Charakterystyka proteomiczna egzosomów z komórek zakażonych HIV-1 na podstawie SILAC

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie proteomu egzosomalnego z komórek zakażonych wirusem HIV-1. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie biologii egzosomów, takie jak wpływ stresów zewnętrznych na skład proteomu egzosomu. Główną zaletą tej techniki jest to, że można się jej nauczyć nawet przy ograniczonym zapleczu w zakresie proteomiki i biologii egzosomów.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat zakażenia wirusem HIV, może być również stosowana do innych badań nad chorobami, takich jak infekcje bakteryjne. W tym eksperymencie wykorzystano linię komórkową H9, chociaż można użyć różnych linii komórkowych, o ile znajdują się one w fazie aktywnej proliferacji i są podatne na wybrane warunki testowe. Wysiewaj dwa razy po 10 do szóstego etapu dziewięć komórek do każdej z dwóch kolb do hodowli komórkowych.

Hoduj jedną populację w 10 mililitrach oznakowanego podłoża zawierającego 10% stylizowanego FBS, 100 miligramów na litr L-lizyny znakowanej C13 i 100 miligramów na litr L-argininy znakowanej C13 i N15. Hoduj drugą populację w 10 mililitrach nieoznakowanego podłoża z 10% stylizowanym FBS, L-lizyną i L-argininą. Hoduj komórki przez sześć podwojeń, po czym białka komórek w znakowanej pożywce są w ponad 99% znakowane ciężkimi aminokwasami.

Dodawaj nowe nośniki lub zmieniaj je w regularnych odstępach czasu, w zależności od typu komórek. Pod koniec znakowania zwiększ objętość kultury do 30 mililitrów, aby dostosować się do wzrostu większej liczby komórek. Zainfekuj znakowane komórki szczepem NL4-3 HIV-1 przy użyciu standardowego protokołu infekcji HIV-1.

Dodaj odpowiednią ilość wirusa do komórek i inkubuj przez 48 godzin, podczas gdy nieznakowane komórki będą nadal rosły w nieznakowanej pożywce bez zakażenia HIV-1. Pod koniec zakażenia wirusem HIV-1 supernatanty z obu populacji komórek są zbierane w celu izolacji egzosomów. Zbierz supernatanty z kultur w 50-mililitrowych stożkowych probówkach, omijając komórki.

Wirować przez 10 minut w temperaturze 300 razy g i czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć pozostałe komórki. Zebrać supernatanty w nowych 50-mililitrowych stożkowych probówkach i odwirować przez 10 minut w temperaturze 2 000 razy g, aby usunąć martwe komórki. Przenieś powstałe supernatanty do komercyjnych probówek kompatybilnych z wirnikiem, które są w stanie wytrzymać ultrawirowanie.

Pamiętaj, aby wyważyć probówki ultrawirówkowe. Wirować probówki przez 30 minut po 10 000 g w celu usunięcia resztek komórek. Zebrać supernatanty w nowych probówkach do ultrawirówek.

Wirować przez 70 minut w temperaturze 100 000 razy g. Wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić każdą osadkę bogatą w egzosomy w pięciu mililitrach świeżego PBS i przenieść roztwór do świeżej probówki ultrawirówkowej.

Wirować ponownie przez 70 minut przy 100 000 razy g. Po ostatnim wirowaniu wyrzuć supernatant. Granulki komórkowe są teraz gotowe do ekstrakcji białka.

Aby rozpocząć tę procedurę, rozpuść każdą izolowaną egzosomalną osadkę w 100 do 200 mikrolitrach fer-pa-lai-ses i buforze ekstrakcyjnym z dodatkiem inhibitorów proteazy, które mogą hamować pełną gamę proteaz. Odwirowywać rozpuszczone roztwory przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Przenieść oczyszczone supernatanty do nowych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek.

Po ilościowym określeniu stężenia białka w każdej próbce za pomocą standardowych testów, należy wymieszać równe ilości białek z próbek znakowanych i nieznakowanych. Uruchom równą mieszaninę na żelu SDS-PAGE od czterech do 20% przez 30 minut. Zabarwić żel kolorem Coomassie blue, a następnie odbarwić.

Za pomocą żyletki odetnij pas próbki od żelu, a następnie pokrój pas żelu na 10 do 15 równych kawałków. Umieść każdy kawałek w świeżej 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej, co daje w sumie od 10 do 15 probówek i kontynuuj procedurę ekstrakcji białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Procedury analizy danych proteomicznych nie zostaną zademonstrowane, ale zostaną podsumowane na tym schemacie blokowym.

