Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

Ogólnym celem tej metody jest synteza magnetycznej nanocząstki wewnątrz białkowej klatki, a następnie funkcjonalizacja białka w taki sposób, aby umożliwić szybkie przytwierdzenie nanocząstki magnetycznej do komórek. Metodę tę można wykorzystać do wytwarzania nanocząstek magnetycznych umożliwiających szybkie i wydajne znakowanie magnetyczne komórek, co jest istotne w takich zastosowaniach jak MRI lub magnetyczna separacja komórek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzenia namagnesowania komórek przy użyciu niskich stężeń nanocząstek i krótkiego czasu inkubacji, co zapobiega potencjalnym niepożądanym skutkom wynikającym z ekspozycji na nanocząstki.

Aby rozpocząć, odgazuj 500 mililitrów wody dejonizowanej, umieszczając w wodzie rurkę podłączoną do butli z azotem i szczelnie zamykając naczynie folią spożywczą. Następnie przedmuchuj wodę azotem przez około 60 minut. Podgrzej kąpiel wodną podłączoną do dwupłaszczowego naczynia reakcyjnego do 65 stopni Celsjusza.

Następnie do naczynia reakcyjnego dodaj 75 mililitrów 50 milimolarnego buforu HEPES, pH 8.6. Zamknij naczynie i odgazuj je, przepuszczając azot przez roztwór buforu przez około 20 minut. W tym samym czasie mieszaj roztwór buforu za pomocą mieszadła magnetycznego.

Po odgazowaniu roztworu buforu HEPES należy wyjąć rurkę z azotem z buforu, utrzymując ją nad roztworem w celu zachowania atmosfery azotu. Dodać apoferrytynę, aby uzyskać stężenie końcowe 3 mg/mL. Kontynuować mieszanie magnetyczne, jednak zmniejszyć prędkość mieszania w przypadku pojawienia się piany.

W celu syntezy magnetoferrytyny należy użyć dwóch pomp strzykawkowych do jednoczesnego wstrzyknięcia 10,1 mililitrów prekursora żelazo-kobalt oraz 10,1 mililitrów nadtlenku wodoru do roztworu apoferrytyny z prędkością przepływu 0,15 mililitra na minutę. Następnie należy kontynuować etapy syntezy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po tym nałożyć próbkę na kolumnę zawierającą macierz kationową, używając pompy perystaltycznej z prędkością przepływu 10 mililitrów na minutę.

Przemyj kolumnę około 100 mililitrami buforu płuczącego, używając pompy gradientowej przy szybkości przepływu 10 mililitrów na minutę. Aby wyeluować białko, przemyj kolumnę 150 mililitrami buforu Tris z rosnącym stężeniem chlorku sodu przy szybkości 10 mililitrów na minutę. Gdy białko zostanie wyeluowane przy stężeniu chlorku sodu 500 milimolarnym, zbierz je w frakcjach po 50 mililitrów, korzystając z automatycznego kolektora frakcji.

Skoncentruj 150 ml magnetoferrytyny do objętości około dwóch ml, używając jednostki filtra wirówkowego o pojemności 15 ml, a następnie jednostki o pojemności czterech ml. Szczegółowy protokół tej procedury znajduje się w instrukcji producenta jednostek filtrów wirówkowych. Następnie wprowadź skoncentrowaną próbkę na kolumnę do filtracji żelowej za pomocą pętli wtryskowej.

Przemyj kolumnę buforem płuczącym przy szybkości przepływu 1,3 ml/min. Zbierz frakcje o objętości sześciu mililitrów, korzystając z automatycznego kolektora frakcji. Monomery białek eluują jako ostatnie.

Na tym etapie oczyszczoną magnetoferrytynę można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu kationizacji. Dla 10 mg magnetoferrytyny odważyć 374 mg DMPA i rozpuścić w 2,5 ml 200 mM buforu MES. Dostosować pH roztworu do wartości około siedem, używając stężonego kwasu solnego.

Podczas regulowania pH roztworu DMPA za pomocą kwasu solnego wydzielają się toksyczne opary. Należy przetwarzać te materiały w dygestorium. Dodać 2,5 ml roztworu magnetoferrytyny o stężeniu 4 mg/ml.

