Name: Charakterystyka proteomiczna egzosomów z komórek zakażonych HIV-1 na podstawie SILAC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę SILAC do charakteryzacji proteomu egzosomów z komórek zakażonych HIV-1. Technika ta umożliwia badanie zmian w składzie białkowym egzosomów pod wpływem infekcji wirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez dodatek ARRA do Lifespan/Tufts/Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, oraz K24HD080539 do BR. Praca ta była również wspierana przez Lifespan Pilot Research Fund (#701-5857), Rhode Island Foundation Medical Research Grant (#20133969) oraz NIH COBRE URI/RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) dla ML. Dziękujemy Jamesowi Myallowi i Vy Dangowi za pomoc w przygotowaniu rękopisu i ryciny.

1. Hodowla komórkowa i zakażenie wirusem HIV-1
UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentów zaleca się sprawdzenie żywotności komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym11 i ich proliferację za pomocą testu MTT12. Bardzo ważne jest również użycie nowo przygotowanego podłoża SILAC. Można stosować różne linie komórkowe, o ile znajdują się one w fazie aktywnej proliferacji i są podatne na zakażenie wirusem HIV-1 lub wybrany stan testowy. W tym protokole użyj linii komórkowej H9 jako przykładu.
<ol>
	<li>Zasiać 2 x 106 komórek H9 do każdej kolby do hodowli komórkowej. Hoduj jedną grupę w 10 ml oznakowanej pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% dializowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 mg / L 13C6 L-lizyny i 100 mg / L 13C615N4 L-argininy. Hoduj drugą grupę w 10 ml nieznakowanej pożywce RPMI 1640, z 10% dializowanym FBS, 100 mg/L L-lizyną i 100 mg/L L-argininą.</li>
	<li>Hoduj komórki przez sześć podwojeń, po czym białka komórek w znakowanej pożywce są praktycznie całkowicie znakowane (>99%) ciężkimi aminokwasami. Dodawaj nowe nośniki lub zmieniaj je regularnie (co 1-3 dni, w zależności od typu komórki. W przypadku komórki H9 zmieniaj pożywkę co 3 dni). Pod koniec znakowania zwiększ objętość kultury (np. ~30 ml), aby dostosować się do wzrostu większej liczby komórek. 
	UWAGA: Określ dokładny czas podwajania komórek na początku eksperymentu za pomocą barwienia błękitem trypanowym i zliczania komórek.</li>
	<li>Zakażone znakowane komórki wirusemHIV-1 NL4-3 należy zainfekować przy użyciu standardowego protokołu zakażenia HIV-113 przez 48 godzin. Inkubować komórki z odpowiednią ilością wirusa o wielokrotności infekcji (MOI) około 0,3. Sprawdź zakażenie HIV-1 poprzez kwantyfikację p24 supernatantów hodowli przy użyciu zestawu ELISA antygenu p24 HIV-1. Wykonaj test immunofluorescencyjny14, aby potwierdzić udaną infekcję komórek. Kontynuuj hodowlę nieznakowanych komórek na nieznakowanym podłożu bez zakażenia HIV-1.</li>
	<li>Zebrać supernatanty z obu grup pod koniec infekcji (krok 2.1).</li>
</ol>
2. Izolacja egzosomów
UWAGA: Poprzez serię etapów ultrawirowania, frakcje egzosomalne z supernatantów hodowlanych są wzbogacane15. Wykonać wszystkie poniższe czynności w temperaturze 4 °C, za pomocą wirnika ultrawirówki, który może osiągnąć prędkość co najmniej 100 000 x g.
<ol>
	<li>Zebrać supernatanty z kultur w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml, omijając komórki. Wirować je przez 10 minut przy 300 x g, aby usunąć pozostałe komórki.</li>
	<li>Zebrać supernatanty do nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować je przez 10 minut przy 2 000 x g w celu usunięcia martwych komórek. Przenieś powstałe supernatanty do komercyjnych probówek kompatybilnych z wirnikiem, które są w stanie wytrzymać ultrawirowanie.</li>
	<li>Pamiętaj, aby wyważyć probówki ultrawirówkowe. Wirować probówki przez 30 minut przy 10 000 x g, aby usunąć resztki komórek.</li>
	<li>Zebrać supernatanty do probówek ultrawirówek i wirować przez 70 minut przy 100 000 x g. Odrzucić supernatanty.</li>
	<li>Zawiesić granulki bogate w egzosomy w 5 ml świeżego PBS. Przenieść roztwory do świeżych probówek ultrawirówek i ponownie odwirować przez 70 minut przy 100 000 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatanty. Aby przechowywać egzosomy przez długi czas, ponownie zawieś granulki w 50 μl PBS i przechowuj w temperaturze -80 °C. Alternatywnie przejdź bezpośrednio do ekstrakcji białek, jak pokazano poniżej.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja i przygotowanie białka
<ol>
	<li>Rozpuść izolowane granulki egzosomalne w 100-200 μl buforu do lizy i ekstrakcji RIPA z dodatkiem koktajli inhibitorów proteazy. Bufor składa się z 25 mM trischlorowodorku, 150 mM chlorku sodu, 1% NP-40, 1% deoksycholanu sodu i 0,1% SDS (dodecylosiarczanu sodu) o pH 7,6. Koktajle inhibitorów proteazy powinny zawierać różne inhibitory proteazy, takie jak aprotynina, bestatyna, leupeptyna, pepstatyna A i EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), które mogą hamować pełną gamę proteaz.</li>
	<li>Rozpuszczone roztwory odwirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g (4 °C) i przenieść oczyszczone supernatanty do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Określ ilościowo stężenie białka w każdej próbce egzosomów za pomocą kwasu bicinchoninowego (BCA) lub testu Bradforda16.</li>
	<li>Wymieszać równą ilość białek (2 μg) z znakowanych i nieznakowanych próbek i uruchomić równą mieszaninę na 4-20% żelu SDS-PAGE przy 120 mA/200 V przez 30 minut.</li>
	<li>Odbarwić żel Coomassie Blue, a następnie odbarwić17.</li>
	<li>Za pomocą żyletki odetnij pas próbki od żelu. Następnie pokrój pas żelowy na 10-15 równych kawałków. Umieść każdy kawałek w świeżej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, co daje w sumie 10-15 probówek.</li>
	<li>Zanurz kostki w 25 mM NH4HCO3 w 50% acetonitrylu, wirze i odrzuć supernatanty. Powtórz dwa razy. Suszenie kostek w koncentratorze próżniowym18,19.</li>
	<li>Uwodnić kostki za pomocą 10 mM ditiotreitolu (DTT), odwirować i krótko odwirować. Inkubować w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zanurz kostki żelu w 55 mM jodoacetamidu, wiruj i wiruj. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 45 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zanurz kostki w 25 mM NH4HCO3, wiruj, wiruj i odrzuć supernatant.</li>
	<li>Zanurz kostki w 25 mM NH4HCO3 w 50% acetonitrylu, wirze i wirowaniu. Powtórzyć czynności 3.9 i 3.10.</li>
