Name: Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Naucz się syntezy kationizowanej magnetoferrytyny do szybkiego namagnesowania komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia efektywne etykietowanie komórek przy niskich stężeniach nanocząstek, co jest kluczowe dla zastosowań w MRI i separacji magnetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsorowane przez Radę Badań Inżynieryjnych i Fizycznych (kod grantu EPSRC EP/G036780/1).

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) pobrano z szpiku kostnego bliższej części kości udowej u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów poddawanych całkowitej endoprotezoplastyce stawu biodrowego, w pełnej zgodności z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Bristol Southmead Hospital (numer referencyjny #078/01) i po uzyskaniu zgody pacjentów.
1. Synteza i oczyszczanie magnetoferytyny
<ol>
	<li>Uwagi ogólne
	<ol>
		<li>Syntezę magnetoferrytyny należy przeprowadzić w szczelnym, dwupłaszczowym naczyniu reakcyjnym w temperaturze 65 °C w atmosferze azotu, aby ograniczyć utlenianie prekursorów metali. Roztwory soli metali oraz nadtlenek wodoru należy wprowadzać do naczynia reakcyjnego przez porty dostępu w pokrywie za pomocą pompy strzykawkowej.</li>
		<li>Po syntezie magnetoferrytyny należy oczyścić białko za pomocą chromatografii wymiany anionowej (patrz sekcja 1.4), aby usunąć nanocząstki niezamknięte w kawernie białka, a następnie za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego (patrz sekcja 1.5), aby wyizolować monomery białka. Stężenie białka należy oznaczyć metodą Bradforda (patrz sekcja 1.6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowania przed syntezą
	<ol>
		<li>500 ml wody dejonizowanej należy odgazować, umieszczając w wodzie rurkę podłączoną do butli z azotem, uszczelniając naczynie folią spożywczą i przepuszczając azot przez około 60 min.</li>
		<li>Kąpiel wodną połączoną z dwupłaszczowym naczyniem reakcyjnym należy podgrzać do 65 °C. Do naczynia reakcyjnego należy dodać 75 ml buforu 50 mM 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosłonianu (HEPES) (pH 8,6), uszczelnić naczynie i odgazować, przepuszczając azot przez roztwór buforu przez około 20 min. Jednocześnie roztwór buforu należy mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
		<li>Po odgazowaniu roztworu buforu HEPES należy wyjąć rurkę doprowadzającą azot z buforu i pozostawić ją zawieszoną w naczyniu, aby utrzymać atmosferę azotu. Należy dodać apo-ferrytynę, aby uzyskać stężenie końcowe 3 mg/ml. Należy kontynuować mieszanie magnetyczne, zmniejszając prędkość mieszania w przypadku wystąpienia pienienia.</li>
		<li>Należy przygotować roztwór zapasowy 25 mM siarczanu kobaltu siedmiowodnego, rozpuszczając 0,19 g w 50 ml odgazowanej wody dejonizowanej.</li>
		<li>Należy przygotować roztwór 25 mM siarczanu żelaza(III) i amonu sześciowodnego, rozpuszczając 0,98 g w 100 ml odgazowanej wody dejonizowanej.</li>
		<li>Należy odjąć 2,5 ml roztworu siarczanu żelaza(III) i amonu sześciowodnego i zastąpić go 2,5 ml siarczanu kobaltu siedmiowodnego.</li>
		<li>Należy przygotować roztwór 8,33 mM nadtlenku wodoru w odgazowanej wodzie dejonizowanej, dodając najpierw 965 μl roztworu nadtlenku wodoru (30% m/m) do 9 ml odgazowanej wody dejonizowanej, a następnie dodając 1 ml tego roztworu pośredniego do 99 ml odgazowanej wody dejonizowanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza magnetoferrytyny
	<ol>
		<li>Należy jednocześnie wstrzyknąć 10,1 ml prekursora żelazo-kobalt oraz nadtlenku wodoru do roztworu apo-ferrytyny (mieszanego magnetycznie) z prędkością przepływu 0,15 ml/min przy użyciu dwóch pomp strzykawkowych (całkowita objętość wstrzyknięta: 20,2 ml).</li>
		<li>W czasie wstrzykiwania należy odgazować kolejne 500 ml wody dejonizowanej. 
		UWAGA: W miarę postępu reakcji zawartość naczynia reakcyjnego stopniowo przybiera ciemnobrązowy kolor.</li>
		<li>Krótko przed zakończeniem pierwszego wstrzykiwania należy przygotować kolejne 100 ml prekursora żelazo-kobalt oraz roztworu nadtlenku wodoru, używając świeżo odgazowanej wody dejonizowanej.</li>
		<li>Należy powtórzyć etap wstrzykiwania opisany w punkcie 1.3.1, używając świeżo przygotowanych roztworów żelazo-kobaltu i nadtlenku wodoru.</li>
		<li>W czasie wstrzykiwania należy odgazować kolejne 500 ml wody dejonizowanej i postępować zgodnie z opisem w punktach 1.3.3 i 1.3.4.</li>
		<li>Po trzecim wstrzykiwaniu należy pozostawić roztwór do dojrzewania na 15 min przy mieszaniu.</li>
		<li>Do naczynia reakcyjnego należy dodać 1,5 ml 1 M roztworu cytrynianu sodu w celu chelatowania wolnych jonów metali w roztworze.</li>
		<li>Roztwór należy przelać z naczynia reakcyjnego do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, wirować przez 30 min przy 4 350 x g, a następnie przepuścić nadsącz przez filtr strzykawkowy 0,22 µm. Na tym etapie przefiltrowany nadsącz można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu oczyszczania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia wymiany jonowej
	<ol>
		<li>Próbkę należy nałożyć na kolumnę (średnica 2,5 cm, długość 20 cm) zawierającą macierz kationową za pomocą pompy perystaltycznej przy prędkości przepływu 10 ml/min.</li>
		<li>Kolumnę należy przemyć około 100 ml buforu prowadzącego (bufor 50 mM Tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris), pH 8,0) za pomocą pompy gradientowej przy prędkości przepływu 10 ml/min.</li>
		<li>Aby eluować białko, kolumnę należy przemywać z prędkością 10 ml/min roztworami chlorku sodu (NaCl) w buforze Tris o rosnących stężeniach: końcowe stężenia NaCl 150, 500 i 1 000 mM, po 150 ml każdego stężenia.</li>
		<li>Ponieważ białko eluuje przy stężeniu NaCl wynoszącym 500 mM, należy je zbierać w frakcjach po 50 ml za pomocą automatycznego zbieracza frakcji. 
		UWAGA: Szczegółowy protokół chromatografii wymiany jonowej znajduje się w wcześniej opublikowanych protokołach.26</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia wykluczania cząsteczkowego
	<ol>
		<li>150 ml magnetoferrytyny należy zagęścić do objętości około 2 ml, używając jednostki filtra wirówkowego 15 ml, a następnie jednostki 4 ml. Szczegółowy protokół tej procedury znajduje się w instrukcjach producenta jednostek filtra wirówkowego (patrz lista materiałów).</li>
		<li>Zagęszczoną próbkę należy nałożyć na kolumnę do filtracji żelowej za pomocą pętli wtryskowej.</li>
		<li>Kolumnę należy przemyć buforem prowadzącym (bufor 50 mM Tris, pH 8,0, zawierający 150 mM NaCl) z prędkością przepływu 1,3 ml/min.</li>
		<li>Frakcje po 6 ml należy zbierać za pomocą automatycznego zbieracza frakcji. Monomery białka eluują na końcu. Na tym etapie oczyszczoną magnetoferrytynę można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu kationizacji. 
		UWAGA: Szczegółowy protokół chromatografii wykluczania cząsteczkowego z użyciem kolumny do filtracji żelowej znajduje się w wcześniej opublikowanych protokołach.27</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie stężenia białka
	<ol>
		<li>Należy przygotować standardy ferrytyny o stężeniach 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 i 1 mg/ml w buforze 50 mM Tris, używając komercyjnie dostępnej ferrytyny z śledziony końskiej. 
		UWAGA: Stężenie białka w komercyjnie dostępnej ferrytynie jest podane na butelce. Jeśli nie, należy skontaktować się z dostawcą w celu uzyskania tej informacji.</li>
		<li>Próbki magnetoferrytyny o nieznanym stężeniu należy rozcieńczyć w buforze 50 mM Tris, aż kolor roztworu będzie odpowiadał mniej więcej kolorowi standardu 0,5 mg/ml. Należy zapisać czynnik rozcieńczenia.</li>
		<li>Do dołków płytki 96-dołkowej należy dodać po 10 μl każdego standardu i próbki magnetoferrytyny w trzech powtórzeniach.</li>
		<li>Do każdego dołka należy dodać 200 μl gotowego odczynnika Bradforda (szczegóły dotyczące odczynnika do testu Bradforda znajdują się na liście materiałów).</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 8 minut.</li>
		<li>Absorbancję należy zmierzyć przy λ = 595 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
		<li>Należy wykreślić średnią absorbancję standardów ferrytyny jako funkcję stężenia białka i wykorzystać nachylenie oraz punkt przecięcia liniowego dopasowania do obliczenia stężenia próbki magnetoferrytyny. 
		UWAGA: Należy uwzględnić czynnik rozcieńczenia, którego użyto do dopasowania próbki magnetoferrytyny do krzywej wzorcowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kationizacja magnetoferrytyny
<ol>
	<li>Uwagi ogólne 
	UWAGA: W celu kationizacji magnetoferrytyny, N,N-dimetylo-1,3-propanodiaminę (DMPA) sprzęgnięto z resztami kwasu asparaginowego i glutaminowego na powierzchni MF przy użyciu chlorowodorku N-(3-dimetylaminopropylo)-N'-etylokarbodiimidu (EDC).
	<ol>
		<li>Reakcję należy prowadzić w temperaturze pokojowej pod stałym mieszaniem. Poniższy protokół dotyczy kationizacji 10 mg magnetoferrytyny w całkowitej objętości 5 ml (stężenie białka 2 mg/ml). Można jednak zwiększyć lub zmniejszyć skalę, zachowując stałe proporcje białka:DMPA:EDC oraz objętości buforu i roztworu magnetoferrytyny.</li>
		<li>Przed reakcją kationizacji próbki magnetoferrytyny należy poddać dializie przeciwko 50 mM buforowi fosforanowemu (pH 7) zawierającemu 50 mM NaCl. Jest to istotne w celu usunięcia buforu elucyjnego Tris i uniknięcia niepożądanych reakcji między aminą Tris a aktywowanymi przez EDC resztami kwasu karboksylowego. Po dializie należy oznaczyć stężenie białka i dostosować je do 4 mg/ml przed przystąpieniem do kationizacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół kationizacji
	<ol>
		<li>Odważyć 374 mg DMPA i rozpuścić w 2,5 ml 200 mM buforu z kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES).</li>
		<li>Dostosować pH roztworu do około 7, używając stężonego (6 M) kwasu solnego (HCl). 
		OSTRZEŻENIE: Ten krok należy przeprowadzić w dygestorium, ponieważ dodanie kwasu do DMPA uwalnia toksyczne opary!</li>
		<li>Dodać 2,5 ml roztworu magnetoferrytyny o stężeniu 4 mg/ml (końcowe stężenie MES wynosi 100 mM, końcowe stężenie magnetoferrytyny wynosi 2 mg/ml, całkowita ilość białka to 10 mg).</li>
		<li>Włożyć mieszadło magnetyczne i mieszać przez 2 h w celu równowagowania.</li>
		<li>Ostrożnie dostosować pH roztworu do 5,0 przy użyciu 1 M HCl.</li>
		<li>Do roztworu DMPA/magnetoferrytyny dodać 141 mg EDC w proszku.</li>
		<li>Kontynuować mieszanie przez 3,5 h.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 µm w celu usunięcia ewentualnych osadów.</li>
		<li>Przenieść roztwór do membrany dializacyjnej o odcięciu masy cząsteczkowej (MWCO) 12-14 kDa i dializować przeciwko 4 L 50 mM buforu fosforanowego (pH 7) zawierającego 50 mM NaCl przez 2 dni w temperaturze 4 °C, wymieniając bufor dializacyjny co najmniej trzy razy w tym okresie. 
		UWAGA: Na tym etapie skationizowaną magnetoferrytynę można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Znakowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych kationizowaną magnetoferrytyną
<ol>
	<li>Uwagi ogólne
	<ol>
		<li>Wszystkie prace z kulturami komórkowymi należy prowadzić w laminarnych szafach klasy II oraz w inkubatorach z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla.</li>
		<li>Komórki hodowano jako monowarstwy w kolbach o powierzchni 175 cm2 z 20 ml pożywki hodowlanej, którą uzupełniano co 3-4 dni. Pożywka hodowlana składała się z DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) zawierającego 1 000 mg/L glukozy, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 1% (v/v) roztworu penicyliny/streptomycyny, 1% (v/v) roztworu L-alanylo-L-glutaminy oraz świeżo dodanych 5 ng/ml ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie magnetyczne hMSC kationizowaną magnetoferrytyną
	<ol>
		<li>Wysiać 150 000 hMSC do kolb o powierzchni 25 cm2 i pozostawić do przytwierdzenia przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Kationizowaną magnetoferrytynę wysterylizować przez filtr strzykawkowy 0,22 µm i oznaczyć stężenie białka.</li>
		<li>Zachowując warunki sterylne, przygotować 0,5 μM roztwór kationizowanej magnetoferrytyny w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Przechowywać zamknięty w sterylnej komorze do hodowli aż do użycia.</li>
		<li>Przemyć wysiane komórki 2 ml PBS o temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Do wysianych komórek dodać 1 ml wysterylizowanego roztworu kationizowanej magnetoferrytyny i inkubować przez pożądany czas (od 1 min do 1 h).</li>
		<li>Przemyć komórki PBS, a następnie zebrać komórki, dodając 0,5 ml trypsyny/kwasu etylendiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubując w temperaturze 37 °C przez 5 min.</li>
		<li>Dodać 1 ml pożywki hodowlanej w celu inaktywacji trypsyny/EDTA, przenieść roztwór do probówki wirówkowej 15 ml i wirować przez 5 min przy 524 x g.</li>
		<li>Odlać nadsącz i zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej, składającego się z 0,5% (w/v) płodowej surowicy bydlęcej i 2 mM EDTA w PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Magnetyczna separacja komórek
	<ol>
		<li>Zamocować magnes do wielostanu i dołączyć do niego kolumnę do separacji magnetycznej. Na kolumnie umieścić filtr do wstępnej separacji.</li>
		<li>Wlać 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej do filtra do wstępnej separacji i pozwolić mu przepłynąć przez filtr oraz kolumnę w celu ich przemycia i nawilżenia.</li>
		<li>Pod kolumną umieścić probówkę wirówkową 15 ml.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml zawiesiny komórkowej do zbiorniczka filtra kolumny do separacji magnetycznej.</li>
		<li>Po opróżnieniu zbiorniczka dodać 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej.</li>
		<li>Po opróżnieniu zbiorniczka dodać kolejne 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej.</li>
		<li>Powtórzyć czynność jeszcze raz (całkowita objętość buforu do separacji magnetycznej użytego do przemywania powinna wynosić 1,5 ml). Ten etap przemywania eluje z kolumny wszystkie niezmagnetyzowane komórki (frakcja komórek niezmagnetyzowanych).</li>
		<li>Zdjąć kolumnę z magnesu i umieścić ją w nowej probówce wirówkowej 15 ml. Usunąć filtr ze zbiorniczka kolumny.</li>
		<li>Do zbiorniczka dodać 1 ml buforu do separacji magnetycznej i natychmiast przepchnąć go przez kolumnę za pomocą tłoka dostarczonego przez producenta. Powoduje to elucję zmagnetyzowanych komórek z kolumny do probówki wirówkowej (frakcja komórek zmagnetyzowanych).</li>
