Name: Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Poznaj metodę Fast Nano-positioning do analizy struktur biomolekularnych przy użyciu mikroskopii TIRF i pojedynczych cząsteczek FRET. Technika ta umożliwia lokalizację elastycznych domen z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują B. Gruchmannowi za rysunki mechaniczne komory przepływowej. Ponadto pragniemy wyrazić naszą wdzięczność Maxowi Beckersowi i Florianowi Drechslerowi za wnikliwe komentarze i dyskusje na temat NPS i leżącego u jego podstaw silnika próbkowania.

<ol><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Particle+Cryo-EM+at+Crystallographic+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution.</a> Cell. 161, 450-457 (2015).</li>
<li>Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+X-ray+Crystallographic+Structure+Determination+of+Biological+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules.</a> Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).</li>
<li>Sali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+the+First+wwPDB+Hybrid%2FIntegrative+Methods+Task+Force+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop.</a> Structure. 23, 1156-1167 (2015).</li>
<li>Hopfner, K. P., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nucleic+acid+translocases%3A+lessons+from+structural+biology+and+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics.</a> Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+and+applications+to+biomolecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM and applications to biomolecular systems.</a> Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).</li>
<li>Neuman, K. K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li>
<li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Single-Molecule+Fluorescence+Methods+for+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology.</a> Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).</li>
<li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation%3A+single-molecule+FRET+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li>
<li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+transfer%3A+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).</li>
<li>Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+Orientation+and+Domain+Conformation+of+the+E.+coli+Rep+Helicase+Monomer+Bound+to+a+Partial+Duplex+Junction%3A+Single-molecule+Studies+of+Fluorescently+Labeled+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes.</a> J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+tracking+of+mRNA+exiting+from+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).</li>
<li>Schröder, G. F., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0010465504000748">FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments.</a> Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).</li>
<li>Margittai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer+reveals+a+dynamic+equilibrium+between+closed+and+open+conformations+of+syntaxin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).</li>
<li>Kalinin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+benchmark+study+for+FRET-restrained+high-precision+structural+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling.</a> Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).</li>
<li>Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nsmb/journal/v23/n2/full/nsmb.3148.html">N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).</li>
<li>Svensson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+trilateration+of+probes+bound+within+functional+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors.</a> Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).</li>
<li>Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+3D+RNA+structure+by+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET.</a> Methods. (2016), 1-11 (2016).</li>
<li>Lee, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
<li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).</li>
<li>Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+molecular+modeling+with+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET.</a> J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).</li>
<li>Schuler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+of+protein+structure+and+dynamics+-+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22J+nanoboitechnology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer.</a> J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).</li>
<li>Choi, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET-derived+model+of+the+synaptotagmin+1-SNARE+fusion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientational+freedom+of+molecular+probes.+The+orientation+factor+in+intramolecular+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer.</a> Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).</li>
<li>Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation of single molecules.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).</li>
<li>Muschielok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nano-positioning+system+for+macromolecular+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A nano-positioning system for macromolecular structural analysis.</a> Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).</li>
<li>Muschielok, A., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+nano-positioning+system+to+the+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks.</a> J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano+positioning+system+reveals+the+course+of+upstream+and+nontemplate+DNA+within+the+RNA+polymerase+ii+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex.</a> Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).</li>
<li>Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Architecture+of+a+Minimal+RNA+Polymerase+II+Open+Promoter+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex.</a> Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).</li>
<li>Nagy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+architecture+of+the+archaeal+RNA+polymerase+open+complex+from+single-molecule%5BTitle%5D)+AND+%22FRET+and+NPS.+Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule.</a> FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161(2015).</li>
<li>Grohmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Initiation+Factor+TFE+and+the+Elongation+Factor+Spt4%2F5+Compete+for+the+RNAP+Clamp+during+Transcription+Initiation+and+Elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation.</a> Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).</li>
<li>Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+structural+information+from+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Quantitative structural information from single-molecule FRET.</a> Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).</li>
<li>Bennink, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+individual+nucleosomes+by+stretching+single+chromatin+fibers+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers.</a> Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).</li>
<li>Chandradoss, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+determination+of+fluorescence+quantum+yields+of+transparent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples.</a> Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer US. Boston, MA. (2006).</li>
<li>Korkhin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+complex+RNA+polymerases%3A+The+complete+archaeal+RNA+polymerase+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure.</a> PLoS Biol. 7 (5), (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy konfigurację i procedurę eksperymentalną w celu dokładnego określenia wydajności FRET między barwnikami przyłączonymi za pomocą elastycznych łączników do biomakrocząsteczek, tj. kwasów nukleinowych i/lub białek.
W celu zapewnienia precyzyjnych pomiarów smFRET (sekcja 3) kluczowe jest wykluczenie powietrza z komory przepływowej w dowolnym momencie pomiaru. Ponadto należy uważać, aby nie przeciążać komory przepływowej fluoroforami. Fluorofory muszą być wyraźnie oddzielone, aby zapewnić prawidłową analizę. Ponieważ pary smFRET, które nie wykazują bielenia dawcy, muszą zostać wyłączone z analizy, upewnij się, że >80% cząsteczek w polu widzenia jest wybielonych na końcu filmu. Aby uwzględnić niejednorodności w próbce, współczynnik β i czynnik γ, korygujące przesłuchy i względną skuteczność wykrywania odpowiednio kanału donorowego i akceptorowego, są obliczane indywidualnie dla każdej pary FRET.
Ustawienia kamery (czas całkowania, wzmocnienie mnożnika elektronów, wzmocnienie przedwzmacniacza i szybkość odczytu opisane w rozdziale 3.9) powinny być ustawione na wartości zapewniające najlepszy kompromis między stosunkiem sygnału do szumu, zakresem dynamiki i rozdzielczością czasową. Muszą one zostać ponownie dostosowane do różnych eksperymentów lub jeśli używany jest inny sprzęt. Liczba ramek musi być wystarczająco duża, aby zapewnić, że większość cząsteczek dawcy wybieli się w czasie obserwacji.
W przypadku pomiarów na spektrometrze fluorescencyjnym (sekcje od 7 do 9) należy znaleźć dobry kompromis między intensywnością sygnału a rozdzielczością widmową zarejestrowanych danych. W tym celu szczeliny w ścieżce wzbudzenia i emisji spektrometru fluorescencyjnego muszą być dostosowane w zależności od użytego przyrządu i stężenia próbki.
Ponadto przedstawiono metodę analizy Fast-NPS służącą do uzyskiwania informacji strukturalnych o przejściowych lub dynamicznych kompleksach makromolekularnych. NPS zastosowano w celu ujawnienia ścieżki nici DNA bez matrycy oraz położenia czynników inicjujących transkrypcję w otwartym kompleksie polimerazy archeonów RNA. Korzystając z sieci ponad 60 różnych pomiarów odległości, wykazaliśmy, że Fast-NPS, wyposażony w nowo zaimplementowany silnik próbkowania (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. w przygotowaniu), skraca czas potrzebny na analizę tej złożonej sieci smFRET o ≈2 rzędy wielkości, w porównaniu z oryginalną globalną metodą NPS27. Solidność algorytmu jest zakorzeniona w samplerze Metropolis-within-Gibbs w połączeniu ze schematem równoległego temperowania. Fast-NPS pokazuje dokładną odtwarzalność wyników sieci i jest spójny z wynikami opublikowanymi wcześniej30.
Opublikowano kilka różnych metod mających na celu wywnioskowanie informacji strukturalnych z pomiarów smFRET 11,12,13,14,15,16,17,18. Wszystkie te podejścia zapewniają tylko jeden konkretny model barwnika. Tym samym barwniki, które nie spełniają założeń przyjętych przez dany model, nie mogą być stosowane ani prowadzić do fałszywych informacji strukturalnych. Fast-NPS, wręcz przeciwnie, pozwala dobrać do każdej cząsteczki barwnika inny model. Pomaga to wyjaśnić różne zachowania konformacyjne zarówno samej cząsteczki barwnika, jak i łącznika używanego do jej przyłączania. Lokalne otoczenie molekularne cząsteczki barwnika, a także jego właściwości fizyczne określą, który model jest najbardziej odpowiedni.
Dla analizowanej sieci smFRET archeonowego kompleksu inicjacyjnego założenie izotropowe dla wszystkich cząsteczek barwnika prowadzi do drastycznego zmniejszenia wielkości wiarygodnych objętości w porównaniu z modelem klasycznym. W połączeniu z dynamicznym uśrednianiem pozycji dla wszystkich cząsteczek barwnika, mediana wszystkich wiarygodnych wielkości objętości (na poziomie 95%) zmniejsza się do mniej niż 0,5 nm3. Jednak te późniejsze cząsteczki barwnika nie są już zgodne z ich pomiarami smFRET, co wskazuje, że przyjęte założenia prowadzą do fałszywych informacji strukturalnych. Natomiast posteriory wyznaczone w modelu klasycznym są zgodne z wyznaczonymi sprawnościami smFRET.
Ponieważ założenie izotropowego i/lub dynamicznego uśredniania pozycji dla wszystkich barwników prowadzi do niespójności, Fast-NPS umożliwia wcześniejsze określenie cząsteczek barwnika, w których każdemu barwnikowi można przypisać jeden z pięciu modeli. Każdy model korzysta z tej samej dostępnej objętości. Algorytm obliczania barwnika AV przyjmuje kilka założeń. Początkowo przestrzenny kształt fluoroforu jest przybliżony przez kulę. W związku z tym należy użyć średnicy uwzględniającej szerokość, wysokość i grubość fluoroforu (sekcja 12). Ponadto kształt łącznika jest przybliżony za pomocą elastycznego pręta. Wartości przedstawione w sekcji 12 zostały obliczone dla barwnika Alexa 647 podłączonego za pomocą łącznika 12-C. Do tej pory nie jest możliwe dokładne określenie a priori, który model jest najbardziej odpowiedni, biorąc pod uwagę geometrię eksperymentalną, a zatem wszystkie modele powinny zostać przetestowane. Ogólnie rzecz biorąc, wybiera się model, który daje najmniejszy możliwy rozmiar tylny, a jednocześnie jest zgodny z danymi. Aby sprawdzić, czy wybór modeli jest zgodny z danymi smFRET, obliczamy zarówno prawdopodobieństwo, jak i a posteriori. Spójność oznacza, że ponad 90% próbek pobranych z tylnego odcinka mieści się w 95% przedziale ufności prawdopodobieństwa.
Chociaż prawdą jest, że im niższa anizotropia, tym mniejsza niepewność odległości, w sieci smFRET należy również wziąć pod uwagę geometryczne układy cząsteczek barwnika. Tak więc, podczas gdy reprezentowanie cząsteczek barwnika o niskiej anizotropii fluorescencji za pomocą modelu ISO jest typowym pierwszym wyborem, test konsystencji zapewnia bardziej bezpośredni sposób wyboru właściwego modelu barwnika. Optymalny wybór modeli barwników może prowadzić do drastycznego wzrostu precyzji lokalizacji, a jednocześnie zachować spójność sieci z danymi FRET.
Podsumowując, Fast-NPS pozwala na uzyskanie informacji strukturalnych i dynamicznych o dużych kompleksach makromolekularnych. W przeciwieństwie do powszechnych metod strukturalnych, takich jak krystalografia rentgenowska lub kriomikroskopia elektronowa, pozwala to na monitorowanie wysoce elastycznych lub przejściowych kompleksów, co znacznie poszerza naszą mechanistyczną wiedzę na temat złożonych procesów biologicznych.