	<li>Wysuszyć kostki w koncentratorze próżniowym. Dodać 25 μl zmodyfikowanej trypsyny do sekwencjonowania w 25 mM NH4HCO3, inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut i wyrzucić nadmiar roztworu. Zanurzyć kostki w 25 mM NH4HCO3 bez trypsyny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Krótko odwiruj kostki w dół i przenieś powstały ekstrakt peptydowy do nowej probówki. Do kostek dodać 30 μl 5% kwasu mrówkowego w 50% acetonitrylu, wirować przez 30 minut i wirować. Połączyć supernatant z ekstraktem. Wysuszyć ekstrakty peptydowe za pomocą koncentratora próżniowego do objętości mniejszej niż 5 μl.</li>
	<li>Prześlij próbki do głównego obiektu spektrometrii mas w celu analizy LC-MS/MS. Dane analityczne MS, które można wygenerować za pomocą oprogramowania typu open source, zazwyczaj zawierają numer dostępu dla każdego zidentyfikowanego białka, wskaźniki znakowane/nieznakowane oraz liczbę zidentyfikowanych unikalnych peptydów.</li>
</ol>
4. Weryfikacja Western Blotting
UWAGA: Western blot jest zalecany do weryfikacji wyników spektrometrii mas.
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami western blotting i upewnij się, że załadowane są równe ilości białka z każdej grupy. Należy stosować przeciwciała przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania (np. anektynie A5, dehydrogenazie mleczanowej w łańcuchu B) zidentyfikowanym przez SM. Wykrywanie Western blot, wraz z analizą densytometryczną, może potwierdzić, że identyfikacja i kwantyfikacja białka SM są prawidłowe.</li>
</ol>
5. Analiza danych proteomicznych
UWAGA: Ocena jakości danych, wstępne przetwarzanie danych, obliczanie i określanie istotnych kandydatów na białka są wykonywane oddzielnie dla każdej kontrpróby MS. Po zakończeniu powyższych analiz analizowane dane z replik są porównywane i łączone6,20,21.
<ol>
	<li>Ocena jakości danych dotyczących państw członkowskich.
	<ol>
		<li>Po pierwsze, log2 przekształca znakowane/nieznakowane proporcje białek znakowanych i nieznakowanych SILAC-MS w programie arkusza kalkulacyjnego.</li>
		<li>W oprogramowaniu do tworzenia wykresów naukowych i statystyk pogrupuj współczynniki w przedziały proporcji 40-100 i wykreśl liczbę współczynników na pojemnik, aby wygenerować histogram. Rozkład normalny histogramu wskazuje na dobrą jakość danych MS6. Wykonaj ten krok dla wszystkich replik MS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zwiększyć pewność i dokładność proporcji peptydów MS, rozważ usunięcie białek, które mają mniej niż dwa peptydy określone ilościowo.</li>
	<li>Aby określić kandydatów na białka regulowane znacząco w górę i w dół, wykonaj następujące kroki w celu obliczenia progów istotności22.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu do tworzenia wykresów naukowych i statystyk wygeneruj regresję nieliniową lub dopasowanie krzywej do danych rozkładu częstotliwości. Ten krok daje wartości, których można użyć do obliczenia wartości odcięcia. Oblicz wartości odcięcia jako medianę ± 1,96 σ dla 95% granic ufności lub 2,56 σ dla 99% granic ufności. 
		UWAGA: Szczegółowe informacje na temat obliczania wartości odcięcia można znaleźć na stronie Emmott i wsp.22.</li>
		<li>Wybierz kandydatów na białka, których współczynniki są większe niż 1,96 (lub 2,56) odchylenia standardowego powyżej mediany (znacznie nadmiernie wyrażone) lub niższe niż 1,96 (lub 2,56) odchylenia standardowe poniżej mediany (znacznie niedostatecznie wyrażone).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Porównaj powtórzenia wyżej zidentyfikowanych istotnych kandydatów, aby osiągnąć spójność. Upewnij się, że spełniają następujące kryteria, aby przejść ten ostatni etap selekcji: kandydaci muszą być spójnie zidentyfikowani we wszystkich powtórzeniach; A powtórzenia kandydata muszą być spójne w swoim kierunku regulacji (najlepiej, aby co najmniej 2 z 3 powtórzeń kandydata były regulowane w górę lub w dół).</li>
	<li>Sfinalizuj dane dla kandydatów, którzy spełniają powyższe kryteria, scalając dane ich replik.</li>
</ol>
6. Weryfikacja i charakterystyka bioinformatyki
UWAGA: Istniejące informacje genomiczne i bioinformatyczne oferują bogactwo informacji dla prawie każdego białka. Eksploracja danych i analiza bioinformatyczna tych informacji mogą pomóc w uzyskaniu dużego wglądu we właściwości i funkcje ważnych kandydatów. Proces ten jest zwykle niezbędny do zaprojektowania odpowiednich dalszych eksperymentów w laboratorium mokrym.
<ol>
	<li>Korzystając z ich numerów dostępu do GenBank lub identyfikatorów UniProt przeszukaj kandydatów w aktualnych bazach danych egzosomów (Exocarta23, Evpedia24), aby sprawdzić, czy białka kandydujące zostały wcześniej znalezione w egzosomie. Ten krok dodaje warstwę pewności, że kandydaci rzeczywiście znajdują się w egzosomach.
	<ol>
		<li>Wejdź na http://www.exocarta.org/, kliknij "Zapytanie" i wprowadź nazwę genu lub białka/numer dostępu. Pojawi się strona podsumowania i zostaną pokazane dowody w egzosomie, pod warunkiem, że takie istnieją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szukaj kandydatów w bazie danych HIV-1 i Human Protein Interaction Database25. Alternatywnie można przeszukać konkretne bazy danych, które mogą dostarczyć informacji na temat interakcji białek kandydujących i warunków testowych.
	<ol>
		<li>Uzyskaj dostęp do bazy danych pod adresem www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteractions. W polu "białkowa nazwa domeny" wpisz nazwiska kandydatów lub numery dostępu, a następnie kliknij przycisk Szukaj. Wyniki poszukiwań mogą dostarczyć informacji na temat interakcji między HIV-1 a potencjalnymi białkami i zasugerować, które z kandydatów mogą być naprawdę związane z HIV-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaimportuj numery akcesyjne GenBank lub identyfikatory UniProt kandydatów do oprogramowania do analizy GO (takiego jak FunRich, narzędzie do analizy wzbogacenia funkcjonalnego26) i uruchom oprogramowanie.
	<ol>
		<li>Pobierz oprogramowanie pod adresem http://www.funrich.org/. Po instalacji otwórz oprogramowanie, w sekcji analiza wzbogacenia kliknij "Dodaj zestaw danych" i prześlij listę białek/genów. Następnie wybierz typ wykresu, aby zwizualizować analizę języka GO. 
