Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

Ogólnym celem tej metodologii testów PCR w czasie rzeczywistym jest wykrywanie patogenów opartych na DNA i RNA w sposób wysokoprzepustowy. Kwas nukleinowy z próbek klinicznych zostanie wstępnie amplifikowany za pomocą wspólnej puli starterów załadowanej na płytkę OpenArray i przeanalizowany pod kątem obecności patogenów. Ta metoda może pomóc w promowaniu działań OneHealth w zakresie nadzoru nad chorobami zakaźnymi.

W porównaniu z tradycyjnymi technikami, metoda ta pozwala na przetestowanie większej liczby próbek pod kątem większej liczby celów bez konkurowania ze sobą, poprawiając w ten sposób wydajność testowania. Metoda wykorzystuje dostosowaną płytkę do PCR w nanoskali. Startery i sondy są drukowane na krawędziach otworów przelotowych, a próbki są ładowane za pomocą manipulatora cieczy.

Metodę zademonstrujemy na próbkach klinicznych badanych pod kątem panelu patogenów układu oddechowego koni i psów. Aby rozpocząć tę procedurę, należy zaprojektować tabliczkę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zastosowana tutaj tabliczka jest skonfigurowana z 18 tarczami w trzech egzemplarzach.

Dodaj pożywkę do wacików i płukanek tchawicy tak, aby był co najmniej jeden do dwóch mililitrów płynu. Energicznie wymieszaj wacik i DMEM w probówce. Następnie za pomocą pipety przenieś około 1 mililitra pożywki do nowej probówki.

Dodaj 235 mikrolitrów buforu do lizy i 175 mikrolitrów próbki do każdej probówki z kulkami. Postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby wyekstrahować całkowity kwas nukleinowy. Przygotuj się do odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji kwasu nukleinowego lub przedwzmacniacza, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, najpierw weryfikując mapę próbki.

Dodaj 8,5 mikrolitra miksu głównego przedwzmacniacza i 5,5 mikrolitra próbki DNA/RNA do każdej studzienki standardowej 96-dołkowej płytki, używając tylko lewej strony płytki. Po połączeniu próbek, kontroli dodatnich i ujemnych z mieszanką przedwzmacniacza, dokładnie uszczelnij standardową 96-dołkową płytkę przezroczystą uszczelką samoprzylepną. Usuń nadmiar uszczelki za pomocą żyletki, aby zapobiec tworzeniu się szczelin uszczelniających podczas jazdy na rowerze.

Odwirowywać szczelnie zapieczętowaną płytkę przez 20 sekund za pomocą wirówki do płytek PCR. Sprawdź, czy wszystkie odczynniki są połączone na dnie dołków płytkowych. Po włączeniu konwencjonalnego termocyklera wybierz program preamp cycling i uruchom program.

Umieść 96-dołkową płytkę w termocyklerze tylko wtedy, gdy dolna część termocyklera osiągnie temperaturę wymaganą do produkcji cDNA poprzez monitorowanie odczytu temperatury na ekranie. Po zakończeniu pracy preamp sprawdź, czy płyta pozostała szczelna. Po założeniu podwójnych rękawic i osłon rękawów, usuń uszczelkę z płytki przedwzmacniacza.

Następnie ostrożnie zdejmij i wyrzuć rękawice zewnętrzne. Rozcieńczyć produkty przedwzmacniacza od jednego do pięciu, dodając 56 mikrolitrów buforu TE do każdej studzienki kolumn od jednej do sześciu 96-dołkowej płytki przedwzmacniacza i mieszając przez pipetowanie w górę iw dół. W tym celu należy podejść tylko do pierwszego przystanku pipety, zassać od dołu i dozować wyżej, ale nie tworzyć pęcherzyków.

Dodaj bufor TE do wszystkich sześciu kolumn niezależnie od nieużywanych studzienek. Przygotuj się do transferu 384-dołkowego na płytkę wzmacniającą, jak opisano w protokole tekstowym. Po zakończeniu etapów przygotowań załóż nowe, dobrze dopasowane podwójne rękawice i pokrowce na rękawy.

Ze względu na wysokie tempo parowania przy pipetowaniu małych objętości bardzo ważne jest, aby skutecznie dozować mieszankę wzorcową i próbkę oraz natychmiast uszczelnić płytkę. Dodaj 2,5 mikrolitra głównej mieszanki amplifikacyjnej do płytki 384-dołkowej. Białe płytki są tutaj używane do celów demonstracyjnych, ale czarne płytki powinny być używane w celu zmniejszenia zmęczenia oczu.

Przenieś 2,5 mikrolitra rozcieńczonego produktu przedwzmacniacza na płytkę 384-dołkową zgodnie z mapą w protokole tekstowym. Pokazane tutaj kolorowe kostki do gry ilustrują sekwencję transferu dla pipety stałokanałowej. Natychmiast szczelnie przykryj płytkę uszczelką foliową.

Wyrzuć rękawice zewnętrzne i pokrowce na rękawy. Odwirować 384-dołkową płytkę przez 20 sekund w wirówce do PCR. Nie zdejmuj uszczelki foliowej, ale umieść płytkę 384-dołkową w pojemniku do cieczy.

Otwórz opakowanie zawierające dołączoną płytkę wzmacniającą i ostrożnie umieść ją w pojemniku na ciecz w pierwszej szczelinie z numerem seryjnym po prawej stronie, przytrzymaj obudowę za krawędzie, nie dotykając powierzchni płytki. Usuń uszczelkę foliową z płytki 384-dołkowej wewnątrz pojemnika do obsługi cieczy, gdy wszystko jest na swoim miejscu. Kliknij Dalej, a następnie zaznacz wszystkie pola po zakończeniu każdego kroku.