Wyznaczenie struktury biomolekuły jest kluczowym warunkiem wstępnym do zrozumienia jej funkcji. Dwiema uznanymi metodami wyznaczania struktury są krio-mikroskopia elektronowa oraz krystalografia rentgenowska1,2. Obecnie obie metody dostarczają wysokorozdzielczych informacji strukturalnych z rozdzielczością sięgającą poziomu angstremów. Obie te metody były szeroko stosowane do wyjaśnienia struktury dużych biomolekuł, takich jak kompleksy białkowe. Choć istniejące metody były stale udoskonalane przez ostatnie dekady, złożoność struktur biologicznych wciąż stanowi główne wyzwanie dla biologii strukturalnej, w szczególności w przypadku badania dużych, dynamicznych i przejściowych kompleksów3.

W celu badania dynamiki kompleksów makromolekularnych, a w szczególności zależności między strukturą a funkcją, niezwykle przydatne informacje dostarczyły metodologie pojedynczych cząsteczek4. Opracowano kilka nowych strategii zapewniających ortogonalne podejście do pozyskiwania informacji strukturalnych i dynamicznych. Przykładami są szybka AFM5, manipulacja mechaniczna6, mikroskopia lokalizacji fluorescencji7, a także transfer energii rezonansowej Förstera w pojedynczych cząsteczkach (smFRET)8,9. Ze względu na zależność od odległości w skali długości biomakromolekuł, FRET od dość dawna określa się mianem molekularnej linijki10.
Jednym z szczególnie interesujących zastosowań smFRET jest wykorzystanie informacji o odległości uzyskanych z pomiarów smFRET do wywnioskowania informacji strukturalnych11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Dzięki wysokiej rozdzielczości czasowej smFRET możliwe jest zlokalizowanie pozycji ruchomych części struktury białka. Jednak w celu wyodrębnienia ilościowych informacji z danych smFRET, podczas pomiaru należy określić istotne parametry korekcyjne dotyczące cząsteczek barwnika24. Przy użyciu tych współczynników korekcyjnych można obliczyć wydajność FRET EFRET korzystając ze wzoru
<img alt="Wzór na wydajność FRET \(E_{FRET}=\frac{I_A-\beta \cdot I_D}{I_A+\gamma \cdot I'_D}\); metoda spektroskopowa." src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">,
 