		<li>Obie probówki wirować przez 5 min przy 524 x g.</li>
		<li>Odlać nadsącz i zawiesić osady komórkowe w 0,3 ml PBS.</li>
		<li>Policzyć liczbę komórek w każdej frakcji za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Wyznaczyć frakcję komórek zmagnetyzowanych, M(%), korzystając z następującego równania: 
		<img alt="Wzór na procent masowy, równanie M(%)=100·n(M)/n(M+NM), obliczenia chemiczne." src="/files/ftp_upload/54785/54785eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie">  
		gdzie n(M) to liczba komórek we frakcji zmagnetyzowanej, a n(M+NM) to suma liczb komórek we frakcjach zmagnetyzowanych i niezmagnetyzowanych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hMSC znakowanych kationizowaną magnetoferrytyną do oznaczania zawartości żelaza metodą spektroskopii emisyjnej z plazmą indukcyjnie sprzężoną (ICP-OES) 
	UWAGA: Protokół może wymagać dostosowania do innych urządzeń ICP-OES. Zaleca się konsultację z odpowiedzialnym technikiem.
	<ol>
		<li>Wirować znaną liczbę komórek przez 5 min przy 524 x g.</li>
		<li>Usunąć nadsącz PBS i dodać 0,25 ml 50% (v/v) kwasu azotowego.</li>
		<li>Wymieszać zakwaszoną zawiesinę komórkową w wstrząsarku typu vortex.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
		<li>Do każdej próbki dodać 4,75 ml wody destylowanej i wymieszać w wstrząsarku typu vortex.</li>
		<li>Przeanalizować za pomocą ICP-OES.28</li>
		<li>Znormalizować zmierzoną zawartość żelaza do liczby komórek, aby wyznaczyć wartość komórkowej zawartości żelaza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gupta, A. K., Gupta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+surface+engineering+of+iron+oxide+nanoparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 26 (18), 3995-4021 (2005).</li>
<li>Decuzzi, P., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specific+and+non-specific+interactions+in+receptor-mediated+endocytosis+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of specific and non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles.</a> Biomaterials. 28 (18), 2915-2922 (2007).</li>
<li>Cunningham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+contrast+magnetic+resonance+imaging+of+cells+labeled+with+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 53 (5), 999-1005 (2005).</li>
<li>Song, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modulation+of+magnetic+nanocrystals+in+the+development+of+highly+efficient+magnetic+resonance+probes+for+intracellular+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (28), 9992-9993 (2005).</li>
<li>Daldrup-Link, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+MR+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents.</a> Radiology. 228 (3), 760-767 (2003).</li>
<li>Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., Doak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+toxicity+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+%28SPION%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Rev%22%5BJournal%5D)">Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION).</a> Nano Rev. 1, (2010).</li>
<li>Dodd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+mammalian+cells+by+high-resolution+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging.</a> Biophys. J. 76 (1), 103-109 (1999).</li>
<li>Ahrens, E. T., Feili-Hariri, M., Xu, H., Genove, G., Morel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+iron-oxide+particles+provides+efficient+labeling+of+dendritic+cells+for+in+vivo+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of iron-oxide particles provides efficient labeling of dendritic cells for in vivo MR imaging.</a> Magn. Reson. Med. 49 (6), 1006-1013 (2003).</li>
<li>Arbab, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+magnetic+cell+labeling+with+protamine+sulfate+complexed+to+ferumoxides+for+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI.</a> Blood. 104 (4), 1217-1223 (2004).</li>
<li>Bulte, J. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetodendrimers+allow+endosomal+magnetic+labeling+and+in+vivo+tracking+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19 (12), 1141-1147 (2001).</li>
<li>Josephson, L., Tung, C. H., Moore, A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+intracellular+magnetic+labeling+with+novel+superparamagnetic-tat+peptide+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-tat peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 10 (2), 186-191 (1999).</li>
<li>Lewin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+peptide-derivatized+magnetic+nanoparticles+allow+in+vivo+tracking+and+recovery+of+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells.</a> Nat. Biotechnol. 18 (4), 410-414 (2000).</li>
<li>Hunter, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+hurdles+in+polyfectin+design+and+mechanistic+background+to+polycation+induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Delivery+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity.</a> Adv. Drug Delivery Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).</li>
<li>Montet-Abou, K., Montet, X., Weissleder, R., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+internalization+of+magnetic+nanoparticles+using+transfection+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Cell internalization of magnetic nanoparticles using transfection agents.</a> Mol. Imaging. 6 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Correia Carreira,, S,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+stem+cell+labelling+using+cationised+magnetoferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin.</a> Nanoscale. 8 (14), 7474-7483 (2016).</li>
<li>Meldrum, F. C., Heywood, B. R., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetoferritin%3A+in+vitro+synthesis+of+a+novel+magnetic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Magnetoferritin: in vitro synthesis of a novel magnetic protein.</a> Science. 257 (5069), 522-523 (1992).</li>
<li>Klem, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+control+over+magnetic+moment+and+exchange+bias+in+all-oxide+materials+encapsulated+within+a+spherical+protein+cage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthetic control over magnetic moment and exchange bias in all-oxide materials encapsulated within a spherical protein cage.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (1), 197-201 (2007).</li>
<li>Okuda, M., Eloi, J. C., Sarua, A., Jones, S. E. W., Schwarzacher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+barrier+distribution+for+dispersed+mixed+oxide+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Energy barrier distribution for dispersed mixed oxide magnetic nanoparticles.</a> J. Appl. Phys. 111 (7), (2012).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+ferritin+iron+oxide+nano-composite+magnetic+resonance+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">A human ferritin iron oxide nano-composite magnetic resonance contrast agent.</a> Magn. Reson. Med. 60 (5), 1073-1081 (2008).</li>
<li>Danon, D., Skutelsk E, M. arikovsY., Goldstei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Cationized+Ferritin+as+a+Label+of+Negative+Charges+on+Cell+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ultrastruc.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of Cationized Ferritin as a Label of Negative Charges on Cell Surfaces.</a> J. Ultrastruc. Res. 38 (5-6), 500-510 (1972).</li>
<li>Valero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+Nanoparticles-Templated+Assembly+of+Protein+Subunits%3A+A+New+Platform+for+Carbohydrate-Based+MRI+Nanoprobes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Magnetic Nanoparticles-Templated Assembly of Protein Subunits: A New Platform for Carbohydrate-Based MRI Nanoprobes.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (13), 4889-4895 (2011).</li>
<li>Zborowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomagnetic+isolation+of+magnetoferritin-labeled+cells+in+a+modified+ferrograph%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Immunomagnetic isolation of magnetoferritin-labeled cells in a modified ferrograph.</a> Cytometry. 24 (3), 251-259 (1996).</li>
<li>Ikezoe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Giant+Two-Dimensional+Crystal+of+Protein+Molecules+from+a+Three-Phase+Contact+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Growth of Giant Two-Dimensional Crystal of Protein Molecules from a Three-Phase Contact Line.</a> Langmuir. 24 (22), 12836-12841 (2008).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+cancer+cells+with+ferrimagnetic+ferritin+cage+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 128 (51), 16626-16633 (2006).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+nanoscale+positioning+of+ferritin+and+nanoparticles+by+means+of+target-specific+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Selective nanoscale positioning of ferritin and nanoparticles by means of target-specific peptides.</a> Small. 2 (10), 1148-1152 (2006).</li>
<li>Williams, A., Frasca, V., et al. UNIT 8.2 Ion-Exchange Chromatography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+A+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22">Current Protocols in Protein Science</a>. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Hagel, L., et al. UNIT 8.3 Gel-Filtration Chromatography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHagel%2C+L+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22">Current Protocols in Protein Science</a>. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Hou, X., Jones, B. T. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHou%2C+X+%22In+Encyclopedia+of+Analytical+Chemistry.+Meyers%2C+R.A.+ed%22">In Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R.A. ed</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 1(2000).</li>
<li>Correia Carreira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+stem+cell+labelling+using+cationised+magnetoferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin.</a> Nanoscale. , (2016).</li>
<li>Simon, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T1+and+T2+relaxivity+of+intracellular+and+extracellular+USPIO+at+1.5+T+and+3T+clinical+MR+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">T1 and T2 relaxivity of intracellular and extracellular USPIO at 1.5 T and 3T clinical MR scanning.</a> Eur. J. Radiol. 16 (3), 738-745 (2006).</li>
<li>Jubb, A. M., Allen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+Spectroscopic+Characterization+of+Hematite%2C+Maghemite%2C+and+Magnetite+Thin+Films+Produced+by+Vapor+Deposition%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (10), 2804-2812 (2010).</li>
<li>Wang, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+x-ray+diffraction+and+Raman+spectroscopic+studies+of+the+tetragonal+spinel+CoFe2O4%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+B%22%5BJournal%5D)">High-pressure x-ray diffraction and Raman spectroscopic studies of the tetragonal spinel CoFe2O4.</a> Phys. Rev. B. 68 (9), (2003).</li>
<li>Wong, K. K., Douglas, T., Gider, S., Awschalom, D. D., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+synthesis+and+characterization+of+magnetic+proteins+%28magnetoferritin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin).</a> Chem. Mater. 10 (1), 279-285 (1998).</li>
<li>Okuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fe3O4+nanoparticles%3A+protein-mediated+crystalline+magnetic+superstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Fe3O4 nanoparticles: protein-mediated crystalline magnetic superstructures.</a> Nanotechnology. 23 (41), 415601(2012).</li>
<li>Perriman, A. W., Cölfen, H., Hughes, R. W., Barrie, C. L., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-Free+Protein+Liquids+and+Liquid+Crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Solvent-Free Protein Liquids and Liquid Crystals.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (34), 6242-6246 (2009).</li>
<li>Billotey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+homing+to+the+pancreas+in+autoimmune+mouse+models+of+diabetes%3A+in+vivo+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">T-cell homing to the pancreas in autoimmune mouse models of diabetes: in vivo MR imaging.</a> Radiology. 236 (2), 579-587 (2005).</li>
<li>Smirnov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+of+lymphocyte+trafficking+by+MRI%3A+a+tumor+model+approach+to+cell-based+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging of lymphocyte trafficking by MRI: a tumor model approach to cell-based anticancer therapy.</a> Magn. Reson. Med. 56 (3), 498-508 (2006).</li>
<li>Wilhelm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+control+of+vascular+network+formation+with+magnetically+labeled+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Magnetic control of vascular network formation with magnetically labeled endothelial progenitor cells.</a> Biomaterials. 28 (26), 3797-3806 (2007).</li>
<li>MacLean, I., Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationized+ferritin+and+phosvitin+uptake+by+coated+vesicles+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Cationized ferritin and phosvitin uptake by coated vesicles of the early chick embryo.</a> Anat. Embryol. 166 (3), 385-397 (1983).</li>
<li>Van Deurs, B., Nilausen, K., Faergeman, O., Meinertz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+pits+and+pinocytosis+of+cationized+ferritin+in+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts.</a> Eur. J. Cell Biol. 27 (2), 270-278 (1982).</li>
<li>Xing, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+cellular+uptake+of+platinum+anticancer+drugs+encapsulated+in+apoferritin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inorg+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin.</a> J Inorg Biochem. 103 (7), 1039-1044 (2009).</li>
<li>Wong, K. K., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+synthesis+of+cadmium+sulfide-ferritin+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomimetic synthesis of cadmium sulfide-ferritin nanocomposites.</a> Adv. Mater. 8 (11), 928-932 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