		UWAGA: Wyniki analizy GO zostaną zobrazowane w postaci wykresów kołowych. Ten krok pomaga nam uzyskać globalny wgląd w kandydatów w obszarach procesów biologicznych (BP), komponentu komórkowego (CC) i funkcji molekularnych (MF).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj dostęp do DAVID pod adresem http://david.ncifcrf.gov/27, kliknij "Funkcjonalne narzędzie adnotacji" na jego stronie internetowej. Wprowadź listę kandydującą, wybierz "Identyfikator" genu, taki jak "UniProt ID", wybierz "Lista genów" i wyszukaj. Wzbogacone terminy GO, wartości p i inne parametry można znaleźć, klikając stronę "Wyniki podsumowania adnotacji" w kategorii "Gene_Ontology".</li>
	<li>Aby zbadać potencjalne interakcje kandydatów z innymi białkami, skorzystaj z ogólnodostępnej bazy danych STRING28, aby wyjaśnić potencjalne interakcje białko-białko i możliwe szlaki biochemiczne. 
	UWAGA: Analiza GO i adnotacja funkcjonalna (sekcja 6.3-6.4) można również przeprowadzić przy użyciu najnowszego oprogramowania STRING.
	<ol>
		<li>Uzyskaj dostęp do bazy danych pod adresem http://string-db.org/. Wprowadź identyfikator lub sekwencję białka w wyznaczonym polu wyszukiwania i wybierz odpowiednie gatunki do analizy. Kliknij "Szukaj". Wyniki dostarczą informacji na temat powiązań zarówno bezpośrednich (fizycznych), jak i pośrednich (funkcjonalnych). Zostanie wyświetlonych dziesięć pierwszych znanych dopasowań dla kandydata egzosomalnego, które powinny być brane pod uwagę przy istotnej selekcji kandydatów. 
		UWAGA: Wiele informacji związanych z kandydatami można przeanalizować, wykonując powyższe kroki. Najważniejsi kandydaci mogą zostać wybrani do dalszej analizy molekularnej i biochemicznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+function%3A+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Booth, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+HIV+Gag+bud+from+endosome-like+domains+of+the+T+cell+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane.</a> J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).</li>
<li>Van Engelenburg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+ESCRT+machinery+at+HIV+assembly+sites+reveals+virus+scaffolding+of+ESCRT+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits.</a> Science. 343 (6171), 653-656 (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+exosomes+from+HIV-1-infected+lymphocytic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells.</a> Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).</li>
<li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Anderson, L., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).</li>
<li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics.</a> Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrober%2C+W+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+MTT+lymphocyte+proliferation+assay+for+the+diagnosis+of+neurocysticercosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis.</a> J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).</li>
<li>Cepko, C., Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus+infection+of+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).</li>
<li>Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+immunofluorescence+assay+for+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus.</a> J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).</li>
<li>Olson, B. J. S. C., Markwell, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOlson%2C+BJSC+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22">Current Protocols in Protein Science</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining+for+high+sensitivity+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteom%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics.</a> J Proteom. 90, 96-106 (2013).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+the+comparative+analysis+of+multiprotein+complexes+based+on+15N+metabolic+labeling+and+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+binding+protein+is+a+multifaceted+cellular+regulator+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication.</a> J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).</li>
<li>Li, M., Ramratnam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Characterization+of+Exosomes+from+HIV-1-Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells.</a> Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).</li>
<li>Emmott, E., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interaction+partners+in+mammalian+cells+using+SILAC-immunoprecipitation+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Keerthikumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExoCarta%3A+A+Web-Based+Compendium+of+Exosomal+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo.</a> J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).</li>
<li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EVpedia%3A+a+community+web+portal+for+extracellular+vesicles+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research.</a> Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).</li>
<li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1%2C+human+protein+interaction+database+at+NCBI%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI.</a> Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).</li>
<li>Pathan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FunRich%3A+An+open+access+standalone+functional+enrichment+and+interaction+network+analysis+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool.</a> Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STRING+database+in+2011%3A+functional+interaction+networks+of+proteins%2C+globally+integrated+and+scored%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored.</a> Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
<li>Webber, J., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+pure+are+your+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">How pure are your vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1%3A+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).</li>
<li>Chertova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+biochemical+analysis+of+purified+human+immunodeficiency+virus+type+1+produced+from+infected+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages.</a> J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).</li>
<li>Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview.</a> Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).</li>
</ol>

Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

W procedurach opisanych w tym artykule zademonstrowaliśmy zastosowanie techniki SILAC do zbadania wpływu zakażenia HIV-1 na proteom egzosomalny gospodarza. Początkowo komórki niezakażone i zakażone wirusem HIV-1 są znakowane izotopowo różnicowo. Różnie znakowane egzosomy są następnie oczyszczane przed wykonaniem ekstrakcji białek. Następnie stosuje się chromatografię cieczową z tandemową spektrometrią mas do analizy proteomu egzosomalnego. Na koniec uzyskane dane ze spektrometrii mas i potencjalne białka kandydujące są p...

Wiele chorób ludzkich, w tym infekcje wirusowe, są często związane z charakterystycznymi procesami komórkowymi, które zachodzą w i wokół dotkniętych komórek. Białka, często działające jako ostateczne efektory komórkowe, pośredniczą w tych procesach. Analiza białek często może dostarczyć bezcennych informacji na temat lokalnego środowiska komórek dotkniętych chorobą i pomóc nam zrozumieć mechanizm leżący u podstaw patogenezy choroby. Wśród różnych technik analizy białek proteomika jest szczególnie obiecująca. Jako potężne narzędzie na dużą skalę, proteomika może zapewnić systemowe zrozumienie procesów komórkowych, szczególnie w obszarze funkcji i interakcji białek. Analiza określonych białek jest prostsza dzięki opracowaniu technik znakowania, które pozwalają badaczom monitorować ekspresję składników komórkowych, w szczególności białek, w miejscu badania. Chociaż przeprowadzono wiele analiz proteomicznych w skali proteomu komórkowego, charakterystyki proteomiczne przedziałów subkomórkowych okazały się szczególnie pouczające1. Jest to dobrze zilustrowane w badaniach nad zakażeniem wirusem HIV-1.
Egzosomy, pęcherzyki błonowe o długości 30-100 nm wydzielane przez szeroki zakres typów komórek2,3, są kluczowymi składnikami komunikacji międzykomórkowej i transportu molekularnego. Wcześniej odkryto, że odgrywają one ważną rolę w procesie pączkowania HIV-14,5. Łącząc analizę proteomiczną z funkcjonalnym rozbiorem, odkryliśmy, że egzosomy uwalniane z komórek zakażonych wirusem HIV-1 składają się z unikalnej i ilościowo różnej sygnatury białkowej i zawierają cząsteczki regulatorowe, które wpływają na właściwości komórkowe sąsiednich komórek receptywnych, w tym apoptozę komórkową i proliferację6. Metody są opisane w tym protokole, a mianowicie SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture)7 oparta na proteomicznej charakterystyce egzosomów z komórek zakażonych HIV-1. Podobne podejścia można zastosować w celu lepszego zrozumienia innych przedziałów subkomórkowych podczas patogenezy poprzez dostosowanie stresu eksperymentalnego do określonego przedziału lub frakcji będącej przedmiotem zainteresowania i wprowadzenie niezbędnych zmian w opisanych procedurach.
Biorąc pod uwagę niedawny rozwój ilościowych metod proteomicznych, jest wiele do wyboru przy wyborze najbardziej efektywnej metody dla konkretnego eksperymentu. Wśród nich znajdują się techniki iTRAQ (znaczniki izobaryczne do względnej i bezwzględnej kwantyfikacji)8 oraz bezznacznikowe techniki MRM (multiple reaction monitoring)9. Obie metody są potężnymi narzędziami i są dobrym wyborem dla określonych ustawień. Dla typowego laboratorium pracującego głównie z liniami komórkowymi te dwie metody wiążą się jednak ze stosunkowo wyższymi kosztami i są bardziej czasochłonne w porównaniu z metodą opartą na SILAC. SILAC to technika znakowania oparta na metabolizmie, która włącza nieradioaktywne izotopowe formy aminokwasów z pożywki hodowlanej do białek komórkowych. Zazwyczaj eksperymenty SILAC rozpoczynają się od dwóch populacji komórek, na przykład zakażonych i niezainfekowanych. Każdy z nich jest znakowany różnicowo w swoim specyficznym środowisku izotopowym, aż do uzyskania pełnego znakowania. Znakowane egzosomy tych komórek są następnie poddawane ekstrakcji białek. Po ekstrakcji znakowane białka egzosomalne są analizowane za pomocą tandemowej spektroskopii mas chromatografii cieczowej10. Na koniec wyniki spektrometrii mas i znacząco znakowane białka są poddawane analizom statystycznym i bioinformatycznym oraz rygorystycznej weryfikacji biochemicznej. Nasze poprzednie raporty badawcze sugerują, że procedury SILAC / egzosomy są bardziej odpowiednie dla linii komórkowych niż komórek pierwotnych, ponieważ linie komórkowe są zwykle w stanie aktywnej proliferacji w celu wydajnego znakowania izotopowego.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa H9</td><td>ATCC</td><td>HTB-176</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Zestaw</td><td></td> do oznaczania MTT Thermo Fisher 15250061 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>Dializowana płodowa surowica bydlęca (FBS)</td>Zestaw do <td></td> oznaczania ilościowego białka SILAC <td>Thermo Fisher</td> 26400044 <td></td></tr> &<tr><td>ndash; RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher</td><td>89982</td><td>Wersja DMEM (89983)</td></tr><tr><td>L-Arginina-HCl, 13C6, 15N4 dla SILAC</td><td>Thermo Fisher</td><td>88434</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine-2HCl, 13C6 dla SILAC</td><td>Thermo Fisher</td><td>88431</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>2480</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 Zestaw antygenowy ELISA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka superszybka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>22628045</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka z chłodzeniem</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td>Powinna być w stanie osiągnąć 100 000 x</td></tr><tr><td>g 50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Probówki ultrawirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW 32 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>bufor RIPA</td><td>Thermo Fisher</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy</td><td>Koktajle Thermo Fisher</td><td>&nbsp; 78430</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik termiczny&nbsp;</td>Zestaw <td></td> do oznaczania białek <td>Eppendorf</td> 5384000020 <td></td></tr><tr><td>BCA&nbsp;</td>Spektrofotometr <td>Thermo Fisher</td><td>23250</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biorad</td><td>1702525</td><td></td></tr><tr><td>SDS PAGE Aparatura żelowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td><td>Novex</td><td>XV04200PK20</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do barwienia w żelu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator SpeedVac</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiej aneksynie A5</td><td>Abcam</td><td>ab14196</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiej dehydrogenazie mleczanowej B łańcuch Abcam</td><td>ab53292</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów i statystyk</td><td>Systat&nbsp;</td><td>Wykres Sigma&nbsp;</td><td>lub GraphPad Prism</td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania do proteomiki</td><td>ilościowej Instytut Biochemii im. Maxa Plancka</td><td>Maxquant&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie i bazy danych</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Szczegółowe informacje można znaleźć w tekście głównym</td></tr></tbody></table>