gdzie IA i ID to odpowiednio intensywności fluorescencji cząsteczki akceptora i donora (patrz Rysunek 2). Współczynnik β uwzględnia tzw. cross-talk, czyli przenikanie emisji donora do kanału akceptora, i jest obliczany według wzoru
<img alt="Wzór na równowagę statyczną, β=I'A/I'D, równanie stosowane w analizie mechanicznej." src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 2">
gdzie I'A i I'D to intensywności fluorescencji cząsteczki akceptora i donora po fotowybieleniu cząsteczki akceptora.
Współczynnik γ koryguje różnicę w względnej wydajności detekcji w dwóch kanałach, a także różnice w kwantowej wydajności fluorescencji barwnika donora i akceptora. Oblicza się go dla każdego pojedynczego przebiegu czasowego według wzoru
<img alt="Wzór na korekcję gamma, ΔIA/ΔID, wyrażenie matematyczne dla analizy przetwarzania obrazu." src="/files/ftp_upload/54782/54782eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 3">
Należy zauważyć, że opis ten pomija bezpośrednie wzbudzenie cząsteczki akceptora, co niekiedy staje się istotne i wymagałoby wprowadzenia odpowiednich korekt. Do wyznaczenia tych współczynników korekcji użyteczne jest wzbudzanie zarówno donora, jak i akceptora w schemacie naprzemiennym25, aby odróżnić zmiany fotofizyczne od dynamiki strukturalnej.
Aby uzyskać nie tylko ilościowe wartości wydajności smFRET, ale także ilościowe informacje strukturalne, w 2008 roku wprowadzono System Nanopozycjonowania (Nano-Positioning System, NPS)26. Nazwa ta została wybrana ze względu na podobieństwo do satelitarnego Systemu Pozycjonowania Globalnego (GPS). NPS jest techniką hybrydową łączącą dane smFRET i krystalografii rentgenowskiej w celu lokalizacji nieznanych pozycji barwników w kompleksach biomakromolekularnych. Struktura krystaliczna służy jako układ odniesienia, a wyniki smFRET są wykorzystywane do uzyskania informacji o odległości między nieznaną pozycją fluoroforu (antena) a pozycją znaną ze struktury krystalicznej (satelita). W kolejnych eksperymentach mierzy się odległości między anteną a kilkoma satelitami, a pozycja anteny jest wyznaczana za pomocą statystycznie rygorystycznego schematu analizy opartego na bayesowskiej estymacji parametrów. W rezultacie obliczana jest nie tylko najbardziej prawdopodobna pozycja anteny, ale także jej pełny trójwymiarowy rozkład niepewności, tzw. rozkład a posteriori, wizualizowany za pomocą objętości wiarygodnych (credible volumes). Ponadto system NPS został rozszerzony, aby umożliwić analizę kompletnych sieci smFRET27.
Metoda NPS została wykorzystana do rozwiązania szeregu istotnych kwestii dotyczących transkrypcji u eukariotów, a mianowicie przebiegu powyżej położonego DNA, DNA niematrycowego oraz powstającego mRNA w obrębie kompleksu elongacyjnego polimerazy RNA II12,28, wykazując również wpływ czynników inicjacji transkrypcji26 oraz dynamiczną architekturę otwartego kompleksu promotora29. Ponadto NPS wykorzystano do wyjaśnienia struktury otwartego kompleksu polimerazy RNA archeonów30, a w szczególności pozycji czynnika inicjacji transkrypcji TFE, który wiąże się konkurencyjnie w tym samym miejscu co czynnik elongacji transkrypcji Spt4/531.
Od tego czasu opublikowano szereg podejść strukturalnych opartych na smFRET15,18,21,23. Porównując różne strukturalne metody oparte na smFRET, staje się jasne, że pozorna precyzja metody jest w dużej mierze zależna od konkretnego wyboru modeli barwników. Należy zauważyć, że cząsteczki barwników mogą wykazywać różne zachowania przestrzenne i orientacyjne w zależności od ich lokalnego otoczenia.
W tym celu wprowadzono metodę Fast-NPS32. Fast-NPS wykorzystuje zaawansowany algorytm próbkowania, który drastycznie skraca czas obliczeń. Ponadto Fast-NPS umożliwia przeprowadzenie analizy strukturalnej, a dla każdej cząsteczki barwnika użytkownik może wybrać jeden z pięciu różnych modeli barwników, które zostaną opisane poniżej. Najbardziej konserwatywny model, nazwany classic, zakłada, że barwnik zajmuje tylko jedną, lecz nieznaną pozycję. W tej pozycji fluorofor może swobodnie obracać się wewnątrz stożka, którego rozmiar jest określany na podstawie odpowiadającej mu (zależnej od czasu) anizotropii fluorescencji. Orientacja stożka jest nieznana, co prowadzi do dużych niepewności podczas przeliczania zmierzonych wydajności smFRET na odległości. W tym względzie model ten jest konserwatywny, ponieważ w porównaniu z innymi modelami barwników prowadzi on do najmniejszej precyzji. Dopiero w przypadku bardzo krótkich odległości założenia modelu classic powinny prowadzić do zauważalnie błędnego wyznaczenia pozycji. Dla typowych wartości smFRET poprawna pozycja jest zawsze zawarta w stosunkowo dużej objętości wiarygodnej.
Ponieważ jednak pożądana jest wyższa precyzja, ważne jest opracowanie i przetestowanie alternatywnych modeli barwnika, które mogłyby pomóc w jej poprawie. Jeśli barwnik obraca się znacznie szybciej niż wynosi jego naturalny czas życia fluorescencji, można zastosować tzw. model iso. W tym przypadku czynnik orientacji κ2 (niezbędny do obliczenia charakterystycznego izotropowego promienia Förstera<img alt="R_iso=0, wzór równowagi statycznej, równanie fizyczne, użytek edukacyjny" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">) przyjmuje wartość 2/3. W rezultacie obliczone objętości wiarygodne są niemal o dwa rzędy wielkości mniejsze w porównaniu z objętościami w modelu klasycznym32. W przypadku, gdy fluorofor znajduje się w środowisku umożliwiającym nie tylko szybką reorientację, ale dodatkowo szybki ruch w całej dostępnej dla niego objętości, należy zastosować model meanpos-iso. W tym modelu barwnik efektywnie zajmuje tylko jedną średnią pozycję, w której uśrednianie przestrzenne jest uwzględniane poprzez wielomianową konwersję odległości15. Model ten ma zastosowanie na przykład wtedy, gdy (zazwyczaj hydrofobowy) barwnik jest przyłączony do regionu hydrofilowego, np. do DNA. Zastosowanie modelu meanpos-iso prowadzi do dalszej redukcji wielkości objętości wiarygodnych o czynnik wynoszący w przybliżeniu dwa. Jednak barwnik połączony z białkiem może wiązać się odwracalnie z kilkoma płatami hydrofobowymi w swojej sterycznie dostępnej objętości (AV). Fluorofor, który natychmiast przełącza się między tymi regionami, ale w obrębie jednego regionu wykonuje swobodny obrót i szybki ruch lokalny, jest najlepiej opisany przez model var-meanpos-iso. W podobnej sytuacji, w której barwnik nie może swobodnie rotować, stosuje się model var-meanpos. Więcej szczegółów na temat tych modeli można znaleźć w naszej niedawnej publikacji32.