TEM próbek magnetoferytyny barwionych aurothioglukozą ujawnił udaną mineralizację nanocząstek wewnątrz klatki białkowej. Dyfrakcja elektronów i analiza Ramana rdzenia nanocząstki wykazały obecność ferrytu kobaltu, co wskazuje na udane domieszkowanie rdzenia nanocząstki kobaltem. Pokazuje to, że nanocząstki o mieszanym tlenku mogą być z powodzeniem mineralizowane w jamie apo-ferrytyny. Ponadto wykazaliśmy wcześniej, że domieszkowanie kobaltem można zmieniać poprzez zmianę ilości prekursora kobaltu dodawanego do mieszaniny reakcyjnej, co umożliwia dostrojenie właściwości magnetycznych. Rozdział 18
Syntezę magnetoferrytyny można przeprowadzać w różnych naczyniach, o ile są one szczelnie zamknięte i mają porty dostępowe, przez które można wprowadzać reagenty (np. kolba okrągłodenna z trzema szyjkami). Temperatura reakcji powinna być utrzymywana na poziomie 65 °C albo poprzez umieszczenie naczynia w kąpieli wodno-olejowej, albo przez użycie naczynia z podwójnym płaszczem. W tym przypadku do przeprowadzenia syntezy użyliśmy dwupłaszczowego zestawu ogniw elektrochemicznych. Aby zagwarantować udaną syntezę, kluczowe znaczenie ma utrzymanie prawidłowego pH i unikanie zanieczyszczenia roztworów wodnych tlenem. Roztwory soli metali należy zawsze przygotowywać na świeżo przed użyciem, a nie wcześniej. Ponadto komercyjne roztwory apoferrytyny mogą różnić się jakością i wpływać na wynik syntezy (np. wielkość zmineralizowanego rdzenia nanocząsteczkowego). Może pomóc w dializie roztworu apoferrytyny do 50 mM buforu HEPES (pH 8,6) przed syntezą w celu usunięcia wszelkich pozostałości środka redukującego stosowanego przez producenta. Przydatne jest zanotowanie numeru partii roztworu apo-ferrytyny używanego do syntezy, aby można było o niego wyraźnie poprosić producenta, jeśli konieczne jest zakupienie dodatkowego materiału. Ponadto na butelce należy podać stężenie białka w dostępnej w handlu apo-ferrytynie, która może być wykorzystana do obliczenia objętości roztworu apo-ferrytyny potrzebnego do syntezy. Jeśli tak nie jest, skontaktuj się z dostawcą, aby uzyskać te informacje.
Zaletą stopniowego dodawania soli metali i nadtlenku wodoru – przedstawionej tutaj i w poprzednich raportach – jest to, że mineralizacja rdzenia nanocząstek może być kontrolowana w taki sposób, że można osiągnąć różne współczynniki obciążenia (tj. rozmiary nanocząstek). 33 Ponadto możliwe jest dalsze oczyszczanie magnetoferrytyny za pomocą magnetycznej kolumny separacyjnej, np. kolumny wypełnionej proszkiem ze stali nierdzewnej zabezpieczonym wewnątrz elektromagnesu. 34 W ten sposób wysoce monodyspersyjne rdzenie nanocząstek można wyizolować z próbki magnetoferytyny w masie. Jednak w przypadku etykietowania komórek magnetycznych, jak to tutaj przedstawiono, nie jest to wymagane. Ograniczeniem syntezy magnetoferytyny jest stosunkowo niska wydajność syntezy wynosząca około 10% oraz stosunkowo wysoki koszt komercyjnych roztworów apo-ferrytyny. Jednak apo-ferrytyna może być również wytwarzana z taniej dostępnej ferrytyny śledziony końskiej, postępując zgodnie z ustalonymi protokołami demineralizacji. 16
Kationizację magnetoferytyny osiągnięto poprzez dodanie stosunku molowego 250 cząsteczek DMPA i 50 cząsteczek EDC na ujemnie naładowaną resztę (obliczenia oparte na sekwencji aminokwasowej ferrytyny śledziony konia). Ten nadmiar odczynnika nad białkiem skutkował wysoką wydajnością kationizacji, porównywalną również z wcześniej zgłaszanymi wynikami dla kationizacji ferrytyny. 35 Do analizy MALDI-TOF użyto apoferrytyny i kationizowanej apoferrytyny ze względu na nadmierną masę cząsteczkową rdzenia magnetoferytyny. Aby uzyskać wysoką wydajność kationizacji, kluczowe znaczenie ma również optymalne pH. Sieciowanie za pośrednictwem EDC jest najskuteczniejsze w łagodnie kwaśnych warunkach i stwierdziliśmy, że pH 5 daje optymalne wyniki kationizacji magnetoferrytyny. Jednak w przypadku innych białek kationizacja pH może wymagać optymalizacji. Należy unikać kationizacji w punkcie izoelektrycznym białka lub w jego pobliżu, ponieważ może to prowadzić do silnych opadów.
Namagnesowanie komórek macierzystych za pomocą kationizowanej magnetoferytyny było bardzo wydajne i można je było osiągnąć przy użyciu czasu inkubacji znacznie poniżej 30 minut. Nawet jednominutowa inkubacja spowodowała zawartość żelaza w komórkach wynoszącą 3,6 pg, co mieści się w zgłoszonym zakresie wymaganym do wpłynięcia na kontrast T2 i T2* w MRI. 36,37 Godne uwagi jest również to, że to skuteczne znakowanie osiąga się przy niskich stężeniach żelaza w zewnątrzkomórkach. Na przykład wcześniejsze badania z wykorzystaniem nanocząstek anionowych wykazały poziom żelaza wynoszący 10 pg na komórkę po 30-minutowym okresie inkubacji z 5 mM żelaza. 38 Dla porównania, inkubacja z kationizowanym roztworem magnetoferytyny zawierającym białko 0,5 μM odpowiada inkubacji z około 0,2 mM żelaza, a także daje około 10 pg żelaza na komórkę po 30 minutach. Nie byliśmy w stanie jednoznacznie zidentyfikować żadnych pęcherzyków endocytotycznych za pomocą TEM. Jednak wcześniejsze badania z użyciem kationizowanej ferrytyny wykazały, że internalizacja nastąpiła w ciągu pierwszych dziesięciu minut ekspozycji. 39,40 Kationizowana ferrytyna może być zlokalizowana w pokrytych pęcherzykach, co wskazuje na endocytozę zależną od klatryny lub kaweoliny. Te same badania wykazały również, że po 30 minutach inkubacji kationizowana ferrytyna była nadal obecna na powierzchni komórki, a także w ciałach wielopęcherzykowych, przypominających lizosomy.
Dalsze zastosowania mogą obejmować kationizację klatek apo-ferrytynowych obciążonych innymi nanocząstkami i/lub cząsteczkami funkcjonalnymi, takimi jak leki przeciwnowotworowe41 lub kropki kwantowe42. Kationizacja tych konstruktów ferrytyny może skutkować szybszym i bardziej wydajnym dostarczaniem ich ładunku do komórek.