charakterystyka proteomiczna egzosomów z komórek zakażonych hiv-1 na podstawie silac

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomika to analiza białek na dużą skalę. Techniki proteomiczne, takie jak tandemowa spektroskopia mas z chromatografią cieczową (LC-MS/MS), mogą charakteryzować tysiące białek jednocześnie. Te potężne techniki pozwalają nam na systemowe zrozumienie zmian komórkowych, zwłaszcza gdy komórki są poddawane różnym bodźcom, takim jak infekcje, stres i określone warunki testowe. Nawet przy najnowszych osiągnięciach analiza proteomu egzosomalnego jest czasochłonna i często wymaga złożonych metodologii. Ponadto uzyskany w ten sposób duży zbiór danych często wymaga solidnej i usprawnionej analizy, aby naukowcy mogli przeprowadzić dalsze badania. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na SILAC do charakteryzowania proteomu egzosomalnego, gdy komórki są zakażone wirusem HIV-1. Metoda opiera się na prostym znakowaniu izotopów, izolacji egzosomów z komórek znakowanych różnicowo oraz analizie spektrometrii mas. Następnie następuje szczegółowa eksploracja danych i analiza bioinformatyczna uderzeń proteomicznych. Wynikowe zestawy danych i kandydaci są łatwe do zrozumienia i często oferują bogactwo informacji, które są przydatne do dalszej analizy. Protokół ten ma zastosowanie do innych przedziałów subkomórkowych i szerokiego zakresu warunków testowych.

Rysunek 1A przedstawia schemat blokowy procedury znakowania metodą SILAC21. W celu oczyszczenia egzosomów próbki muszą zostać poddane wirowaniu w wirówce. Rysunek 1B przedstawia etapy oczyszczania egzosomów za pomocą seryjnej ultrawirowki21. Po oczyszczeniu egzosomy są poddawane eksperymentalnej analizie proteomicznej zgodnie z opisaną procedurą.
<...

Tutaj opisujemy ilościową metodę proteomiki wykorzystującą technikę znakowania stabilnych izotopów przez aminokwasy w hodowli komórkowej (SILAC) do analizy wpływu zakażenia HIV-1 na egzosomalne proteomy gospodarza. Protokół ten można łatwo dostosować do komórek w różnych warunkach stresu lub infekcji.

Charakterystyka proteomiczna egzosomów z komórek zakażonych HIV-1 na podstawie SILAC