Modele te zapewniają szeroki repertuar, który pozwala na specyficzne uwzględnienie różnych środowisk, w jakich może znajdować się barwnik, a ich przemyślane zastosowanie optymalizuje precyzję lokalizacji. W programie Fast-NPS każdą cząsteczkę barwnika przyłączoną do określonej pozycji można przypisać do indywidualnego modelu, dzięki czemu partnerzy FRET mogą posiadać różne modele. Umożliwia to nielimitowane modelowanie, bliskie warunkom naturalnym. Ważne jest jednak, aby przeprowadzić rygorystyczne testy statystyczne w celu upewnienia się, że wynik uzyskany przez końcową kombinację modeli jest nadal zgodny z danymi eksperymentalnymi. Testy te są zawarte w oprogramowaniu Fast-NPS.
Aby zastosować metodę Fast-NPS do danych eksperymentalnych, wymagany jest pomiar (tylko) trzech parametrów wejściowych. Po pierwsze, należy wyznaczyć izotropowe promienie Förstera specyficzne dla danej pary barwników (<img alt="Równanie statycznej równowagi \( R_0^{iso} \); schemat inżynieryjny lub fizyczny." src="/files/ftp_upload/54782/54782eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">). W tym celu należy zmierzyć wydajność kwantową (QY) barwnika donora, widma emisji fluorescencji donora oraz widma absorpcji akceptora. Pomiary te można przeprowadzić w roztworze objętościowym, wykorzystując standardowy spektrometr oraz standardowy spektrometr fluorescencyjny. Dla każdej pary wartość R0 jest następnie obliczana za pomocą bezpłatnego oprogramowania PhotochemCAD i może być wykorzystana w analizie NPS. Ponadto, przy użyciu spektrometru fluorescencyjnego czułego na polaryzację (i czas), należy wyznaczyć (rozdzielcze w czasie) anizotropie fluorescencji cząsteczek barwnika. Jednak najważniejszymi parametrami wejściowymi dla Fast-NPS są wydajności smFRET mierzone na układzie do mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek, takim jak mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM).
W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół pozyskiwania danych smFRET oraz zastosowania metody Fast-NPS (Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Przygotowanie komory przepływowej</td></tr><tr><td>Indywidualny uchwyt na próbki metalowe</td><td>samodzielnie zbudowany</td><td>bez</td><td></td></tr><tr><td>szkiełek kwarcowych, 76&nbsp; mm x 26&nbsp; mm</td><td>Szkiełka techniczne</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe, 60 mm x 24&nbsp; mm</td> Detergent <td>do 101242</td><td></td><td>Marienfeld</td></tr><tr><td>, Hellmanex II</td><td>Hellma</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>ultraczysta woda od Synergy UV</td><td>Millipore</td><td>2512600</td><td></td></tr><tr><td>Myjka plazmowa Zepto</td><td>Diener</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropylo)-trietoksysilan, p.a.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>walerianian metoksy PEG-sukcynimidylu, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowany walerianian PEG-sukcynimidylu, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTIN-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Biowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127 Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>folia uszczelniająca (Nescofilm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Elastyczny przewód silikonowy, 0,8&nbsp; mm ID, 2.4&nbsp; mm OD</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics</td><td>720958</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polietylenowe o drobnych otworach, 0,58 mm ID, 0,96 mm OD (Smiths Medical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Life Technologies</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser, 532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr><tr><td>pompowany diodowo laser półprzewodnikowy, 491 nm, laser diodowy Calypso</td><td>Cobolt</td><td>904010050</td><td></td></tr><tr><td>643 nm, iBeam smart</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td></td></tr><tr><td>zwierciadło dichroiczne, 532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr><tr><td>zwierciadło dichroiczne, 476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr><td>akustyczno-optyczny filtr przestrajalny</td><td>AA Optoelektroniczna</td><td>soczewka cylindryczna plano-wypukła AOTFnC-VIS</td><td></td></tr><tr><td>, f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>płasko-wklęsła cylindryczna, f = -300&nbsp; mm</td> pryzmat <td>Thorlabs</td>, soczewka skupiająca <td></td><td></td></tr><tr><td>PS 991</td><td>Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>, f = 75&nbsp; mm</td> Pompa strzykawkowa <td>Thorlabs</td><td>LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>, PHD 2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2 silniki krokowe, Z812B</td> Siłownik piezoelektryczny <td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr>, laser diodowy <tr><td>PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td>IR</td><td>Edmund Optics</td><td>CPS808</td><td>część systemu autofokusa</td></tr><tr><td>lustro dichroiczne, 775 DCXR</td><td>Chroma</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>detektor położenia (PSD), PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>część systemu autofokusa</td></tr><tr><td>obiektyw zanurzeniowy w wodzie, Plan Apo 60X WI, NA 1.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>zwierciadło dichroiczne, 645 DCXR</td><td>Chroma</td><td>645 DCXR</td><td>część filtra emisji ścieżki</td></tr><tr><td>emisji, 3RD550-510</td><td>Omega Optical</td><td>3RD550-510</td><td>zielony kanał w filtr emisyjny ścieżki emisyjnej</td></tr><tr><td>, 3RD660-760</td><td>Omega Optical</td><td>3RD660-760</td><td>czerwony kanał w ścieżce emisyjnej</td></tr><tr><td>kamera EMCCD, iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>Kamera EMCCD, iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>AND-20-000141</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Różne</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>Spektrometr UV-VIS</td></tr><tr><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td><td>spektrometr fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Solis (V4.15)</td><td>Oprogramowanie sterujące Andor</td><td></td><td>do kamery EM-CCD</td></tr><tr><td>Narzędzie użytkownika Apt&nbsp; (wersja 1.022)</td><td>Oprogramowanie sterujące Thorlabs</td><td></td><td>dla silników piezoelektrycznych</td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive 68</td><td>Klej Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC-AFN-0.8 Nil czerwony</td><td>Kisker Biotech</td><td></td><td>fluorescencyjne koraliki multispec powlekane awidyną&nbsp;</td></tr><tr>Techniczny język obliczeniowy <td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>dla oprogramowania pisanego dla klientów</td></tr><tr><td>Origin (V9.0)</td><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy danych</td> <td>Originlab</td><td></td></tr><tr><td>Hellma 105-202-15-40</td> Kuweta absorpcyjna <td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td><td>o średnicy 1&nbsp; cm długość ścieżki</td></tr><tr><td>Hellma 105-251-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-251-15-40</td><td>kuweta fluorescencyjna o długości ścieżki 3 mm</td></tr></tbody></table>

informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami fret przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) może być używany do uzyskiwania informacji strukturalnych o kompleksach biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W ten sposób stosuje się wielokrotne pomiary smFRET w celu zlokalizowania nieznanej pozycji barwnika w kompleksie białkowym za pomocą trilateracji. W celu uzyskania informacji ilościowych, Nano-Positioning System (NPS) wykorzystuje probabilistyczną analizę danych do łączenia informacji strukturalnych z krystalografii rentgenowskiej z danymi fluorescencji pojedynczych cząsteczek w celu obliczenia nie tylko najbardziej prawdopodobnej pozycji, ale także pełnego trójwymiarowego rozkładu prawdopodobieństwa, zwanego a posterior, co wskazuje na niepewność eksperymentalną. Koncepcja ta została uogólniona na potrzeby analizy sieci smFRET zawierających liczne cząsteczki barwnika. Najnowsza wersja NPS, Fast-NPS, zawiera nowy algorytm wykorzystujący estymację parametrów bayesowskich w oparciu o próbkowanie Monte Carlo łańcucha Markowa i równoległe temperowanie, który pozwala na analizę dużych sieci smFRET w stosunkowo krótkim czasie. Co więcej, Fast-NPS umożliwia obliczenie tylnego odcinka poprzez wybór jednego z pięciu różnych modeli dla każdego barwnika, które uwzględniają różne zachowania przestrzenne i orientacyjne wykazywane przez cząsteczki barwnika ze względu na ich lokalne środowisko.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół uzyskiwania danych smFRET i stosowania Fast-NPS. Udostępniamy szczegółowe instrukcje dotyczące akwizycji trzech parametrów wejściowych Fast-NPS: wartości smFRET, a także wydajności kwantowej i anizotropii cząsteczek barwnika. Ostatnio NPS został wykorzystany do wyjaśnienia architektury archeonowego otwartego kompleksu promotorowego. Dane te służą do zademonstrowania wpływu pięciu różnych modeli barwnika na rozkład a posteriori.

