Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

Ogólnym celem tej metody jest synteza nanocząstki magnetycznej wewnątrz klatki białkowej, a następnie funkcjonalizacja białka w taki sposób, aby umożliwiła szybkie przyłączenie nanocząstki magnetycznej do komórek. Metoda ta może być wykorzystana do generowania nanocząstek magnetycznych, które umożliwiają szybkie i wydajne znakowanie magnetyczne komórek, co jest ważne w zastosowaniach takich jak rezonans magnetyczny lub magnetyczna separacja komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że magnetyzację komórek można osiągnąć przy użyciu niskich stężeń nanocząstek i krótkich czasów inkubacji, co zapobiega potencjalnym niekorzystnym skutkom wynikającym z ekspozycji na nanocząstki.

Na początek odtlenij 500 mililitrów zdejonizowanej wody, umieszczając rurkę podłączoną do butli z azotem w wodzie i uszczelniając naczynie folią spożywczą. Następnie przepuszczaj azot przez około 60 minut. Podgrzać łaźnię wodną podłączoną do naczynia reakcyjnego z podwójnym płaszczem do 65 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj 75 mililitrów 50-milimolowego buforu HEPES o pH 8,6 do naczynia reakcyjnego. Uszczelnić naczynie i odtlenić poprzez bulgotanie azotu gazowego przez roztwór buforowy przez około 20 minut. W tym samym czasie wymieszać roztwór buforowy za pomocą mieszadła magnetycznego.

Po odtlenieniu roztworu buforowego HEPES należy wyjąć rurkę z azotem z buforu, trzymając ją zawieszoną nad roztworem, aby utrzymać atmosferę azotu. Dodaj apoferrytynę, aby osiągnąć końcowe stężenie 3 miligramów na mililitr. Kontynuuj mieszanie magnetyczne, ale zmniejsz prędkość mieszania, jeśli wystąpi pienienie.

Do syntezy magnetoferytyny należy użyć dwóch pomp strzykawkowych, aby jednocześnie wstrzyknąć 10,1 mililitra prekursora żelazo-kobalt i 10,1 mililitra nadtlenku wodoru do roztworu apoferrytyny z natężeniem przepływu 0,15 mililitra na minutę. Kontynuuj etapy syntezy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie załaduj próbkę do kolumny zawierającej matrycę kationową za pomocą pompy perystaltycznej o natężeniu przepływu 10 mililitrów na minutę.

Przemyć kolumnę około 100 mililitrami buforu roboczego za pomocą pompy gradientowej przy natężeniu przepływu 10 mililitrów na minutę. Aby wymyć białko, przemyj kolumnę 150 mililitrami rosnącego stężenia chlorku sodu i buforu tris w ilości 10 mililitrów na minutę. Gdy białko wymywa się przy stężeniu chlorku sodu 500 milimolów, zbierz je we frakcjach 50 mililitrów za pomocą automatycznego kolektora frakcji.

Skoncentrować 150 mililitrów magnetoferytyny do objętości około dwóch mililitrów za pomocą 15-mililitrowej odśrodkowej jednostki filtracyjnej, a następnie czteromililitrowej jednostki objętościowej. Zapoznaj się z instrukcjami producenta odśrodkowych jednostek filtrujących, aby uzyskać szczegółowy protokół tej procedury. Następnie załadować zagęszczoną próbkę do żelowej kolumny filtracyjnej za pomocą pętli iniekcyjnej.

Przemyć kolumnę działającym buforem o natężeniu przepływu 1,3 mililitra na minutę. Zbierz sześć mililitrowych frakcji za pomocą automatycznego kolektora frakcji. Monomery białkowe eluują się jako ostatnie.

W tym momencie oczyszczona magnetoferytyna może być przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza do kationizacji. Na 10 miligramów magnetoferrityny odważyć 374 miligramy DMPA i rozpuścić w 2,5 mililitra 200-milimolowego buforu MES. Doprowadzić pH roztworu do około siedmiu za pomocą stężonego kwasu solnego.

Toksyczne opary uwalniają się po dostosowaniu pH roztworu DMPA kwasem solnym. Pamiętaj, aby obchodzić się z tymi materiałami w dygestorium. Dodaj 2,5 mililitra roztworu magnetoferrytyny w stężeniu czterech miligramów na mililitr.