Wiązanie powierzchni lub internalizacja superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION) umożliwiła magnetyzację różnych typów komórek do zastosowań takich jak obrazowanie i zdalna manipulacja. 1 Jednak osiągnięcie wystarczającego namagnesowania komórkowego może być wyzwaniem, szczególnie gdy interakcja między SPION a powierzchnią komórki jest słaba. 2 W przeszłości długotrwałe narażenie lub wysokie stężenia SPION były stosowane jako strategie przezwyciężania tego wyzwania. 3,4 Niemniej jednak strategie te są problematyczne, ponieważ zwiększają toksyczność5,6 i mają bardzo ograniczony sukces w typach komórek o niskich wskaźnikach internalizacji, takich jak limfocyty. 7 Aby zwiększyć wychwyt komórkowy SPION, zbadano kilka podejść do funkcjonalizacji powierzchni. Na przykład, przeciwciała są stosowane do promowania endocytozy za pośrednictwem receptorów,8 podczas gdy niespecyficzny wychwyt można osiągnąć za pomocą środków transfekcyjnych9,10 lub gatunków penetrujących komórki, takich jak peptyd tatowy HIV. 11,12 Jednak podejścia do funkcjonalizacji przeciwciał i peptydów są ograniczone przez drogie odczynniki i złożone preparaty syntetyczne, podczas gdy środki transfekcyjne mogą indukować wytrącanie się nanocząstek i niekorzystnie wpływać na funkcję komórek. Pytania z kategorii 13,14 
Niedawno informowaliśmy o syntezie chemicznie kationizowanej magnetoferytyny, nowego SPION, który był bardzo skuteczny w magnesowaniu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC) przy użyciu czasu inkubacji tak krótkiego jak jedna minuta. 15 Magnetoferytyna jest syntetyzowana przez odtworzenie SPION w zdemineralizowanej jamie ferrytyny białka magazynującego żelazo. 16 Ten oparty na białku SPION łączy w sobie wiele właściwości, które sprawiają, że dobrze nadaje się do magnetyzacji komórek, takich jak kontrola właściwości magnetycznych rdzenia magnetycznego,17-19 oraz biokompatybilność i rozpuszczalność w wodzie zapewniana przez otoczkę białkową. Co więcej, funkcjonalizacja powierzchni jest łatwa do osiągnięcia dzięki adresowalnym aminokwasom, które mogą być chemicznie20-22 lub genetycznie modyfikowane. 23-25 Wykazaliśmy, że kationizacja chemiczna kwasowych reszt aminokwasowych otoczki białkowej generuje stabilną nanocząstkę, która łatwo oddziałuje z domenami anionowymi na powierzchni komórki, prowadząc do szybkiego i trwałego namagnesowania komórki. Procedura ta eliminuje potrzebę pracochłonnej funkcjonalizacji i długich protokołów inkubacji, a ze względu na niespecyficzny mechanizm znakowania, ta strategia szybkiego magnesowania powinna znaleźć szerokie zastosowanie w innych typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy raport na temat ultraszybkiej metody znakowania komórek, w tym szczegółowe protokoły syntezy, oczyszczania i funkcjonalizacji powierzchni kationizowanej magnetoferytyny.