Wyekstrahowane białka są najpierw analizowane za pomocą chromatografii cieczowej, tandemowej spektroskopii mas i oceniana jest jakość danych. Następnie dane są poddawane wstępnej obróbce poprzez usunięcie białek, które mają mniej niż dwa określone ilościowo peptydy. Następnie identyfikowane są białka znacznie regulowane w górę i w dół.

Na koniec repliki istotnych kandydatów są porównywane w celu osiągnięcia spójności, a dane ze wszystkich powtórzeń są łączone. Aby rozpocząć charakterystykę zidentyfikowanych białek, użyj ich numerów dostępu do GenBank lub identyfikatorów UniProt w celu przeszukania obecnych baz danych egzosomów. ExoCarta zostanie wykorzystana w tej demonstracji.

Kliknij zapytanie i wprowadź nazwę genu lub białka lub numer dostępu. Wszelkie dowody w egzosomach potwierdzają, że białka kandydujące zostały wcześniej znalezione w egzosomach i dodaje warstwę pewności, że kandydaci rzeczywiście znajdują się w egzosomach. Następnie przeszukaj kandydatów w bazie danych interakcji HIV-1 i białek ludzkich.

We wpisie nazwy domeny białka wprowadź nazwiska kandydata lub numery dostępu, a następnie kliknij przycisk Szukaj. Wyniki poszukiwań mogą dostarczyć informacji na temat interakcji między wirusem HIV-1 a kandydatami na białko i zasugerować, które z kandydatów mogą być naprawdę związane z HIV-1. Trzecim krokiem jest uzyskanie globalnego wglądu w kandydatów za pomocą oprogramowania do ontologii genów lub analizy GO, takiego jak fun-brich.

W obszarze analizy wzbogacania kliknij dodaj zestaw danych i prześlij numery dostępu GenBank lub identyfikatory UniProt kandydatów, a następnie wybierz typ wykresu, aby zwizualizować analizę GO. Wyniki analizy GO są wizualizowane w postaci wykresów kołowych, które dostarczają informacji o białkach kandydujących w obszarach procesu biologicznego, komponentu komórkowego i funkcji molekularnej. Następnym krokiem jest zidentyfikowanie statystycznie nadreprezentowanych terminów GO za pomocą analizy DAVID.

Kliknij narzędzie adnotacji funkcjonalnej, wprowadź listę kandydującą i wybierz identyfikator genu, taki jak UniProt ID.Wybierz listę genów i wyszukaj. Po zakończeniu wyszukiwania kliknij stronę wyników podsumowania adnotacji w kategorii ontologii genów, aby wyświetlić wzbogacone terminy GO, wartości p i inne parametry. Na koniec zbadaj potencjalne interakcje białko-białko i możliwe szlaki biochemiczne, korzystając z ogólnodostępnej bazy danych STRING.

Wprowadź identyfikator lub sekwencję białka w wyznaczonym polu wyszukiwania i wybierz odpowiednie gatunki do analizy. Kliknij przycisk Szukaj. Wyniki dostarczą informacji na temat zarówno bezpośrednich, jak i pośrednich powiązań.

10 najbardziej znanych dopasowań dla kandydata egzosomalnego wyświetlanego w wynikach powinno być branych pod uwagę przy istotnym wyborze kandydata. Przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy DAVID zestawu 14 białek. Wzbogacenie procesów biologicznych wykazało, że procesy związane ze śmiercią komórkową są znacznie wzbogacone.

Wzbogacenie składników komórkowych wskazuje na wiele białek pochodzenia wewnątrzkomórkowego, a wzbogacenie funkcji molekularnych zidentyfikowało rolę w wiązaniu białek dla większości kandydatów. Łańcuch B dehydrogenazy L-mleczanowej lub LDHB został wybrany jako najważniejszy kandydat, a analiza STRING zidentyfikowała 10 najważniejszych oddziałujących partnerów LDHB. Większość partnerów LDHB była również funkcjonalnie i lokalizacyjnie związana z egzosomami w HIV-1.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby każdy krok wykonywać w odpowiedniej temperaturze i warunkach. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak izolacja powinowactwa, w celu potwierdzenia przewidywań analizy bioinformatycznej.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaniom w dziedzinie egzosomalnej w celu zbadania zmian w proteomie egzosomalnym związanych z zakażeniami HIV-1 w biologii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować egzosom z hodowli komórkowej, przeanalizować ich proteomy i zbadać ich związek z HIV. Nie zapominaj, że praca z wirusem HIV lub innym czynnikiem zakaźnym może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.