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie proteomu egzosomalnego z komórek zakażonych wirusem HIV-1. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie biologii egzosomów, takie jak wpływ stresów zewnętrznych na skład proteomu egzosomu. Główną zaletą tej techniki jest to, że można się jej nauczyć nawet przy ograniczonym zapleczu w zakresie proteomiki i biologii egzosomów.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat zakażenia wirusem HIV, może być również stosowana do innych badań nad chorobami, takich jak infekcje bakteryjne. W tym eksperymencie wykorzystano linię komórkową H9, chociaż można użyć różnych linii komórkowych, o ile znajdują się one w fazie aktywnej proliferacji i są podatne na wybrane warunki testowe. Wysiewaj dwa razy po 10 do szóstego etapu dziewięć komórek do każdej z dwóch kolb do hodowli komórkowych.Hoduj jedną populację w 10 mililitrach oznakowanego podłoża zawierającego 10% stylizowanego FBS, 100 miligramów na litr L-lizyny znakowanej C13 i 100 miligramów na litr L-argininy znakowanej C13 i N15. Hoduj drugą populację w 10 mililitrach nieoznakowanego podłoża z 10% stylizowanym FBS, L-lizyną i L-argininą. Hoduj komórki przez sześć podwojeń, po czym białka komórek w znakowanej pożywce są w ponad 99% znakowane ciężkimi aminokwasami.Dodawaj nowe nośniki lub zmieniaj je w regularnych odstępach czasu, w zależności od typu komórek. Pod koniec znakowania zwiększ objętość kultury do 30 mililitrów, aby dostosować się do wzrostu większej liczby komórek. Zainfekuj znakowane komórki szczepem NL4-3 HIV-1 przy użyciu standardowego protokołu infekcji HIV-1.Dodaj odpowiednią ilość wirusa do komórek i inkubuj przez 48 godzin, podczas gdy nieznakowane komórki będą nadal rosły w nieznakowanej pożywce bez zakażenia HIV-1. Pod koniec zakażenia wirusem HIV-1 supernatanty z obu populacji komórek są zbierane w celu izolacji egzosomów. Zbierz supernatanty z kultur w 50-mililitrowych stożkowych probówkach, omijając komórki.Wirować przez 10 minut w temperaturze 300 razy g i czterech stopniach Celsjusza, aby usunąć pozostałe komórki. Zebrać supernatanty w nowych 50-mililitrowych stożkowych probówkach i odwirować przez 10 minut w temperaturze 2 000 razy g, aby usunąć martwe komórki. Przenieś powstałe supernatanty do komercyjnych probówek kompatybilnych z wirnikiem, które są w stanie wytrzymać ultrawirowanie.Pamiętaj, aby wyważyć probówki ultrawirówkowe. Wirować probówki przez 30 minut po 10 000 g w celu usunięcia resztek komórek. Zebrać supernatanty w nowych probówkach do ultrawirówek.Wirować przez 70 minut w temperaturze 100 000 razy g. Wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić każdą osadkę bogatą w egzosomy w pięciu mililitrach świeżego PBS i przenieść roztwór do świeżej probówki ultrawirówkowej.Wirować ponownie przez 70 minut przy 100 000 razy g. Po ostatnim wirowaniu wyrzuć supernatant. Granulki komórkowe są teraz gotowe do ekstrakcji białka.Aby rozpocząć tę procedurę, rozpuść każdą izolowaną egzosomalną osadkę w 100 do 200 mikrolitrach fer-pa-lai-ses i buforze ekstrakcyjnym z dodatkiem inhibitorów proteazy, które mogą hamować pełną gamę proteaz. Odwirowywać rozpuszczone roztwory przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Przenieść oczyszczone supernatanty do nowych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek.Po ilościowym określeniu stężenia białka w każdej próbce za pomocą standardowych testów, należy wymieszać równe ilości białek z próbek znakowanych i nieznakowanych. Uruchom równą mieszaninę na żelu SDS-PAGE od czterech do 20% przez 30 minut. Zabarwić żel kolorem Coomassie blue, a następnie odbarwić.Za pomocą żyletki odetnij pas próbki od żelu, a następnie pokrój pas żelu na 10 do 15 równych kawałków. Umieść każdy kawałek w świeżej 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej, co daje w sumie od 10 do 15 probówek i kontynuuj procedurę ekstrakcji białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Procedury analizy danych proteomicznych nie zostaną zademonstrowane, ale zostaną podsumowane na tym schemacie blokowym.Wyekstrahowane białka są najpierw analizowane