Dodaj mieszadło magnetyczne i mieszaj przez dwie godziny w celu osiągnięcia stanu równowagi. Po dostosowaniu pH roztworu do wartości 5,0 dodaj 141 mg proszku EDC do roztworu magnetoferrytyny DMPA. Kontynuuj mieszanie przez trzy i pół godziny.

Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy o rozmiarze porów 0,22 mikrona, aby usunąć ewentualne osady, a następnie przeprowadzić dializę białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Hodować hMSC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przemyć wysiane komórki dwoma mililitrami PBS o temperaturze pokojowej.

Następnie, przed inkubacją przez pożądany czas, dodaj jeden mililitr sterylnego roztworu kationizowanej magnetoferrytyny do komórek na płytce. Przemyj komórki buforem PBS, a następnie zbierz je, dodając 0,5 mililitra Trypsyny-EDTA i inkubując w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Po dodaniu jednego mililitra pożywki hodowlanej w celu inaktywacji trypsyny EDTA, przenieś roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów i wiruj przez pięć minut przy 524 ×g. Odlej nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 0,5 mililitra buforu do separacji magnetycznej.

Następnie przymocuj magnes do wielostanu i zamocuj kolumnę do separacji magnetycznej w magnesie. Na kolumnie umieść filtr do wstępnej separacji. Następnie dodaj 0,5 milliliters buforu do separacji magnetycznej do filtra do wstępnej separacji i pozwól mu przepłynąć przez filtr oraz kolumnę w celu ich przemycia.

Następnie umieść probówkę do wirowania o objętości 15 ml pod kolumną i dodaj 0,5 ml zawiesiny komórkowej do zbiornika filtra kolumny do separacji magnetycznej. Po opróżnieniu zbiornika dodaj 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej. Gdy zbiornik ponownie się opróżni, dodaj kolejne 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej.

Powtórz płukanie jeszcze raz, tak aby całkowita objętość buforu do separacji magnetycznej wyniosła 1,5 mililitrów. Ten etap płukania wypłukuje z kolumny wszystkie komórki nieoznaczone magnetycznie. Zdejmij kolumnę z magnesu i umieść ją w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.

Następnie wyjmij filtr z rezerwuaru kolumny. Dodaj 1 mililitra buforu do separacji magnetycznej do rezerwuaru i natychmiast przepchnij go przez kolumnę za pomocą tłoka dostarczonego przez producenta. Pozwoli to na elucję namagnesowanych komórek z kolumny do probówki wirówkowej.

Należy przystąpić do oznaczania ilości żelaza zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej próbek magnetoferrytyny barwionych negatywnie wykazały, że nanocząstki utworzyły się wewnątrz klatki białkowej. Pomiary potencjału zeta potwierdzają, że magnetoferrytyna uzyskała dodatni ładunek powierzchniowy po kationizacji.

Poddanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych działaniu kationizowanej magnetoferrytyny przez jedną minutę doprowadziło do namagnesowania 92% populacji komórek i dostarczenia 3,6 picogramów żelaza na komórkę. Wydłużenie czasu inkubacji do 15 minut skutkowało namagnesowaniem całej populacji komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak syntetyzować nanocząstkę magnetyczną wewnątrz wnęki apoferrytyny poprzez sekwencyjne dodawanie prekursorów soli metali do roztworu białka.

Następnie przedstawiono sposób kationizacji białka metodą sprzęgania z TMPA. Po opanowaniu tej techniki synteza, oczyszczanie i kationizacja magnetoferrytyny mogą zostać przeprowadzone w ciągu trzech dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Podczas realizacji tej procedury kluczowe jest unikanie kontaminacji tlenem oraz utrzymywanie odpowiedniej temperatury i pH przez cały proces syntezy magnetoferrytyny.

W nawiązaniu do tej procedury, inne ładunki, takie jak kropki kwantowe lub środki terapeutyczne, mogą zostać zamknięte w kationizowanej klatce apoferrytyny, aby zapewnić bardziej wydajne dostarczanie tych materiałów do komórek. Technika ta może otworzyć przed badaczami z dziedziny magnipulacji magnetycznej komórkami możliwość zbadania znakowania magnetycznego w komórkach wykazujących słabe pobieranie nanocząsteczek lub takich, które są bardzo wrażliwe na przedłużoną ekspozycję na nanocząsteczki bądź na podwyższone stężenia nanocząsteczek.