<table><tbody><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>Proszek Fisher Scientific</td><td>BPE310-1</td><td>; przygotować 1 M roztwór podstawowy o pH 8,6 i rozcieńczyć do 50&nbsp; mM przed użyciem. Sprawdź dokładnie pH przed syntezą!</td></tr><tr><td>apoferrytyna ze śledziony</td><td>koni Sigma Aldrich</td><td>A3641</td><td>użyliśmy LOT# 081M7011V</td></tr><tr><td>siarczan kobaltu siedmiowodny&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>przygotować świeże roztwory z soli przed syntezą</td></tr><tr><td>sześciowodnego siarczanu amonu i żelaza&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1543</td><td>przygotować świeże roztwory z soli przed syntezą</td></tr><tr><td>roztwór nadtlenku wodoru (30%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td>przygotować świeże roztwory z soli przed syntezą</td></tr><tr><td>cytrynian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804</td><td>w proszku; można przygotować 1 M roztwór i przechowywać go w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy</td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Millex GP, 0,22&nbsp; mikronowy</td><td>filtr strzykawkowy</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>w proszku; przygotować 1 M roztwór podstawowy o pH 8,0 i rozcieńczyć do 50&nbsp; mM przed użyciem</td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434</td><td>poweder; dodać do w razie potrzeby</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Centriprep</td> membrana <td>Merck Millipore</td><td>4310</td><td>Ultracel YM-50, objętość 12 ml; stosować do początkowego zatężania do momentu zagęszczenia roztworu magnetoferytyny z około 150 ml do 20 ml; ml</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4 z</td> membraną <td>Merck Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Ultracel-10, 4&nbsp; objętość ml; Służy do zagęszczania roztworu magnetoferytyny od około 20 ml do&nbsp; 2 ml</td></tr><tr><td>ANX Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1287-04</td><td>sami zapakowaliśmy tę kolumnę</td></tr><tr><td>Kolumna HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1196-01</td><td>ta kolumna została zakupiona w stanie gotowym do zapakowania</td></tr><tr><td>&Auml; System oczyszczania KTA</td><td>Pompa</td> do <td>28406264</td><td></td>próbek GE Healthcare</tr><tr><td>P-960</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6727-00</td><td>załaduj próbkę z natężeniem przepływu 10 ml/min</td></tr><tr><td>automatyczny kolektor frakcji Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania Bradford</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916</td><td>roztwór gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Ferrytyna, Typ I: ze śledziony konia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4503</td><td>przygotuj wzorce ferrytyny z tego roztworu, aby określić stężenie magnetoferrytyny</td></tr><tr><td>N,N-dimetylo-1,3-propanodiamina (DMPA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>308110</td><td>UWAGA: podczas regulacji pH roztworu DMPA wykonaj ten krok w dygestorio</td></tr><tr><td>N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimid ( EDC)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>E6383</td><td>przechowywać w zamrażarce, ale przed otwarciem butelki doprowadzić do temperatury pokojowej</td></tr><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)</td><td>AppliChem</td><td>A0689,0500</td><td>przygotować 200 M roztwór podstawowy o pH 5</td></tr><tr><td>rurka do dializy membrana celulozowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9652</td><td>przed użyciem</td></tr> <tr><td>namoczyć 10 minut w wodzie dejonizowanejDulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glukozy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5546</td><td>ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>dodaj do zapasów butelka DMEM, 10% (v/v) końcowe stężenie</td></tr><tr><td>roztwór penicyliny/streptomycyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td>dodaj do zapasów Butelka DMEM, 1% (v/v) końcowe stężenie</td></tr><tr><td>roztwór glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-087</td><td>dodaj do magazynu Butelka DMEM, 1% (v/v) stężenie końcowe</td></tr><tr><td>ludzki czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>dodawać do DMEM świeżo do kolby do hodowli komórkowych przy każdej zmianie pożywki; stężenie końcowe 5 ng/ml</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D8537</td><td>sterylny roztwór, do komórek cultrue</td></tr><tr><td>roztwór trypsyny/EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td>przechowywać w zamrażarce i rozmrażać w 37&nbsp; &deg; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td>proszek; przygotować 2 mM roztwór w PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>dodać 0,5% (w/v) do 2&nbsp; Roztwór mM EDTA w PBS; ostrożnie wymieszać mieszadłem magnetycznym, unikać pienienia; filtr sterylizuj przez filtr strzykawkowy 0,22 mikrona</td></tr><tr><td>MACS multi stand&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>do mocowania magnesu MACS</td></tr><tr><td>Kolumny MACS MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>jednorazowe; przeznaczone do jednorazowego użytku, ale jeśli sterylność nie jest wymagana, można je ponownie użyć: umyć wodą dejonizowaną i 100% etanolem i umieścić w suszarce; wyrzucić, jeśli zauważysz zardzewiałe plamy</td></tr><tr><td>Magnes separatora MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td>można kupić jako zestaw startowy, razem z kolumnami i stojakami</td></tr><tr><td>Filtr wstępnej separacji kolumn MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>Filtr 30 mm</td></tr><tr><td>Kwas azotowy, 64-66%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7006</td><td></td></tr><tr><td>Titrando 907, pompa strzykawkowa</td><td>Metrohm</td><td>2.907.0020</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sprzęt używany do charakteryzowania magnetoferrytyny i kationizowanej magnetoferytynyUrządzenia</td></tr> <tr><td></td><td>molekularne</td> <td>SpectraMax M5</td><td>Służy do pomiaru absorbancji w teście Bradforda</td></tr><tr><td>JEM 1200 EX</td><td>JEOL</td><td></td><td>Służy do obrazowania TEM magnetoferrytyny</td></tr><tr><td>Spektrometr Ramana InVia</td><td>Renishaw</td><td></td><td>Używany do spektroskopii Ramana</td></tr><tr><td>Laser Torus DPSS</td><td>Laser Quantum</td><td></td><td>Używany do spektroskopii Ramana</td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Używany do analizy MALDI-TOF apoferrytyny i kationizowanej apoferrytyny</td></tr><tr><td>ZetaSizer Nano-ZS</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td>Służy do pomiaru średnicy hydrodynamicznej i potencjału zeta magnetoferrytyny i kationizowanej magnetoferrytyny</td></tr><tr><td>System pomiaru właściwości magnetycznych</td><td>Projekt kwantowy</td><td></td><td>Służy do pomiaru momentu nasycenia magnetycznego i podatności magnetycznej</td></tr><tr><td>Magnetom Skyra</td><td>Siemens</td><td></td><td>Służy do wyznaczania relaksatywności wzdłużnej i poprzecznej&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnai 12 BioTwin Spirit</td><td>FEI</td><td></td><td>Służy do obrazowania TEM hMSC znakowanego kationizowaną magnetoferytyną</td></tr><tr><td>710 ICP-OES</td><td>Agilent</td><td></td><td>Służy do oznaczania zawartości żelaza w komórkach</td></tr></tbody></table>

synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Wiele ważnych zastosowań biomedycznych, takich jak obrazowanie komórek i zdalna manipulacja, można osiągnąć poprzez znakowanie komórek za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION). Osiągnięcie wystarczającego wychwytu komórkowego SPION-ów jest wyzwaniem, któremu tradycyjnie sprostano poprzez wystawienie komórek na podwyższone stężenia SPION lub wydłużenie czasu ekspozycji (do 72 godzin). Jednak strategie te mogą pośredniczyć w toksyczności. W tym miejscu przedstawiamy syntezę magnetoferytyny SPION na bazie białka, a także łatwy protokół funkcjonalizacji powierzchni, który umożliwia szybkie namagnesowanie komórek przy niskich stężeniach ekspozycji. Rdzeń magnetoferytyny SPION składa się z domieszkowanego kobaltem tlenku żelaza o średniej średnicy cząstek 8,2 nm, zmineralizowanego wewnątrz jamy apo-ferrytyny śledziony konia. Chemiczna kationizacja magnetoferytyny pozwoliła na wytworzenie nowego, wysoce aktywnego błonowo SPION, który namagnesował ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) przy użyciu czasu inkubacji wynoszącego zaledwie jedną minutę i stężenia żelaza tak niskie, jak 0,2 mM.

Metodą TEM potwierdzono mineralizację nanocząstek wewnątrz wnęki apoferrytyny i określono średnią wielkość rdzenia (ryciny 1A oraz 1B). Analiza obrazu niebarwionych próbek magnetoferrytyny wykazała średnią średnicę rdzenia wynoszącą 8,2 ± 0,7 nm, a barwienie aurotioglukozą potwierdziło obecność nanocząstek wewnątrz białkowej klatki. Należy zauważyć, że obrazy przedstawiają próbkę magnetoferrytyny, która została dodatkowo oczyszczona za pomocą separacji magnetycznej w celu wyizolowania jednorodnych rdzeni nanocząstek. Próbki magnetoferrytyny, które nie zostały oczyszczone magnetycznie, charakteryzują się nieco szerszym rozkładem wielkości rdzeni.29 Analiza struktury rdzenia magnetoferrytyny za pomocą dyfrakcji elektronów z wybranej powierzchni wskazała na możliwą obecność struktury spinelu odwróconego na bazie magnetytu (Fe3O4) i/lub maghemytu (γ-Fe2O3), a także struktury spinelu wynikającej z obecności Co3O4. Ponadto widma Ramana ujawniły piki przypisane do Fe3O4, niewielkich ilości γ-Fe2O3 oraz ferrytu kobaltu (rycina 1 C). Analiza ICP-OES magnetoferrytyny wykazała średnio 102 μg żelaza i 0,9 μg kobaltu na miligram magnetoferrytyny.
Dołączono schemat przedstawiający następny etap kationizacji (Rysunek 2 A). Średnica hydrodynamiczna magnetoferrytyny i magnetoferrytyny kationizowanej wynosiła odpowiednio 11,8 ± 1,1 nm oraz 12,5 ± 1,4 nm, co określono za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Efektywność kationizacji poprzez kowalencyjne sprzęganie DMPA z magnetoferrytyną oceniono za pomocą potencjometrii zeta oraz spektrometrii mas MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight). Potencjał zeta zmienił się z -10,5 mV dla MF do + 8,3 mV dla magnetoferrytyny kationizowanej, co potwierdza zmianę potencjału powierzchniowego z ujemnego na dodatni (Tabela 1). Badania spektrometrii mas wykazały masę cząsteczkową podjednostki wynoszącą 20,1 kDa dla natywnej apoferrytyny i 21,1 kDa dla apoferrytyny kationizowanej (Rysunek 2 B). Ten przyrost masy odpowiada około 12 przyłączonym cząsteczkom DMPA na podjednostkę białka oraz kationizacji 288 reszt w całym 24-podjednostkowym białku.
Nasycenie magnetyczne oraz podatność magnetyczną zmierzono za pomocą magnetometrii SQUID, a relaksywność poprzeczną i podłużną zmierzono przy użyciu obrazowania rezonansu magnetycznego. Właściwości magnetyczne były zbliżone dla magnetoferrytyny i kationizowanej magnetoferrytyny, co wskazuje, że kationizacja miała pomijalny wpływ na właściwości magnetyczne zamkniętych wewnątrz SPION (Tabela 1). Ponadto właściwości te są podobne do innych nanocząstek opartych na tlenku żelaza,19,30 co dowodzi, że kationizowana magnetoferrytyna byłaby tak samo odpowiednia jak konwencjonalne środki kontrastowe do MRI oparte na SPION w celu wzmocnienia kontrastu obrazowania.
Po 30-minutowej ekspozycji powierzchnia komórek była gęsto pokryta kationizowaną magnetoferrytyną (Rycina 3 A). Jednak po jednym tygodniu na powierzchni komórek nie stwierdzono obecności nanocząsteczek (Rycina 3 B). Kationizowana magnetoferrytyna okazała się niezwykle skuteczna w magnetycznym znakowaniu hMSC. Warto zaznaczyć, że wystawienie komórek na działanie kationizowanej magnetoferrytyny przez jedną minutę doprowadziło do namagnesowania 92% populacji komórek i dostarczenia 3,6 pg żelaza na komórkę. Wydłużenie czasu inkubacji do 15 minut skutkowało namagnesowaniem całej populacji komórek (Rycina 3 C).
<img alt="Obrazy TEM nanocząsteczek magnetycznych i widmo Ramana wykazujące ferryt kobaltu, magnetyt i maghemit." src="/files/ftp_upload/54785/54785fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Charakterystyka rdzeni magnetoferrytyny domieszkowanych 5% kobaltu. Obrazy TEM magnetoferrytyny barwionej aurotioglukozą (A) oraz niebarwionej (B). Wstawka przedstawia odpowiadającą dyfrakcję elektronów z indeksami magnetytu. Pasek skali: 20 nm. (C) Widmo Ramana dla magnetoferrytyny. Strzałki wskazują główne mody wibracyjne Ramana dla ferrytu kobaltu (T2g), magnetytu i maghemitu (oba A1g).31,32 Zastosowana długość fali lasera wynosiła 532 nm. (Obraz zaadaptowany z Okuda et al.18). Należy zauważyć, że ta próbka magnetoferrytyny została dodatkowo oczyszczona za pomocą separacji magnetycznej, co pozwoliło wyizolować jednorodnie obciążone cząstki magnetoferrytyny. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces modyfikacji nanocząsteczek; wykres spektrometrii mas; analiza białek; rozmiar cząstek 12 nm." src="/files/ftp_upload/54785/54785fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Kationizacja magnetoferrytyny. A) Reprezentacje dostępnej powierzchni rozpuszczalnika pokazujące rozkład kwasowych (czerwonych) i zasadowych (żółtych) reszt aminokwasowych na powierzchni białka. Magnetoferrytyna (1) zostaje przekształcona w kationizowaną magnetoferrytynę (2) poprzez sieciowanie DMPA z kwasowymi resztami aminokwasowymi na powierzchni białka za pośrednictwem karbodiimidu (3). B) Analiza spektrometrią mas podjednostek apoferrytyny i kationizowanej apoferrytyny. Widmo stosunku masy do ładunku (m/z) apoferrytyny (ApoF) i kationizowanej apoferrytyny (cat-ApoF) uzyskane metodą MALDI-TOF. Po kationizacji obserwuje się wzrost masy z 20.1 kDa do 21.1 kDa. (Obraz zaadaptowany z Correia Carreira et al.15) <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces namagnesowania komórek; obrazy mikroskopowe, wykres; pobór żelaza w czasie w minutach znakowania." src="/files/ftp_upload/54785/54785fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Znakowanie magnetyczne i separacja komórek hMSC inkubowanych z kationizowaną magnetoferrytyną. A) Obraz TEM komórek hMSC po 30-minutowej inkubacji z kationizowaną magnetoferrytyną. Strzałka wskazuje obecność rdzeni magnetoferrytyny gęsto upakowanych na powierzchni komórki. Paski skali: 200 nm. B) Obraz TEM komórki hMSC tydzień po znakowaniu. Powierzchnia komórki jest wolna od kationizowanej magnetoferrytyny. C) Badanie szybkości znakowania magnetycznego: 92% populacji komórek zostało namagnesowanych po jednej minucie ekspozycji na 0,5 μM kationizowanej magnetoferrytyny, a cała populacja komórek została namagnesowana w ciągu 15 minut. Zawartość żelaza na komórkę określono za pomocą ICP-OES. Przedstawiono średnią i odchylenie standardowe z trzech powtórzeń biologicznych. (Obraz zaadaptowany z Correia Carreira et al.15) <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>MF</td>
			<td>cat-MF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnica hydrodynamiczna [nm]</td>
			<td>11.8 ± 1.1</td>
			<td>12.5 ± 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potencjał zeta [mV]</td>
			<td>(-)10.4 ± 0.2</td>
			<td>8.3 ± 0.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetyczny moment nasycenia [Am²]2 kg-1]</td>
			<td>54.9 ± 1.6</td>
			<td>55.3 ± 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podatność masowa [x 104 m3 kg-1]</td>
			<td>1.75 ± 0.08</td>
			<td>1.75± 0.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>relaksywność podłużna [mM⁻¹s⁻¹]-1 sek-1]</td>
			<td>2.6 ± 0.1</td>
			<td>2.3 ± 0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>relaksywność poprzeczna [mM⁻¹s⁻¹]-1 sek-1]</td>
			<td>44.6 ± 1.0</td>
			<td>52.8 ± 0.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Charakterystyka fizykochemiczna magnetoferrytyny (MF) i kationizowanej magnetoferrytyny (cat-MF). (Tabela zaadaptowana z Correia Carreira et al.15)

