodanej karty na „eksport”.Kliknij widok, następnie makra i wybierz makro, a potem kliknij uruchom. Następnie powtórz tę czynność dla Macro2, klikając widok, potem makra, wybierając Macro2 i klikając uruchom. W oprogramowaniu urządzenia do amplifikacji sprawdź krzywe dla każdej próbki i kontroli w odniesieniu do tabeli makr, wybierając analiza/wykres amplifikacji po lewej stronie ekranu.Następnie wybierz kartę próbek i kliknij w każdą próbkę, aby potwierdzić, że dla każdego z wyników dodatnich w tabeli istnieją dwie lub trzy dodatnie krzywe amplifikacji. Odczyty fluorescencji naniesiono na cykle amplifikacji, aby zilustrować prawidłowy przebieg reakcji real-time PCR. Większość próbek osiągnęła względne poziomy progowe między drugim a 25. cyklem reakcji real-time PCR.Krzywe standardowe wyznaczone w trzy różne dni zostały naniesione na wykres, aby wykazać liniowość i zakres amplifikacji z użyciem kontroli dodatnich. Wartości progowe cyklu (Ct) naniesiono w funkcji logarytmu dziesiętnego liczby kopii standardu kwasu nukleinowego. Dwa makra uzupełnią nazwy próbek w pierwszej kolumnie oraz średnią z trzech wartości Ct dla każdego celu w przypadku wyników dodatnich.Cele, które nie uległy amplifikacji, pozostają puste w tej tabeli. Przedstawiono wyniki ilościowe dla 10 próbek klinicznych i czterech rutynowych kontroli; w tym przypadku kontrola negatywna amplifikacji powinna być ujemna dla wszystkich celów, a kontrola negatywna ekstrakcji powinna zawierać wyłącznie kontrolę wewnętrzną. Jedna próbka w tym zestawie wykazuje niepowodzenie kontroli wewnętrznej, co wskazuje na obecność inhibitorów w próbce.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić eksperyment PCR w skali nano. Ta procedura ułatwi wykonywanie paneli opartych na syndromach w diagnostyce weterynaryjnej. Metodę tę można dostosować tak, aby obejmowała testy w kierunku czynników etiologicznych wielu różnych chorób zakaźnych.

high-throughput-detection-respiratory-pathogens-animal-specimens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Zintegrowany mikroprzepływowy układ termoplastyczny został opracowany do użytku jako diagnostyka molekularna. Chip wykonuje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkryptazę i PCR. Opisano metody wytwarzania i uruchamiania chipa.

Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

Sekwencjonowanie nanoporowe to nowatorska technologia, która pozwala na efektywne kosztowo sekwencjonowanie w odległych lokalizacjach i miejscach o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół sekwencjonowania mRNA z krwi pełnej, który jest zgodny z takimi warunkami.

Sekwencjonowanie mRNA z krwi pełnej za pomocą sekwencjonowania nanoporowego

W tym artykule opisany jest protokół o wysokiej przepustowości do szybkiego i niezawodnego określania poziomów ekspresji genów w pojedynczych lub zbiorczych próbkach C. elegans. Protokół ten nie wymaga izolacji RNA i wytwarza cDNA bezpośrednio z próbek. Może być używany razem z wysokoprzepustowymi, multipleksowanymi, nanofluidycznymi platformami qPCR w czasie rzeczywistym.

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

Prezentujemy protokół, który łączy amplifikację polimerazy rekombinazy z systemem CRISPR/Cas12a do wykrywania śladów wirusów DNA i tworzy przenośną mikroskopię smartfonów z klasyfikacją wspomaganą sztuczną inteligencją do wykrywania wirusów DNA w miejscu opieki nad pacjentem.

System detekcji wirusów DNA oparty na RPA-CRISPR/Cas12a-SPM i głębokim uczeniu

Ten protokół ma na celu ilościowe określenie RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza, które mają być wykorzystane do badań epidemiologicznych opartych na ściekach oraz ocenę ryzyka narażenia na SARS-CoV-2 w aerozolach wewnątrz i na zewnątrz. Protokół ten opisuje również podejście do sekwencjonowania długiego szablonu amplikonu w celu charakterystyki całego genomu SARS-CoV-2.

Kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza

Tutaj prezentujemy szybki i ekonomiczny proces charakteryzowania genomów wirusa wścieklizny (RABV) za pomocą technologii nanoporowej. Przepływ pracy ma na celu wsparcie nadzoru opartego na genomice na poziomie lokalnym, dostarczając informacji na temat krążących linii RABV i ich umiejscowienia w regionalnych filogenezach w celu ukierunkowania środków kontroli wścieklizny.

Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

Prezentujemy dwa wewnętrzne, jednoetapowe zestawy RT-qPCR do powszechnych wirusów układu oddechowego. Pierwszy test dotyczy SARS-CoV-2 (N), grypy A (H1N1 i H3N2) oraz grypy B. Drugi dotyczy SARS-Cov-2 (N) i MERS (UpE i ORF1a). Testy te mogą być z powodzeniem wdrożone w każdym specjalistycznym laboratorium.

Opracowanie multipleksowych testów RT-qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania SARS-CoV-2, grypy A/B i MERS-CoV

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Tutaj opisujemy prostą i szybką procedurę wykrywania DNA z patogenów pszczół, takich jak Lotmaria passim i Nosema ceranae, przy użyciu lizy komórek gotowej do amplifikacji, amplifikacji polimerazy rekombinazy i testów CRISPR/Cas12a.

Wykrywanie DNA pasożytów trypanosomatydów i Nosema ceranae na miejscu poprzez alkaliczną lizę sprzężoną z systemem RPA/CRISPR/Cas12a

Poznaj metodę nanoscale PCR do wysokoprzepustowego wykrywania patogenów DNA i RNA w próbkach oddechowych psów i koni. Ta technika poprawia efektywność diagnostyki weterynaryjnej i wspiera inicjatywy OneHealth.

Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

Przeglądaj więcej filmów