za pomocą chromatografii cieczowej, tandemowej spektroskopii mas i oceniana jest jakość danych. Następnie dane są poddawane wstępnej obróbce poprzez usunięcie białek, które mają mniej niż dwa określone ilościowo peptydy. Następnie identyfikowane są białka znacznie regulowane w górę i w dół.Na koniec repliki istotnych kandydatów są porównywane w celu osiągnięcia spójności, a dane ze wszystkich powtórzeń są łączone. Aby rozpocząć charakterystykę zidentyfikowanych białek, użyj ich numerów dostępu do GenBank lub identyfikatorów UniProt w celu przeszukania obecnych baz danych egzosomów. ExoCarta zostanie wykorzystana w tej demonstracji.Kliknij zapytanie i wprowadź nazwę genu lub białka lub numer dostępu. Wszelkie dowody w egzosomach potwierdzają, że białka kandydujące zostały wcześniej znalezione w egzosomach i dodaje warstwę pewności, że kandydaci rzeczywiście znajdują się w egzosomach. Następnie przeszukaj kandydatów w bazie danych interakcji HIV-1 i białek ludzkich.We wpisie nazwy domeny białka wprowadź nazwiska kandydata lub numery dostępu, a następnie kliknij przycisk Szukaj. Wyniki poszukiwań mogą dostarczyć informacji na temat interakcji między wirusem HIV-1 a kandydatami na białko i zasugerować, które z kandydatów mogą być naprawdę związane z HIV-1. Trzecim krokiem jest uzyskanie globalnego wglądu w kandydatów za pomocą oprogramowania do ontologii genów lub analizy GO, takiego jak fun-brich.W obszarze analizy wzbogacania kliknij dodaj zestaw danych i prześlij numery dostępu GenBank lub identyfikatory UniProt kandydatów, a następnie wybierz typ wykresu, aby zwizualizować analizę GO. Wyniki analizy GO są wizualizowane w postaci wykresów kołowych, które dostarczają informacji o białkach kandydujących w obszarach procesu biologicznego, komponentu komórkowego i funkcji molekularnej. Następnym krokiem jest zidentyfikowanie statystycznie nadreprezentowanych terminów GO za pomocą analizy DAVID.Kliknij narzędzie adnotacji funkcjonalnej, wprowadź listę kandydującą i wybierz identyfikator genu, taki jak UniProt ID.Wybierz listę genów i wyszukaj. Po zakończeniu wyszukiwania kliknij stronę wyników podsumowania adnotacji w kategorii ontologii genów, aby wyświetlić wzbogacone terminy GO, wartości p i inne parametry. Na koniec zbadaj potencjalne interakcje białko-białko i możliwe szlaki biochemiczne, korzystając z ogólnodostępnej bazy danych STRING.Wprowadź identyfikator lub sekwencję białka w wyznaczonym polu wyszukiwania i wybierz odpowiednie gatunki do analizy. Kliknij przycisk Szukaj. Wyniki dostarczą informacji na temat zarówno bezpośrednich, jak i pośrednich powiązań.10 najbardziej znanych dopasowań dla kandydata egzosomalnego wyświetlanego w wynikach powinno być branych pod uwagę przy istotnym wyborze kandydata. Przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy DAVID zestawu 14 białek. Wzbogacenie procesów biologicznych wykazało, że procesy związane ze śmiercią komórkową są znacznie wzbogacone.Wzbogacenie składników komórkowych wskazuje na wiele białek pochodzenia wewnątrzkomórkowego, a wzbogacenie funkcji molekularnych zidentyfikowało rolę w wiązaniu białek dla większości kandydatów. Łańcuch B dehydrogenazy L-mleczanowej lub LDHB został wybrany jako najważniejszy kandydat, a analiza STRING zidentyfikowała 10 najważniejszych oddziałujących partnerów LDHB. Większość partnerów LDHB była również funkcjonalnie i lokalizacyjnie związana z egzosomami w HIV-1.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby każdy krok wykonywać w odpowiedniej temperaturze i warunkach. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak izolacja powinowactwa, w celu potwierdzenia przewidywań analizy bioinformatycznej.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaniom w dziedzinie egzosomalnej w celu zbadania zmian w proteomie egzosomalnym związanych z zakażeniami HIV-1 w biologii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować egzosom z hodowli komórkowej, przeanalizować ich proteomy i zbadać ich związek z HIV. Nie zapominaj, że praca z wirusem HIV lub innym czynnikiem zakaźnym może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.