Przedstawiono protokół syntezy i kationizacji magnetoferytyny domieszkowanej kobaltem, a także metodę szybkiego magnesowania komórek macierzystych za pomocą kationizowanej magnetoferytyny.

Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Ogólnym celem tej metody jest synteza magnetycznej nanocząstki wewnątrz białkowej klatki, a następnie funkcjonalizacja białka w taki sposób, aby umożliwić szybkie przytwierdzenie nanocząstki magnetycznej do komórek. Metodę tę można wykorzystać do wytwarzania nanocząstek magnetycznych umożliwiających szybkie i wydajne znakowanie magnetyczne komórek, co jest istotne w takich zastosowaniach jak MRI lub magnetyczna separacja komórek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzenia namagnesowania komórek przy użyciu niskich stężeń nanocząstek i krótkiego czasu inkubacji, co zapobiega potencjalnym niepożądanym skutkom wynikającym z ekspozycji na nanocząstki.Aby rozpocząć, odgazuj 500 mililitrów wody dejonizowanej, umieszczając w wodzie rurkę podłączoną do butli z azotem i szczelnie zamykając naczynie folią spożywczą. Następnie przedmuchuj wodę azotem przez około 60 minut. Podgrzej kąpiel wodną podłączoną do dwupłaszczowego naczynia reakcyjnego do 65 stopni Celsjusza.Następnie do naczynia reakcyjnego dodaj 75 mililitrów 50 milimolarnego buforu HEPES, pH 8.6. Zamknij naczynie i odgazuj je, przepuszczając azot przez roztwór buforu przez około 20 minut. W tym samym czasie mieszaj roztwór buforu za pomocą mieszadła magnetycznego.Po odgazowaniu roztworu buforu HEPES należy wyjąć rurkę z azotem z buforu, utrzymując ją nad roztworem w celu zachowania atmosfery azotu. Dodać apoferrytynę, aby uzyskać stężenie końcowe 3 mg/mL. Kontynuować mieszanie magnetyczne, jednak zmniejszyć prędkość mieszania w przypadku pojawienia się piany.W celu syntezy magnetoferrytyny należy użyć dwóch pomp strzykawkowych do jednoczesnego wstrzyknięcia 10,1 mililitrów prekursora żelazo-kobalt oraz 10,1 mililitrów nadtlenku wodoru do roztworu apoferrytyny z prędkością przepływu 0,15 mililitra na minutę. Następnie należy kontynuować etapy syntezy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po tym nałożyć próbkę na kolumnę zawierającą macierz kationową, używając pompy perystaltycznej z prędkością przepływu 10 mililitrów na minutę.Przemyj kolumnę około 100 mililitrami buforu płuczącego, używając pompy gradientowej przy szybkości przepływu 10 mililitrów na minutę. Aby wyeluować białko, przemyj kolumnę 150 mililitrami buforu Tris z rosnącym stężeniem chlorku sodu przy szybkości 10 mililitrów na minutę. Gdy białko zostanie wyeluowane przy stężeniu chlorku sodu 500 milimolarnym, zbierz je w frakcjach po 50 mililitrów, korzystając z automatycznego kolektora frakcji.Skoncentruj 150 ml magnetoferrytyny do objętości około dwóch ml, używając jednostki filtra wirówkowego o pojemności 15 ml, a następnie jednostki o pojemności czterech ml. Szczegółowy protokół tej procedury znajduje się w instrukcji producenta jednostek filtrów wirówkowych. Następnie wprowadź skoncentrowaną próbkę na kolumnę do filtracji żelowej za pomocą pętli wtryskowej.Przemyj kolumnę buforem płuczącym przy szybkości przepływu 1,3 ml/min. Zbierz frakcje o objętości sześciu mililitrów, korzystając z automatycznego kolektora frakcji. Monomery białek eluują jako ostatnie.Na tym etapie oczyszczoną magnetoferrytynę można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu kationizacji. Dla 10 mg magnetoferrytyny odważyć 374 mg DMPA i rozpuścić w 2,5 ml 200 mM buforu MES. Dostosować pH roztworu do wartości około siedem, używając stężonego kwasu solnego.Podczas regulowania pH roztworu DMPA za pomocą kwasu solnego wydzielają się toksyczne opary. Należy przetwarzać te materiały w dygestorium. Dodać 2,5 ml roztworu magnetoferrytyny o stężeniu 4 mg/ml.Dodaj mieszadło magnetyczne i mieszaj przez dwie godziny w celu osiągnięcia stanu równowagi. Po dostosowaniu pH roztworu do wartości 5,0 dodaj 141 mg proszku EDC do roztworu magnetoferrytyny DMPA. Kontynuuj mieszanie przez trzy i pół godziny.Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy o rozmiarze porów 0,22 mikrona, aby usunąć ewentualne osady, a następnie przeprowadzić dializę białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Hodować hMSC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przemyć wysiane komórki dwoma mililitrami PBS o temperaturze pokojowej.Następnie, przed inkubacją przez pożądany czas, dodaj jeden mililitr sterylnego roztworu kationizowanej magnetoferrytyny do komórek na płytce. Przemyj komórki buforem PBS, a następnie zbierz je, dodając 0,5 mililitra Trypsyny-EDTA i inkubując w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Po dodaniu jednego mililitra pożywki hodowlanej w celu inaktywacji trypsyny EDTA, przenieś roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów i wiruj przez pięć minut przy 524 ×g. Odlej nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 0,5 mililitra buforu do separacji magnetycznej.Następnie przymocuj magnes do wielostanu i zamocuj kolumnę do separacji magnetycznej w magnesie. Na kolumnie umieść filtr do wstępnej separacji. Następnie dodaj 0,5 milliliters buforu do separacji magnetycznej do filtra do wstępnej separacji i pozwól mu przepłynąć przez filtr oraz kolumnę w celu ich przemycia.Następnie umieść probówkę do wirowania o objętości 15 ml pod kolumną i dodaj 0,5 ml zawiesiny komórkowej do zbiornika filtra kolumny do separacji magnetycznej. Po opróżnieniu zbiornika dodaj 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej. Gdy zbiornik ponownie się opróżni, dodaj kolejne 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej.Powtórz płukanie jeszcze raz, tak aby całkowita objętość buforu do separacji magnetycznej wyniosła 1,5 mililitrów. Ten etap płukania wypłukuje z kolumny wszystkie komórki nieoznaczone magnetycznie. Zdejmij kolumnę z magnesu i umieść ją w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.Następnie wyjmij filtr z rezerwuaru kolumny. Dodaj 1 mililitra buforu do separacji magnetycznej do rezerwuaru i natychmiast przepchnij go przez kolumnę za pomocą tłoka dostarczonego przez producenta. Pozwoli to na elucję namagnesowanych komórek z kolumny do probówki wirówkowej.Należy przystąpić do oznaczania ilości żelaza zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej próbek magnetoferrytyny barwionych negatywnie wykazały, że nanocząstki utworzyły się wewnątrz klatki białkowej. Pomiary potencjału zeta potwierdzają, że magnetoferrytyna uzyskała dodatni ładunek powierzchniowy po kationizacji.Poddanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych działaniu kationizowanej magnetoferrytyny przez jedną minutę doprowadziło do namagnesowania 92% populacji komórek i dostarczenia 3,6 picogramów żelaza na komórkę. Wydłużenie czasu inkubacji do 15 minut skutkowało namagnesowaniem całej populacji komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak syntetyzować nanocząstkę magnetyczną wewnątrz wnęki apoferrytyny poprzez sekwencyjne dodawanie prekursorów soli metali do roztworu białka.Następnie przedstawiono sposób kationizacji białka metodą sprzęgania z TMPA. Po opanowaniu tej techniki synteza, oczyszczanie i kationizacja magnetoferrytyny mogą zostać przeprowadzone w ciągu trzech dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Podczas realizacji tej procedury kluczowe jest unikanie kontaminacji tlenem oraz utrzymywanie odpowiedniej temperatury i pH przez cały proces syntezy magnetoferrytyny.W nawiązaniu do tej procedury, inne ładunki, takie jak kropki kwantowe lub środki terapeutyczne, mogą zostać zamknięte w kationizowanej klatce apoferrytyny, aby zapewnić bardziej wydajne dostarczanie tych materiałów do komórek. Technika ta może otworzyć przed badaczami z dziedziny magnipulacji magnetycznej komórkami możliwość zbadania znakowania magnetycznego w komórkach wykazujących słabe pobieranie nanocząsteczek lub takich, które są bardzo wrażliwe na przedłużoną ekspozycję na nanocząsteczki bądź na podwyższone stężenia nanocząsteczek.

