Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Ogólnym celem systemu Fast Nano-positioning jest dostarczanie informacji strukturalnych o biomolekułach w czasie rzeczywistym poprzez połączenie eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET z rygorystyczną analizą statystyczną. Metoda ta odpowiada na kluczowe pytania z zakresu biologii strukturalnej, takie jak lokalizacja elastycznych domen w makrocząsteczkach, w których nie można zastosować standardowych narzędzi biologii struktury. Główną zaletą szybkiego NPS w porównaniu z innymi narzędziami strukturalnymi opartymi na FRET jest to, że różne modele barwników można porównywać nie tylko przy użyciu najbardziej prawdopodobnych pozycji, ale także trójwymiarowego rozkładu prawdopodobieństwa.

Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona dane strukturalne z bazy danych białek z ilościowymi pomiarami fluorescencji pojedynczych cząsteczek. Aby rozpocząć procedurę, należy zamontować komorę przepływową i uchwyt na próbkę. Aby przygotować wlotowe i wylotowe, wkręć silikonową rurkę w z wydrążonymi wypustkami i przetnij rurkę prosto na obu końcach żyletką.

Przykręć z klapką do uchwytu próbki. Dopasuj otwory suwaka kwarcowego komory przepływowej do gwintów uchwytu próbki. Delikatnie dokręć uchwytu szkła, aby zamocować komorę przepływową na miejscu.

Wkręć 20-centymetrowe kawałki silikonowej rurki w wlotowe i wylotowe. Umyć komorę przepływową 500 mikrolitrami PBS. Następnie przepłukać komorę przepływową 100 mikrolitrami roztworu neutrawidyny w PBS, upewniając się, że na końcu rurki dolotowej utworzy się kropelka, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do komory próbki.

Clamp rurki wlotowe i wylotowe zamknięte po każdej manipulacji, aby wykluczyć powietrze z komory przepływowej. Inkubować komorę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przepłukać roztwór neutrawidyny 500 mikrolitrami PBS.

Dodaj kroplę olejku immersyjnego na pryzmat i przykręć pryzmat do komory próbki. Dane dotyczące pojedynczej cząsteczki FRET są pozyskiwane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Uruchom oprogramowanie kamery i oprogramowanie piezomotoryczne sceny.

Zamontuj komorę do stolika mikrometrycznego mikroskopu TIRF poziomo, tak prosto, jak to możliwe, i w taki sposób, aby przecinała wszystkie trzy lasery. Dodaj płyn zanurzeniowy i ustaw ostrość obiektyw mikroskopu, sprawdzając odbicia w podczerwieni. Ustaw parametry kamery, ścieżkę do pliku i parametry automatycznego zwiększania.

Rozpocznij transmisję z kamery na żywo i rozjaśnij fluorescencję tła przy użyciu wszystkich trzech laserów z pełną intensywnością. Następnie zmniejsz intensywność lasera. Następnie załaduj 100 mikrolitrów roztworu kulek fluorescencyjnych do komory.

Odczekaj 10 minut, aż koraliki zwiążą się z powierzchnią komory. Nagraj film z polem widzenia od 50 do 100 ściegów i wykonaj analizę wsadową z wysokim progiem znajdowania szczytu. Wczytaj plik filmowy i wybierz dwa koraliki z wyraźnymi środkami w przeciwległych rogach pola widzenia.

Zaznacz piksele o maksymalnej intensywności w tych koralikach. Usuń i wyczyść pryzmat. Przygotuj drugą komorę na próbkę i przykręć uchwyt pryzmatu do komory.

Zamontuj komorę do stolika mikrometrycznego. Następnie załaduj do komory 100 mikrolitrów 50 do 100 pikomolarnego roztworu biotynylowanej próbki znakowanej fluorescencyjnie. Poczekaj, aż cząsteczki zwiążą się z powierzchnią komory.

Jednocześnie kliknij Take Signal, aby rozpocząć nagrywanie i włączyć laser wzbudzający dawcę. Dostosuj moc lasera, aby upewnić się, że co najmniej 80% cząsteczek w polu widzenia jest wybielonych, Następnie przesuń komorę, aby pokazać niewybielony obszar i nagraj następny film. W ten sposób wybielić resztę komory próbki.

Po pomiarach pod mikroskopem TIRF, uzyskane dane dotyczące pojedynczej cząsteczki FRET muszą zostać przeanalizowane w celu uzyskania średniej wydajności FRET. Przeprowadzić analizę wsadową filmów z dawcą i akceptorem próbki. Następnie załaduj wsadowe pliki filmowe do oprogramowania do analizy danych.

Kliknij przycisk NIE Wybrano, aby wskazać poszczególne fazy FRET. Kliknij początek okresu FRET, następnie punkt czasowy, w którym intensywność akceptora zmniejsza się z powodu bielenia, a na końcu punkt czasowy, w którym intensywność dawcy zmniejsza się z powodu bielenia. W następnym oknie wybierz opcję Tak, aby zachować wybrany ślad wydajności FRET.

Po przeanalizowaniu każdej cząsteczki zapisz ślady i przeanalizuj następny film. Po zakończeniu analizy uruchom skrypt, aby połączyć wyniki FRET. Zaimportuj połączony plik FRET z klatką do oprogramowania do analizy danych, korzystając z domyślnej opcji wprowadzania.