Dodaj mieszadło magnetyczne i mieszaj przez dwie godziny, aby uzyskać równowagę. Po dostosowaniu roztworu do pH 5,0 dodać 141 miligramów proszku EDC do roztworu magnetoferytyny DMPA. Kontynuuj mieszanie przez trzy i pół godziny.

Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona, aby usunąć wszelkie osady i dializować białko zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Kultury hMSC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umyj posiane komórki dwoma mililitrami PBS o temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj jeden mililitr wysterylizowanego kationizowanego roztworu magnetoferrytyny do posianych komórek przed inkubacją przez żądany okres czasu. Umyj komórki PBS, a następnie zbierz je, dodając 0,5 mililitra Trypsyny-EDTA i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po dodaniu jednego mililitra pożywki hodowlanej w celu dezaktywacji trypsyny EDTA, przenieś roztwór do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj przez pięć minut przy 524 razy G. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 0,5 mililitra buforu do separacji magnetycznej.

Następnie przymocuj magnes do stojaka wielofunkcyjnego i dodaj magnetyczną kolumnę separacyjną do magnesu. Umieść filtr wstępnej separacji na kolumnie. Następnie dodaj 0,5 mililitra buforu do separacji magnetycznej do filtra przed separacją i pozwól mu przepłynąć zarówno przez filtr, jak i kolumnę, aby je umyć.

Następnie umieść 15-mililitrową probówkę wirówkową pod kolumną i dodaj 0,5 mililitra zawiesiny komórek do zbiornika filtracyjnego kolumny separacji magnetycznej. Gdy zbiornik jest pusty, dodaj 0,5 mililitra bufora separacji magnetycznej. Gdy zbiornik ponownie się opróżni, dodaj kolejne 0,5 mililitra bufora separacji magnetycznej.

Powtórz pranie jeszcze raz, aby uzyskać całkowitą objętość buforu separacji magnetycznej wynoszącą 1,5 mililitra. Ten etap mycia wymywa wszystkie nienamagnesowane komórki z kolumny. Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w świeżej 15-mililitrowej probówce wirówkowej.

Następnie wyjmij filtr ze zbiornika kolumny. Dodać 1 mililitr buforu do separacji magnetycznej do zbiornika i natychmiast przepchnąć przez kolumnę za pomocą tłoka dostarczonego przez producenta. W ten sposób namagnesowane komórki są eluowane z kolumny do probówki wirówkowej.

Przystąpić do oznaczania ilościowego żelaza zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej próbek magnetoferytyny wybarwionych ujemnie wykazały, że wewnątrz klatki białkowej utworzyły się nanocząstki. Pomiary potencjału Zeta potwierdzają, że magnetoferytyna uzyskała dodatni ładunek powierzchniowy po kationizacji.

Wystawienie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na działanie kationizowanej magnetoferytyny przez jedną minutę spowodowało namagnesowanie 92% populacji komórek i dostarczenie 3,6 pikograma żelaza na komórkę. Wydłużenie czasu inkubacji do 15 minut spowodowało namagnesowanie całej populacji komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak zsyntetyzować nanocząstkę magnetyczną w jamie apoferrytyny poprzez sekwencyjne dodawanie prekursorów soli metali do roztworu białkowego.

A następnie, jak chemicznie kationizować białko za pomocą sprzężenia TMPA. Po opanowaniu syntezę, oczyszczanie i kationizację magnetoferrytyny można przeprowadzić w ciągu trzech dni, jeśli zostanie przeprowadzone prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia tlenem oraz utrzymać prawidłową temperaturę i pH podczas syntezy magnetoferrytyny.

W następstwie tej procedury inne ładunki, takie jak kropki kwantowe lub środki terapeutyczne, mogą być zamknięte w kationizowanej klatce apoferrytyny, aby uzyskać bardziej efektywne dostarczanie tych materiałów do komórek. Technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się manipulacją komórkami magnetycznymi do zbadania znakowania magnetycznego w komórkach, które wykazują słaby absorpcję nanocząstek lub są bardzo wrażliwe na długotrwałą ekspozycję na nanocząstki lub podwyższone stężenia nanocząstek.