Zamknij drzwiczki do urządzenia do obsługi cieczy i natychmiast rozpocznij proces napełniania. Pozostań obok osoby zajmującej się obsługą płynów i natychmiast przejdź do następnego kroku po napełnieniu płytki. Podczas pracy urządzenia do obsługi cieczy usuń folię ochronną ze spodu pokrywy etui.

Pozostaw górną folię na miejscu. Zagruntuj czerwoną taśmę, lekko pociągając, aby uwolnić ją od kleju. Wyjmij załadowaną amppłytkę wzmacniającą z urządzenia do obsługi cieczy i delikatnie umieść ją w prasie do płyt z numerem seryjnym po prawej stronie.

Umieść pokrywkę na górze talerza z karbowanym końcem po prawej stronie, a klejem na dole. Pociągnij w dół dźwignię docisku płyty, ostrożnie ją zamykając, lampka będzie migać przez 20 sekund. W tym czasie nie dotykaj prasy do płyt.

Gdy lampka zmieni kolor na zielony, podnieś dźwignię i ostrożnie wyjmij uszczelnioną płytkę, przytrzymując ją za krawędzie. Trzymając szczelną płytkę wzmacniającą pionowo za krawędzie obudowy, natychmiast włóż końcówkę strzykawki do portu ładowania na końcu obudowy, a następnie powoli dozuj płyn zanurzeniowy jednym delikatnym ciągłym ruchem, aby wypełnić przestrzeń między płytką a pokrywką. Zostaw jeden mały pęcherzyk powietrza w rogu po zanurzeniu płytki.

Trzymając płytkę pionowo za krawędzie, uszczelnij port ładowania, wkładając wtyczkę do portu i przekręcając wtyczkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, wywierając wystarczający nacisk, aż uchwyt się oderwie. Wyczyść obudowę niestrzępiącą się chusteczką, która została dokładnie spryskana etanolem. Aby wysuszyć etui, przetrzyj je w dół czystą chusteczką.

Przynieś zapieczętowaną płytkę do ampmaszyna do lifikacji. Na karcie instrument wybierz konsolę instrumentów. Wybierz amplifikator, a następnie kliknij przycisk otwierania drzwi.

Umieść amppłytka wzmacniająca w pierwszym gnieździe adaptera płyty, sprawdzając, czy adapter jest prawidłowo wyrównany z płytką w lewym górnym rogu. Ustaw tabliczkę tak, aby kod kreskowy był skierowany do góry i do przodu urządzenia. Po kliknięciu przycisku zamykania drzwi przejdź do zakładki głównej u dołu ekranu.

W menu uruchamiania wybierz pozycję OpenArray. Kliknij opcję Pobierz identyfikatory tablic. Aby rozpocząć uruchamianie, kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie.

Otwórz arkusz kalkulacyjny zawierający makro z wynikami. W wyeksportowanym pliku danych kliknij prawym przyciskiem myszy zakładkę u dołu ekranu i wybierz przenieś lub kopiuj. W polu Do rezerwacji wybierz makro wyników.

Następnie kliknij przenieś na koniec i zaznacz pole oznaczone utwórz kopię. Na koniec kliknij OK. Usuń starą kartę eksportu, a następnie zmień nazwę nowo dodanej karty na eksport.

Kliknij pozycję Widok, a następnie makra, wybierz makro, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Następnie powtórz to dla Makro2, klikając Widok, a następnie Makra, wybierając Makro2 i klikając Uruchom. W oprogramowaniu maszyny do amplifikacji sprawdź krzywe dla każdej próbki i porównaj je z tabelą makr, wybierając wykres analizy/amplifikacji po lewej stronie ekranu.

Następnie wybierz zakładkę próbki i kliknij każdą próbkę, aby potwierdzić, że istnieją dwie lub trzy dodatnie krzywe amplifikacji dla każdego z pozytywnych wyników w tabeli. Odczyty fluorescencji są wykreślane w stosunku do cykli amplifikacji, aby zilustrować, że udało się przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym. Większość próbek osiągnęła względne poziomy progowe między drugim a 25 cyklem reakcji PCR w czasie rzeczywistym.

Standardowe krzywe przebiegające w trzech różnych dniach są wykreślane w celu wykazania liniowości i zakresu amplifikacji przy użyciu kontroli dodatnich. Wartości progowe cyklu są wykreślane w odniesieniu do logarytmu o podstawie 10 liczby kopii wzorca kwasu nukleinowego. Dwa makra wypełnią nazwy próbek w pierwszej kolumnie i średnią z trzech wartości Ct dla każdego celu dla tych z wynikami pozytywnymi.

Cele, które nie zostały wzmocnione, są puste w tej tabeli. Przedstawiono wyniki ilościowe dla 10 próbek klinicznych i czterech rutynowych kontroli, tak jak w tym przypadku, kontrola amplifikacji ujemnej powinna być ujemna dla wszystkich celów, a kontrola ekstrakcji ujemnej powinna obejmować tylko kontrolę wewnętrzną. Jedna próbka w tym zestawie wykazuje nieudaną kontrolę wewnętrzną, co wskazuje na obecność inhibitorów w próbce.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić eksperyment PCR w nanoskali. Procedura ta ułatwi prowadzenie paneli opartych na syndromach w diagnostyce weterynaryjnej. Metodę tę można zaadaptować tak, aby zawierała eseje na temat czynników wywołujących wiele różnych chorób zakaźnych.