Transkrypcja jest pierwszym etapem ekspresji genów u wszystkich organizmów. U archeonów transkrypcja jest prowadzona przez pojedynczą polimerazę RNA (RNAP). W porównaniu z eukariotami, archeonowa RNAP wykazuje uderzające podobieństwo strukturalne do swoich eukariotycznych odpowiedników, posiadając jednocześnie prostszy aparat transkrypcyjny. W związku z tym archeony mogą służyć jako system modelowy do badania inicjacji transkrypcji u eukariotów przez polimerazę RNA II (Pol II). Niedawno, dzięki metodom smFRET i NPS, określono pełną architekturę otwartego kompleksu polimerazy RNA u archeonów. Dane z analizy NPS zostały wykorzystane do budowy modelu pełnego otwartego kompleksu promotora u archeonów, co dostarcza cennych informacji na temat mechanizmu inicjacji transkrypcji.
Aby wyjaśnić tę strukturę, zmierzono wydajności smFRET pomiędzy nieznanymi cząsteczkami barwnika antenowego znajdującymi się w otwartym kompleksie promotora a kilkoma znanymi cząsteczkami barwnika satelitarnego, które włączono w pięciu miejscach referencyjnych w RNAP, których pozycje są znane z struktur krystalograficznych (pdb-ID: 2WAQ)37. Barwniki antenowe przyłączono do jednej z różnych pozycji w niet szablonowej nici DNA, TFB, TBP lub TFE. Kompletna sieć wykorzystana w niniejszym badaniu składała się z ponad 60 zmierzonych odległości.
Rysunek 7 przedstawia model kompletnego archeonowego otwartego kompleksu promotora zbudowany na podstawie analizy NPS. Składa się on z dwuniciowego DNA promotora (jasnoniebieski i ciemnoniebieski), polimerazy RNA (szary) oraz czynników inicjacji transkrypcji TBP (fioletowy), TFB (zielony) i TFE (żółty). Model jest nałożony na wyniki analizy NPS, czyli objętości wiarygodne, które zostały obliczone przy użyciu modelu klasycznego (A), modelu iso (B), modelu meanpos-iso (C), modelu var-meanpos-iso (D) oraz modelu var-meanpos (E).
<img alt="Mikroskop TIRF, schemat spektrometru UV/VIS; wydajność FRET, promień Förstera; analiza Fast-NPS." src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat pozyskiwania i przetwarzania parametrów niezbędnych do obliczeń Fast-NPS. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres natężenia fluorescencji w funkcji czasu; analiza danych procesu wzbudzenia optycznego." src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przykładowy przebieg czasowy natężenia fluorescencji podczas zdarzenia smFRET. Natężenia fluorescencji donora (zielony) i akceptora (czerwony) wykazujące trzy charakterystyczne fazy, mianowicie I: smFRET, II: fluorescencja donora po fotobleachingowaniu akceptora, III: fluorescencja tła po fotobleachingowaniu donora. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu optycznego do spektroskopii z wykorzystaniem szkiełka kwarcowego, kanału przepływowego, pryzmatu i uchwytu akrylowego." src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schematyczna ilustracja komory przepływowej do eksperymentów smFRET. Komora przepływowa jest zamontowana na specjalnie dostosowanym metalowym uchwycie z elementami z szyb z tworzywa akrylowego. Konstrukcja komory przepływowej typu kanapkowego składa się z szkiełka kwarcowego (topionej krzemionki) z dwoma otworami do podłączenia rurek doprowadzających i odprowadzających, folii uszczelniającej oraz szkiełka nakrywkowego, które zamyka komorę przepływową. Pryzmat do oświetlenia TIRF jest zamontowany do dolnej części komory przepływowej. Śruby z pustym rdzeniem pełnią funkcję wlotów i wylotów komory przepływowej. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat szklanego slajdu kwarcowego; wymiary 76x26x1mm; konstrukcja wlotowo-wylotowa do zestawów laboratoryjnych." src="/files/ftp_upload/54782/54782fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przygotowanie szklanego slajdu kwarcowego i folii uszczelniającej. Rysunek techniczny szklanego slajdu kwarcowego ze wskazaniem pozycji otworów (podane w milimetrach). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schematy wymiarowe uchwytu aluminiowego i akrylowego, rysunek techniczny, wykonanie sprzętu." src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Rysunek techniczny komory przepływowej. Wymiary uchwytu pryzmatu aluminiowego, uchwytów z pleksi oraz aluminiowej ramy montażowej podano w milimetrach. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu spektroskopii optycznej z laserami, EM-CCD i AOTF do analizy wzbudzenia i emisji." src="/files/ftp_upload/54782/54782fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Schematyczny rysunek układu TIRF z pryzmatem użytego w eksperymentach smFRET. Skróty dla komponentów optycznych: A, apertura; DM, lustro dichroiczne; F, filtr emisyjny; L, soczewka; M, lustro; O, obiektyw; P, pryzmat; PSD, fotodioda czuła na położenie; S, próbka; PS, stół pozycjonujący; T, teleskop. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Molekularne modele wiązania DNA-białko, schemat przedstawiający oddziaływania ntDNA z różnymi białkami." src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Wyniki symulacji dla różnych założeń modelowych. Wszystkie obrazy przedstawiają archeonową polimerazę RNA (pdb-ID: 2WAQ, widok z góry) wraz z modelem DNA promotora (tDNA i ntDNA odpowiednio w kolorze niebieskim i cyjanowym), TBP (fioletowy), TFB (zielony) i TFE (żółty) w archeonowym kompleksie otwartym30. Objętości wiarygodne są nałożone dla wyników symulacji NPS w przypadku (A) modelu klasycznego, (B) modelu iso, (C) modelu meanpos-iso, (D) modelu var-meanpos-iso oraz (E) modelu var-meanpos. Wszystkie objętości są pokazane przy wiarygodności 68%. Sieci klasyczna i var-meanpos są zgodne z danymi smFRET. W przeciwieństwie do nich, sieci, w których dla wszystkich barwników wybrano model iso, meanpos-iso lub var-meanpos-iso, są niezgodne z pomierzonymi danymi. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Przedstawiamy konfigurację i eksperymentalną procedurę uzyskiwania danych smFRET z dużych sieci donor-akceptor za pomocą mikroskopu TIRF. Analiza tych pomiarów krok po kroku za pomocą oprogramowania do wnioskowania bayesowskiego Fast-NPS pozwala uzyskać informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dzięki zastosowaniu dostosowanych modeli barwników.

Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Ogólnym celem systemu Fast Nano-positioning jest dostarczanie informacji strukturalnych o biomolekułach w czasie rzeczywistym poprzez połączenie eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET z rygorystyczną analizą statystyczną. Metoda ta odpowiada na kluczowe pytania z zakresu biologii strukturalnej, takie jak lokalizacja elastycznych domen w makrocząsteczkach, w których nie można zastosować standardowych narzędzi biologii struktury. Główną zaletą szybkiego NPS w porównaniu z innymi narzędziami strukturalnymi opartymi na FRET jest to, że różne modele barwników można porównywać nie tylko przy użyciu najbardziej prawdopodobnych pozycji, ale także trójwymiarowego rozkładu prawdopodobieństwa.Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona dane strukturalne z bazy danych białek z ilościowymi pomiarami fluorescencji pojedynczych cząsteczek. Aby rozpocząć procedurę, należy zamontować komorę przepływową i uchwyt na próbkę. Aby przygotować wlotowe i wylotowe, wkręć silikonową rurkę w z wydrążonymi wypustkami i przetnij rurkę prosto na obu końcach żyletką.Przykręć z klapką do uchwytu próbki. Dopasuj otwory suwaka kwarcowego komory przepływowej do gwintów uchwytu próbki. Delikatnie dokręć uchwytu szkła, aby zamocować komorę przepływową na miejscu.Wkręć 20-centymetrowe kawałki silikonowej rurki w wlotowe i wylotowe. Umyć komorę przepływową 500 mikrolitrami PBS. Następnie przepłukać komorę przepływową 100 mikrolitrami roztworu neutrawidyny w PBS, upewniając się, że na końcu rurki dolotowej utworzy się kropelka, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do komory próbki.Clamp rurki wlotowe i wylotowe zamknięte po każdej manipulacji, aby wykluczyć powietrze z komory przepływowej. Inkubować komorę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przepłukać roztwór neutrawidyny 500 mikrolitrami PBS.Dodaj kroplę olejku immersyjnego na pryzmat i przykręć pryzmat do komory próbki. Dane dotyczące pojedynczej cząsteczki FRET są pozyskiwane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Uruchom oprogramowanie kamery i oprogramowanie piezomotoryczne sceny.Zamontuj komorę do stolika mikrometrycznego mikroskopu TIRF poziomo, tak prosto, jak to możliwe, i w taki sposób, aby przecinała wszystkie trzy lasery. Dodaj płyn zanurzeniowy i ustaw ostrość obiektyw mikroskopu, sprawdzając odbicia w podczerwieni. Ustaw parametry kamery, ścieżkę do pliku i parametry automatycznego zwiększania.Rozpocznij transmisję z kamery na żywo i rozjaśnij fluorescencję tła przy użyciu wszystkich trzech laserów z pełną intensywnością. Następnie zmniejsz intensywność lasera. Następnie załaduj 100 mikrolitrów roztworu kulek fluorescencyjnych do komory.Odczekaj 10 minut, aż koraliki zwiążą się z powierzchnią komory. Nagraj film z polem widzenia od 50 do 100 ściegów i wykonaj analizę wsadową z wysokim progiem znajdowania szczytu. Wczytaj plik filmowy i wybierz dwa koraliki z wyraźnymi środkami w przeciwległych rogach pola widzenia.Zaznacz piksele o maksymalnej intensywności w tych koralikach. Usuń i wyczyść pryzmat. Przygotuj drugą komorę na próbkę i przykręć uchwyt pryzmatu do komory.Zamontuj komorę do stolika mikrometrycznego. Następnie załaduj do komory 100 mikrolitrów 50 do 100 pikomolarnego roztworu biotynylowanej próbki znakowanej fluorescencyjnie. Poczekaj, aż cząsteczki zwiążą się z powierzchnią komory.Jednocześnie kliknij Take Signal, aby rozpocząć nagrywanie i włączyć laser wzbudzający dawcę. Dostosuj moc lasera, aby upewnić się, że co najmniej 80% cząsteczek w polu widzenia jest wybielonych, Następnie przesuń komorę, aby pokazać niewybielony obszar i nagraj następny film. W ten sposób wybielić resztę komory próbki.Po pomiarach pod mikroskopem TIRF, uzyskane dane dotyczące pojedynczej cząsteczki FRET muszą zostać przeanalizowane w celu uzyskania średniej wydajności FRET. Przeprowadzić analizę wsadową filmów z dawcą i akceptorem próbki. Następnie załaduj wsadowe pliki filmowe do oprogramowania do analizy danych.Kliknij przycisk NIE Wybrano, aby wskazać poszczególne fazy FRET. Kliknij początek okresu FRET, następnie punkt czasowy, w którym intensywność akceptora zmniejsza się z powodu bielenia, a na końcu punkt czasowy, w którym intensywność dawcy zmniejsza się z powodu bielenia. W następnym oknie wybierz opcję Tak, aby zachować wybrany ślad wydajności FRET.Po przeanalizowaniu każdej cząsteczki zapisz ślady i przeanalizuj następny film. Po zakończeniu analizy uruchom skrypt, aby połączyć wyniki FRET. Zaimportuj połączony plik FRET z klatką do oprogramowania do analizy danych, korzystając z domyślnej opcji wprowadzania.Wykreśl dane jako histogram i użyj narzędzia do dopasowywania krzywej nieliniowej, aby dopasować je do krzywej Gaussa. Przekroczona wartość to główna wydajność FRET. Użyj UV VIS i spektroskopii fluorescencyjnej, aby określić izotropowy promień Forstera i wartości anizotropii w stanie ustalonym dla każdego barwnika.Nano-system pozycjonowania został zainspirowany dobrze znanym GPS, ponieważ lokalizujemy nieznaną pozycję, antenę, z kilkoma znanymi pozycjami, satelity. Aby rozpocząć analizę NPS, uruchom oprogramowanie FastNPS i utwórz nowy plik zadania. Aby zdefiniować a priori pozycji oznaczonych anten i satelitów, w oknie ModelDyePrior wprowadź rozdzielczość przestrzenną definiowanej pozycji.Wyklucz wnętrze makrocząsteczki, ładując odpowiedni wyśrodkowany plik PDB. Wprowadź średnicę barwnika i odległość szkieletyzacji. Wypełnij minimalne i maksymalne współrzędne pozycji możliwej lokalizacji barwnika.Jeśli definiowaną pozycją jest satelita, wybierz mocowanie barwnika za pomocą elastycznego łącznika i wprowadź współrzędne atomu z wyśrodkowanego pliku PDB. Wypełnij długość i średnicę łącznika. Kliknij opcję Oblicz dostępną objętość, zapisz wcześniejszą pozycję i wyeksportuj ją do wizualizacji.Powtórz ten proces dla wszystkich satelitów i anten. Po zdefiniowaniu pozycji otwórz okno Definiuj pomiar i utwórz nową cząsteczkę barwnika. Załaduj pozycję wcześniej skojarzoną z tym barwnikiem.Uzupełnij anizotropię fluorescencji, wybierz odpowiedni model barwnika i aktywuj barwnik. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie barwniki zostaną zdefiniowane. Następnie utwórz nowy pomiar.Wybierz parę FRET ze zdefiniowanych barwników. Wprowadź wydajność pojedynczej cząsteczki FRET z błędem oraz izotropowy promień Forstera tej pary barwników i aktywuj pomiar. Powtórz to dla wszystkich par barwników.Następnie otwórz okno obliczeń. Jeśli barwniki zostały przypisane do różnych modeli, wybierz opcję Zdefiniowane przez użytkownika. W przeciwnym razie wybierz model, który ma być używany dla wszystkich barwników.Wykonaj obliczenia i otwórz okno wyników. Korzystając z FastNPS, należy pamiętać o dostosowaniu modeli do wszystkich barwników, aby zminimalizować wiarygodne ilości, przy jednoczesnym zachowaniu spójności. Jeśli konsystencja jest niższa niż 90%kliknij szczegółową spójność i zidentyfikuj barwniki wspólne dla wpisów o konsystencji mniejszej niż 90%.Otwórz okno Definiuj pomiar i zmień model danego barwnika. Uruchom ponownie obliczenia w trybie Zdefiniowany przez użytkownika. Eksportuj wiarygodne ilości barwników pojedynczo lub jako partię.Otwórz pliki gęstości w oprogramowaniu do wizualizacji i dostosuj wiarygodność do żądanego poziomu. Wydajność pojedynczej cząsteczki FRET mierzono między nieznanymi cząsteczkami anteny a kilkoma znanymi cząsteczkami satelitarnymi w archeonowym kompleksie promotorowym polimerazy RNA. Analiza NPS tych danych określiła wiarygodne objętości tych cząsteczek barwnika w stosunku do otwartego kompleksu promotora archeonowej polimerazy RNA.Pięć różnych modeli, w których użyto cząsteczek barwnika, a wyniki porównano. Wiarygodne objętości były zgodne z danymi pomiarowymi, gdy zostały obliczone za pomocą modeli, które zakładały, że barwnik może swobodnie obracać się tylko w stożku o nieznanej orientacji. W szczególności klasyczny model jest najbardziej konserwatywny, ponieważ dalej zakłada, że barwnik znajduje się w ustalonym miejscu.W ten sposób powstaje stosunkowo duża wiarygodna objętość, ale wolumin zazwyczaj obejmuje właściwą pozycję. Modele o wyższej precyzji opierają się na założeniu, że barwnik może całkowicie swobodnie obracać się w okresie swojej fluorescencji. Model iso, podobnie jak model klasyczny, zakłada, że barwnik znajduje się w ustalonej pozycji w dostępnej objętości.Model meanpos-iso zakłada dynamiczne uśrednianie dla wszystkich możliwych pozycji. Chociaż wiarygodne objętości modeli ISO są znacznie mniejsze niż te obliczone przez modele inne niż ISO, są one niespójne z zmierzonymi danymi. Chcieliśmy opracować technikę, która pozwoli nam uchwycić dynamiczne informacje strukturalne o przejściowych kompleksach, problemie, którego nie można było rozwiązać za pomocą istniejących narzędzi strukturalnych.Po zarejestrowaniu danych dotyczących pojedynczej cząsteczki FRET, analiza FastNPS jest wykonywana w ciągu kilku godzin, co pozwala na szybkie porównanie różnych modeli barwników. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak symulacje MD, mogą być następnie wykonywane w celu uzyskania ustrukturyzowanych modeli, które są zgodne z eksperymentalnymi danymi FRET dla pojedynczych cząsteczek.