synthesis-cationized-magnetoferritin-for-ultra-fast-magnetization

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie pokazujemy, jak znakować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) za pomocą chlorku manganu (MnCl2), który może wnikać do komórek poprzez napięciowo zależne kanały wapniowe, gdy komórki są biologicznie aktywne. Dodatkowo prezentujemy zastosowanie MnCl2 jako komórkowego środka kontrastowego w MRI w celu określenia żywotności hESC in vitro.

Znakowanie in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

Tutaj opisujemy protokół syntezy magneto-plazmonicznych nanocząstek o silnym momencie magnetycznym i silnej absorbancji bliskiej podczerwieni (NIR). Protokół obejmuje również koniugację przeciwciał z nanocząstkami za pomocą ugrupowania Fc do różnych zastosowań biomedycznych, które wymagają specyficznego celowania molekularnego.

Synteza immunoukierunkowanych magnetoplazmonicznych nanoklastrów

Ukierunkowane dostarczanie komórek jest przydatne w różnych zastosowaniach biomedycznych.  Celem tego protokołu jest wykorzystanie superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION) do znakowania komórek, a tym samym umożliwienie podejścia do magnetycznego celowania w komórki w celu uzyskania wysokiego stopnia kontroli nad dostarczaniem i lokalizacją komórek.

Znakowanie i celowanie w komórki za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Ta praca opisuje protokoły przygotowania nanocząstek magnetycznych, ich powlekania SiO2, następnie funkcjonalizacji aminy (3-aminopropylo)trietoksysilanem (APTES) i jej koniugacji z deferoksaminą przy użyciu ugrupowania sukcynylu jako łącznika. Szczegółowo opisano również szczegółowy opis charakterystyki strukturalnej i test wychwytywania bakterii z użyciem Y. enterocolitica dla wszystkich nanocząstek pośrednich i końcowego koniugatu.

Synteza funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, ich koniugacja z sideroforem feroksaminą i jej ocena pod kątem wykrywania bakterii

Nanocząstki tlenku żelaza są syntetyzowane za pomocą niewodnego żelu zolowego i pokrywane anionowymi krótkimi cząsteczkami lub polimerem. Zastosowanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji i biotransformacji nanocząstek magnetycznych wewnątrz ludzkich komórek macierzystych wykazano za pomocą magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM).

Wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza

W tej pracy dostarczamy protokół do biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów z przeciwciałami do określonego celowania w komórki. Na przykład wykorzystujemy nanodruty żelaza do celowania w komórki rakowe.

Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

Ta praca przedstawia oddolne podejście do inżynierii lokalnych sił magnetycznych do kontroli organizacji neuronów. Komórki podobne do neuronów załadowane nanocząstkami magnetycznymi (MNP) są powlekane na wierzchu i kontrolowane przez platformę o mikrowzorze z prostopadłym namagnesowaniem. Opisano również charakterystykę magnetyczną, wychwyt komórkowy MNP, żywotność komórek i analizę statystyczną.

Wytwarzanie platform magnetycznych do organizacji połączonych neuronów w skali mikronowej

Informujemy o jednogarnkowej syntezie hydrotermalnej klastrów ferrytu manganu (MFC), która oferuje niezależną kontrolę nad wymiarami i składem materiału. Separacja magnetyczna umożliwia szybkie oczyszczanie, a funkcjonalizacja powierzchni za pomocą sulfonowanych polimerów zapewnia, że materiały nie agregują się w biologicznie istotnym środowisku. Uzyskane w ten sposób produkty są dobrze przygotowane do zastosowań biomedycznych.

Stabilne zawiesiny wodne klastrów ferrytu manganu o przestrajalnym wymiarze i składzie w nanoskali

Zgłaszamy test hybrydowy i jednocząsteczkowy, aby bezpośrednio zobrazować i określić ilościowo ruch fluorescencyjnie znakowanej, w pełni zrekonstytuowanej helikazy Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) na liniowych cząsteczkach DNA utrzymywanych w miejscu w pułapce optycznej.

Zestaw hybrydowy i test jednocząsteczkowy do obrazowania ruchu w pełni odtworzonego CMG

Naucz się syntezy kationizowanej magnetoferrytyny do szybkiego namagnesowania komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia efektywne etykietowanie komórek przy niskich stężeniach nanocząstek, co jest kluczowe dla zastosowań w MRI i separacji magnetycznej.

Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

Przeglądaj więcej filmów