Wykreśl dane jako histogram i użyj narzędzia do dopasowywania krzywej nieliniowej, aby dopasować je do krzywej Gaussa. Przekroczona wartość to główna wydajność FRET. Użyj UV VIS i spektroskopii fluorescencyjnej, aby określić izotropowy promień Forstera i wartości anizotropii w stanie ustalonym dla każdego barwnika.

Nano-system pozycjonowania został zainspirowany dobrze znanym GPS, ponieważ lokalizujemy nieznaną pozycję, antenę, z kilkoma znanymi pozycjami, satelity. Aby rozpocząć analizę NPS, uruchom oprogramowanie FastNPS i utwórz nowy plik zadania. Aby zdefiniować a priori pozycji oznaczonych anten i satelitów, w oknie ModelDyePrior wprowadź rozdzielczość przestrzenną definiowanej pozycji.

Wyklucz wnętrze makrocząsteczki, ładując odpowiedni wyśrodkowany plik PDB. Wprowadź średnicę barwnika i odległość szkieletyzacji. Wypełnij minimalne i maksymalne współrzędne pozycji możliwej lokalizacji barwnika.

Jeśli definiowaną pozycją jest satelita, wybierz mocowanie barwnika za pomocą elastycznego łącznika i wprowadź współrzędne atomu z wyśrodkowanego pliku PDB. Wypełnij długość i średnicę łącznika. Kliknij opcję Oblicz dostępną objętość, zapisz wcześniejszą pozycję i wyeksportuj ją do wizualizacji.

Powtórz ten proces dla wszystkich satelitów i anten. Po zdefiniowaniu pozycji otwórz okno Definiuj pomiar i utwórz nową cząsteczkę barwnika. Załaduj pozycję wcześniej skojarzoną z tym barwnikiem.

Uzupełnij anizotropię fluorescencji, wybierz odpowiedni model barwnika i aktywuj barwnik. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie barwniki zostaną zdefiniowane. Następnie utwórz nowy pomiar.

Wybierz parę FRET ze zdefiniowanych barwników. Wprowadź wydajność pojedynczej cząsteczki FRET z błędem oraz izotropowy promień Forstera tej pary barwników i aktywuj pomiar. Powtórz to dla wszystkich par barwników.

Następnie otwórz okno obliczeń. Jeśli barwniki zostały przypisane do różnych modeli, wybierz opcję Zdefiniowane przez użytkownika. W przeciwnym razie wybierz model, który ma być używany dla wszystkich barwników.

Wykonaj obliczenia i otwórz okno wyników. Korzystając z FastNPS, należy pamiętać o dostosowaniu modeli do wszystkich barwników, aby zminimalizować wiarygodne ilości, przy jednoczesnym zachowaniu spójności. Jeśli konsystencja jest niższa niż 90%kliknij szczegółową spójność i zidentyfikuj barwniki wspólne dla wpisów o konsystencji mniejszej niż 90%.

Otwórz okno Definiuj pomiar i zmień model danego barwnika. Uruchom ponownie obliczenia w trybie Zdefiniowany przez użytkownika. Eksportuj wiarygodne ilości barwników pojedynczo lub jako partię.

Otwórz pliki gęstości w oprogramowaniu do wizualizacji i dostosuj wiarygodność do żądanego poziomu. Wydajność pojedynczej cząsteczki FRET mierzono między nieznanymi cząsteczkami anteny a kilkoma znanymi cząsteczkami satelitarnymi w archeonowym kompleksie promotorowym polimerazy RNA. Analiza NPS tych danych określiła wiarygodne objętości tych cząsteczek barwnika w stosunku do otwartego kompleksu promotora archeonowej polimerazy RNA.

Pięć różnych modeli, w których użyto cząsteczek barwnika, a wyniki porównano. Wiarygodne objętości były zgodne z danymi pomiarowymi, gdy zostały obliczone za pomocą modeli, które zakładały, że barwnik może swobodnie obracać się tylko w stożku o nieznanej orientacji. W szczególności klasyczny model jest najbardziej konserwatywny, ponieważ dalej zakłada, że barwnik znajduje się w ustalonym miejscu.

W ten sposób powstaje stosunkowo duża wiarygodna objętość, ale wolumin zazwyczaj obejmuje właściwą pozycję. Modele o wyższej precyzji opierają się na założeniu, że barwnik może całkowicie swobodnie obracać się w okresie swojej fluorescencji. Model iso, podobnie jak model klasyczny, zakłada, że barwnik znajduje się w ustalonej pozycji w dostępnej objętości.

Model meanpos-iso zakłada dynamiczne uśrednianie dla wszystkich możliwych pozycji. Chociaż wiarygodne objętości modeli ISO są znacznie mniejsze niż te obliczone przez modele inne niż ISO, są one niespójne z zmierzonymi danymi. Chcieliśmy opracować technikę, która pozwoli nam uchwycić dynamiczne informacje strukturalne o przejściowych kompleksach, problemie, którego nie można było rozwiązać za pomocą istniejących narzędzi strukturalnych.

Po zarejestrowaniu danych dotyczących pojedynczej cząsteczki FRET, analiza FastNPS jest wykonywana w ciągu kilku godzin, co pozwala na szybkie porównanie różnych modeli barwników. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak symulacje MD, mogą być następnie wykonywane w celu uzyskania ustrukturyzowanych modeli, które są zgodne z eksperymentalnymi danymi FRET dla pojedynczych cząsteczek.