structural-information-from-single-molecule-fret-experiments-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Metoda badania struktury fotoreceptora białkowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) jest opisana w tym artykule. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) ujawnia nienaruszone dimery białkowe na powierzchni miki.

Mikroskopia sił atomowych fotoreceptorów światła czerwonego przy użyciu ilościowego mapowania właściwości nanomechanicznych PeakForce

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Ostatnio opracowano wiele biosensorów siły opartych na FRET, które umożliwiają specyficzne dla białek rozwiązywanie siły wewnątrzkomórkowej. W tym protokole pokazujemy, w jaki sposób jeden z tych czujników, zaprojektowany dla łącznika białka kompleksu nukleoszkielet-cytoszkielet (LINC) Nesprin-2G, może być wykorzystany do pomiaru sił aktomiozyny w jądrowym kompleksie LINC.

Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Ten protokół szczegółowo opisuje budowę i działanie mikroskopu 3D do śledzenia pojedynczych cząstek w czasie rzeczywistym, zdolnego do śledzenia nanoskalowych sond fluorescencyjnych przy wysokich prędkościach dyfuzyjnych i niskich szybkościach zliczania fotonów.

Protokół do śledzenia pojedynczych cząstek 3D w czasie rzeczywistym

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Ten protokół opisuje zastosowanie mikroskopii sił atomowych i nanoskalowej spektroskopii w podczerwieni do oceny wydajności fototermicznej spektroskopii w podczerwieni w nanoskali w charakterystyce trójwymiarowych próbek wielopolimerowych.

Postępy w nanoskalowej spektroskopii w podczerwieni w celu zbadania wielofazowych układów polimerowych

Poznaj metodę Fast Nano-positioning do analizy struktur biomolekularnych przy użyciu mikroskopii TIRF i pojedynczych cząsteczek FRET. Technika ta umożliwia lokalizację elastycznych domen z wysoką rozdzielczością.

Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Przeglądaj więcej filmów