silac-based-proteomic-characterization-exosomes-from-hiv-1-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza praca przedstawia metody izolacji, oczyszczania i detekcji egzosomów, a także techniki analizy ich zawartości molekularnej. Metody te można dostosować do izolacji egzosomów zarówno z pożywek hodowli komórkowych, jak i z płynów biologicznych; poza analizą zawartości molekularnej mogą one być również przydatne w badaniach funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Opisano techniki analizowania mechanizmów leżących u podstaw wydzielania HIV-1 Nef w egzosomach. Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z transfekcji Nef i białka wykorzystano do określenia struktury, funkcji i partnerów wiążących region modyfikacji wydzielania Nef. Procedury te mają ogólne znaczenie w wielu badaniach mechanistycznych.

Identyfikacja motywów funkcjonalnych i ich partnerów wiążących w oparciu o peptydy

Eksperymenty immunoprecypitacji SILAC stanowią potężny sposób na odkrycie nowych interakcji białko-białko. Umożliwiając dokładną względną kwantyfikację obfitości białek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i testowych, prawdziwe interakcje można łatwo odróżnić od zanieczyszczeń eksperymentalnych, a interakcje o niskim powinowactwie zachować dzięki zastosowaniu mniej rygorystycznych warunków buforowych.

Identyfikacja partnerów interakcji białkowych w komórkach ssaków za pomocą proteomiki ilościowej SILAC-immunoprecypitacji

Opisano techniki opisujące gradientową procedurę oddzielania egzosomów od cząsteczek ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Procedura ta została wykorzystana do wyizolowania egzosomów z dala od cząstek HIV w ludzkim osoczu od osób zakażonych wirusem HIV. Wyizolowane egzosomy analizowano pod kątem zawartości cytokin/chemokin.

Izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem HIV-1

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Tutaj prezentujemy protokół, w którym pojedyncze komórki są monitorowane pod kątem ostrych zdarzeń i produktywnego zakażenia HIV-1 na urządzeniu nanofluidycznym. Dane obrazowe definiują interakcje wirus-receptor gospodarza i dynamikę szlaku sygnałowego. Jest to pierwsza metoda nanofluidycznej, wysokoprzepustowej, podłużnej hodowli pojedynczej komórki i obrazowania w celu zbadania kinetyki sygnalizacji i interakcji molekularnych.

Jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Poznaj metodę SILAC do charakteryzacji proteomu egzosomów z komórek zakażonych HIV-1. Technika ta umożliwia badanie zmian w składzie białkowym egzosomów pod wpływem infekcji wirusowej.

Charakterystyka proteomiczna egzosomów z komórek zakażonych HIV-1 na podstawie SILAC

Przeglądaj więcej filmów